WO2016068587A1 - 흰잎 마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질 전환 식물체 - Google Patents

흰잎 마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질 전환 식물체 Download PDF

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    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)

Definitions

  • the present invention includes a plant transformant having an enhanced activity of a LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding a methyltransferase, and a plant resistance enhancer comprising an expression inducing sequence that enhances the activity of the gene.
  • the present invention relates to a recombinant vector and a method for producing the plant transformant.
  • the present invention relates to a method of enhancing disease resistance of a plant, comprising the step of enhancing the activity of the LOC_Os01g50610 gene.
  • the rice leaf blight is Xanthomonas oryzae pv. It is a bacterial catheter caused by oryzae . Its onset is from early July to harvest, but usually from early July to mid August. Bacteria can be overwintered in underground stems such as rope and mustard, which are intermediate host plants, or around roots or diseased rice straw and rice stumps. Bacteria are spread along the water by flagella and invade the water and air holes of rice leaves and cut roots. Disease outbreaks occur mainly in areas of frequent habitual occurrence, but also occur in areas other than invasive water.
  • Rice leaf blight is classified as Gram-negative bacteria and is a phytopathogenic bacterium that causes bacterial forgery of rice. It is widely distributed around the world and causes great damage to rice. However, the effect of chemical control is very low because pathogens multiply in rice catheter. To date, there are no fungicides specific to the disease.
  • Dongjin rice was developed in 1975 by breeding Geumnam wind, Nakdong rice and Sadominori at the Rural Development Administration with the aim of fostering new disease, high quality and multiplicity. It is resistant to white leaf blight and other pests. Therefore, there is a need for a study on the resistance of dongjinbyeon to leaf blight and blast disease, and a strategy for cultivating improved varieties.
  • the present inventors have identified a methyltransferase gene (LOC_Os01g50610) that provides resistance to leaf blight among genes of native rice dongjin, The transformant which activated this showed resistance to the blight blight, and completed the present invention by confirming that the yield of seeds was enhanced.
  • LOC_Os01g50610 methyltransferase gene
  • One object of the present invention is to provide a plant transformant having enhanced activity of the LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding a methyltransferase.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector for enhancing disease resistance of plants, comprising an expression inducing sequence for enhancing the activity of the LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding a methyltransferase.
  • Another object of the present invention is to (a) infecting a plant with Agrobacterium introduced with the recombinant vector; And (b) callusing the cells of the infected plant in step (a) to obtain cells of the transformed plant, thereby providing a method for producing a plant transformant having improved disease resistance.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for enhancing disease resistance of plants, comprising the step of enhancing the activity of the LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding a methyltransferase.
  • the present invention relates to a transformed rice plant having a strong resistance to leaf blight and enhancing the yield of seeds by inserting an expression inducing sequence into the expression control region of LOC_Os01g50610, which is inherent in rice leaf blight.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the structure of LOC_Os01g50610 selected as a gene associated with resistance to leaf blight, where A in FIG. 1 shows a structure on a gene, and B in FIG. 1 shows a structure of a protein in which a gene is expressed.
  • Methyltransf_7 as indicated here refers to the methyltransferase domain.
  • FIG. 2 is a structural diagram showing a part of genomic DNA of SAMT 01 transgenic rice in which a gene expression inducing sequence including T-DNA is inserted at a site that controls expression of LOC_Os01g50610.
  • 3 is a diagram confirming the T-DNA insertion position by PCR in the SAMT 01 genetically modified rice.
  • Figure 4 shows the results of RT-PCR confirming the expression of LOC_Os01g50610 in SAMT 01 transgenic rice.
  • FIG. 5 shows the results of experiments of resistance to white leaf blight of SAMT 01 transgenic rice.
  • FIG. 5A shows the result of inoculation of white leaf blight bacteria of natural type rice and SAMT 01 genetically modified rice by scissors inoculation method. It is a photograph, and
  • FIG. 5B is a graph which shows the averaged result of measuring the length of the rice leaves destroyed by its infection.
  • FIG. 6 is a diagram comparing the types of seeds of SAMT 01 genetically modified rice and Dongjin rice as natural rice.
  • Figure 7 is a view comparing the seed length and width of SAMT 01 genetically modified rice and Dongjin rice as a natural type rice.
  • the present invention provides a plant transformant, the activity of the LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the methyltransferase is enhanced.
  • LOC_Os01g50610 by inserting an expression inducing sequence into the expression control region of LOC_Os01g50610 to enhance the activity of the LOC_Os01g50610 gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, which is a methyltransferase, it expresses the gene and is resistant to white leaf blight. Transformed rice was prepared.
  • the present inventors observed plant transformants resistant to white leaf blight in 100,000 populations of rice mutants produced by the transformation method using Agrobacterium .
  • the plant transformant is a plant in which the gene function of the region where the T-DNA including the expression inducing sequence expressing the gene by Agrobacterium is inserted onto the genome is activated and the T-DNA is inserted. The location can be confirmed by genome DNA PCR and sequencing, and the gene locus id can be found in the database.
  • methyltransferase is a generic term for an enzyme that catalyzes a methyltransferase, and may be referred to as a methylase by methylating an amino group, a hydroxy group, and a thiol group as substrates as a kind of methyltransferase.
  • LOC_Os01g50610 is a gene present in the Oryza sativa first genome (chromosome), and its expression is a kind of protein methyltransferase.
  • the LOC_Os01g50610 gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence is encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the LOC_Os01g50610 gene used for preparing the plant transformant may be a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, specifically, a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a sequence It may be a gene encoded by the amino acid sequence of the number 3.
  • LOC_Os01g50610 TIGR, Os01g0701700 (RAP-DB)
  • LOC_Os01g50610 TIGR, Os01g0701700 (RAP-DB)
  • LOC_Os01g50610.1 TIGR, Os01g0701700 (RAP-DB)
  • LOC_Os01g50610.1 TIGR, Os01g0701700 (RAP-DB)
  • the LOC_Os01g50610 gene is a gene inherently present in rice.
  • the term "intrinsic" means that a living organism has a natural state.
  • a plant specifically, a rice ( Oriza sp. ) Genome ( chromosomes are used to identify genes that are naturally present.
  • the term "enhancing activity” means enhancing the activity of a specific gene, and may be used in combination with the term “activation”. It also includes activating inactivated genes or increasing the activity of low activity genes.
  • enhancing activity means enhancing the activity of a specific gene, and may be used in combination with the term “activation”. It also includes activating inactivated genes or increasing the activity of low activity genes.
  • a sequence or a promoter for inducing expression can be inserted into the expression control site of LOC_Os01g50610, and more specifically, a sequence including the expression inducing sequence described in SEQ ID NO: 4 can be inserted. .
  • the term "low activity gene” means that DNA, that is, present on a gene but has a low rate of transcription into RNA, or a low rate of translation into a protein, does not function properly.
  • the gene inherently possessed by the rice has a low rate of transcription or translation and thus does not properly express its function, and in particular, means that the LOC_Os01g50610 gene does not properly express its function.
  • the expression of the LOC_Os01g50610 gene is increased by inserting an expression inducing sequence (SEQ ID NO: 4) into the expression control region of the LOC_Os01g50610 gene (FIG. 4).
  • SEQ ID NO: 4 an expression inducing sequence
  • the plant transformants transformed to enhance the activity of the LOC_Os01g50610 gene have disease resistance against leaf blight (FIG. 5), and the activity of the LOC_Os01g50610 gene is enhanced to enhance the activity.
  • Dongjin rice which is a natural type rice, it was confirmed that the yield, the length, the width, and the weight of 1,000 seeds of the transformant were excellent (Figs. 6 to 8).
  • expression inducing sequence includes, without limitation, a sequence that functions to promote expression when present at an expression control site of a gene, and includes a transcription factor binding site, an enhancer, and a coenzyme binding site (co-factor). binding region) and the like.
  • sequence inserted into the expression control region of the gene preferably comprises an expression inducing sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • transformation refers to any activity in which a specific trait occurs, disappears, or is regulated through mutations such as insertion, deletion, or replacement on a DNA sequence. It means that the genetic nature of the change.
  • transformant refers to a transgenic plant produced by transformation, and includes a genetic recombinant produced by modification or activity of a specific gene by using a genetic recombination technique.
  • the term "plant transformant” includes all plants that may be subjected to transformation, and in particular, the LOC_Os01g50610 gene or a plant in which the corresponding gene is inactive or low in activity is included without limitation.
  • the plant transformant may be rice ( Oryza sp. ), More specifically, Dongjin rice.
  • the plant transformant may have resistance to leaf blight.
  • the present invention provides a recombinant vector for enhancing disease resistance of a plant, comprising an expression inducing sequence for enhancing the activity of the LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding a methyltransferase.
  • the methyltransferase, LOC_Os01g50610 and expression inducing sequence are as described above.
  • disease resistance means that disease does not occur well for various diseases, or even if the disease progresses significantly slower or excellent ability to recover.
  • bottle resistance may mean resistance to white leaf blight.
  • the term "recombinant vector” refers to a vector that has undergone a genetic recombination process in which a specific sequence is mutated, inserted or removed, preferably means a vector into which an expression inducing sequence is inserted, and more preferably, induces corresponding expression. Refers to a recombinant vector that functions to insert the sequence into the expression control region of LOC_Os01g50610.
  • the recombinant vector is functionally linked with an expression control sequence so that the LOC_Os01g50610 gene can be expressed.
  • a vector may contain a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, enhancers and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the vector may comprise a selectable marker, and the vector may self replicate or integrate into the host DNA.
  • Vectors of the present invention can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art.
  • a recombinant vector comprising an expression inducing sequence of SEQ ID NO: 4 was prepared in the expression control region of the LOC_Os01g50610 gene, and introduced into rice cells through Agrobacterium, thereby expressing the expression of the LOC_Os01g50610 gene, which is an endogenous gene. Increased.
  • the present invention provides a method for treating a plant, comprising the steps of: (a) infecting a plant with Agrobacterium into which the recombinant vector is introduced; And (b) callusing the cells of the infected plant in step (a) to obtain cells of the transformed plant, thereby providing a method for producing a plant transformant having improved disease resistance.
  • the term "Agrobacterium” is a Gram-positive bacterium, which is infected with plant cells through wounds of plant roots or stems, and inserts its own gene into the genome of plant cells to transform plant cells. It is a kind of carcinoma bacteria that causes it.
  • the Agrobacterium may be Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ).
  • the term “callus” refers to an undifferentiated atypical cell mass generated when a plant is injured, that is, an undifferentiated cell, and in particular, in the present invention, Agrobacterium or the like at the cut portion of the plant.
  • the infected cells are agglomerated at the wound site in an undifferentiated state. That is, in the present invention, transformed undifferentiated cells can be obtained by using only a cell infected with a carcinoma bacterium and generating a carcinoma mass, which is generated in a callus form.
  • the method for producing a transformant having improved disease resistance may preferably further comprise differentiating the obtained callus into roots and adults. Since callus is only a cell mass in an undifferentiated state as described above, it may be necessary to induce differentiation into roots and adults to obtain them as intact seeds.
  • the obtained callus was cultured in root-induction medium to induce differentiation into roots and adults (Example 2).
  • the present invention provides a method for enhancing disease resistance of a plant, comprising the step of enhancing the activity of the LOC_Os01g50610 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding a methyltransferase.
  • LOC_Os01g50610 gene, activity enhancement and disease resistance of the present invention is as described above.
  • the term “enhancement” means at least 5% or 10%, in particular at least 20% or 40%, more specifically 50%, 60%, 70% or 80% in comparison with the control rice in the present invention. It means the above disease resistance, means that the disease resistance is increased by introducing the gene compared to the disease resistance of rice originally.
  • a vector was constructed to insert the expression inducing sequence into the nucleotide sequence of the expression control region of the target gene.
  • a vector having L-0.5 / 1.5 was prepared to identify the DNA and the right gene sequence at the insertion position.
  • Primers for identifying and amplifying the target gene from the inserted genome are as follows.
  • Enhancer-F (Forward, SEQ ID NO: 9)
  • Enhancer-R (Reverse SEQ ID NO: 10)
  • PCR amplification conditions were performed for 1 cycle at 94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 1 minute, 58 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes for the first time DNA denaturation. It was made.
  • the amplified PCR product was electrophoresed with 1.0% agarose gel, and then stained with EtBr (ethidium bromide) solution to cut a band corresponding to base size under UV lamp to purify agarose gel. Purified by law.
  • the extracted PCR product was digested with the restriction enzymes BamHI / KpnI.
  • the recombinant vector pGA2772 vector was digested with restriction enzymes BamHI / KpnI and the digested vector was purified by the agarose gel purification method.
  • the DNA fragment obtained by the PCR product was inserted into the cut recombinant vector to prepare a recombinant vector pGA2772 vector in which a regulatory region expression derivative sequence (Enhance sequence, SEQ ID NO: 4) was inserted.
  • the prepared vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens using electroporation.
  • Dongjin rice grown aseptically in the culture room was transformed by the leaf disc method. Specifically, the rice leaf was cut into approximately 5 ⁇ 5 mm size and placed in 200 ⁇ l of MSO liquid medium (4.3 g of MS salt, 30 g / L sucrose, pH 5.6 to 5.8) containing Agrobacterium, and then 2 to 2 under dark conditions.
  • MSO liquid medium 4.3 g of MS salt, 30 g / L sucrose, pH 5.6 to 5.8
  • callus-shoot induction medium 100 ⁇ g NAA, 1 mg BA, 500 ⁇ g Cytaxim, 1 mg phosphinothricin, 0.7% phyto in MSO medium
  • agar phyto agar
  • pH 5.6 agar
  • Induced germination was transferred to root-induction medium (250 ⁇ g Cytaxime, 10 mg phosphinothricin, 0.7% phytoagar, pH 5.6) when grown to 1.5 to 2 cm.
  • the transgenic rice into which the expression derivative was inserted was named SAMT 01, and its gene structure is as shown in FIG. Specifically, by inserting the T-DNA sequence (SEQ ID NO: 5) into the upstream region predicted as the expression control site of LOC_Os01g50610 present in the first derivative of Dongjin rice, the trait having the genome structure as shown in FIG. A converter was produced.
  • T-DNA inserted chromosome was analyzed by inverse-PCR and sequencing on SAMT 01 made by T-DNA insertion.
  • Rice seeds of the selected strains were incubated at 28 ° C. for 10 days in MSO medium. 100 mg of the leaves of the cultured individuals were collected, quenched using liquid nitrogen, and ground. DNA was extracted from the ground leaves using one step buffer (1M Tris (pH9.5) 5ml, 0.5M EDTA 1ml, KCl 3.73g and 50ml adjusted to water).
  • SAMT 01 is a line in which T-DNA is inserted upstream of the expression control region of the LOC_Os01g50610 gene.
  • a primer (SEQ ID NO. 6 and SEQ ID NO. 7) made at the T-DNA insertion position and the iR2 primer (SEQ ID NO. 8) genotyping was performed by PCR.
  • PCR reaction after 5 minutes at 95 °C; 38 minutes was repeated 1 minute at 95 degreeC, 1 minute at 57 degreeC, and 1 minute at 72 degreeC, and it lasted 7 minutes at 72 degreeC.
  • PCR products were confirmed by electrophoresis using agarose gel (Fig. 3). This led to genotyping.
  • SAMT 01_R (SEQ ID NO: 7)
  • LOC_Os01g50610 gene activity was confirmed by reverse transcriptase PCR (RT-PCR) in transgenic rice (SAMT 01) in which expression derivatives were inserted in the expression control region of LOC_Os01g50610 gene.
  • RNA reverse transcriptase PCR was performed using RNA reverse transcriptase and reverse transcriptase DNA polymerase capable of confirming the expression of LOC_Os01g50610.
  • RT-SAMT 01_R reverse direction, SEQ ID NO: 12
  • a white leaf blight was grown for 6 weeks using SAMT 01, which is a transformed rice having an expression derivative inserted at the LOC_Os01g50610 expression control site, and a control.
  • SAMT 01 which is a transformed rice having an expression derivative inserted at the LOC_Os01g50610 expression control site, and a control.
  • Xanthomonas oryzae pv. oryzae (strain: PXO99Az) of the neuropathy was measured two weeks after vaccination buried the scissors (Fig. 5). The pathology was measured by comparing the wound lengths (Lesion Lengths) infected and destroyed from the inoculated site, and compared with the native Dongjin rice.
  • the SAMT 01 transformant has an average path length of about half of that of the native Dongjin rice (natural vs. SAMT 01: 22.3 cm vs. 11.3 cm), and has strong resistance to leaf blight. It could be confirmed that having.
  • the transformed rice SAMT 01 of the present invention can have resistance to white leaf blight by activating the endogenous gene LOC_Os01g50610.
  • the seed of the native type Dongjin rice as a control and SAMT 01 which is an expression derivative inserted into the LOC_Os01g50610 expression control site The shape, length, width and weight of 1,000 seeds were measured and compared.
  • the seed size of the SAMT 01 transformant was larger in shape and thicker than the native Dongjinbyeong, the length, width and weight of 1,000 seeds also confirmed that the SAMT 01 transformant was further improved.
  • the length, width and weight of 1,000 seeds also confirmed that the SAMT 01 transformant was further improved.
  • the transformed rice SAMT 01 of the invention was confirmed to improve the yield of better than the native type Dongjin rice by activating the endogenous gene LOC_Os01g50610.

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Abstract

본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체, 상기 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터 및 상기 식물 형질 전환체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법에 관한 것이다. 본 발명은 벼에 내재적으로 존재하며 흰잎 마름병에 대한 저항성 유전자, LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 흰잎 마름병에 대해 강력한 저항성을 가지고 종자의 품질을 향상시킨 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성 및 종자의 수량 증진을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.

Description

흰잎 마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질 전환 식물체
본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체, 상기 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터 및 상기 식물 형질 전환체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법에 관한 것이다.
벼 흰잎 마름병은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae에 의해서 발생되는 세균성 도관병으로, 발병시기는 7월 초~수확기이나 주로 7월 상순~8월 중순에 발병한다. 중간 기주식물인 줄풀 및 겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚 및 벼 그루터기에서 세균의 월동이 가능하다. 세균이 편모(鞭毛)에 의해 물을 따라 전염하고 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위 및 절단된 뿌리로 침입한다. 병 발생은 해마다 발생이 많은 상습발생지 위주로 발생하나 침관수지역이 아닌 지역에서도 발생이 많다.
보통 출수기 전후에 나타나나 상습발생지나 다발생 발생지에는 본답 초기에 발병하며, 드물게는 묘판에서도 발병된다. 국내에서 최초 발병보고는 1930년 전라남도 해남군에서 처음 발견된 이래 1960년까지 남부 일부 지역에 제한적인 발생을 보이다 이병성 품종인 금남풍의 재배 확대로 전국적인 발생을 나타내었으며, 이후 다수계 품종 재배에 의한 밀양 23호에 의해 피해가 확대되어 재배기간 중 후기에 발생되는 잎에서의 발병 뿐만 아니라 이앙 후 분열기까지 주 전체가 발생되는 금성형 증상을 보여 벼의 3대 병해의 하나로 간주된다.
벼 흰잎 마름병균은 그람음성세균으로 분류되고 벼의 세균성 위조병을 유발하는 식물병원세균으로 세계적으로 널리 분포하여 벼에 큰 피해를 주지만, 병원균이 벼의 도관 내에서 증식하므로 약제방제 효과는 매우 낮으며, 현재까지 이 병에 특이적인 살균제 또한 없는 실정이다.
또한, 기존의 작물에 대한 저항성 부여방법은 외래 유전자의 도입을 통해 식물체로 하여금 새로운 형질을 부여하는 기술이 대다수였다.
한편, 동진벼는 내병, 양질, 다수성 신품종육성을 목표로 1975년에 농촌진흥청에서 금남풍과 낙동벼 그리고 사도미노리를 교배하여 개발된 품종으로, 병해 저항성의 경우 줄무늬잎마름병에 강하고, 도열병에는 중간 정도의 저항성을 가지며, 흰잎 마름병과 기타 병충해에는 약한 편이다. 이에, 동진벼의 흰잎 마름병과 도열병에 대한 저항성 연구와 개량된 품종에 대한 육성 전략이 요구되고 있다.
본 발명자들은 아직 극복되지 못한 벼 흰잎 마름병에 대한 저항성 유전자를 동정하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 천연형 벼 동진의 보유 유전자 중 흰잎 마름병에 저항성을 부여하는 메틸전이효소 유전자 (LOC_Os01g50610)를 동정해내어, 이를 활성화시킨 형질전환체가 흰잎 마름병에 저항성을 나타냈으며, 종자의 수량이 증진된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 식물을 감염시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 감염된 식물의 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 식물의 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증진된 식물 형질 전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 벼에 내재적으로 존재하는 흰잎 마름병에 대한 저항성 유전자, LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 흰잎 마름병에 대해 강력한 저항성을 가지고 종자의 수량을 증진시킨 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성 및 종자의 수량 증진을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.
도 1은 흰잎 마름병에 대한 저항성과 관련된 유전자로 선별된 LOC_Os01g50610의 구조에 대한 개요도로, 도 1의 A는 유전자 상의 구조를 나타내며, 도 1의 B는 유전자가 발현된 단백질의 구조를 나타낸다. 이에 표시된 Methyltransf_7은 메틸전이효소 활성 부분 (methyltransferase domain)을 의미한다.
도 2는 LOC_Os01g50610의 발현을 조절하는 부위에 T-DNA를 포함한 유전자 발현 유도 서열이 삽입된 SAMT 01 유전자 변형 벼의 게놈 DNA의 일부분을 나타내는 구조도이다.
도 3은 SAMT 01 유전자 변형 벼에서 T-DNA 삽입위치를 PCR로 확인한 도면이다.
도 4는 SAMT 01 유전자 변형 벼에서 LOC_Os01g50610의 발현을 확인하는 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 SAMT 01 유전자 변형 벼의 흰잎 마름병에 대한 저항성을 실험한 결과를 보여주는 도면으로, 도 5의 A는 천연형 벼 및 SAMT 01 유전자 변형 벼의 흰잎 마름병균을 가위 접종법으로 접종한 결과를 보여주는 사진이고, 도 5의 B는 이의 감염에 의해 파괴된 벼 잎의 길이를 측정하여 평균 낸 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 SAMT 01 유전자 변형 벼와 천연형 벼인 동진벼의 종자의 형태를 비교한 도면이다.
도 7은 SAMT 01 유전자 변형 벼와 천연형 벼인 동진벼의 종자 길이 및 너비를 비교한 도면이다.
도 8은 SAMT 01 유전자 변형 벼와 천연형 벼인 동진벼의 1,000개의 종자 무게를 비교한 도면이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체를 제공한다.
본 발명에서는 메틸전이효소인 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화되도록, LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 해당 유전자를 발현하여 흰잎 마름병에 대해 저항성을 갖춘 형질전환 벼를 제조하였다.
보다 상세하게는 본 발명자들은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 방법을 통해 만들어진 10만 개통의 벼 돌연변이 집단에서 흰잎 마름병에 저항성이 있는 식물 형질 전환체를 관찰하였다. 상기 식물 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의해 유전자를 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는 T-DNA 가 genome 상에 삽입되어 삽입된 지역의 유전자 기능이 활성화된 식물체로, T-DNA의 삽입 위치는 genome DNA PCR과 염기서열 분석을 통해 확인할 수 있으며, 데이터 베이스에서 유전자 locus id를 찾을 수 있다.
본 발명에서 용어 "메틸전이효소"는 메틸기전이를 촉매하는 효소의 총칭으로, 메틸기전달효소의 일종으로 기질인 아미노기, 히드록시기, 티올기를 메틸화하여 메틸화효소라고 부르는 경우도 있다
본 발명에서 용어, "LOC_Os01g50610"는 Oryza sativa 1번째 유전체 (chromosome)에 존재하는 유전자로, 이의 발현물은 단백질 메틸전이효소의 일종이다. 상기 LOC_Os01g50610 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 상기 염기서열은 서열번호 3의 아미노산 서열로 코딩된다.
본 발명에서 상기 식물 형질 전환체 제조에 사용되는 LOC_Os01g50610 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자 일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자 일 수 있으며, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 코딩되는 유전자 일 수 있다.
상기 LOC_Os01g50610 (TIGR, Os01g0701700 (RAP-DB))의 genome DNA 크기는 2844 bp (서열번호 1)이며 대표 coding sequence (LOC_Os01g50610.1)의 크기는 1140 bp (서열번호 2)로 5개의 엑손(exon)과 4개의 인트론(intron)으로 구성되며, 380 개의 아미노산으로 번역되어 단백질 (서열번호 3)이 만들어진다. 이 단백질은 plant methyltransferase domain (Methyltransf_7)을 암호화 한다 (도 1B).
상기 LOC_Os01g50610 유전자는 벼에 내재적으로 존재하는 유전자로, 본 발명에서 용어, "내재적"이란 생물이 천연의 상태로 가지고 있는 것을 의미하는데, 본 발명에서는 식물, 구체적으로는 벼(Oriza sp.) 유전체(chromosome)가 천연적으로 가지고 있는 유전자를 표시할 때 사용한다.
본 발명에서 용어, "활성 강화"는 특정 유전자의 활성을 강화시키는 것을 의미하고, 용어 "활성화"와 혼용하여 사용될 수 있다. 또한 불활성화된 유전자를 활성화시키거나 활성이 낮은 유전자의 활성을 높이는 것도 포함한다. 1) 해당하는 유전자를 1 카피 이상 도입, 2) 해당하는 유전자의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열을 삽입, 3) 활성이 강화된 형태로 변형시키는 방법으로 강화, 또는 4) 이의 조합에 의해 활성이 강화되도록 변형시킬 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로는 LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열 또는 프로모터(promoter)를 삽입할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열번호 4로 기재되는 발현 유도 서열을 포함하는 서열을 삽입할 수 있다.
본 발명에서 용어, "활성이 낮은 유전자"는 DNA, 즉 유전자 상으로는 존재하나 RNA로 전사(transcription)되는 비율이 낮거나, 단백질로 번역(translation) 되는 비율이 낮아서 본연의 기능을 발휘하지 못하는 것을 의미하고, 본 발명에서는 벼가 내재적으로 가지고 있는 유전자가 전사 또는 번역이 되는 비율이 낮아서 그 기능을 제대로 발현하지 못하는 것을 의미하고, 특히, LOC_Os01g50610 유전자가 그 기능을 제대로 발현하지 못하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 LOC_Os01g50610 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열(서열번호 4)을 삽입함으로써, LOC_Os01g50610 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 4). 또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 상기 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화되도록 형질전환된 식물 형질 전환체가 흰잎 마름병에 대해 병 저항성을 가지는 것을 확인하였으며(도 5), 상기 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화되도록 형질전환된 식물 형질 전환체와 천연형 벼인 동진벼를 비교하였을 때, 상기 형질 전환체의 종자의 형태, 길이, 너비 및 종자 1,000개의 무게가 우수하여 수량이 증진된다는 것을 확인하였다(도 6 내지 8).
본 발명에서 용어, "발현 유도 서열"은 유전자의 발현 조절 부위에 존재할 때 발현을 촉진하는 기능을 하는 서열을 제한없이 포함하며, 전사인자 결합 부위, 인핸서(enhancer), 조효소 결합 부위(co-factor binding region) 등을 포함한다. 본 발명에서 상기 유전자의 발현 조절 부위에 삽입되는 서열은 서열번호 4로 기재되는 발현 유도 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA 염기서열 상의 삽입, 결실 또는 대체 등의 변이를 통해 특정 형질이 발생하거나 사라지거나 조절되는 모든 행위를 의미하며, 특히 본 발명에서는 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어, "형질 전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환 식물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 활성의 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다.
본 발명에서 용어, "식물 형질 전환체"는 형질전환의 대상이 될 수 있는 모든 식물을 포함하며, 특히, LOC_Os01g50610 유전자 또는 이에 해당하는 유전자가 불활성되거나 활성이 낮은 식물은 모두 제한없이 포함한다. 구체적으로는 상기 식물 형질 전환체는 벼(Oryza sp.)일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 동진벼일 수 있다.
본 발명에서 상기 식물 형질 전환체는 흰잎 마름병에 대한 저항성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 동진벼에 상기 내재적 유전자인 LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위에 서열번호 4의 발현 유도 서열을 삽입하는 형질전환을 통하여 LOC_Os01g50610에 해당하는 유전자의 활성이 강화되는 형질전환체를 제조하였으며, 이를 SAMT 01이라고 명명하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.
상기 메틸전이효소, LOC_Os01g50610 및 발현 유도 서열은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "병 저항성"은 각종 질병에 대해 발병이 잘 일어나지 않거나, 발병되더라도 병 진행의 속도가 현저히 느리거나, 회복이 되는 능력이 뛰어난 것을 의미한다. 본 발명에서 병 저항성은 흰잎 마름병에 대한 저항성을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터"는 특정 서열이 변이, 삽입 또는 제거되는 유전자 재조합 과정을 거친 벡터를 의미하며, 바람직하게는 발현 유도 서열이 삽입된 벡터를 의미하고, 더욱 바람직하게는 해당 발현 유도 서열을 LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위에 삽입할 수 있는 기능을 하는 재조합 벡터를 의미한다.
상기 재조합 벡터는 LOC_Os01g50610 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다
본 발명의 일 실시예에서는, LOC_Os01g50610 유전자의 발현 조절 부위에 서열번호 4의 발현 유도 서열 포함하는 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 아그로박테리움을 통해 벼 세포에 도입하여, 내재적 유전자였던 LOC_Os01g50610 유전자의 발현을 증가하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 식물을 감염시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 감염된 식물의 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 식물의 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증진된 식물 형질 전환체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 그람양성의 세균으로, 식물의 뿌리나 줄기의 상처를 통해 식물세포에 감염되어, 자신이 가지고 있는 유전자를 식물 세포의 유전체에 삽입하여 식물세포의 형질전환을 일으키는 암종세균의 일종이다. 본 발명에서 상기 아그로박테리움은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
본 발명에서 용어, "캘러스(callus)"란, 식물에 상처가 났을 때 생기는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 즉, 미분화세포를 의미하며, 특히, 본 발명에서는 식물의 잘린 부위에 아그로박테리움 등 형질전환용 암종세균을 감염시켰을 때 감염된 세포가 미분화상태로 상처부위에 덩어리진 것을 의미한다. 즉, 본 발명에서는 암종세균에 감염되어 형질전환된 세포만이 암종 덩어리를 생성하는 특징을 이용하여 형질전환된 미분화세포를 얻을 수 있는데 이것이 캘러스 형태로 생성되게 된다.
상기 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법은, 바람직하게는 수득된 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 캘러스는 상기 설명한대로 미분화된 상태의 세포 덩어리에 불과하기 때문에, 이를 온전한 종자로 수득하기 위해서는 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 수득된 캘러스를 루트-인덕션 배지에서 배양하여 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하였다(실시예 2).
또 하나의 양태로, 본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법을 제공한다.
본 발명의 LOC_Os01g50610 유전자, 활성 강화 및 병 저항성 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 용어 "증진"은 본 발명에서 대조군 벼와 비교하여 적어도 5% 또는 10%, 구체적으로는 적어도 20% 또는 40%, 더욱 구체적으로는 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상의 병 저항성을 의미하며, 벼가 원래 가지고 있는 병 저항성에 비해 상기 유전자를 도입하여 병 저항성이 증가되는 것을 의미한다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Bioinformatics를 통한 형질전환 타겟 유전자 선별
동진벼의 유전체가 보유한 식물체의 질환 저항성과 밀접한 관련이 있을 것으로 예측되는 메틸전이효소 230개를 동정하였다. 이 중, microarray data를 바탕으로 MeV v2.0 프로그램을 이용하여 흰잎 마름병에 저항성을 가질 확률이 높은 유전자를 108개 선별하였다. 선별된 유전자에 대하여 형질전환체를 제조하여 병 저항성을 갖는 유전자를 동정해 내는 과정에서, 본 발명의 LOC_Os01g50610이 흰잎 마름병에 저항성을 갖는 유전자로 선별되었다.
실시예 2. 발현 유도체 삽입된 형질전환 벼 제조
2-1. 벼 형질전환용 재조합 벡터 제조
타겟 유전자의 발현 조절 부위의 염기서열에 발현 유도 서열을 삽입하기 위해 벡터를 제작하였다. 먼저, 유전체 삽입을 위한 T-DNA, 삽입위치의 왼쪽 유전자 서열을 확인하기 위한 N-GUS, 서열번호 4의 유전자의 발현 유도 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위한, 담배 잎 모자이크바이러스 35S 프로모터 유래 DNA, 삽입위치의 오른쪽 유전자 서열을 확인하기 위한 L-0.5/1.5를 가지는 벡터를 제작하였다. 삽입된 유전체로부터 타겟 유전자의 확인과 증폭을 위한 프라이머는 아래와 같다.
Enhancer-F (정방향, 서열번호 9)
5'-gatccccaacatggtggagc-3'
Enhancer-R (역방향, 서열번호 10)
5'-ggatctagatatcacatcaa-3'
PCR 증폭 조건은 처음 DNA의 열변성을 위하여 94℃에서 3분간 1 cycle, 그리고 94℃ 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 2분간으로 총 35 cycle을 실시하였으며, 최종 DNA 합성은 7분으로 하였다.
해당 증폭된 PCR 산물을 1.0%의 아가로즈겔(agarose gel)로 전기영동 한 후 EtBr(ethidium bromide) 용액에 염색하여 UV lamp하에서 염기 크기에 해당하는 band를 절단하여 아가로즈겔(agarose gel) 정제법으로 정제하였다.
추출한 PCR 산물을 상기 제한효소 BamHⅠ/KpnⅠ으로 절단하였다. 또한, 재조합 벡터인 pGA2772 벡터를 제한효소 BamHⅠ/KpnⅠ로 절단하여, 절단된 벡터를 상기 아가로즈겔 정제법으로 정제하였다. 상기 PCR 산물에 의한 DNA 단편을 절단된 재조합 벡터에 삽입하여, 조절부위 발현 유도체 서열 (Enhance sequence, 서열번호 4)이 삽입된 재조합 벡터 pGA2772 vector를 제조하였다.
2-2. 형질전환체 제조
상기 제조된 벡터를 전기충격 방법(electroporation)을 이용하여 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하였다. 배양실에서 무균상태로 자란 동진벼에 리프 디스트(leaf disc)법으로 형질전환하였다. 구체적으로는 벼잎을 대략 5 x 5 mm 크기로 잘라서 200㎕의 아그로박테리움이 포함된 MSO 액체 배지(MS 염 4.3g, 수크로스 30g/L, pH 5.6 내지 5.8)에 넣었다가 암조건에서 2 내지 3일 동안 배양하고, 배양된 잎 절편을 캘러스-슈트(callus-shoot) 유도 배지(MSO배지에 100㎍ NAA, 1mg BA, 500㎍ 세포탁심, 1 mg 포스피노트리신(phospinothricin), 0.7% 피토 한천(phyto agar), pH 5.6)으로 옮기고, 새로운 배지로 옮겨 주었다. 유도된 발아는 1.5 내지 2 cm 정도 자라면 루트-인덕션 배지(MSO배지에 250㎍ 세포탁심, 10mg 포스피노트리신, 0.7% 피토 한천, pH 5.6)로 옮겨 주었다.
발현 유도체가 삽입된 상기 유전자 형질전환 벼를 SAMT 01로 명명하였으며, 이의 유전자 구조는 도 2에 개시된 바와 같다. 구체적으로는, 동진 벼의 첫 번째 유도체에 존재하는 LOC_Os01g50610의 발현 조절 부위로 예측되는 상류부분 (upstream region)에 T-DNA 서열 (서열번호 5)을 삽입하여, 도 2와 같은 유전체 구조를 가진 형질전환체를 제작하였다.
2-3. 재조합 벡터의 벼 유전체 삽입위치 확인
T-DNA 삽입에 의해 만들어진 SAMT 01에 대한 inverse-PCR 및 염기 서열 분석을 통해 T-DNA가 삽입된 염색체를 분석하였다.
상기 선발된 계통의 벼 종자를 MSO 배지에 28℃에서 10일간 배양하였다. 이렇게 배양한 개체들의 잎 100mg을 채취하여 액체질소를 이용하여 급냉각한 후 분쇄하였다. 분쇄된 잎에서 one step buffer (1M Tris (pH9.5) 5ml, 0.5M EDTA 1ml, KCl 3.73g을 넣고 물로 50ml을 맞춰 조제)을 이용하여 DNA를 추출하였다.
SAMT 01은 LOC_Os01g50610 유전자의 발현조절 상류부분에 T-DNA가 삽입된 계통으로 T-DNA 삽입위치에서 앞뒤에서 만들어진 프라이머 (서열번호 6 및 서열번호 7)와 T-DNA 삽입서열 중 iR2 프라이머 (서열번호 8)를 이용하여 PCR로 유전형 분석을 하였다.
PCR 반응은 95℃에서 5분 후; 95℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 1분 을 38회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분을 진행하였다. PCR 산물은 agarose gel을 이용하여 전기영동으로 확인하였다(도 3). 이를 통해 유전형을 선발하였다.
이에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
SAMT 01_F (서열번호 6)
5'-TCTGCCACATCTTTTGACCT-3'
SAMT 01_R (서열번호 7)
5'-GCCCATCTCTCTCATTCACA-3'
iR2 (서열번호 8)
5'-CAGGACGTAACATAAGGGACTGA-3'
실시예 3. 형질전환 벼의 유전자 활성 검증
LOC_Os01g50610 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도체를 삽입한 형질전환 벼 (SAMT 01)에서 LOC_Os01g50610 유전자 활성을 역전사 효소 PCR (RT-PCR, reverse transcriptase-PCR)로 확인 하였다.
구체적으로는, 형질전환 벼 (SAMT 01)의 잎 0.1g에서 total RNA를 추출하였다. 이를 주형으로 하여 LOC_Os01g50610의 발현을 확인할 수 있는 RNA 역전사용 프라이머와 역전사 효소 (reverse transcriptase DNA polymerase)를 이용하여 역전사 효소 PCR을 수행하였다.
도3 에서 확인할 수 있듯이, 천연형 동진벼에 비하여 본 발명의 형질전환 벼에서는 유전자 LOC_Os01g50610의 발현이 높아졌다는 것을 확인할 수 있었다.
RT-SAMT 01_F (정방향, 서열번호 11)
5'-CAACGACTTCAACACCATCTT-3'
RT-SAMT 01_R (역방향, 서열번호 12)
5'-GAAGGAACCTGACCTGGGAG-3'
실시예 4. 형질전환 벼(SAMT 01)의 벼 흰잎 마름병에 대한 저항성 검정
상기 실시예 2에서 제조된 형질전환 벼가 흰잎 마름병에 대해 저항성을 보이는지 확인하기 위해, LOC_Os01g50610 발현 조절부위에 발현 유도체가 삽입된 형질전환 벼인 SAMT 01과 대조군으로 천연형 동진벼를 6주간 생장시켜 흰잎 마름병을 유발하는 균주인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (strain : PXO99Az)를 가위에 묻혀 접종한 2주 후 병증을 측정하였다 (도 5). 병증 측정은 접종한 부위로부터 감염되어 파괴된 상처 길이(Lesion Lengths)를 측정하여 천연형 동진벼와 비교하였다.
도 5의 B에서 확인할 수 있듯이 SAMT 01 형질전환체는 평균 병증의 길이가 천연형 동진벼의 반 정도에 불과하여 (천연형 vs. SAMT 01 : 22.3cm vs. 11.3cm), 흰잎 마름병에 대한 강력한 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 형질전환 벼 SAMT 01은 내재적 유전자 LOC_Os01g50610를 활성화시킴으로써 흰잎 마름병에 대한 저항성을 가질 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 형질전환 벼(SAMT 01)의 수량 증진 확인
상기 실시예 2에서 제조된 형질전환 벼가 천연형 동진벼에 비해 그 수량이 증진되는지를 확인하기 위해, LOC_Os01g50610 발현 조절부위에 발현 유도체가 삽입된 형질전환 벼인 SAMT 01과 대조군으로 천연형 동진벼의 종자의 형태, 길이, 너비 및 종자 1,000개의 무게를 측정하여 비교하였다.
도 6 내지 8에서 확인할 수 있듯이, SAMT 01 형질전환체의 종자 크기는 천연형 동진벼보다 그 형태가 크고 두께가 두꺼웠으며, 길이, 너비 및 종자 1,000개의 무게 또한 SAMT 01 형질전환체가 더 향상되었음을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과를 통하여, 발명의 형질전환 벼 SAMT 01은 내재적 유전자 LOC_Os01g50610를 활성화시킴으로써 천연형 동진벼보다 더 나은 수량의 증진을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LOC_Os01g50610 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 식물 형질 전환체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LOC_Os01g50610 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 메틸전이효소로 코딩되는 것인, 식물 형질 전환체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 식물은 벼 (Oryza sp.)인 것인, 식물 형질 전환체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벼 (Oryza sp.)는 동진벼인 식물 형질 전환체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 활성 강화는 LOC_Os01g50610 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열 또는 프로모터를 삽입하여 이루어지는 것인, 식물 형질 전환체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 발현 유도 서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 식물 형질 전환체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 식물 형질 전환체는 흰잎 마름병에 대한 저항성을 갖는 것인, 식물 형질 전환체.
  9. 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 LOC_Os01g50610 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 상기 LOC_Os01g50610 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 메틸전이효소로 코딩되는 것인, 재조합 벡터.
  12. 제9항에 있어서, 상기 발현 유도 서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
  13. 제9항에 있어서, 상기 식물은 벼 (Oryza sp.)인 것인, 재조합 벡터.
  14. 제9항에 있어서, 상기 병 저항성은 흰잎 마름병에 대한 저항성인 것인, 재조합 벡터.
  15. (a) 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 식물을 감염시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 감염된 식물의 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 식물의 세포를 수득하는 단계를 포함하는,
    병 저항성이 증진된 식물 형질 전환체의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 식물은 벼 (Oryza sp.)인 것인, 제조방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 병 저항성은 흰잎 마름병에 대한 저항성인 것인, 제조방법.
  19. 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os01g50610 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법.
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