WO2016063225A1 - Preparation de polyplexes monoplasmidiques - Google Patents

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WO2016063225A1
WO2016063225A1 PCT/IB2015/058112 IB2015058112W WO2016063225A1 WO 2016063225 A1 WO2016063225 A1 WO 2016063225A1 IB 2015058112 W IB2015058112 W IB 2015058112W WO 2016063225 A1 WO2016063225 A1 WO 2016063225A1
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WO
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polyplexes
polymer
nucleic acid
dna
cells
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Application number
PCT/IB2015/058112
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Philippe Guegan
Jérôme MATHE
Patrick Midoux
Elodie TARNAUD
Original Assignee
Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
Application filed by Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6), Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a polymer complex preparation method (s) charge (s) and a single charge of opposite molecule of interest, in particular polyplexes comprising a cationic polymer and a single nucleic acid molecule , especially a plasmid, such as polyplexes mo no pl as midiq ues.
  • the present invention also relates to the complexes obtained by the process.
  • the present invention relates to polyplexes comprising a cationic polymer and a single molecule "nucleic acid and their use for transfection in vitro, ex vivo and in vivo molecules loaded interest, in particular of therapeutic molecules, such that especially nucleic acids.
  • viral vectors The strategies used in gene therapy to introduce a drug gene into cells use modified viruses called viral vectors. These vectors pose a number of problems for their safe application in humans. There are also physical methods such as ⁇ e i that is troperméati and use, ultrasound or sonoporation.
  • Chemical vectors could in principle replace viral vectors because they are less immunogenic and have a lower manufacturing cost. It has been shown for almost twenty years that it is possible to use a cationic polymer, such as polylysine, polyethylenimine or chitosan to condense a nucleic acid (polynucleotide such as in particular a plasmid DNA or an AN) and form a particle that can then be used to convey the polynucleotide to the interior of the cell.
  • a cationic polymer such as polylysine, polyethylenimine or chitosan
  • WO 2009/1 12402 and Bertrand et al. Chem. Commmun .. 201 1, 14, 12547- 12549 disclose linear polymers of polyethylenimine modified with histidine residues. which have good transfection efficiency and low cell toxicity.
  • polyplexes The use of cationic polymers for transfection of cells relies on the formation of electrostatic complexes between a cationic polymer and a nucleic acid, called polyplexes.
  • the methodology conventionally used to prepare polyplexes consists in adding a cationic polymer solution in a solution containing the plasmid DNA, and the particles are form spontaneously. Optimization of polyplexes is ensured by the variation of the N / P ratio, expressing the number of positive charges (N for nitrogen) per molecule of polymer relative to the number of negative charges (P for phosphate) per molecule of DNA.
  • the particles are characterized by their average hydrodynamic diameter and their surface charge or zeta potential.
  • the particles have an average diameter generally greater than 100 nm and consist of several (3 to 4) plasmid molecules (Range et al, Biophysical Journal, 2003, 84, 1960-1968, Mi dux et al, Somatic Ce 11 and Molecular Genetics, 2002, 27, 27-47).
  • N / P charge ratio between the polycation and the polyanion changes as the polycation is poured into the polyanion solution.
  • N / P 1 is initially inside, then rises up to the neutralization (N / P around 1) to reach a final value of P / N close to 3 or 6 according to the formulations.
  • the polyplexes are generally formed at a concentration in DNA much lower than that required for in vivo studies and whatever the modes of administration.
  • the polyplexes thus generated so have generally diameters greater than 100 nm allows to envisage their use in vitro, but their use in vivo making impossible because of the severe toxicity risks.
  • the polyplexes thus formed are unstable in the presence of saline solution such as physiological saline: they quickly form aggregates up to the size of 1 ⁇ .
  • Particle size reduction should facilitate both biodistribution in the body and penetration into the cell and intracellular trafficking to nuclear delivery.
  • the high size of the polyplexes is partly due to the fact that these complexes are formed with several plasmid DNA molecules.
  • One way to reduce this is to control the particle formation process so that it contains a single molecule of plasmid DNA.
  • Polyplexes monoplasmidiques n have never been obtained in concentrated with cationic polymers. Such polyplexes n 'were obtained that twice, and only when using a lipid-based formulation (Chittimalla et al, JACS, 2005, 127, 11436-1 1441; Rudorf OJ Deregister, JACS, 2012, 134 , 1852-11858).
  • the inventors have developed an original process for the preparation of polyplexes which advantageously makes it possible to produce DNA and cationic polymer-based monoDNA polyplexes while avoiding the problems of precipitation encountered with the standard method for the preparation of polyplexes.
  • this method can be used to produce polyplexes based on positively (polymer) cationic polymer (s) or negatively (anionic polymer (s)) and on a single molecule. of opposite charge interest (negative or positive polyelectrolyte), including a single nucleic acid.
  • the present invention relates to a process for preparing at least one polymer complex (s) charged (s) and one molecule of opposite interest, characterized in that it comprises at least the following steps:
  • the method of preparing polyplexes comprising: a single molecule of interest according to the invention has the following advantages over the conventional method of preparing polyplexes:
  • Each molecule of interest charged for example a plasmid
  • a plasmid is condensed in a unique and independent, making obsolete formulation concentration issues: it is possible to consider the polyplexes of training including a single molecule of interest regardless the size of the molecule of interest, in particular the plasmid and the concentration at which it is formulated. This observation is particularly important for considering therapeutic applications for which the molecules to be delivered in the cells, in particular the plasmids, are of high size, or even close to 20 kbp.
  • This form of formulation can be applied to any type of charged polymer (anionic or cationic).
  • the amount of polymer (s) charged (s) necessary to achieve a polyplex according to the invention is greatly reduced, which has the effect of decreasing the amount of charged polyelectrolyte, including positive polyelectrolyte, often toxic, injected during in vivo transfection.
  • the polyplexes obtained by the process according to the invention have very varied applications in all fields involving the transfer of molecules into cells, in particular of genes, using synthetic vectors, such as in a non-limiting way the field of cell imaging, diagnosis, therapy, including gene therapy and regenerative medicine, and biomanufacturing.
  • the pathologies concerned are extremely numerous, they concern both genetic diseases (Cystic Fibrosis, Duchenne Muscular Dystrophy ...) or acquired (cancer, infections with pathogenic microorganisms including viruses).
  • the method of formulation of the invention allowing to avoid the formation of aggregates in a concentrated medium, is a very important outlet for filled polymers, especially cationic polymers.
  • the formulations reproducibility issue is not discussed in the literature but this method has the advantage of a standardized formulations, leading to a better reproducibility of the results.
  • the porous membrane used in the process according to the invention consists of a material suitable for extrusion.
  • it is a polycarbonate membrane.
  • Said membrane advantageously comprises pores with a size of 5 to 200 nm, preferably 10 to 50 nm (10, 20, 30, 40 or 50 nm), even more preferably 50 nm.
  • extrusion is conducted at a pressure of 10 m bar to 3 bar, preferably 100 mbar to 2 bar, in particular 100 mbar, 500 m bar or 2 bar even more preferably 1 to 2 bars.
  • the rate of flow through the membrane is dictated by pore size and pressure.
  • the method of the invention can be implemented with varying concentrations of charged molecule of interest, including nucleic acid (first compartment), both low and high, as demonstrated by the examples of this Application which were performed with nucleic acid concentrations varying from a factor of 1 to 200 (10).
  • the respective proportions of the polymer and the molecule of interest, in particular the cationic polymer and the nucleic acid, are preferably determined so that the mass ratio (g / g) between the polymer and the molecule of interest, especially the nucleic acid, is 2 to 6
  • the present invention also relates to a complex of polymer (s) charged (s) and a single molecule of interest of opposite charge, obtained or obtainable by the method according to the invention. More particularly, the present invention provides a polymer complex (s) charged (s) positively (polymer (s) cation (s)) and one nucleic acid molecule.
  • the complex according to the invention also referred to as polyplex is formed by associations, in particular electrostatic, between the molecule of interest charged and the (s) polymer (s) of opposite charge, in particular the (s) polymer (s) cationic (s) including positive charges and the molecule comprising nucleic acid negatively charged.
  • a polyplex containing DNA is called polyplex mono-DNA; when the DNA is a plasmid. then it is a monoplasmidique polyplex.
  • the filled polymer includes all cationic or anionic polymers and co-polymers having a cationic or anionic block, useful for transferring cells in vitro, ex vivo or in vivo.
  • These include cationic polymers or co-polymers having a cationic block.
  • cationic polymers or co-polymers having a cationic block such as, for example, polylysine, polyethylenimine, chitosan and their derivatives.
  • the charged polymer is advantageously a cationic polymer, preferably a linear polyethyleneimine, preferably a partially histidinylated linear polyethyleneimine (IPEI-His), even more preferably in which 5% to 25%, more preferably 16%, of the total monomers are hislidinylated; such copolymers are described in Application WO 2009/112402.
  • a cationic polymer preferably a linear polyethyleneimine, preferably a partially histidinylated linear polyethyleneimine (IPEI-His), even more preferably in which 5% to 25%, more preferably 16%, of the total monomers are hislidinylated; such copolymers are described in Application WO 2009/112402.
  • the molecule of interest charged is capable of forming a particle with one or more polymer (s) of opposite charge. It is a positive or negative polyelectrolyte, especially a molecule used for diagnosis, therapy or cell / tissue imaging.
  • the molecule of interest is loaded in particular a nucleic acid, especially a DNA molecule, RNA or mixed DNA / RNA, single-stranded, double-stranded (in whole or in part), linear or circular, natural, recombinant synthetic or semi-synthetic, including nucleic acids modified at the level of the sugar moiety and / or the base of their nucleotides, and / or their immuno-nucleotide bonds, for example of the morpholino or PNA type.
  • a nucleic acid especially a DNA molecule, RNA or mixed DNA / RNA, single-stranded, double-stranded (in whole or in part), linear or circular, natural, recombinant synthetic or semi-synthetic, including nucleic acids modified at the level of the sugar moiety and / or the base of their nucleotides, and / or their immuno-nucleotide bonds, for example of the morpholino or PNA type.
  • the nucleic acid is advantageously a DNA or an mRNA comprising a sequence coding for a polypeptide or a protein of interest, in particular therapeutic: an antisense DNA or RNA, an interfering RNA or a ribozyme comprising a sequence complementary to a gene of interest, especially therapeutic; a DNA encoding the previous RNAs.
  • said nucleic acid comprises elements allowing its expression in the host cell or organism, namely transcriptional and / or translational regulatory elements (polyA promoter). It can also be incorporated into a vector such as a plasmid vector.
  • nucleic acids of therapeutic interest mention may be made of the non-mutated and therefore functional form of the genes involved in hereditary diseases, in particular heritable monogenic diseases, as well as the nucleic acids coding for antigens of microorganisms or tumor antigens. .
  • the nucleic acid is a DNA, preferably a plasmid.
  • said nucleic acid is a nucleic acid of therapeutic interest.
  • the complex according to the invention is a particle of size less than 100 nm, preferably less than 70 nm. These include a particle of 10 to 70 nm, preferably 30 to 70 nm, preferably about 50 nm.
  • said particle is a nucleic acid polyplex, preferably a monoplasmid polyplex.
  • the invention encompasses the charged particles positively or negatively, such as in particular inorganic or magnetic particles.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a complex according to the invention and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
  • compositions are the conventional excipients well known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may further comprise at least one other compound, in particular an active ingredient of a drug or an adjuvant capable of associating with the polymer / nucleic acid complex according to the invention, and of improving the transfecting capacity. of said complex.
  • the complex or the composition of the invention comprises a targeting element or agent for orienting the transfer of the charged molecule of interest, in particular the nucleic acid.
  • This targeting element may be an extracellular targeting element, making it possible to direct the transfer of the nucleic acid towards certain cell types or certain desired tissues, for example tumoral, hepatic, immune or hematopoietic cells. It can also be an intracellular targeting element, to guide the transfer of nucleic acid to certain preferred cellular compartments, for example the nucleus, microtubules or rnitochondria.
  • sugars oligonucleotide peptides, lipids or proteins.
  • sugars, peptides or proteins such as, but not limited to: antibodies or antibody fragments, cell receptor ligands or fragments thereof, receptors or fragments thereof. receptors.
  • the targeting element may be the sugar moiety for targeting the immunoglobulin Fc receptor.
  • the targeting element is advantageously linked to the complex according to the invention, directly or indirectly, via covalent and / or non-covalent bonds, according to the standard techniques known to those skilled in the art.
  • the targeting agent is attached to the cationic or anionic polymer so as to be exposed on the surface of the polyplex according to the invention, in particular a Mono DNA polyplex, to obtain a maximum targeting efficiency of the complex according to the invention. .
  • compositions according to the invention may be formulated for oral, parenteral. including intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, sublingual; local, including topical, transdermal, rectal, vaginal, intraocular, intranasal; intratumoral, or by inhalation.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a vehicle pharmaceutically acceptable for an injectable formulation, especially for a direct injection into the desired organ, for inhalation (aerosol) administration, or for topical administration ( on skin and / or mucosa).
  • a vehicle pharmaceutically acceptable for an injectable formulation especially for a direct injection into the desired organ, for inhalation (aerosol) administration, or for topical administration ( on skin and / or mucosa).
  • injectable formulation especially for a direct injection into the desired organ, for inhalation (aerosol) administration, or for topical administration ( on skin and / or mucosa).
  • injectable formulation especially for a direct injection into the desired organ, for inhalation (aerosol) administration, or for topical administration ( on skin and / or mucosa).
  • These may act in sterile isotonic solutions or dry compositions, in particular lyophilized, which on addition of sterilized water or of physiological saline, allow the constitution of injectable solutions.
  • the complexes and compositions according to the invention can be used for the transfer of charged molecules of interest, in particular nucleic acids into the cells in vivo, in vitro or ex vivo.
  • the complexes according to the invention can be used to efficiently transfer nucleic acids into many cell types that are usually difficult to transfect, especially primary cell lines and fragile cells, which are particularly sensitive to the toxicity of the transfection agents.
  • the present invention relates to the use of a complex according to the present invention to transfect cells in vitro or ex vivo.
  • the present invention also relates to a method for transferring in vitro or ex vivo a charged molecule of interest, in particular a nucleic acid, in particular a plasmid, into cells, said method comprising contacting said cells with at least one complex according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the invention.
  • the cells may be of prokaryotic or eukaryotic origin, in particular animal, plant or human origin.
  • the cells are mammalian cells, advantageously chosen from: hematopoietic stem cells, cells of the immune system, such as dendritic cells, macrophages and lymphocytes; liver cells; skeletal muscle cells; skin cells such as fibroblasts, keratinocytes, dendritic cells and melanocytes; blood vessel and microvessel cells, such as endothelial cells and smooth muscle cells; epithelial cells of the airways; central nervous system cells; cancer cells; connective tissue cells, such as tenocytes.
  • hematopoietic stem cells cells of the immune system, such as dendritic cells, macrophages and lymphocytes
  • liver cells such as fibroblasts, keratinocytes, dendritic cells and melanocytes
  • skin cells such as fibroblasts, keratinocytes, dendritic cells and melanocytes
  • blood vessel and microvessel cells such as endothelial cells and smooth muscle cells
  • epithelial cells of the airways
  • the transfection method or use of the complex or the pharmaceutical composition according to the invention for the transfection in vitro or ex vivo are characterized in that is brought into the complex or the composition in a medium containing cells to be transfected, under conditions such that the complex passes through the plasma membrane of the cells and releases the charged molecule of interest, in particular the nucleic acid, in particular the plasmid, in the cytoplasm and / or the nucleus of the cells.
  • the nucleic acid thus released into the cells is transcribed and the corresponding protein expressed in the cell.
  • the present invention further relates to a complex according to the invention for its use as a medicament.
  • the invention also encompasses a complex of the invention for use in the treatment of an inherited or acquired genetic disease.
  • Hereditary genetic disease is preferably a monogenic disease such as non-limiting way the syndromes of severe combined immunodeficiency (SCID), cystic fibrosis, hemophilia, sickle cell disease, beta-thalassemia and Duchenne muscular dystrophy.
  • the acquired genetic disease includes cancers and infections by pathogenic microorganisms such as, in particular, pathogenic bacteria, viruses or parasites.
  • FIG. 1 illustrates the principle of the formation of polyplexes according to the method of the invention, using as an example the monoplasmid polyplexes (MonoDNA).
  • Figure 2 illustrates the process for formulating polyplexes by plasmid extrusion.
  • FIG. 3 represents the dynamic light scattering analysis (DLS) of the diameter of the lambda folding DNA polyplexes and of linear unmodified polyethyleneimine (1-PEI) or modified with histidyl groups (1-PEI). histidine 16%), prepared according to the method of e trusion of the invention:
  • FIG. 4 represents transmission electron microscopy (TEM) images of mono-DNA polyplexes formed by extrusion of a plasmid solution of approximately 9500 base pairs in a solution of polycations of histidine grafted 1PEI (16% grafting) with DNA charge ratio: polymer of 1: 1. the pores used have a diameter of 50 nm and the extrusion pressure is 2 bar.
  • B CryoTEM image of polyplexes formulated in concentrated medium (2 ng / ml) of DNA). The scale bar represents 100 nm.
  • FIG. 5 represents the dynamic light scattering measurement of the diameter of the plasmid-based and cationic polymer-based mono-DNA polyplexes (1-PEI-listidine 16%) prepared according to the extrusion method of the invention, using increasing concentrations (0.1 to 2 mg / ml) of two plasmids (pDNA 1: 9.6 kb and pDNA 2: 5.9 kb).
  • FIG. 7 represents the measurement of the toxicity induced by the transfection of HeLa cells with polyplexes resulting from the complexation of DNA.
  • IPEI-His linear polyethylenimine, 11PEI (jetPEI®, POLYPLUS TRANSFECTION) and linear polyethylenimine histidyine (IPEI-His) as described in application WO 2009/1 12402 and marketed by POLYTHERAGENE: IPEI-His comprising 6, 14. 1 or 30% of histidylated momomers, also called PTG1 6 , PTGI 14 PTG1, 6, PTG1 3 o or IPEI-Histidine 6%, IPEI-Histidine 14%, IPEI-Histidine 16% and IPEI-Histidine 30%, respectively.
  • Linear phage lambda DNA (48 kb); 9.6 kb plasmid; 5.9 kb plasmid; pCMV-luc plasmid encoding the lamprey luciferase (Luc) gene (Photinus pyralis) under the control of the human cytomegalovirus promoter (CMV, pTG1 1033, 9514 bp Transgene S.A., France):
  • HeLa cells (CCL2, ATCC, Rockville MD, USA) are maintained in culture by regular passage in MEM medium (Gibco, Invitrogen S ARL, CergyPontoise, France) containing 10% heat-inactivated fetal calf serum. 2 m M 1-glutamine and 100 U / mL penicillin and 50 U / mL streptomycin (Gibco).
  • the extruder is pneumatic (LiposoFasl TM, AVESTIN).
  • the syringes and pre-filters in the extrusion system are cleaned with ethanol and then rinsed with doubly deionized water.
  • the porous polycarbonate membrane (Nuclepore TM; WHATMAN®) is previously dipped in ethanol few seconds and then in water to ensure the filling of the pores.
  • Syringes (with a capacity of 1 ml) are filled to a maximum of half. Thus after extrusion the volume will not exceed the capacity of the trans syringe.
  • the solutions of DNA and positive polyelectrolytes are placed in each syringe.
  • the pre-filter support of the extruder is inserted into the mouth of each syringe.
  • the porous membrane is placed without drying on one of the pre-filters and the two syringes are mounted on the pneumatic extruder.
  • the activation of the extruder injecting a solution into the other through the porous membrane.
  • the syringes are disassembled from the extruder and the formed polyplexes are recovered in the filled syringe.
  • DLS Dynamic Light Scattering
  • the polyplex solutions are diluted to 1 ml. solution and then analyzed by a Zetasizer Nano (MALVKRN, Malvern Instrument, France, Red laser: 633 nm, angle 173 °) using dynamic light scattering, based on particle scattering.
  • MALVKRN Malvern Instrument, France, Red laser: 633 nm, angle 173 °
  • a Quantifoil carbon grid (Jena, Germany) is ionized by electric discharge and 5 ⁇ of polyplexes are deposited there.
  • the grid is rapidly immersed in liquid emanate by a cryoplonger and then stored in liquid nitrogen before analysis.
  • the frozen sample is then introduced in a transmission electron microscope of JEOL Préci ion 201 1 by a cryogenic sample holder.
  • the polyplexes are imaged at 200 kV using a minimum exposure dose to keep the film intact and allow 50,000X magnification.
  • the photographs are digitized at 4000 dots per inch by a Nikon CoolScan scanner.
  • Cytotoxicity was determined by measuring the absorbance at 570 nm with a Victor I spectrophotometer (PerkinEImer, Courtaboeuf, France) and expressed as a percentage of the absorbance of cells incubated with the polyplexes with respect to the absorbance of cells incubated without polyplexes .
  • Transfection efficiency is quantified after 48 h of culture by measuring luciferase activity in cell lysates as follows.
  • the culture medium is removed and the cells are lysed at room temperature for 10 min in lysis buffer (1% Triton X-100, 25 mM Tris-phosphate, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, % glycerol, 1 mM MgCl2, pH 7.8).
  • the luciferase substrate (Beetle luciferin, Promega, Madison, USA) is added to the lysate supernatant in the presence of 1 mM ATP.
  • Luciferase activity was measured using a luminometer (Lumat LB 9507, Berthold, Thoiry, France) and expressed as RI / kg per ⁇ g protein after protein normalization using the BCA colorimetric assay and bovine serum albumin.
  • Monoplasmidic polyplexes were prepared according to the method described in Example 1, the principle and the implementation conditions of which are shown diagrammatically in FIGS. 1 and 2.
  • two compartments separated by a porous surface are respectively filled with a solution of DNA and cationic polymer.
  • the DNA is extruded to the cationic polymer solution. thus causing the condensation of the DNA macromolecules, one by one ( Figure 1).
  • the concentrations of plasmid DNA and polymer used in this work are listed in Figure 2.
  • extrusion pressure of 2 bar is sufficient to allow the linear DNA translocation of phage lambda (48 kb) to the turning radius of the order of 650 nm or tall plasmid, the through pores 50 nm in diameter.
  • the experiments carried out with the DNA of this virus showed that this DNA was capable of passing through a pore of approximately 50 nm (FIGS. 3a and 3b); this implies that a constraint is exerted on the molecule during the crossing. However, 90% of the DNA actually passes the pore.
  • the diameter of the pore was varied between 15 nm and 1000 nm, and it seems that the best pore diameter is around 50 nm, for the plasmids. It is likely that the pore diameter should be adapted to the size of the plasmid to be translocated. The nature of the membrane does not matter. By microscopy, plasmid molecules crossing the pores were visualized; at the conclusion of this study, it can be said that a single plasmid molecule passes the pore at a time.
  • TEM transmission negative electron microscopy
  • Polyplexes formed with PEI-His are smaller, more spherical, and contain DNA in amorphous form; on the contrary, those formed with PEI will be larger, non-spherical (appearance of bulges), and contain DNA in compacted form (may aggregate in the cytosol after transfection).
  • the polyplexes retain their shape, even 3 days after their formation; This indicates high stability of polyplexes prepared according to the extrusion method of the invention.
  • the polyplexes produced by the standard method are unstable (only a few hours) and must be used quickly after their preparation.
  • the nanoparticles prepared according to the extrusion method described in Example 1 were used to perform transfection tests on Hela cells according to a 4-hour incubation protocol, followed by 48 hours of culture (formulation conditions: pores: 50 nm, P: 2 bar). The transfection results are reported in Figure 6.
  • DLS Dynamic Light Scattering
  • the DNA formulation method proposed in this study makes it possible to obtain monoplasmid polyplexes having in vitro transfection levels equivalent to those obtained in the case of standard formulation.
  • the resulting nanoparticles appear to be heart-crown type, which is important for a question of targeting and stealth in in vivo applications.
  • the calculated toxicity is lower than in the case of a conventional formulation, and it can be expected that this type of formulation limit questions of pulmonary embolism during IV injection in mice, and therefore a significant decrease in vivo toxicity.

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Abstract

L'invention est relative à un procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, en particulier de polyplexes comprenant un polymère cat ionique et une seule molécule d'acide nucléique, notamment un plasmide. La présente invention concerne également les complexes obtenus par le procédé et leur utilisation pour la transfection in vitro, ex vivo et in vivo de molécules d'intérêt chargées, en particulier des molécules thérapeutique, telles que notamment des acides nucléiques.

Description

PREPARATION DE POLYPLEXES MONOPLASMIDÏQUES
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, en particulier de polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique, notamment un plasmide, tels que des polyplexes mo no pl as m i d i q ues . La présente invention a également pour objet les complexes obtenus par le procédé. Particulièrement, la présente invention a pour objet des polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d "acide nucléique et leur utilisation pour la transfection in vitro, ex vivo et in vivo de molécules d'intérêt chargées, en particulier de molécules thérapeutique, telles que notamment des acides nucléiques.
Les stratégies utilisées en thérapie génique pour introduire un gène médicament dans les cellules font appel à des virus modifiés encore appelés vecteurs viraux. Ces vecteurs posent un certain nombre de problèmes pour leur application en toute sécurité chez l'homme. Il existe également des méthodes physiques telles que Γ é I ce troperméati on et l'utilisation, des ultrasons ou sonoporation.
Les vecteurs chimiques ( lipides cationiques et polymères cationiques) pourraient à priori remplacer les vecteurs viraux car moins immunogènes et de plus faible coût de fabrication. Il a été montré depuis près de vingt ans qu'il est possible d'utiliser un polymère cationique, telle que la polylysine, la polyéthylènimine ou le chitosan pour condenser un acide nucléique (polynueléotide tel que notamment un ADN plasmidique ou un A N) et former une particule qui pourra ensuite être utilisée pour véhiculer le polynueléotide vers l'intérieur de la cellule. Par exemple, la Demande WO 2009/1 12402 et Bertrand et al, Chem. Commmun.. 201 1 , 14, 12547- 12549 décrivent des polymères linéaires de polyéthylènimine, modifiés par des résidus d'histidine. qui ont une bonne efficacité de transfection et une toxicité cellulaire faible.
L'utilisation de polymères cationiques pour la transfection de cellules repose sur la formation de complexes électrostatiques entre un polymère cationique et un acide nucléique, dénommés polyplexes. La méthodologie classiquement utilisée pour préparer des polyplexes consiste à ajouter une solution de polymère cationique dans une solution contenant le plasmide ADN, et les particules se forment spontanément. L'optimisation de polyplexes est assurée par la variation du rapport N/P, exprimant le nombre de charges positives (N pour azote) par molécule de polymère rapporté au nombre de charges négatives (P pour phosphate) par molécule d'ADN. Les particules sont caractérisées par leur diamètre hydrodynamique moyen et leur charge de surface ou potentiel zêta. Les particules ont un diamètre moyen généralement supérieur à 100 nm et sont constituées de plusieurs (3 à 4) molécules de plasmides (Gamme et al , Biophysical Journal, 2003, 84, 1960-1968 ; Mi d ux et al, Somatic Ce 11 and Molecular Genetics. 2002, 27, 27-47).
Lors de la préparation de ces particules par cette méthode, le rapport de charge N/P entre le polycation et le polyanion évolue puisque le polycation est versé dans la solution de polyanion. N/P est initialement intérieur à 1 , puis augmente jusqu'à la neutralisation (N/P autour de 1) pour atteindre une valeur finale de N/P voisine de 3 ou 6 selon les formulations. Ainsi, le procédé de formulation « remonte » le diagramme de phase proposé par Mengarelli, V (Complexes de polyélectrolytes de charge opposée : des polymères synthétiques à la thérapie génique ; Thèse de doctorat en Physique, Université de Paris-sud XI, Orsay, 2009), et passe systématiquement par le point N/P ( ou X) = 0, zone de précipitation, observée à partir d'une concentration, généralement de l'ordre du pg^L, Ainsi les polyplexes sont généralement formés à une concentration en ADN bien inférieure à celle nécessaire pour des études in vivo et ce quelques soient les modes d'administration. Les polyplexes ainsi générés ont donc des diamètres généralement supérieurs à 100 nm permettant d'envisager leur utilisation in vitro, mais rendant leur utilisation in vivo impossible du fait des risques de toxicité sévères. De plus les polyplexes ainsi formés sont instables en présence de solution saline telle que le sérum physiologique : ils forment rapidement des agrégats pouvant atteindre la taille de 1 μηι.
Pour éviter les problèmes de précipitation observés aux concentrations élevées d'ADN, il a été proposé de préparer des polyplexes selon le procédé standard, avec des concentrations d'ADN inférieures à celles induisant la formation d'agrégats (solution très peu saline) puis de concentrer les polyplexes. Toutefois, cette méthode conduit le plus souvent à la formation d'agrégats.
En vue d'applications de transfert de gènes in vivo, il est donc indispensable de disposer de nouveaux procédés de formulation des polyplexes permettant de préparer des nanoparticules de faible diamètre (<100 nm), stables en milieu salin, pour des concentrations élevées d'ADN et de polymère.
La réduction de la taille des particules doit faciliter tant la biodistribution dans l'organisme que la pénétration dans la cellule et le trafic intracellulaire vers la délivrance nucléaire.
En effet, il a été démontré que le processus d'internalisation de particules dans une cellule peut être directement corrélé aux tailles de ces particules : des particules de diamètre faible sont plus facilement internalisées que des particules de diamètre élevé. L'entrée des polyplexes dans le cytoplasme qui se fait généralement par endocytose clathrine ou cavéoline dépendante, implique que le diamètre des polyplexes soit inférieur à la taille de l'endosome (environ 100 nm).
La taille élevée des polyplexes tient en partie au fait que ces complexes sont formés avec plusieurs molécules d'ADN plasmidique. Une façon de diminuer celle-ci est de contrôler le processus de formation de particules de façon à ce qu'elles contiennent une seule molécule d'ADN plasmidique.
Des polyplexes monoplasmidiques n'ont jamais été obtenus en milieu concentré avec des polymères cationiques. De tels polyplexes n'ont été obtenus qu'à deux reprises, et uniquement en utilisant une formulation à base de lipides (Chittimalla et al , JACS, 2005, 127, 11436-1 1441 ; Rudorf, J. O. Radier, JACS, 2012, 134, 1 1852-11858).
La formation de polyplexes monoplasmidiques utilisables en thérapie reste donc un challenge.
Les inventeurs ont mis au point un procédé original de préparation de polyplexes qui permet avantageusement de produire des polyplexes monoADN à base d'ADN et de polymère cationique tout en s 'affranchissant des problèmes de précipitation rencontrés avec le procédé standard de préparation de polyplexes de l'art antérieur. De façon générale, ce procédé est utilisable pour produire des polyplexes à base de polymère(s) chargé(s) positivement (polymèrefs) cationique(s)) ou négativement (polymère(s) anionique(s)) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée (polyélectrolyte négatif ou positif), notamment un seul acide nucléique.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'au moins un complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
- la distribution d'une solution de molécules d'intérêt chargées dans un premier compartiment séparé d'un deuxième compartiment par une surface poreuse, et ledit deuxième compartiment comprenant une solution de polymère(s) de charge opposée, et
- l'extrusion des molécules d'intérêt chargées, une à une, au travers de ladite surface poreuse vers la solution de polymère de charge opposée pour former des complexes entre le(s) polymère(s) chargé(s) et une seule molécule d'intérêt de charge opposée.
Le principe du procédé est illustré dans les figures 1 et 2.
Le procédé de préparation de polyplexes comprenant: une seule molécule d'intérêt selon l'invention présente les avantages suivants par rapport au procédé classique de préparation de polyplexes :
11 permet d'obtenir des nanoparticules de taille comprise entre 50 n m et 100 nm, préférentiellement 50 nm.
il permet de s'affranchir des questions relatives au diagramme de phase du mélange polyélectrolyte positif/polyéîectrolyte négatif, notamment, ADN/polymère cationique, et donc du passage de la zone de précipitation pour laquelle il est observé une floculation des complexes, généralement autour de N/P=l, qui les rend impropres à une utilisation biologique.
Chaque molécule d'intérêt chargée, par exemple un plasmide, est condensée de façon unique et indépendante, rendant les questions de concentration de formulation caduques : il est alors possible d'envisager la formation de polyplexes comprenant une seule molécule d'intérêt quelle que soit la taille de la molécule d'intérêt, notamment du plasmide et la concentration à laquelle elle est formulée. Cette observation est particulièrement importante pour envisager des applications thérapeutiques pour lesquelles les molécules à délivrer dans les cellules, notamment les plasmides, sont de taille élevée, voire voisine de 20 kbp.
Ce mode de formulation peut s'appliquer à n'importe quel type de polymère chargé (anionique ou cationique). La quantité de polymère(s) chargé(s)nécessaire à la réalisation d'un polyplexe selon l'invention est fortement diminuée, ce qui a pour effet de diminuer la quantité de polyélectrolyte chargé, notamment de polyélectrolyte positif, souvent toxique, injectée lors de transfection in vivo.
Les polyplexes obtenus par le procédé selon l'invention ont des applications très variées dans tous les domaines mettant en œuvre le transfert de molécules dans les cellules, notamment de gènes, à l'aide de vecteurs synthétiques, tels que de façon non-limitative le domaine de l'imagerie cellulaire, du diagnostic, de la thérapie, notamment la thérapie géniquc et la médecine régénérative, et de la bioproduction. Dans le cadre de la thérapie géniquc, les pathologies concernées sont extrêmement nombreuses, elles concernent aussi bien les maladies génétiques (Mucoviscidose, Dystrophie musculaire de Duchenne... ) ou acquises (cancer, infections par des microorganismes pathogènes notamment des virus). Dans le cadre de la bioproduction, la méthode de formulation selon l'invention, en permettant d'éviter la formation d'agrégats en milieu concentré, constitue un débouché très important pour les polymères chargés, en particulier les polymères cationiques. La question de reproductibilité des formulations est peu discutée dans la littérature scientifique mais ce procédé présente l'avantage d' une standardisation des formulations, conduisant à une meilleure reproductibilité des résultats.
La membrane poreuse utilisée dans le procédé selon l'invention est constituée d'un matériau adapté à l'extrusion. De préférence, il s'agit d'une membrane de polycarbonate. Ladite membrane comprend avantageusement des pores d'une taille de 5 à 200 nm, de préférence de 10 à 50 nm (10, 20, 30, 40 ou 50 nm), de manière encore plus préférée de 50 nm.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'extrusion est réalisée à une pression de 10 m bar à 3 bars, de préférence de 100 mbar à 2 bars, notamment 100 mbar, 500 m Bar ou 2 bars, de manière encore plus préférée de 1 à 2 bars.
La vitesse du flux au travers de la membrane est imposée par la taille des pores et la pression.
Le procédé de l'invention peut être mis en œuvre avec des concentrations variables de molécule d'intérêt chargée, notamment d'acide nucléique (premier compartiment), aussi bien faibles qu'élevées, comme le démontre les exemples de la présente Demande qui ont été réalisées avec des concentrations d'acide nucléique variant d'un facteur 1 à 200 (10
Figure imgf000007_0001
Les proportions respectives du polymère et de la molécule d'intérêt, notamment du polymère cationique et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport massique ^g^g) entre le polymère et la molécule d'intérêt, notamment l'acide nucléique, soit de 2 à 6
Figure imgf000007_0002
La présente invention a également pour objet un complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, obtenu ou susceptible d'être obtenu par le procédé selon Γ invention. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un complexe de polymère(s) chargé(s) positivement (polymère(s) cationique(s)) et d'une seule molécule d'acide nucléique.
Le complexe selon l'invention, dénommé également polyplexe, est formé par des associations, notamment électrostatiques, entre la molécule d'intérêt chargée et le(s) polymère(s) de charge opposée, notamment le(s) polymère(s) cationique(s) comprenant des charges positives et la molécule d'acide nucléique comprenant des charges négatives.
Un polyplexe contenant de l'ADN est dénommé polyplexe mono ADN ; lorsque l'ADN est un plasmide. il s'agit alors d'un polyplexe monoplasmidique.
Le polymère chargé englobe tous les polymères cationiques ou anioniques et les co-polymères possédant un bloc cationique ou anionique, utilisables pour transfccter des cellules in vitro, ex vivo ou in vivo. Il s'agit notamment de polymères cationiques ou de co-polymères possédant un bloc cationique. tels que par exemple, la polylysine, la polyéthylénimine, le chitosan et leurs dérivés.
Le polymère chargé est avantageusement un polymère cationique, de préférence une polyéthylèneimine linéaire, de manière préférée une polyéthylèneimine linéaire partiellement histidinylée (IPEI-His), de manière encore plus préférée dans laquelle 5% à 25 %, plus préférentiellement 16%, des monomères totaux sont hislidinylés ; de tels copolymères sont décrits dans la Demande WO 2009/112402.
La molécule d'intérêt chargée est capable de former une particule avec le ou les polymère(s) de charge opposée. Il s'agit d'un polyélectrolyte positif ou négatif, notamment une molécule utilisée pour le diagnostic, la thérapie ou l'imagerie cellulaire/tissulaire.
La molécule d'intérêt chargée est en particulier un acide nucléique, notamment une molécule d'ADN, d'ARN ou mixte ADN/ARN, simple-brin, double- brin (en totalité ou partiellement), linéaire ou circulaire, naturelle, recombinante, synthétique ou semi-synthétique, incluant les acides nucléiques modi iés au niveau de la partie sucre et/ou ou base de leurs nucléotides, et/ou de leurs liaisons inlernucléotidiques, par exemple du type morpholino ou PNA.
L'acide nucléique est avantageusement un ADN ou un ARNm comprenant une séquence codant pour un polypeptide ou une protéine d'intérêt, notamment thérapeutique: un ADN ou ARN antisens, un ARN interférant ou un ribozyme comprenant une séquence complémentaire d'un gène d'intérêt, notamment thérapeutique; un ADN codant les ARN précédents. De préférence, ledit acide nucléique comprend les éléments permettant son expression dans la cellule ou l'organisme hôte, à savoir des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction (promoteur. polyA). Il peut être également incorporé dans un vecteur tel qu'un vecteur plasmidique.
Parmi les acides nucléiques d'intérêt thérapeutique, on peut citer la forme non-mutee et par conséquent fonctionnelle des gènes impliqués dans les maladies héréditaires, notamment les maladies héréditaires monogéniques, ainsi que les acides nucléiques codant pour des antigènes de microorganismes ou des antigènes tumoraux.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'acide nucléique est un ADN, de préférence un plasmide.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit acide nucléique est un acide nucléique d'intérêt thérapeutique.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le complexe selon l'invention est une particule de taille inférieure à 100 nm, de préférence inférieure à 70 nm. Il s'agit notamment d'une particule de 10 à 70 nm, de préférence de 30 à 70 nm, de manière préférée d'environ 50 nm. De préférence, ladite particule est un polyplexe d'acide nucléique, de manière préférée un polyplexe monoplasmidique. L'invention englobe les particules chargées négativement ou positivement, telles que notamment des particules inorganiques ou magnétiques.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention et éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont les excipients classiques bien connus de l'Homme du métier.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre composé, notamment un principe actif d'un médicament ou un adjuvant capable de s'associer au complexe polymère/acide nucléique selon l'invention et d'améliorer le pouvoir transfectant dudit complexe. Selon un mode de réalisation avantageux, le complexe ou la composition de l'invention comprennent un élément ou agent de ciblage permettant d'orienter le transfert de la molécule d'intérêt chargée, notamment l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités, par exemple des cellules tumorales, hépatiques, immunitaires ou hématopoïétiques. Il peut s'agir également d'un élément de ciblage intracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés, par exemple le noyau, les microtubules ou les rnitochondries.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides oiigonucléotides, les lipides ou les protéines. Avantageusement, il s'agit de sucres, de peptides ou de protéines, tels que de façon non-limitative : des anticorps ou fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou des fragments de récepteurs.
En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de cytokines. de lectines cellulaires ou de protéines d'adhésion. On peut également citer le récepteur de la transferrine, des HDL et des LDL. L'élément de ciblage peut également être la partie sucre permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immunoglobulines. L'élément de ciblage est avantageusement lié au complexe selon l'invention, de façon directe ou indirecte, par l'intermédiaire de liaisons covalentes et/ou non-covalentes, selon les techniques standards connues de l'homme du métier. De préférence, l'agent de ciblage est fixé sur le polymère cationique ou anionique de façon à être exposé à la surface du polyplexe selon l'invention, en particulier un polyplexe MonoADN, pour obtenir une efficacité de ciblage maximale du complexe selon l'invention.
Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie orale, parentérale. notamment intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, sublinguale ; locale, notamment topique, transdermique, rectale, vaginale, intraoculaire, intranasaie ; intratumorale, ou par inhalation.
De préférence, les compositions pharmaceutiques de l' invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, pour une administration par inhalation (aérosol), ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir de solutions stériles isotoniques ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettant la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée.
Les complexes et compositions selon l'invention peuvent être utilisés pour le transfert de molécules d'intérêt chargées, notamment d'acides nucléiques dans les cellules in vivo, in vitro ou ex vivo. En particulier, du fait de leur toxicité réduite et de leur efficacité de transfection. les complexes selon l'invention peuvent être utilisés pour transférer de manière efficace des acides nucléiques dans de nombreux types cellulaires habituellement difficiles à transfecter, notamment des lignées cellulaires primaires et des cellules fragiles, particulièrement sensibles à la toxicité des agents de transfection. Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un complexe selon la présente invention pour transfecter des cellules, in vitro ou ex vivo.
La présente invention a également pour objet un procédé pour transférer in vitro ou ex vivo une molécule d'intérêt chargée, notamment un acide nucléique, en particulier un plasmide, dans des cellules, ledit procédé comprenant la mise en contact desdites cellules avec au moins un complexe selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention.
Les cellules peuvent être d'origine procaryote ou eucaryote, en particulier animale, végétale ou humaine.
Avantageusement, les cellules sont des cellules de mammifères, de façon avantageuse choisies parmi : des cellules souches hématopoïétiques, des cellules du système immunitaire, telles que des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes ; des cellules du foie ; des cellules des muscles squelettiques ; des cellules de la peau telles que des fibroblastes, des kératinocytes, des cellules dendritiques et des mélanocytes ; des cellules des vaisseaux et microvaisseaux sanguins, telles que des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses ; des cellules épithéliales des voies aériennes ; des cellules du système nerveux central ; des cellules cancéreuses ; des cellules du tissu conjonctif, telles que des ténocytes.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la méthode de transfection ou l'utilisation du complexe ou de la composition pharmaceutique selon l'invention pour la transfection in vitro ou ex vivo se caractérisent en ce que l'on met en présence le complexe ou la composition dans un milieu contenant des cellules à transfecter, dans des conditions telles que le complexe passe au travers de la membrane plasmique des cellules et libère la molécule d'intérêt chargée, notamment l'acide nucléique, en particulier le plasmide, dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. L'acide nucléique ainsi libéré dans les cellules est transcrit et la protéine correspondante exprimée dans la cellule.
La présente invention a en outre pour objet un complexe selon l'invention pour son utilisation comme médicament.
L'invention englobe également un complexe selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une maladie génétique héréditaire ou acquise. La maladie génétique héréditaire est de préférence une maladie monogénique telle que de façon non-limitative les syndromes de déficit immunitaire combiné sévère (SCID), la mucoviscidose, l'hémophilie, la drépanocytose, la béta-thalassémie et la dystrophie musculaire de Duchenne. La maladie génétique acquise inclut les cancers et les infections par des microorganismes pathogènes tels que notamment des bactéries, virus ou parasites pathogènes.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre le principe de la formation de polyplexes selon le procédé de l'invention, en utilisant comme exemple les polyplexes monoplasmidiques (MonoADN).
la figure 2 illustre le procédé de formulation des polyplexes par extrusion de plasmide.
- la figure 3 représente l'analyse par diffusion dynamique de la lumière (DLS) du diamètre des polyplexes d'ADN du pliage lambda et de polyéthyléneimine linéaire, non modifiée (1-PEI) ou modifiée par des groupements histidyles (1-PEI-Histidine 16 %), préparés selon le procédé d' e trusion de l'invention :
-figure 3a. Diamètre des polyplexes en fonction du diamètre des pores de la membrane d" extrusion (15 nm à 1000 nm), à une pression de 120 m bars.
-figure 3b. Diamètre des polyplexes en fonction du diamètre des pores de la membrane d'extrusion ( 15 nm à 1000 nm), à une pression de 2 bars.
-figure 3c. Diamètre des polyplexes en fonction du rapport massique ^ *g) entre le polymère et l'ADN, N/P (1 à 6), à une pression de 2 bars, en utilisant une membrane d'extrusion avec des pores de 50 nm.
- la figure 4 représente des images de microscopie électronique en transmission (TEM) de polyplexes monoADN formés par extrusion d'une solution de plasmide d'environ 9500 paires de bases dans une solution de polycations de 1PEI greffée histidine (16% de greffage) avec un rapport de charge ADN : Polymère de 1 : 1. Les pores utilisés ont un diamètre de 50 nm et la pression d'extrusion est de 2 bars. A. images de TEM en coloration négative des polyplexes formulés en milieu dilué (0,1 g/ L d'ADN). La barre d'échelle sur l'image de gauche représente 50 mu. La barre d'échelle sur l'image de droite représente 150 nm. L'image du polyplexe montre en clair les parties anioniques et en foncé les parties cationiques. B. image de CryoTEM des polyplexes formulés en milieu concentré (2 ng/).iL d'ADN). La barre d'échelle représente 100 nm.
- la figure 5 représente la mesure par diffusion dynamique de la lumière du diamètre des polyplexes monoADN à base de plasmide et de polymère cationique (1-PEI-I listidine 16 %) préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention, en utilisant des concentrations croissantes (0,1 à 2 mg/ml) de deux plasmides (ADNp 1 : 9,6 kb et ADNp 2 : 5,9 kb).
- la figure 6 représente la mesure de l'activité luciférase (RLU) après transfection de cellules Hela avec des polyplexes MonoADN préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention, en utilisant un plasmide de 9500 paires de base (2.5 ng) codant pour la luciférase (pCMVLuc) et différents polymères cationiques : polyéthylénimine linéaire comprenant 0, 6 ou 14 % de momomères histidylés (IPEI, 6 % ou 14 %), avec un rapport N/P (rapport massique (μ^μ^) entre le polymère et l'ADN) variable, compris entre 1 et 6, par comparaison avec des polyplexes obtenus par le procédé de formulation standard (N/P=6).
- la figure 7 représente la mesure de la toxicité induite par la transfeclion de cellules HeLa avec des polyplexes issus de la complexation de l'ADN
(2.5pg ou 5,ug) par plusieurs types de polymères cationiques : polyéthylénimine linéaire non-modifiée (IPEI) et polyéthylénimine linéaire comprenant 6 ou 14 % de momomères histidylés (ÎPEI-Histidine 6 % et ÎPEI-Histidine 14 %), selon la formulation standard (rapport massique (μg/μg) entre le polymère et l'ADN, N/P =6 et la formulation par extrusion (rapport massique (μ^μ ) entre le polymère et l'ADN, N/P=3)
EXEMPLE 1: MATERIELS ET METHODES
1) Matériels
- Polymères cationiques
Deux polymères cationiques standards ont été testé:
- polyéthylénimine linéaire, 11PEI (jetPEI®, POLYPLUS TRANSFECTION) et - polyéthylénimine linéaire histidyîée (IPEI-His) telle que décrite dans la Demande WO 2009/1 12402 et commercialisée par POLYTHERAGENE : IPEI-His comprenant 6, 14. 1 ou 30% de momomères histidylés, également dénommée PTG16, PTGÎ 14 PTGl ,6, PTGl3o ou IPEI-Histidine 6 %, IPEI-Histidine 14 %, IPEI-Histidine 16 % et IPEI-Histidine 30 %, respectivement.
- Acides nucléiques
ADN linéaire de phage lambda (48 kb) ; plasmide de 9,6 kb ; plasmide de 5.9 kb ; plasmide pCMV-luc codant pour le gène de la luciferase (Luc) de lampyre (Photinus pyralis) sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain (CMV ; pTGl 1033, 9514 bp. Transgène S.A.. Strasbourg, France) :
- Cellules
Les cellules HeLa (CCL2, ATCC, Rockvillc MD, USA) sont maintenues en culture par passage régulier clans du milieu MEM (Gibco. Invitrogen S ARL, CergyPontoise, France) contenant 10% de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur. 2 m M 1-glutamine et 100 U/mL de pénicilline et 50 U/mL de streptomycine (Gibco).
2) Méthodes
- Extrusion du plasmide dans la solution de polymère cationique
L'extrudeuse est de type pneumatique (LiposoFasl™ ; AVESTIN). Les seringues et pré-filtres support du système d'extrusion sont nettoyés par sinisation dans l'éthanol puis rincés à l'eau doublement dé-ionisée. La membrane poreuse en polycarbonate (Nuclepore™ ; WHATMAN®) est préalablement trempée dans l'éthanol quelques secondes puis dans l'eau afin d'assurer le remplissage des pores. Les seringues (d'une contenance de lmL) sont remplies au maximum jusqu'à moitié. Ainsi après extrusion le volume ne dépassera pas la contenance de la seringue trans. Les solutions d'ADN et de polyélectrolytes positifs sont placées dans chaque seringue. Les pré-filtres support de l'extrudeuse sont insérés dans l'embouchure de chaque seringue. La membrane poreuse est placée sans la sécher sur l'un des pré-filtres et les deux seringues sont montées sur l'extrudeuse pneumatique. L'activation de l'extrudeuse, injecte une solution dans l'autre au travers de la membrane poreuse. Puis les seringues sont démontées de l'extrudeuse et les polyplexes formés sont récupérés dans la seringue remplie. - Mesure de la taille des particules par Diffusion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering)
Les solutions de polyplexes sont diluées de façon à obtenir 1 ml. de solution puis analysées par un Zetasizer Nano (MALVKRN. Malvern Instrument, France, Laser rouge : 633 nm, angle 173°) utilisant la diffusion de la lumière dynamique, d'après la diffusion des particules.
- Analyse des particules par microscopie électronique en transmission (TEM pour Transmission Electron Microscopy)
CryoTEM
Une grille de carbone Quantifoil (Jena, Allemagne) est ionisée par décharge électrique et 5 μΐ, de polyplexes y sont déposés. La grille est rapidement imergée dans de l'émane liquide par un cryoplongeur puis stockée dans l'azote liquide avant analyse. L'échantillon congelé est alors introduit dans un microscope électronique à transmission de préci ion JEOL 201 1 par un porte échantillon cryogénique. Les polyplexes sont imagés à 200 kV en utilisant une dose d'exposition minimale pour garder le film intact et permettre un grossissement de 50,000X. Les photographies sont digitalisées à 4000 points par pouce par un scanner Nikon CoolScan.
- Visualisation des molécules d 'ADN franchissant les pores
La méthode utilisée est celle précédemment décrite (Auger et al. ,
Physical Review Letters ; 9 juillet 2014, 1 13. 028302.1-5).
- Test de cytotoxicité (MTT)
Après incubation des cellules avec les polyplexes pendant 48h, 100 μΐ d'une solution de 3 (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) à 5 m g/ml dans du PBS sont ajoutés par puits de culture, et les cellules sont incubées pendant 4 h à 37 °C. Le MTT qui a été converti en formazan est solubilisé par la suite avec de l'isopropanol acide. La cytotoxicité a été déterminée en mesurant l'absorbance à 570 nm avec un spectrophotomètre Victor I (PerkinEImer, Courtaboeuf, France) et exprimée en pourcentage de l 'absorbance des cellules incubées avec les polyplexes par rapport à l'absorbance des cellules incubées sans polyplexes. - Test de mesure de l 'activité luciférase
L'efficacité de transfection est quantifiée après 48 h de culture en mesurant l'activité de la luciférase dans les lysats cellulaires comme suit. Le milieu de culture est éliminé et les cellules sont lysées à la température ambiante pendant 10 min dans du tampon de lyse (1% de Triton X-100, 25 m M de Tris-phosphate, 1 mM de DTT, 1 mM EDTA, 15% glycérol, 1 mM MgC12, pH 7.8). Le substrat de la luciférase (Beetle luciférine, Promega, Madison, USA) est ajouté au surnageant de lysat en présence de 1 m M d'ATP. L'activité luciférase est mesurée en utilisant un luminomètre (Lumat LB 9507, Berthold. Thoiry. France) et exprimée en RI .IJ par m g de protéine après normalisation des protéines en utilisant le test colorimétrique BCA et la sérum-albumine bovine.
EXEMPLE 2 : PREPARATION DE POLYPLEXES MONO-ADN
Des polyplexes monoplasmidiques ont été préparés selon la méthode décrite à l'exemple 1 dont le principe et: les conditions de mise en œuvre sont schématisés sur les figures 1 et 2. Typiquement, deux compartiments séparés par une surface poreuse sont respectivement remplis d'une solution d'ADN et de polymère cationique. L'ADN est extradé vers la solution de polymère cationique. provoquant ainsi la condensation des macromolécules d'ADN, une à une (Figure 1). Les concentrations d'ADN plasmidique et de polymère utilisées dans ce travail sont répertoriées sur la figure 2.
11 a été montré qu'une pression d'extrusion de 2 bars est suffisante pour permettre la translocation d'ADN linéaire du phage lambda (48 kb) au rayon de giration de l'ordre de 650 nm ou de plasmide de taille élevée, au travers de pores de 50 nm de diamètre. Les expériences réalisées avec l'ADN de ce virus ont montré que cet ADN était capable de passer à travers un pore d'environ 50 nm (figure 3a et 3b) ; ceci implique qu'une contrainte est exercée sur la molécule lors du franchissement. Cependant, 90% de l'ADN passe effectivement le pore.
Le diamètre du pore a été varié entre 15 nm et 1000 nm, et il semble que le meilleur diamètre de pore soit autour des 50 nm, pour les plasmides. Il est probable que le diamètre des pores doive être adapté à la taille du plasmide à transloquer. La nature de la membrane importe peu. Par microscopie, des molécules de plasmide franchissant les pores ont été visualisées ; en conclusion de cette étude, on peut affirmer qu'une unique molécule de plasmide passe le pore à la fois.
La caractérisation en imagerie par microscopie électronique en transmission (TEM) en coloration négative a démontré que ces polyplexes sont formés d'un coeur riche en ADN (en clair les parties anioniques ) et une couronne riche en polycations (en foncé les parties cationiques) (Figure 4). En outre, la taille mesurée du polyplexes est inférieure à celle théorique de deux molécules de plasmide condensées, indiquant que les polyplexes comprennent une seule molécule de plasmide par nanoparticule.
En variant les rapports N / P (rapports en masse de polymère / ADN, il a été observé que les polyplexes conservaient une taille constante, attestant de l'avantage de la méthode d'extrusion (figure 3c).
De même, en faisant varier la concentration en ADN plasmi clique, on obtient des polyplexes de taille comparable (figures 4 et 5).
Les polyplexes formés avec du PEI-His sont plus petits, plus sphériques, et contiennent de l'ADN sous forme amorphe ; au contraire, ceux formés avec du PEI seront plus gros, non-sphcriques (apparition de renflements), et contiennent de l'ADN sous forme compactée ( peut s'agréger dans le cytosol après la transfection).
Les polyplexes conservent leur forme, même 3 jours après leur formation; ceci indique une grande stabilité des polyplexes préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention. Par comparaison, les polyplexes produits par le procédé standard sont peu stables (quelques heures seulement) et doivent donc être utilisés rapidement après leur préparation.
EXEMPLE 3 : TRANSFECTION IN VITRO AVEC LES POLYPLEXES MONO-ADN
Les nanoparticules préparées selon le procédé d'extrusion décrit à l'exemple 1 ont été utilisées pour effectuer des tests de transfection sur des cellules Hela selon un protocole d'incubation de 4 heures, suivi de 48h de culture (conditions de formulation : pores : 50 nm ; P : 2 bars). Les résultats de transfection sont reportés sur la figure 6. Les polyplexes utilisés dans cette étude avaient différents rapports rapport massique (μg/μg) entre le polymère et l'ADN, N/P = 1, 2, 3 et 6). Les transfections sont évaluées par rapport au mode de formulation standard avec un rapport 1/6.
On observe que les diamètres moyens des nanoparticules mesurés par Diffusion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering) sont inférieurs à 60 nm pour N/P = 6, quel que soit le polymère cationique utilisé. Ce diamètre est maintenu lorsque l'on diminue le rapport N/P jusqu'à 3 sauf pour la 1PEI, et tend vers des valeurs proches de 150 nm pour N/P =1. De façon très surprenante, aucune précipitation n'est observée lorsque N/P=l , ce qui confirme les observations faites par TEM, à savoir des particules non-homogènes probablement de type cœur- couronne. Les niveaux de transfection des polyplexes monoplasmidiques sont de l'ordre de ceux obtenus dans le cas d'une formulation standard, ce qui est tout à fait performant sauf pour la 1PEI avec laquelle les transfections sont moins efficaces.
L'évaluation de la toxicité des formulations menée avec des polyplexes obtenus par formulation classique et des polyplexes obtenus par formulation par extrusion a été conduite par le test M IT (Figure 7).
Les résultats obtenus sur différents polymères, à différentes concentration en ADN montrent que les polyplexes monoplasmidiques sont moins toxiques que les nanoparticules issues de formulations standard.
D'un point de vue général, la toxicité induite par les polyplexes monoplasmidiques est significativement inférieure à celle des polyplexes standards, ouvrant de nouvelles perspectives pour le transfert de gènes in vivo.
EXEMPLE 4 : TRANSFECTION IN VIVO AVEC LES POLYPLEXES MONO- ADN
Des études in vivo ont également été menées pour évaluer l'efficacité de transfection des polyplexes produits par la méthode de l'invention. Des polyplexes contenant 40n de plasmide codant pour la Luciférase ont été préparés selon le procédé décrit à l'exemple 1 , puis injectés dans la veine caudale de souris. L'injection de Luci férine permet alors de détecter les cellules qui ont été transfectées et expriment le gène luciférase. Les résultats de ces expériences montrent que les particules vont en majorité dans les poumons (capillaires fins), mais également dans la rate ou la vessie (prise en charge par le système de détoxification). Conclusions
La méthode de formulation d'ADN proposée dans cette étude permet d'obtenir des polyplexes monoplasmidiques ayant des niveaux de transfection in vitro équivalents à ceux obtenus dans le cas de formulation standard. Les nanoparlicules obtenues semblent être de type cœur-couronne, ce qui est important pour une question de ciblage et de furtivité dans les applications in vivo. La toxicité déterminée est plus faible que dans le cas d'une formulation classique, et on peut s'attendre à ce que ce type de formulation limite les questions d'embolie pulmonaire lors d'injection IV dans les souris, et donc une diminution significative de la toxicité in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de complexes de polymère(s) cationique(s) et d'une seule molécule d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
- la distribution d'une solution de molécules d'acide nucléique dans un premier compartiment séparé d'un deuxième compartiment par une surface poreuse, et ledit deuxième compartiment comprenant une solution de polymère(s) cationique(s), et
- 1 "extorsion des molécules d'acide nucléique, une à une. au travers de ladite surface poreuse vers la solution de polymère(s) cationique(s) pour former des complexes entre le(s) polymère(s) cationique(s) et une seule molécule d'acide nucléique.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit polymère cationique est une polyéthylèneimine linéaire.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite polyéthylèneimine est partiellement histidylée.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la dite surface est une membrane comprenant des pores d'une taille de 5 à 200 nm.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. caractérisé en ce que l'extrusion est réalisée à une pression comprise entre 10 mbar et 3 bars.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. caractérisé en ce que ledit acide nucléique est un plasmide.
7. Complexe de polymère(s) cationique(s) et d'une seule molécule d'acide nucléique, caractérisé en ce que ledit polymère cationique est une polyéthylèneimine linéaire.
8. Complexe de polymère(s) cationique(s) et d'une seule molécule d'acide nucléique, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6.
9. Complexe selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que ladite polyéthylèneimine est partiellement histidylée.
10. Complexe selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est un plasmide.
1 1. Complexe selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une particule de taille inférieure à 70 nm.
12. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 7 a 1 1 pour transfecter des cellules, in vitro ou ex vivo.
13. Complexe selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 , destiné à être utilisé comme médicament.
14. Complexe selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 , destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie génétique ou acquise
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