WO2016039278A1 - 分泌腺の製造方法 - Google Patents

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WO2016039278A1
WO2016039278A1 PCT/JP2015/075286 JP2015075286W WO2016039278A1 WO 2016039278 A1 WO2016039278 A1 WO 2016039278A1 JP 2015075286 W JP2015075286 W JP 2015075286W WO 2016039278 A1 WO2016039278 A1 WO 2016039278A1
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tissue
animal
embryoid body
gland
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PCT/JP2015/075286
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English (en)
French (fr)
Inventor
孝 辻
美帆 小川
Original Assignee
株式会社オーガンテクノロジーズ
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a secretory gland and the produced secretory gland.
  • stem cell technology With the recent development of stem cell technology, a technology for inducing cells constituting various tissues of living bodies from stem cells has been established.
  • biological organs have a three-dimensional arrangement of multiple types of functional cells, and the development proceeds by the interaction of each cell. It is very difficult to induce artificially.
  • a technique for constructing a regenerative organ that can be immediately transplanted has not been developed yet.
  • organ primordia such as hair follicle primordia using epithelial cells and mesenchymal cells derived from organ primordia in vivo ("organ primordium").
  • organ primordium epithelial cells and mesenchymal cells derived from organ primordia in vivo
  • the present inventors prepared secretory gland primordia such as salivary gland and lacrimal gland using the organ primordium method described above, and after culturing after inserting a guide into the primordia, A method for producing an organ primordium having a conduit that can be combined with the conduit is also shown (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 described above are very promising techniques for constructing transplantable regenerative organs, but use organ primordium in the living body as a material for regenerative organs. It is difficult to apply when it is difficult to collect materials. Accordingly, the present inventors have attempted to develop a technique for efficiently producing secretory glands from pluripotent stem cells with respect to regeneration of secretory glands.
  • the present inventors have produced an embryoid body using pluripotent stem cells, combined with a scaffold material, and then transplanted to an animal.
  • the inventors have found that secretory glands can be produced, and have completed the present invention.
  • the present invention is a method for producing a secretory gland, The following steps: (A) preparing a conjugate comprising (A) and (B) below; (A) all or part of an embryoid body (B) scaffold material (b) implanting the conjugate prepared in step (a) into an animal; and (C) producing a secretory gland derived from the conjugate in the animal,
  • a method comprising:
  • the animal is a non-human animal.
  • the non-human animal is a non-human immunodeficient animal.
  • the embryoid body is an embryoid body prepared from iPS cells or ES cells.
  • the embryoid body is stimulated with a physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway.
  • the Wnt path is a classic Wnt path.
  • the “physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway” is Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt6, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10b, and TGF-. It is selected from the group consisting of ⁇ .
  • the “physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway” may be, for example, a Wnt receptor agonist.
  • the scaffold material is a collagen gel.
  • the transplant is a transplant under the renal capsule.
  • a secretory gland can be frequently produced in a teratoma derived from a pluripotent stem cell.
  • the secretory gland produced by the method of the present invention is used as an organ for transplantation for restoring its function, for example, when the function of the secretory gland such as salivary gland is reduced or lost innate or acquired in the living body. Can be used. In this case, it is also possible to use a technique as described in Patent Document 1 above.
  • FIG. 1 shows a tissue image of a teratoma formed when iPS cells in a single cell state are transplanted into a living body.
  • FIG. 1A shows a weakly enlarged photograph of an HE image of a tissue section. The same lot tissue is divided into a plurality of tissues, and two sections are shown. The position of a region showing typical histological characteristics in this tissue is indicated by af.
  • FIG. 1B shows a strongly magnified image of the af region shown in FIG. 1A.
  • a is the respiratory system
  • b is the neuroepithelial system
  • c is the mesodermal connective tissue
  • d is the respiratory system (bronchi)
  • e is the upper digestive system
  • f was distinguished from the ectodermal deciduous system partially containing transitional epithelium. Histological analysis of all three cases was performed, and only one very small secretory gland was observed (d).
  • FIG. 2 shows a tissue image of teratoma formed when iPS cells are in an embryoid body and transplanted in vivo.
  • FIG. 2A shows a weakly enlarged photograph of an HE image of a tissue section. The same lot tissue is divided into a plurality of tissues, and two sections are shown. The representative histological features of this tissue are shown, and the position of the region where the exocrine gland-like structure is recognized is indicated by ad.
  • FIG. 2B shows a strongly magnified image of the a-d region shown by FIG. 2A. It was found that exocrine gland-like tissue structures (dot gland box) were concentrated in all transplants to be analyzed.
  • FIG. 3 shows an HE-stained image of a teratoma formed by transplanting an embryoid body subjected to Wnt10b stimulation into a living body.
  • the left figure shows skin-like tissue containing ectodermal cyst hair follicles, and the right figure shows mucosal-like tissue.
  • FIG. 4A shows a schematic diagram of a method for forming a teratoma enclosing various organs, which is an embodiment of the present invention.
  • Embryoid bodies were formed from iPS cells, arranged three-dimensionally in a collagen gel, and then transplanted into adults to form teratomas.
  • FIG. 4B shows the classification of the various organs formed in the teratoma.
  • Each of the figures a to d shows typical histological images of a: skin-like tissue, b: mucosal-like tissue, c: cyst tissue consisting of transitional epithelium, and d: cyst tissue consisting of endoderm epithelium.
  • Cyst cyst cavity
  • Epi epithelial tissue
  • Der dermal tissue
  • Ad adipose tissue
  • LP lamina intestinal
  • SM smooth muscle tissue.
  • the cystic epithelial tissue of c is composed of a single-layered columnar epithelium including squamous stratified epithelium (*) and goblet cells (arrow).
  • FIG. 4C shows the frequency of organs induced by teratoma derived from embryoid bodies subjected to Wnt10b stimulation (Dark bar), and the frequency of organs induced by teratomas derived from embryoid bodies not stimulated by Wnt10b (Light bar). It is the graph which compared.
  • FIG. 4D shows the number of hair follicle formation (Dark bar) induced per gram of teratoma derived from embryoid bodies subjected to Wnt10b stimulation, and the hair follicle induced per gram of teratoma derived from embryoid bodies not subjected to Wnt10b stimulation. It is the graph which compared the number of formation (Light bar).
  • FIG. 5 shows a histological image of a secretory gland-like structure induced by a teratoma derived from an embryoid body subjected to Wnt10b stimulation.
  • the left figure shows an HE-stained image
  • the middle figure shows an immunostained image with an anti-amylase antibody
  • the right figure shows an immunostained image with an anti-E-cadherin antibody.
  • the arrow in the figure indicates the cytoplasmic granular amylase in the acinar-like tissue.
  • the dotted line in the figure indicates the area of the acinar tissue, and “D” in the figure indicates the adjacent duct-like structure.
  • pluripotent stem cell refers to a cell having both the pluripotency capable of differentiating into any cell of the living body and the self-replicating ability capable of maintaining the pluripotency even after differentiation and proliferation, for example, ES cell And iPS cells.
  • ES cell Embryonic Stem cells
  • stem cell line made from an inner cell mass belonging to a part of an embryo at the blastocyst stage, which is an early stage of animal development, and is extremely numerous. It has the pluripotency capable of differentiating into cells and the self-replicating ability that can maintain pluripotency even after dividing proliferation.
  • the origin of ES cells that can be used in the present invention is not particularly limited, and ES cells derived from the inner cell mass of any animal can be used.
  • ES cells derived from the inner cell mass of humans, mice, rats, pigs, monkeys can be used as the origin of ES cells.
  • iPS cells induced Pluripotent Stem cells
  • ES cells ES cells
  • somatic cells A cell that has sex and self-replicating ability to maintain pluripotency even after dividing proliferation.
  • the origin of iPS cells that can be used in the present invention is not particularly limited, and iPS cells derived from any animal can be used.
  • iPS cells derived from humans, mice, rats, pigs, and monkeys can be used as the origin of iPS cells.
  • somatic cells derived from iPS cells that can be used in the present invention are not particularly limited, and iPS cells derived from cells derived from any tissue can be used.
  • the iPS cell induction method that can be used in the present invention is not particularly limited, and any method can be used as long as it can induce iPS cells from somatic cells. be able to.
  • the method for culturing pluripotent stem cells without differentiation is not particularly limited, and a person skilled in the art can appropriately select a culture environment or medium known in the art or a culture environment or medium equivalent thereto.
  • a culture environment or medium known in the art or a culture environment or medium equivalent thereto For example, mouse embryo fibroblasts (MEF) can be used as feeder cells for culturing pluripotent stem cells.
  • MEF mouse embryo fibroblasts
  • a medium for culturing pluripotent stem cells a medium generally used for culturing pluripotent stem cells can be used, and the composition thereof is not particularly limited.
  • teratoma is a well-differentiated germ cell tumor having a bi- or tri-germ component, and is also referred to as a malformed species.
  • the “teratoma” in the present invention also includes a structure histologically similar to a deformed species that can be generated when pluripotent stem cells are transplanted into a living body. Teratomas can occur naturally in vivo, but can also be generated artificially by transplanting pluripotent stem cells into animals.
  • the site for transplanting cells into an animal is not particularly limited, and for example, it can be transplanted under the kidney capsule, subcutaneous, or testis of an animal.
  • the method for transplanting cells into an animal is not particularly limited.
  • the kidney capsule of a mouse an incision of 2 to 3 mm is made in the kidney capsule, and the kidney capsule and the kidney parenchyma are peeled off. In the meantime, cells can be transplanted.
  • a method for confirming that teratoma is formed in an animal transplanted with pluripotent stem cells is not particularly limited.
  • a laparotomy is performed 3 to 4 weeks after transplantation to form a tumor in appearance. This can be confirmed by visual inspection.
  • analyzing the tumor histologically it is possible to confirm the formation of trigerminal tissue that is characteristic of teratomas.
  • the “secretory gland” in the present invention may be an exocrine gland or an endocrine gland.
  • exocrine glands include lacrimal gland, salivary gland, cardia gland, pyloric gland, gastric gland, intestinal crypt, prostate, sweat gland, sebaceous gland, etc.
  • endocrine gland include pituitary gland, thyroid gland, parathyroid , Adrenal glands, gonadal and the like.
  • pancreatic cell since the pancreatic cell has a function as an exocrine gland (secretion of trypsin, amylase, etc.) and a function as an endocrine gland (secretion of insulin, glucagon, somatostatin, etc.), it is included in the secretory gland in the present invention.
  • organ primordium refers to a region of an embryo or a structure of an embryo that is determined to develop in a specific organ as the developmental stage proceeds in a living body, and is simply referred to as “primitive primordium”. There is also. Almost all organs in a living body are generated from organ primordia derived from epithelial stem cells and mesenchymal stem cells by a fetal development program, and develop into a predetermined position and a predetermined number.
  • the method for confirming that the target secretory gland is formed in the teratoma is not particularly limited.
  • the teratoma is opened and the skin appendages (for example, hair follicles, nails, sebaceous glands, sweat glands, It can be confirmed by looking for a structure that appears to be full-thickness skin with mammary glands).
  • a tissue section of teratoma can be prepared and confirmed to be a predetermined organ from the tissue structure.
  • it can be analyzed by an in situ hybridization method that a gene expressed in each organ is expressed at an appropriate site.
  • embryoid body refers to a cell mass formed when pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are cultured in suspension. Embryoid bodies may take the form of embryos and may be composed of various tissues.
  • the method for producing an embryoid body that can be used in the present invention is not particularly limited. For example, a method of seeding pluripotent stem cells on a low-adhesion plate, or hanging a droplet of a cell suspension of pluripotent stem cells. The hanging drop method according to, and the method of suspension culture while shaking the culture dish of pluripotent stem cells can be used.
  • iPS cells when an embryoid body is prepared by seeding iPS cells on a low adhesion plate, iPS cells are 1500 cells to 10000 cells / 200 ⁇ l / well, more preferably 2000 cells to 4000 cells / 200 ⁇ l / well.
  • An embryoid body can be produced by seeding on an adhesive plate and culturing. If the number of cells to be seeded is less than 1500 cells / 200 ⁇ l / well, the embryoid body may not be formed properly, and if it exceeds 10,000 cells / 200 ⁇ l / well, necrosis due to lack of nutrition may occur inside the embryoid body.
  • the embryoid bodies used in the present invention are from the start of suspension culture, but, for example, those from 5 to 9 days from the start of suspension culture can be suitably used. .
  • an embryoid body when used for transplantation, all or part of the embryoid body can be used for transplantation.
  • the embryoid body can be used for transplantation as it is, or only part of the embryoid body can be used for transplantation.
  • the method for separating only the surface tissue from the embryoid body is not particularly limited.
  • the surface tissue of the embryoid body can be physically collected by microsurgery using a syringe under a stereomicroscope.
  • “scaffold material” expresses various cell functions such as cell adhesion, proliferation, differentiation, activation, migration, migration, and morphological change by contacting the material with the cell on or within the material. It refers to all materials that can be promoted and is not particularly limited as long as it is suitable for transplanting pluripotent stem cells.
  • a collagen gel can be used as the scaffold material, and preferably, a type I collagen gel, a type III collagen gel, a type IV collagen gel, and a matrigel can be used.
  • Transplanting pluripotent stem cells in a scaffold material prevents pluripotent stem cells from dissipating in the transplanted tissue and becomes a scaffold for tissue survival
  • Secretory glands can be produced in the teratoma.
  • the embryoid body can be transplanted in a collagen gel while maintaining a desired three-dimensional arrangement.
  • transplantation is performed in a state where the surface tissues of the respective embryoid bodies are in contact with each other, whereby a secretory gland can be more efficiently produced in the teratoma.
  • a method for producing a conjugate including “all or part of an embryoid body” and a scaffold material It may be used for transplantation after the scaffold material is combined with “all or part of the embryoid body” in vitro.
  • the scaffold material is introduced into the body and then “all or part of the embryoid body”. May be combined by injection and transplantation may be performed.
  • the collagen gel and the embryoid body are put into a sol-like collagen gel and solidified. A combination with all or a part of can be produced.
  • the “physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway” may be, for example, a physiologically active substance capable of activating the classic Wnt pathway (also referred to as ⁇ -catenin pathway). It may be a physiologically active substance that can activate the pathway (in-plane cell polarity pathway; also referred to as PCP pathway or Ca2 + pathway). Examples of physiologically active substances that can activate the classical Wnt pathway include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt6, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10b, and TGF- ⁇ .
  • physiologically active substances that can activate the classical Wnt pathway include Wnt4, Wnt5a, and Wnt11. That Wnt10b can activate the classical Wnt pathway ( ⁇ -catenin pathway) is described in, for example, Maksim V. et al. Prikus et al. (Science 332, 586 (2011)), Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt6, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b can activate the classic Wnt pathway ( ⁇ -catenin pathway), Wnt4, The fact that Wnt5a and Wnt11 can activate the non-classical Wnt pathway is described in, for example, Kemp et al. (Functional Development and Embrology 1 (1), 1-13 (2007)), TGF- ⁇ stabilizes the expression of ⁇ -catenin in derma fibroblast, for example, Sato (Acta derm6; : 300-307).
  • the embryoid body is stimulated by a “bioactive substance capable of activating the Wnt pathway”, but in addition to the “bioactive substance capable of activating the Wnt pathway”,
  • the embryoid body can be additionally stimulated by various cytokines known to be involved in development and various factors used for induction of embryo differentiation. Examples of such cytokines and factors include Hox protein, Dlx protein, TGF ⁇ , SAG, insulin, BMP4, Cyclopamine, FGF2, ⁇ FGF, SB431542, BMP4, Nodal, apotransferrin, FGF8, Endotheline, LDN193189, EFN9902, EFN9902 , Activin, retinoic acid, or any combination thereof.
  • cytokines and factors may be administered at the same timing as the “bioactive substance capable of activating the Wnt pathway” when stimulating the embryoid body, and “physiological activation capable of activating the Wnt pathway” It may be administered at a different timing from the “substance”.
  • a protein whose expression is increased in the differentiation process from an embryo to the tissue in a living body for example, the protein exemplified above
  • the induction efficiency to the target tissue can be increased.
  • the type of animal into which cells are transplanted is not particularly limited, and any animal can be used for transplantation.
  • non-human animals such as pigs, cows, monkeys, baboons, dogs, cats, rats, and mice can be used for transplantation to avoid ethical problems that arise when cells are transplanted into humans.
  • rejection due to the immune function of the living body can be prevented, and a teratoma can be produced efficiently.
  • a teratoma derived from a cell of another species can be produced in the living body of the non-human immunodeficient animal.
  • a human cell-derived teratoma can be produced in the living body of the non-human immunodeficient animal.
  • an “immune-deficient animal” refers to an animal that lacks part or all of the immune function of a living body, and the type of immune function that is deficient is not particularly limited, but is derived from other species of animals transplanted into the living body. Animals lacking immune function are preferred so as not to exclude the cells or tissues.
  • SCID mice, nude mice, NOD mice, NOD-SCID mice, IL-2Rg knockout mice, RAG2 knockout mice, NOG mice, RAG2 / IL-2Rg double knockout mice can be used as long as they are immunodeficient mice.
  • an immunodeficient rat can be used as a SCID rat.
  • IL-2rg knockout pigs can be used for immunodeficient pigs.
  • a method for extracting a desired organ from the teratoma is not particularly limited, but for example, it can be extracted by microsurgery.
  • first, second, etc. may be used to represent various elements, but these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • Example 1 Formation of secretory gland by in vivo transplantation of a conjugate containing an embryoid body 1.
  • Materials and Methods (1) Experimental animals C.I. B-17 / lcr-scid / scid Jcl mice were purchased from Claire (Tokyo, Japan). Further, scid / scid hr / hr (SHO) mice were purchased from Charles River (Kanagawa, Japan). Mouse management and manipulation was in accordance with NIH laboratory animal guidelines. All experiments were conducted with the approval of the Laboratory Animal Care Committee of Tokyo University of Science.
  • the medium was changed every day, and subculture was performed using a solution obtained by adding 0.25% Trypsin-1 mM EDTA (Invitrogen) to D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque) on the second day after subculture.
  • SNLP76.7-4 feeder cells are cultured on a gelatin-coated dish (referred to as gelatin-coated dish in this example) at 37 ° C. for 2 hours or more with a 0.1% gelatin aqueous solution. did.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • 7% fetal bovine serum 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ s / ml penicillin Medium was used.
  • Mitomycin C was added to the above medium to a final concentration of 12 ⁇ g / ml, and SNLP76.7-4 feeder cells were reacted at 37 ° C.
  • iPS cells 1 ⁇ 10 6 cells from which feeder cells have been removed by sorting are suspended in 30 ⁇ l type I collagen gel (Nitta Gelatin), and 10 minutes or more in a CO 2 incubator at 37 ° C. Cells were encapsulated in the collagen gel by solidifying the collagen gel. These iPS cells encapsulated in collagen gel were used for transplantation.
  • embryoid bodies When embryoid bodies are used for transplantation, 48 embryoid bodies prepared by the method described in (3) from 3000 cells of iPS cells are included in 30 ⁇ l type I collagen gel (Nitta gelatin). The collagen gel was solidified in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 10 minutes or longer to encapsulate the embryoid body in the collagen gel. These embryoid bodies encapsulated in collagen gel were used for transplantation.
  • mice 7-10 weeks old C.I. B-17 / lcr-scid / scid Jcl mice were anesthetized by intraperitoneal injection of 5 ng / ml pentobarbital, and iPS cells encapsulated in the aforementioned collagen gel, or embryoid bodies prepared from iPS cells, Implanted under the skin. On the 28th day after transplantation, the formed teratomas were extracted.
  • ectodermal tissues such as epidermis and neural rosette structure, mesodermal tissues such as muscle, bone and cartilage, and endoderm tissues such as intestinal tract-like epithelium was observed in the teratoma (Fig. 1). .
  • secretory glands only a very small secretory gland was observed in one case among all three cases subjected to histological analysis.
  • an embryoid body that is an aggregate of iPS cells is prepared by the method described in (3), and the kidney capsule of SCID mice is formed by the method described in (4). Transplanted. Teratomas formed 28 days after transplantation were analyzed histologically by HE staining. As a result, in the teratoma formed in the group transplanted with embryoid bodies, secretory gland-like tissue structures were confirmed with high frequency (FIG. 2). Furthermore, a luminal structure consisting of columnar epithelium was found adjacent to the secretory gland-like structure, suggesting that these are part of the ductal structure adjacent to the glandular tissue. In other words, by mixing and transplanting the iPS cells in the embryoid body state with the scaffold material, the secretory glands can be induced more efficiently than in the case of transplanting the single-cell iPS cells. Indicated.
  • Example 2 Formation of a secretory gland by in vivo transplantation of a conjugate containing an embryoid body 1.
  • Materials and Methods (1) Experimental animals C.I. B-17 / lcr-scid / scidJcl mice were purchased from Claire (Tokyo, Japan) and scid / scid hr / hr (SHO) mice were purchased from Charles River (Kanagawa, Japan). Mouse management and manipulation was in accordance with NIH laboratory animal guidelines. All experiments were conducted with the approval of the Laboratory Animal Care Committee of Tokyo University of Science.
  • the medium was changed every day, and on the second day after subculture, subculture was performed using a solution in which 0.25% Trypsin-1 mM EDTA (Invitrogen) was added to D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque).
  • SNLP76.7-4 feeder cells were cultured on gelatin-coated dishes in 0.1% gelatin aqueous solution at 37 ° C. for 2 hours or more.
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM without sodium pyruvate; Nacalai Tesque), 7% fat bovine serum, 50 units / mL penicillin, 50 units / mL penicillin Medium was used.
  • Mitomycin C was added to the medium to a final concentration of 12 ⁇ g / ml, and SNLP76.7-4 feeder cells were reacted at 37 ° C. for 2 hours and 15 minutes to treat mitomycin of SNLP76.7-4 feeder cells. .
  • the reacted cells were seeded on a gelatin-coated dish at 2.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 . What was cultured for 24 hours or more after mitomycin treatment was used as a feeder cell for co-culture with iPS cells.
  • Wnt10b 0.1 mg / mL Wnt10b (R & D) in PBS was added as a stock to the medium for iPS cells to 1 ⁇ g / mL.
  • Half of the Well medium in which embryoid bodies were formed was discarded, and half of the medium was replaced with a medium for iPS cells containing Wnt10b (final concentration 500 ng / mL).
  • Embryoid bodies in Wnt10b-added medium were cultured for 24 hours in a CO 2 incubator.
  • the epidermis layer of the cyst is a typical skin because the basal cell layer, curved cell layer, granule layer, and stratum corneum are regularly arranged, and the stratum corneum is separated into a clear layer toward the cyst cavity. It was shown to be epidermal tissue. It was shown that the hair shaft grew from the opening of the hair follicle toward the cyst lumen (FIG. 3, black arrow). The connection site between the sebaceous gland and the hair follicle is the hair follicle funnel or the opening of the pore (FIG. 3, left white arrowhead), suggesting that sebum can be secreted into the outer epidermis through the pore.
  • cyst epithelium From the histological characteristics of the formed cyst epithelium and surrounding stromal tissue, skin-like (squamous keratinized epithelial layer / dermis layer / fatty or striated muscle), mucosal-like (squamous stratified horn epithelium / Classified into mucosal lamina (striated muscle), transitional epithelium (transitional form of flat stratified keratinized epithelium and monolayer columnar epithelium), endoderm epithelial (monolayer columnar epithelium / mucosal lamina / striated muscle) The composition ratio was measured (FIG. 4B).
  • iPS cells in embryoid state can be stimulated with a physiologically active substance that can activate the Wnt pathway, and then transplanted to animals to induce secretory glands more efficiently. It was shown that.

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Abstract

　【課題】　多能性幹細胞から効率的に分泌腺を製造する方法を提供する。　【解決手段】　分泌腺を製造する方法であって、次のステップ（ａ）～（ｃ）；（ａ）胚様体の全部または一部、および、足場材料を含む結合体を調製するステップ、（ｂ）前記ステップ（ａ）で調製した前記結合体を、動物に移植するステップ、および、（ｃ）前記動物中において、前記結合体由来の分泌腺を製造するステップ、を含むことを特徴とする方法を提供する。

Description

分泌腺の製造方法
　本発明は、分泌腺を製造する方法、および、製造された分泌腺に関する。
　再生医療の究極の目標は、病気や損傷、加齢によって機能不全となった臓器または組織を、完全な機能を持つ再生臓器または再生組織と置き換える、置換再生医療である。しかしながら、現在までに生体内の臓器または組織と同等の機能と構造を持つ臓器または組織の再生には至っていない。
　近年の幹細胞技術の発達により、幹細胞から生体の様々な組織を構成する細胞を誘導する技術が確立されている。しかし、生体の器官は複数種類の機能的な細胞が三次元的な配置をとり、それぞれの細胞の相互作用によって発達が進むため、それぞれの細胞を誘導する場合と比較して、特定の器官を人為的に誘導することは非常に難しい。現在の再生医療技術では、すぐに移植可能な再生器官の構築技術はまだ開発されていない。
　本発明者らは、生体における器官の原基を由来とする上皮系細胞および間葉系細胞を用いて、人為的に毛包原基等の器官原基を再構築する技術（「器官原基法」という）を確立した（非特許文献１）。
　さらに本発明者らは、上記の器官原基法を用いて唾液腺や涙腺のような分泌腺の原基を作製し、当該原基にガイドを挿入したうえで培養を行うことで、生体側の導管と結合可能な導管を有する器官原基を製造する方法も示している（特許文献１）
ＷＯ２０１２／１０８０６９
Ｎａｋａｏ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　４，　２２７－３０（２００７）
　上記の非特許文献１や特許文献１に記載の技術は、移植可能な再生器官の構築技術として非常に有望な技術であるが、再生器官の材料として生体における器官の原基を用いているため、材料の採取が困難な場合には適用することが難しい。そこで、本発明者らは、分泌腺の再生に関し、多能性幹細胞から効率的に分泌腺を製造する技術の開発を試みた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、多能性幹細胞を用いて胚様体を作製し、足場材料と結合させたうえで動物へ移植することにより、効率的に分泌腺を製造することができることを見出し、本発明を完成させるに到った。
　すなわち、本発明は、分泌腺を製造する方法であって、
　下記ステップ；
　（ａ）下記（Ａ）および（Ｂ）を含む結合体を調製するステップ；
　　（Ａ）胚様体の全部または一部
　　（Ｂ）足場材料
　（ｂ）前記ステップ（ａ）で調製した前記結合体を、動物に移植するステップ、および、
　（ｃ）前記動物中において、前記結合体由来の分泌腺を製造するステップ、
を含むことを特徴とする、方法を提供する。
　また、本発明の一実施態様においては、前記動物が、非ヒト動物であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記非ヒト動物が、非ヒト免疫不全動物であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記胚様体が、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から作製された胚様体であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記胚様体が、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質による刺激を行ったものであることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記Ｗｎｔ経路が古典的Ｗｎｔ経路であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質」が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、および、ＴＧＦ－βからなる群から選択されることを特徴とする。また、前記「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質」は、例えば、Ｗｎｔ受容体アゴニストであってもよい。
　また、本発明の一実施態様においては、前記足場材料が、コラーゲンゲルであることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記移植が、腎皮膜下への移植であることを特徴とする。
　本発明の他の実施態様においては、上記のいずれかに記載の方法によって製造される、
分泌腺を提供する。
　以上の本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせたものも、本発明に含まれることはいうまでもない。
　本発明に係る分泌腺の製造方法によれば、多能性幹細胞由来のテラトーマ内に、高頻度に分泌腺を製造することができる。本発明の方法により製造された分泌腺は、例えば、生体において唾液腺等の分泌腺の機能が先天的または後天的に低下または喪失している場合に、その機能回復のための移植用の器官として用いることができる。また、その際には上記の特許文献１に記載のような技術を利用することも可能である。
図１は、単個細胞の状態のｉＰＳ細胞を生体内に移植した際に形成されたテラトーマの組織像を示す。図１Ａは、組織切片のＨＥ像の弱拡大写真を示す。同一ロット組織より複数組織へと切り分けそのうちの２切片を示す。本組織において代表的な組織学的特徴を示す領域の位置を、ａ－ｆにより示す。図１Ｂは、図１Ａに示したａ－ｆ領域の強拡大像を示す。それぞれの上皮組織の組織学的な特徴より、ａは呼吸器系、ｂは神経上皮系、ｃは中胚葉性の結合組織、ｄは呼吸器系（気管支）、ｅは上部消化器系と呼吸器系、ｆは一部に移行上皮を含む外胚葉性外皮系と判別した。全３例の組織学的解析を行ったが、非常に小型な分泌腺が一例のみ認められた（ｄ）。図中の各記号は、Ｅｎｄ：内胚葉性上皮、Ｅｃｔ：外胚葉性上皮、ｍｕｃ：粘上皮、ＣｏＥ：円柱上皮、Ｉｎ：消化器系、Ｎｅｕ：神経上皮、ＫＳ：角化重層扁平上皮、ｎｏｎＫＳ：皮角化重層上皮、Ｍｓ：筋肉（横紋筋を主とする）、ｓｍ：平滑筋、ｃｉｌｌ：繊毛上皮、Ａｄｐ：脂肪組織、Ｃｔ：硝子軟骨、ＥｘＧ：外分泌腺様構造をそれぞれ示す。 図２は、ｉＰＳ細胞を胚様体の状態にしたうえで生体内に移植した際に形成されたテラトーマの組織像を示す。図２Ａは、組織切片のＨＥ像の弱拡大写真を示す。同一ロット組織より複数組織へと切り分けそのうちの２切片を示す。本組織において代表的な組織学的特徴を示し、外分泌腺様構造が認められた領域の位置を、ａ－ｄにより示す。図２Ｂは、図２Ａにより示したａ－ｄ領域の強拡大像を示す。解析対象とした全ての移植物中に外分泌腺様の組織構造（点腺囲み）が集蔟していることが散見された。外分泌腺様構造に隣接して円柱状皮よりなる管腔構造が存在していることから、腺組織と接続する導管構造の一部が拡張したものであることが示唆された。図中の各記号は、Ｅｃｔ：外胚葉性上皮、ｍｕｃ：粘上皮、ＣｏＥ：円柱上皮、Ｉｎ：消化器系、Ｎｅｕ：神経上皮、ＫＳ：角化重層扁平上皮、ｎｏｎＫＳ：皮角化重層上皮、Ｍｓ：筋肉（横紋筋を主とする）、ｓｍ：平滑筋、Ｃｔ：硝子軟骨、ＥｘＧ：外分泌腺様構造をそれぞれ示す。図中のＳｃａｌｅ　ｂａｒｓは１００μｍを示す。 図３は、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体を生体に移植して形成されたテラトーマのＨＥ染色像を示す。左図は外胚葉性嚢胞毛包を含む皮膚様組織を示し、右図は粘膜様組織を示す。 図４Ａは、本発明の一実施形態である、様々な器官を内包するテラトーマの形成方法の模式図を示す。ｉＰＳ細胞より胚様体を形成して、コラーゲンゲル内において三次元的配置した後に、成体内へ移植してテラトーマを形成した。またＷｎｔ１０ｂ刺激は胚様体形成７日目より２４時間行い、その後三次元配置を行った。図４Ｂは、テラトーマ内に形成された各種器官の分類を示す。ａ～ｄの各図は、それぞれａ：皮膚様組織、ｂ：粘膜様組織、ｃ：移行上皮よりなる嚢胞組織、およびｄ：内胚葉性上皮よりなる嚢胞組織の典型的組織像を示す。図中の各記号は、Ｃｙｓｔ：嚢胞腔、Ｅｐｉ：上皮組織、Ｄｅｒ：真皮組織、Ａｄ：脂肪組織、ＬＰ：粘膜固有層、ＳＭ：平滑筋組織をそれぞれ示す。ｃの嚢胞上皮組織は扁平重層上皮（＊）と杯細胞（矢印）を含む単層円柱上皮より構成される。図４Ｃは、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体由来のテラトーマに誘導される器官の頻度（Ｄａｒｋ　ｂａｒ）と、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行わない胚様体由来のテラトーマに誘導される器官の頻度（Ｌｉｇｈｔ　ｂａｒ）を比較したグラフである。図４Ｄは、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体由来のテラトーマ１ｇあたりに誘導される毛包形成数（Ｄａｒｋ　ｂａｒ）と、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行わない胚様体由来のテラトーマ１ｇあたりに誘導される毛包形成数（Ｌｉｇｈｔ　ｂａｒ）を比較したグラフである。 図５は、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体由来のテラトーマに誘導された分泌腺様構造の組織像を示す。左図はＨＥ染色像、中央の図は抗アミラーゼ抗体による免疫染色像、右図は抗Ｅカドヘリン抗体による免疫染色像を示す。図中の矢印は腺房様組織における細胞質内の顆粒状のアミラーゼを示す。図中の点線の範囲が腺房組織の範囲を示し、図中の「Ｄ」は、近接した導管様構造を示す。
　本発明において、「多能性幹細胞」とは、生体のあらゆる細胞に分化できる分化万能性と、分化増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能をあわせもつ細胞をいい、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が挙げられる。
　本発明において、「ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）」とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株のことをいい、非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持つ。
　本発明において用いることのできるＥＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物の内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。例えば、ＥＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サルの内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。
　本発明において、「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）」とは、体細胞へ、例えば数種類の遺伝子および／または薬剤を導入することにより、ＥＳ細胞のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持たせた細胞をいう。
　本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。例えば、ｉＰＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。また、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来となる体細胞も特に限定されず、あらゆる組織由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を用いることができる。さらに、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の誘導方法も特に限定されず、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる方法であれば、どのような方法を用いて誘導されたｉＰＳ細胞でも用いることができる。
　本発明において、多能性幹細胞を分化させずに培養する方法は特に限定されず、当業者が公知の培養環境や培地、またはそれに準ずる培養環境や培地を適宜選択することができる。例えば、多能性幹細胞を培養するためのフィーダー細胞としては、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いることができる。また、多能性幹細胞を培養するための培地としては、一般的に多能性幹細胞の培養に用いられる培地を用いることができ、その組成については特に限定されない。
　本発明において、「テラトーマ」とは、二胚葉性あるいは三胚葉性の成分を有する、高分化な胚細胞性腫瘍であり、奇形種ともいう。本発明における「テラトーマ」には、多能性幹細胞を生体に移植した場合に発生し得る、組織学的に奇形種に似た構造物も含む。テラトーマは生体内において自然発生することがあるが、多能性幹細胞を動物に移植することによって人工的に発生させることもできる。
　本発明において、動物に細胞を移植する部位は特に限定されないが、例えば、動物の腎皮膜下、皮下、精巣に移植することができる。
　本発明において、動物に細胞を移植する方法は特に限定されないが、例えば、マウスの腎皮膜下へ移植する場合は、腎臓皮膜に２～３ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に細胞を移植することができる。
　本発明において、多能性幹細胞を移植された動物にテラトーマが形成されていることの確認方法は特に限定されないが、例えば、移植から３～４週間後で開腹し、外観での腫瘤の形成を目視することで確認することができる。好ましくは、腫瘤を組織学的に解析することにより、テラトーマの特徴である三胚葉性の組織形成を確認することができる。
　本発明における「分泌腺」は外分泌腺であってもよく、内分泌腺であってもよい。外分泌腺の例としては、涙腺、唾液腺、噴門腺、幽門腺、胃腺、腸陰窩、前立腺、汗腺、皮脂腺等を挙げることができ、内分泌腺の例としては、下垂体、甲状腺、上皮小体、副腎、性腺等を挙げることができる。また、膵臓細胞は外分泌腺としての機能（トリプシン、アミラーゼ等の分泌）と内分泌腺としての機能（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の分泌）を備えるため、本発明における分泌腺に含まれる。
　本発明において、「器官原基」とは、生体において、発生の段階が進むと特定の器官に発生することが決定づけられた胚の領域または胚の構造をいい、単に「原基」と呼ばれることもある。生体におけるほぼ全ての器官は、胎児期の発生プログラムによって上皮系幹細胞と間葉系幹細胞から誘導された器官原基から発生し、所定の位置、所定の数に発達する。
　本発明において、テラトーマ内に目的の分泌腺が形成されていることの確認方法は特に限定されないが、例えば、テラトーマを切開し、外観から皮膚付属器官（例えば、毛包、爪、皮脂腺、汗腺、乳腺）を有する全層皮膚と思われる構造物を探すことで確認することができる。好ましくは、テラトーマの組織切片を作製し、組織構造から所定の器官であることを確認することができる。より詳細に確認する場合は、各器官で発現する遺伝子が適切な部位で発現していることをｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって解析することができる。
　本発明において、「胚様体」とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を浮遊培養した際に形成される細胞塊をいう。胚様体は、胚様の形態をとることがあり、様々な組織から構成されることがある。本発明において用いることのできる胚様体の作成方法は特に限定されないが、例えば、多能性幹細胞を低接着性プレートに播種する方法、多能性幹細胞の細胞懸濁液の液滴を吊るすことによるハンギングドロップ法、多能性幹細胞の培養皿を振盪させながら浮遊培養する方法を用いることができる。
　例えば、ｉＰＳ細胞を低接着性プレートに播種する方法で胚様体を作製する場合には、ｉＰＳ細胞を１５００ｃｅｌｌｓ～１００００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌ、より好ましくは、２０００ｃｅｌｌｓ～４０００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴低接着性プレートに播種し、培養することにより、胚様体を作製することができる。播種する細胞が１５００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌより少ないと胚様体が適切に形成されない恐れがあり、１００００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌより多いと胚様体内部で栄養不足による壊死が起こる恐れがある。
　また、本発明において用いられる胚様体が、浮遊培養開始から何日目のものであるかは特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から５～９日目のものを好適に用いることができる。
　本発明において、胚様体を移植に用いる場合、胚様体の全部または一部を移植に用いることができる。胚様体をそのまま移植に用いることもできるし、胚様体の一部のみを移植に用いることもできる。胚様体の一部のみを移植に用いる場合には、胚様体の表層組織を用いることが好ましい。胚様体の表層は上皮系の細胞で構成されていることから、胚様体の表層組織を移植に用いることにより、より効率的にテラトーマ内に分泌腺を製造することができる。
　本発明において、胚様体から表層組織のみを分離する方法は、特に限定されない。例えば、実体顕微鏡下での注射器によるマイクロサージェリーで、胚様体の表層組織を物理的に採取することができる。
　本発明において、「足場材料」とは、その材料上あるいは材料内で細胞と材料が接することにより、細胞の接着、増殖、分化、活性化、移動、遊走、形態変化など様々な細胞機能を発現、促進されるような材料全般を指し、多能性幹細胞を移植する際に好適なものであれば、特に限定されない。例えば、足場材料としてコラーゲンゲルを用いることができ、好ましくは、I型コラーゲンゲル、III型コラーゲンゲル、IV型コラーゲンゲル、マトリゲルを用いることができる。多能性幹細胞を足場材料に内包させたうえで移植することにより、移植した組織において多能性幹細胞が散逸することを防ぎ、組織が生着するための足場となることで、より効率的にテラトーマ内に分泌腺を製造することができる。また、多能性幹細胞を足場材料に内包させたうえで移植することにより、胚様体をコラーゲンゲル内に所望の立体的配置を保ったまま移植することができる。コラーゲンゲル内において、それぞれの胚様体の表層組織どうしが接した状態で移植を行うことにより、より効率的にテラトーマ内に分泌腺を製造することができる。
　本発明において、「胚様体の全部または一部」と足場材料を含む結合体を作製する方法は特に限定されない。生体外において「胚様体の全部または一部」と足場材料を結合させてから移植に用いてもよく、はじめに生体内に足場材料を導入し、そこに「胚様体の全部または一部」を注入することで結合させ、移植をおこなってもよい。また、例えば、足場材料としてコラーゲンゲルを用い、胚様体の全部または一部と結合させる場合には、ゾル状のコラーゲンゲルに胚様体を入れ、固化させることによって、コラーゲンゲルと胚様体の全部または一部との結合体を作製することができる。
　本発明において、「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性化物質」とは、例えば古典的Ｗｎｔ経路（βカテニン経路ともいう）を活性化させ得る生理活性化物質であってよく、非古典的Ｗｎｔ経路（平面内細胞極性経路；ＰＣＰ経路、Ｃａ２＋経路ともいう）を活性化させ得る生理活性化物質であってもよい。古典的Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性化物質としては、例えばＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、および、ＴＧＦ－βを例示することができ、非古典的Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質としては、例えばＷｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１が例示できる。Ｗｎｔ１０ｂが古典的Ｗｎｔ経路（βカテニン経路）を活性化させ得ることは、例えばＭａｋｓｉｍ　Ｖ．　Ｐｌｉｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３２，　５８６　（２０１１））に記載されており、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂが古典的Ｗｎｔ経路（βカテニン経路）を活性化させ得、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１が非古典的Ｗｎｔ経路を活性化させ得ることは、例えばＫｅｍｐ　ｅｔ　ａｌ．（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　１（１），　１－１３　（２００７））に記載されており、ＴＧＦ－βがｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔにおいてβカテニンの発現を安定化させることは、例えばＳａｔｏ（Ａｃｔａ　Ｄｅｒｍ　Ｖｅｎｅｒｅｏｌ　２００６；　８６：　３００－３０７）に記載されている。
　本発明の一実施態様においては、「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性化物質」によって胚様体を刺激するが、「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性化物質」に加えて、胚の発生に関与することが知られている様々なサイトカインや、胚の分化誘導に用いられる様々な因子によって、胚様体を追加的に刺激することもできる。そのようなサイトカインや因子の例としては、Ｈｏｘタンパク質、Ｄｌｘタンパク質、ＴＧＦβ、ＳＡＧ、インスリン、ＢＭＰ４、Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ、ＦＧＦ２、βＦＧＦ、ＳＢ４３１２５４２、ＢＭＰ４、Ｎｏｄａｌ、ａｐｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＦＧＦ８、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｅ、ＬＤＮ１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、ａｃｔｉｖｉｎ、ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、または、これらの任意の組み合わせを挙げることができる。これらのサイトカインや因子は、胚様体を刺激する際に、「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性化物質」と同じタイミングで投与されてもよく、「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性化物質」と異なるタイミングで投与されてもよい。例えば、本発明を用いて、分泌腺を含むある特定の組織を製造する場合には、生体における、胚からその組織への分化過程において発現が上昇するタンパク質（例えば上記に例示したタンパク質）を、その発現の順番を模して投与することにより、目的とする組織への誘導効率を上昇させ得る。
　本発明において、細胞を移植する動物の種類は特に限定されず、あらゆる動物を移植に用いることができる。好ましくは、非ヒト動物、例えば、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、イヌ、ネコ、ラット、マウスを移植に用いることで、ヒトに細胞を移植する際に生じる倫理面の問題を回避することができる。より好ましくは、非ヒト免疫不全動物を移植に用いることで、生体の免疫機能による拒絶反応を防ぐことができ、効率よくテラトーマを作製することができる。また、非ヒト免疫不全動物を移植に用いることで、非ヒト免疫不全動物の生体内に、他種の動物の細胞由来のテラトーマを作製することができる。例えば、非ヒト免疫不全動物に、ヒト由来の多能性幹細胞を移植することによって、非ヒト免疫不全動物の生体内にヒト細胞由来のテラトーマを作製することができる。
　本発明において、「免疫不全動物」とは、生体の免疫機能の一部または全部を欠損する動物をいい、欠損する免疫機能の種類は特に限定されないが、生体に移植された他種の動物由来の細胞または組織を排除しないように免疫機能を欠損する動物が好ましい。例えば、免疫不全マウスであれば、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、ＮＯＤマウス、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス、ＩＬ－２Ｒｇノックアウトマウス、ＲＡＧ２ノックアウトマウス、ＮＯＧマウス、ＲＡＧ２／ＩＬ－２Ｒｇダブルノックアウトマウス用いることができ、好ましくは、ＳＣＩＤマウスを用いることができる。また、例えば、免疫不全ラットであれば、ＳＣＩＤラットと用いることができる。また、例えば、免疫不全ブタであれば、ＩＬ－２ｒｇノックアウトブタを用いることができる。
　本発明において、テラトーマから所望の器官を摘出する方法は特に限定されないが、例えば、マイクロサージェリーによって摘出することができる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
実施例１：胚様体を含む結合体の生体内移植による分泌腺の形成
１．材料と方法
（１）実験動物
　Ｃ．Ｂ－１７／ｌｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ　Ｊｃｌマウスはクレア（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）にて購入した。また、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ　ｈｒ／ｈｒ（ＳＨＯ）マウスはチャールズリバー（Ｋａｎａｇａｗａ，　Ｊａｐａｎ）にて購入した。マウスの管理および操作はＮＩＨの実験動物指針に従った。全ての実験は東京理科大学の実験動物管理委員会の認可の上実施した。
（２）細胞培養
　マウスｉＰＳ細胞（ｍＧＦ－ｉＰＳ－３Ｆ－３，　京都大学　江草宏先生より供与）はマイトマイシンＣ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）処理したＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞と共培養した。培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ；　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、１５％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（Ｊａｐａｎ　Ｂｉｏ　Ｓｅｒｕｍ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０　μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｘ１０－４Ｍ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｘ１０－４Ｍ　Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地を用いた。１日毎に培地を交換し、継代後２日目にＤ－ＰＢＳ（－）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて継代培養した。
　ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞（京都大学　江草宏先生より供与）は０．１％ゼラチン水溶液で３７℃、２時間以上ゼラチンコートしたディッシュ（本実施例において、これをゼラチンコートディッシュという）上で培養した。培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ；　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、７％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地を用いた。前記培地にマイトマイシンＣを終濃度１２μｇ／ｍｌになるよう添加し、ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞を３７℃、２時間１５分反応させることにより、ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞のマイトマイシン処理を行った。その後、反応させた細胞を２．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でゼラチンコートディッシュに播種した。播種後２４時間以上培養したものをｉＰＳ細胞との共培養用のフィーダー細胞として用いた。
（３）胚様体の作製
　（２）において、フィーダー細胞と共培養することによって培養したｉＰＳ細胞から、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ　ＡｒｉａIII，　ＢＤ）を用いてｉＰＳ細胞のみをソーティングした。ソーティングしたｉＰＳ細胞を、３０００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴低接着性プレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ，　ＮＯＦ）に播種することにより、胚様体を作製した。培地は（２）においてｉＰＳ細胞の培養に用いた培地を用いた。培養３日目に培地を半量交換した。
　胚様体の表層組織を移植に用いる場合には、実体顕微鏡の下での注射針によるマイクロサージェリーにより、胚様体の表層組織のみを採取し、移植に用いた。
（４）ｉＰＳ細胞の移植によるテラトーマの形成
　ソーティングによりフィーダー細胞を除去したｉＰＳ細胞１ｘ１０６ｃｅｌｌｓを、３０μｌのI型コラーゲンゲル（新田ゼラチン）に懸濁し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで１０分以上コラーゲンゲルを固化させることによって、コラーゲンゲル内に細胞を内包させた。コラーゲンゲルに内包させたこれらのｉＰＳ細胞を、移植に用いた。
　また、胚様体を移植に用いる場合には、それぞれｉＰＳ細胞３０００ｃｅｌｌｓから、（３）に記載の方法で作製した胚様体４８個を、３０μｌのI型コラーゲンゲル（新田ゼラチン）に包含し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで１０分以上コラーゲンゲルを固化させることによって、コラーゲンゲル内に胚様体を内包させた。コラーゲンゲルに内包させたこれらの胚様体を、移植に用いた。
　７～１０週齢のＣ．Ｂ－１７／ｌｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ　Ｊｃｌマウスに５ｎｇ／ｍｌペントバルビタールを腹腔注射することによって麻酔し、前述のコラーゲンゲルに内包させたｉＰＳ細胞、または、ｉＰＳ細胞から作製した胚様体を、腎臓皮膜下に移植した。移植後２８日目に、形成されたテラトーマを摘出した。
（５）テラトーマからの器官の摘出
　テラトーマを５ｍｍ角の片になるように裁断した。０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（－）に対し１００Ｕ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を加えた溶液に、裁断したテラトーマを加え、３７℃で５分間振とうさせながら反応させた。酵素処理後のテラトーマ片からマイクロサージェリーにより器官を摘出した。
２．結果
（６）胚様体を介したテラトーマ内での器官誘導
　単個細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌｓ）状態のｉＰＳ細胞を生体内に移植した際に形成されるテラトーマ内の各組織の形成を解析するため、（２）に記載の方法で培養した１ｘ１０６個のｉＰＳ細胞を、（４）に記載の方法で３０μｌのコラーゲンゲルに内包させ、ＳＣＩＤマウスの腎皮膜下に移植した。移植２８日後に形成されたテラトーマを、ＨＥ染色により組織学的に解析した。その結果、表皮やニューラルロゼット構造などの外胚葉性組織、筋や骨、軟骨などの中胚葉性組織、腸管様上皮などの内胚葉性組織のテラトーマ内での形成が認められた（図１）。しかし、分泌腺に関しては、組織学的解析を行った全３例中、非常に小型の分泌腺が１例において認められたのみであった。
　テラトーマ中における分泌腺の誘導を促進するため、（３）に記載の方法で、ｉＰＳ細胞の凝集塊である胚様体を作製し、（４）に記載の方法でＳＣＩＤマウスの腎皮膜下に移植した。移植２８日後に形成されたテラトーマを、ＨＥ染色により組織学的に解析した。その結果、胚様体を移植した群において形成されたテラトーマでは、分泌腺様の組織構造が高い頻度で確認された（図２）。さらに、分泌腺様構造に隣接して円柱上皮よりなる管腔構造がみられ、これらは腺組織と隣接する導管構造の一部であることが示唆された。すなわち、胚様体の状態にしたｉＰＳ細胞を足場材料と混合して移植することにより、単個細胞状態のｉＰＳ細胞を移植する場合と比較して、効率よく分泌腺を誘導することができることが示された。
実施例２：胚様体を含む結合体の生体内移植による分泌腺の形成
１．材料と方法
（１）実験動物
　Ｃ．Ｂ－１７／ｌｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウスはクレア（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）にて、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ　ｈｒ／ｈｒ（ＳＨＯ）マウスはチャールズリバー（Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）にて購入した。マウスの管理および操作はＮＩＨの実験動物指針に従った。全ての実験は東京理科大学の実験動物管理委員会の認可の上実施した。
（２）細胞培養
　マウスｉＰＳ細胞（ｍＧＦ－ｉＰＳ－３Ｆ－３）はマイトマイシンＣ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）処理したＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞と共培養した。培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ；　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、１５％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（Ｊａｐａｎ　Ｂｉｏ　Ｓｅｒｕｍ）、５０　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１ｘ１０－４Ｍ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１ｘ１０－４Ｍ　Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地を用いた。１日毎に培地交換し、継代後２日目にＤ－ＰＢＳ（－）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて継代培養した。
　ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞は０．１％ゼラチン水溶液で３７℃，２時間以上ゼラチンコートしたディッシュ上で培養した。培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ；　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、７％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地を用いた。前記培地にマイトマイシンＣを終濃度１２μｇ／ｍｌになるよう添加し、ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞を３７℃，２時間１５分反応させることにより、ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞のマイトマイシン処理を行った。その後、反応させた細胞を２．５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でゼラチンコートディッシュに播種した。マイトマイシン処理後２４時間以上培養したものをｉＰＳ細胞との共培養用のフィーダー細胞として用いた。
（３）胚様体の作製
　ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞ごと酵素処理により培養皿より剥離し、緩和なピペッティングによりシングルセル化した。セルソーター（ＦＡＣＳ　ＡｒｉａIII，　ＢＤ）を用いて、ＳＳＣとＦＳＣにより、フィーダー細胞を除去してｉＰＳ細胞のみをソーティングした。ソーティングしたｉＰＳ細胞を１．５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように、（２）に記載のｉＰＳ細胞の培養培地へ再懸濁し、さらに３，０００ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように、９６穴低接着性プレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ，ＮＯＦ）へ播種した。
（４）胚様体へのＷｎｔ１０ｂ刺激
　（２）および（３）に記載の方法にて低細胞付着性プレートへｉＰＳ細胞を播種した後、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ　；　ＧＩＢＣＯ）に，１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（Ｊａｐａｎ　Ｂｉｏ　Ｓｅｒｕｍ），５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを加えた培地を用いて、７日間の培養を行った。播種後４日目に半量培地交換し、培養７日目に、胚様体の形成を位相差顕微鏡により確認を行い、形態的に異常が無い胚様体に対してＷｎｔ１０ｂ刺激を行った。０．１ｍｇ／ｍＬ　Ｗｎｔ１０ｂ（Ｒ&Ｄ）ｉｎ　ＰＢＳをストックとして、１μｇ／ｍＬとなるようにｉＰＳ細胞用の培地に添加した。胚様体を形成したＷｅｌｌの培地を半量捨てて、Ｗｎｔ１０ｂを含むｉＰＳ細胞用の培地により半量交換した（終濃度５００ｎｇ／ｍＬ）。ＣＯ２インキュベーター内にて、Ｗｎｔ１０ｂ添加培地中の胚様体を２４時間培養した。
（５）ｉＰＳ細胞由来の胚様体の移植によるテラトーマの形成
　シリコングリースを薄く塗った滅菌プラスチックディッシュ上にて３０μｌの冷I型コラーゲンゲル（新田ゼラチン）ドロップを形成し、ゲル形成する前に手早く３２個または４８個の胚様体を包含させ、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃、１０分間インキュベートしてゲル化させた。胚様体を包含したコラーゲンゲルを、１個ずつ麻酔下でＣ．Ｂ－１７／ｌｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウス（７～１０週齢）の両腎の腎皮膜下へ移植した。移植後２８または３０日目にｉＰＳ細胞由来の胚様体を移植したマウスを犠牲死させて、テラトーマを摘出した。
（６）テラトーマ内の嚢胞の組織学的分析
　テラトーマ内の嚢胞上皮の解析および誘導された器官の組織学的分析を行うために、摘出したテラトーマの重量を計測してマクロ写真を撮影した後に、当該テラトーマをマイルドホルム１０Ｎ固定液（Ｗａｋｏ）に浸漬して、室温にて一晩固定した。固定したテラトーマ組織は、通法に従ってパラフィン包埋または凍結包埋して、１０μｍ厚の連続切片を作製した。連続切片の全部または一部をマイヤー処方のヘマトキシリンを用いてＨＥ染色して、テラトーマ内嚢胞の組織学的分析を行った。テラトーマ内の毛包形成頻度を解析するために、ブロック表面より３ｍｍ厚分を組織化学解析し、正立顕微鏡Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ　Ａ１（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）とＡｘｉｏＣＡＭ　ＭＲｃ５（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を用いて、形成された毛包の個数をカウントした。連続切片上で毛球部が一番大きくなった毛包のみをカウントした。また、組織像は正立顕微鏡Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ　Ａ１（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）とＡｘｉｏＣＡＭ　ＭＲｃ５（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で撮影した。
２．結果
（７）胚様体を含む結合体の生体内移植による、分泌腺の形成
（７－１）胚様体を含む結合体の生体内移植物の組織学的解析
　胚様体を含む結合体を生体内に移植して形成されたテラトーマ内の嚢胞について、連続切片のＨＥ染色像を観察して、組織学的な特徴を解析した。その結果、皮膚様嚢胞には皮脂腺を有する毛包が接続しており、皮脂腺の接続位置を境界として嚢胞上皮方向には線維芽細胞が散在するエオジン好性の真皮層が位置しており、毛球部方向には脂肪組織が分布していた。嚢胞の表皮層は基底細胞層、曲細胞層、顆粒層および角質層が規則的に配置されており、角質層は嚢胞腔内に向けて明瞭な層状に剥離していることから典型的な皮膚表皮組織であることが示された。毛包の開口部より嚢胞内腔に向けて毛幹が成長していることが示された（図３、黒矢印）。皮脂腺と毛包の接続部位は毛包漏斗部または毛穴の開口部であり（図３、左白矢頭）、皮脂が毛穴を介して表皮外層に分泌しうることが示唆された。この構造は天然の皮膚の組織学的特徴と完全に一致しており、嚢胞腔を中心として全層皮膚が誘導されていることが示された。一方、粘膜様嚢胞には毛包などの外胚葉性器官は認められず、やや不明瞭な単層角化上皮層の周囲をルーズな結合組織である粘膜固有層と粘膜下層がとりまき、粘膜下層には平滑筋層と分泌腺様の組織が配置されており、組織学的に粘膜などと同等であることが示された（図３、右）。
（７－２）胚様体形成時のＷｎｔ１０ｂ添加による上皮組織の領域誘導
　（３）～（５）に記載の方法により、マウス腎皮膜下に形成したテラトーマ（図４Ａ）の組織切片をＨＥ染色し、形成された嚢胞の上皮組織および周囲の間質組織の組織学的特徴より、皮膚様（扁平重層角化上皮層／真皮層／脂肪または横紋筋）、粘膜様（扁平重層角上皮／粘膜固有層／横紋筋）、移行上皮（扁平重層角化上皮と単層柱状上皮の移行形態）、内胚葉性上皮様（単層柱状上皮／粘膜固有層／横紋筋）に分類して、その構成比率を計測した（図４Ｂ）。その結果、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行わなかった胚様体による移植物と比べて、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体を移植した場合、内胚葉性上皮様の嚢胞が減少して、皮膚様および粘膜様の頻度が増加した（図４Ｃ）。
（７－３）Ｗｎｔ１０ｂ添加による毛包形成頻度の増加
　Ｗｎｔ１０ｂ刺激した胚様体由来のテラトーマ１ｇあたりに含まれる誘導毛包数（２８５±１２８，ｎ＝４）は、Ｗｎｔ１０ｂ未処理群（３９±２１，ｎ＝８）に比べて有意に増加した（図４Ｄ）。また腎皮膜下内への胚様体移植後２８－３０日目のテラトーマ内に誘導された毛包より成長した毛幹長を計測したところ、Ｗｎｔ１０ｂ添加群が未処理群に比べて２倍の長さであった。
（７－４）Ｗｎｔ１０ｂ添加による外分泌腺組織の誘導
　Ｗｎｔ１０ｂ刺激を加えた胚様体由来のテラトーマのＨＥ組織解析において、外分泌腺の腺房構造が多数集蔟した構造が認められた（図３右）。そこで、唾液腺と膵臓の外分泌腺のみが分泌するアミラーゼに対する抗体を用いて、外分泌腺の腺房類似組織を免疫染色したところ、上皮性細胞マーカーであるＥカドヘリン陽性細胞の細胞質において分泌小胞に特有な顆粒状の陽性像が示された。この結果より、Ｗｎｔ１０ｂ刺激により、唾液腺などの外分泌腺がより効率的に誘導されることが示唆された（図５）。
　以上の結果から、胚様体の状態にしたｉＰＳ細胞に対し、Ｗｎｔ経路を活性化し得る生理活性物質で刺激を行ったうえで動物に移植することにより、さらに効率的に分泌腺を誘導し得ることが示された。

Claims (10)

  1. 　分泌腺を製造する方法であって、
    　下記ステップ；
    　（ａ）下記（Ａ）および（Ｂ）を含む結合体を調製するステップ；
    　　（Ａ）胚様体の全部または一部
    　　（Ｂ）足場材料
    　（ｂ）前記ステップ（ａ）で調製した前記結合体を、動物に移植するステップ、および、
    　（ｃ）前記動物中において、前記結合体由来の分泌腺を製造するステップ、
    を含むことを特徴とする、方法。
  2. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記動物が、非ヒト動物である、
    方法。
  3. 　請求項２に記載の方法であって、
    　前記非ヒト動物が、非ヒト免疫不全動物である、
    方法。
  4. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記胚様体が、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から作製された胚様体である、
    方法。
  5. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記胚様体が、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質による刺激を行ったものである、
    方法。
  6. 　請求項５に記載の方法であって、
    　前記Ｗｎｔ経路が古典的Ｗｎｔ経路である、
    方法。
  7. 　請求項５または６に記載の方法であって、
    　前記「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質」が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、および、ＴＧＦ－βからなる群から選択される、
    方法。
  8. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記足場材料が、コラーゲンゲルである、
    方法。
  9. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記移植が、腎皮膜下への移植である、
    方法。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって製造される、
    　分泌腺。
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