WO2016031892A1 - イムノクロマトグラフィー用テストストリップ - Google Patents

イムノクロマトグラフィー用テストストリップ Download PDF

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WO2016031892A1
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pad
sample
conjugate
substance
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Inventor
いつみ 高野
公良 西谷
Original Assignee
積水メディカル株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic test strip and a detection method using the same.
  • the present invention relates to a test strip suitable for detecting a substance to be detected in a sample derived from stool and a detection method using the test strip. Furthermore, it is related with the suppression method of a nonspecific reaction in the detection using the test strip for immunochromatography.
  • Detection methods using immunochromatography are widely used because detection with high specificity and sensitivity is possible.
  • samples applied for detection using immunochromatography include urine, feces, saliva, blood, serum, and the like, which are suitable as clinical laboratory samples and are widely used as diagnostically useful samples.
  • In order to detect a substance to be detected contained in these samples using immunochromatography it is necessary to exclude various detection interfering substances contained in the sample. As an interfering substance, a color reaction is carried out in spite of the fact that there is no substance that causes clogging of the insoluble membrane for development, which hinders the development of the sample itself by immunochromatography, or there is no substance to be detected. There are substances that cause so-called non-specific reactions as shown.
  • Patent Document 1 discloses a method in which a buffer containing a specific polymer is used as a developing solvent for immunochromatography in order to suppress nonspecific reactions.
  • Patent Document 2 discloses an immunochromatographic detection device in which serum albumin and a linear water-soluble polymer are coexisting with a conjugate in order to suppress nonspecific reactions.
  • gelatin, casein, bovine serum albumin and the like are generally known as reagents for blocking non-specific reactions in antigen-antibody reactions, and various methods for coexisting them in the immunochromatographic reaction system are also known. As described above, various methods for eliminating the influence of detection interference substances are known. In the detection method using immunochromatography, a method for suppressing these non-specific reactions when a sample derived from stool is applied. So far there has been no investigation.
  • the present invention relates to a method for suppressing nonspecific reactions peculiar to stool in a detection method using immunochromatography for detecting a substance to be detected in a sample by developing a sample derived from stool in an insoluble membrane, and
  • An object is to provide an immunochromatographic test strip to be used.
  • the present inventors have used a test strip in which a porous third pad made of polysulfone or cellulose acetate is arranged upstream of an insoluble membrane, so that a fecal sample can be used.
  • a test strip in which a porous third pad made of polysulfone or cellulose acetate is arranged upstream of an insoluble membrane, so that a fecal sample can be used.
  • the present inventors have found that the non-specific reaction can be suppressed and detected accurately, and the present invention has been completed.
  • These materials have been used as blood cell separation membranes in immunochromatography for developing whole blood as a sample, but have been completely used in immunochromatography for developing fecal samples. And the possibility has not been studied.
  • the present inventors have found that a nonspecific reaction can be unexpectedly suppressed by allowing a complex of a stool-derived sample and a conjugate to pass through using such a material suitable for blood cell separation, and the present invention. It came to complete. That is, the present invention has the following configuration.
  • An immunochromatographic test strip for detecting a complex of a detected substance and a conjugate in a sample by spreading a sample derived from stool in an insoluble membrane, wherein the conjugate is immunized against the detected substance.
  • the test strip wherein an antibody or antigen that reacts chemically is immobilized on a label and has the following constitutions (1) to (3).
  • Sample pad having a sample supply part
  • Porous third pad made of polysulfone or cellulose acetate disposed downstream of the sample pad and upstream of the insoluble membrane
  • Immunity against a substance to be detected Insoluble membrane ⁇ 2> having a detection part for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample, to which a chemically reactive antibody or antigen is immobilized
  • the porous third pad has an average pore diameter of 1 to 100 ⁇ m.
  • a detection method using immunochromatography that detects a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample by developing a sample derived from stool in an insoluble membrane, and includes the following steps (a) to (c): Comprising the steps of: (A) A sample is brought into contact with a conjugate in which an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label to form a complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample.
  • a non-specific reaction suppression method in detection using immunochromatography for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample by developing a sample derived from stool in an insoluble membrane comprising the following steps (a ) To (c). (A) A sample is brought into contact with a conjugate in which an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label to form a complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample.
  • the immunochromatographic test strip including a third pad made of a specific material according to the present invention can detect a substance to be detected in a stool-derived sample without causing a non-specific reaction peculiar to stool. Therefore, the substance to be detected in stool can be accurately detected using immunochromatography.
  • test strip which has arrange
  • stool is used as a sample.
  • the stool may be used as a sample as it is, or may be diluted with a diluent as appropriate. Moreover, you may use as a sample what was diluted and filtered suitably.
  • the substance to be detected of the present invention may be any substance as long as it is contained in feces as a sample and can be detected using an antigen-antibody reaction, and examples thereof include viruses, parasites, and proteins.
  • infectious gastroenteritis is mainly caused by viruses and parasites.
  • viruses that can be detected include norovirus, adenovirus, rotavirus, sapovirus, enterovirus, etc.
  • insects include cryptospiridium, amoeba dysentery, giardia and the like.
  • influenza virus as a virus to be detected, and proteins to be detected include human hemoglobin, hepatitis B virus antibody, hepatitis C virus antibody, human immunodeficiency virus antibody, and the like.
  • the immunochromatographic test strip of the present invention is a test strip for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample by developing a sample derived from stool in an insoluble membrane, and has the following configuration ( 1) to (3).
  • Sample pad having a sample supply part (2) Porous third pad made of polysulfone or cellulose acetate disposed downstream of the sample pad and upstream of the insoluble membrane (3) Immunity against a substance to be detected
  • An insoluble membrane having a detection part for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample, to which a chemically reactive antibody or antigen is immobilized
  • the conjugate is an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected and is immobilized on a label.
  • the conjugate is present as a conjugate pad, a sample pad, a third pad, It may exist in a state where it is impregnated in another pad other than the insoluble membrane (type A), may exist as a conjugate part in a part of the sample pad (type B), and further, a test strip Alternatively, it may exist as a separate conjugate reagent to be mixed with the specimen (type C).
  • test strip of the type A in which the conjugate is present will be described.
  • the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are arranged in this order from upstream to downstream in the sample flow direction, and are arranged so that at least a part of the upper and lower layers overlap each other.
  • a test strip of such an arrangement is shown in FIG.
  • the composite is then passed through a porous third pad placed in contact with the bottom surface of the conjugate pad and developed into an insoluble membrane. Since an insoluble membrane is immobilized with an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected, a part of the insoluble membrane is bound and immobilized by an immune reaction. Become.
  • the immobilized complex is detected by a means for detecting absorbance or reflected light derived from the conjugate.
  • test strip having a conjugate type of type B will be described.
  • the difference from the type A test strip is that the sample pad and the conjugate pad are integrated, that is, the sample supply part and the conjugate part are formed in a part of the sample pad.
  • the sample supply part is a part for supplying a sample containing a substance to be detected
  • the conjugate part is a part containing a conjugate
  • the sample supply part is on the upstream side of the conjugate part.
  • a test strip having a conjugate type of type C will be described.
  • the difference from the above type A test strip is that there is no conjugate pad and the conjugate is present as a separate conjugate reagent.
  • a filter chip in which a conjugate is incorporated in a filter can be mentioned.
  • the conjugate and the substance to be detected are bonded to each other by passing the specimen diluent, thereby forming a complex (aggregate).
  • the substance to be detected can be detected.
  • the sample pad used in the present invention is a portion that receives a sample, and includes any substance and form that can absorb a liquid sample while being molded into the pad and allow the liquid and the detection target to pass through.
  • materials suitable for the sample pad include, but are not limited to, glass fiber (glass fiber), acrylic fiber, hydrophilic polyethylene material, dry paper, paper pulp, and fabric.
  • a fiberglass pad is used.
  • the sample pad can also have the function of a conjugate pad described later.
  • the sample pad can contain a blocking reagent that is usually used for the purpose of preventing / suppressing nonspecific reaction (adsorption) in the antibody-immobilized membrane.
  • the third pad may be any one that can permeate the complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample.
  • the purpose of the present invention is to capture a nonspecific reaction substance derived from stool. Therefore, the third pad needs to be a porous member made of polysulfone or cellulose acetate. Although the reason is not clear, the third pad made of these materials allows the non-specific reaction substance due to the stool sample to be captured and the non-specific reaction can be reduced, although the complex of the conjugate and the substance to be detected is passed. .
  • a third pad made of a material other than polysulfone and cellulose acetate did not show the effect of reducing non-specific reactions.
  • the average pore diameter of the porous third pad of the present invention is 1 ⁇ m or more as a lower limit, preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more, further preferably 15 ⁇ m or more, particularly preferably 20 ⁇ m or more, and preferably 25 ⁇ m or more. Most preferred.
  • 100 micrometers or less are illustrated, 80 micrometers or less are preferable, 60 micrometers or less are more preferable, 55 micrometers or less are further more preferable, 50 micrometers or less are especially preferable, and 45 micrometers or less are the most preferable.
  • the range of the average pore diameter is exemplified by 1 to 100 ⁇ m which is a combination of the above lower limit and upper limit, preferably 5 to 80 ⁇ m, more preferably 10 to 60 ⁇ m, further preferably 15 to 55 ⁇ m, and particularly preferably 20 to 50 ⁇ m. 25 to 45 ⁇ m is most preferable. This is because if it is less than 1 ⁇ m, clogging is caused and the flow of the specimen itself becomes slow, and if it is more than 100 ⁇ m, it is considered that the function of capturing the non-specific reaction substance is lowered.
  • the said average hole diameter is calculated
  • the insoluble membrane used in the present invention has at least one detection unit on which an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized. Immobilization of an antibody or antigen that reacts immunologically with a substance to be detected on an insoluble membrane carrier can be carried out by a conventionally known method.
  • a lateral flow type immunochromatographic reagent it has a mechanism capable of preparing a liquid containing the above-mentioned antibody or antigen at a predetermined concentration and moving it horizontally while discharging the liquid from the nozzle at a constant speed.
  • the solution can be immobilized by applying the solution to the insoluble membrane carrier in a line using a device or the like and drying.
  • the concentration of antibody or antigen in the above solution is preferably 0.1 to 5 mg / mL, more preferably 0.5 to 2 mg / mL.
  • the amount of antibody or antigen immobilized on an insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the ejection speed from the nozzle of the above apparatus in the case of the lateral flow type, and is preferably 0.5 to 2 ⁇ L / cm. It is.
  • the measurement method using the lateral flow type immunochromatography reagent is a measurement method in which the sample is developed so as to move in a parallel direction with respect to the insoluble membrane carrier by capillary action.
  • a solution containing the antibody or antigen described above at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody or antigen to a buffer solution.
  • the buffer examples include normal buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good's buffer.
  • the pH of the buffer is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and even more preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers such as sucrose, preservatives, preservatives such as procrine, and the like.
  • the salts include those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide, in addition to those included for adjusting the ionic strength, such as sodium chloride.
  • blocking can also be carried out by coating a region other than the region where the antibody or antigen is immobilized with a commonly used blocking agent in the form of a solution or vapor.
  • a control capture reagent conventionally used in immunochromatographic reagents may be immobilized on the insoluble membrane.
  • the control capture reagent is a reagent for ensuring the reliability of the assay, and captures the control reagent contained in the conjugate pad.
  • an anti-KLH antibody or the like corresponds to the control capture reagent.
  • the position at which the control capture reagent is immobilized can be appropriately selected to suit the design of the assay system.
  • a known membrane conventionally used as an insoluble membrane carrier for an immunochromatographic reagent can be used.
  • membranes composed of fibers made of polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, ceramics, and the like are preferred.
  • glass fiber filter paper and cellulose filter paper commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Roshi, Whatman and the like. Of these, Sartorius and UniSart® CN140 are preferred.
  • by appropriately selecting the pore size and structure of the insoluble membrane carrier it is possible to control the speed at which the complex of the conjugate and the substance to be detected in the sample flows through the insoluble membrane carrier.
  • the immunochromatographic test strip is preferably disposed on a solid support such as a plastic adhesive sheet.
  • the solid support is composed of a material that does not interfere with the capillary flow of the sample and conjugate.
  • the immunochromatographic test strip may be fixed on a solid support with an adhesive or the like.
  • the adhesive component and the like are also composed of a substance that does not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the immunochromatographic test strip is stored in an appropriate container (housing) taking into account the size of the immunochromatographic test strip, the method and position of sample addition, the position where the insoluble membrane detector is formed, and the signal detection method. -It can be mounted and used, and the state stored and mounted in this way is called "device".
  • the antibody or antigen that immunologically reacts with the substance to be detected used in the present invention is an antibody or antigen that can bind to the substance to be detected.
  • the substance to be detected is a virus or an antigen
  • the antibody or the substance to be detected When is an antibody, an antigen is preferred.
  • An antibody or antigen that reacts immunologically with a substance to be detected is immobilized on a label and a detection part described later.
  • the antibody or antigen immobilized on the label and the detection unit may be the same, but it is preferable that the label and the detection unit are different.
  • Marker As the label used in the present invention, a known label conventionally used for a test strip for immunochromatography can be used.
  • colloidal metal particles such as gold colloid particles and platinum colloid particles, color latex particles, magnetic particles, and fluorescent particles are preferable, and gold colloid particles and color latex particles are particularly preferable.
  • the conjugate used in the present invention is obtained by immobilizing an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected on the label as described above.
  • the conjugate is preferably one in which an anti-rotavirus monoclonal antibody and an anti-adenovirus monoclonal antibody are immobilized on colloidal gold particles.
  • Examples of a method for immobilizing an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected to a label include physical adsorption and chemical bonding, and are generally immobilized by physical adsorption.
  • the immunochromatographic test strip of the present invention may further contain other reagents and components depending on measurement conditions and samples.
  • examples of other reagents include blocking agents that prevent non-specific reactions.
  • Other configurations include, for example, an absorption pad that controls the development of the sample by absorbing the sample that has moved and passed through the insoluble membrane.
  • the production of the immunochromatographic test strip of the present invention can be carried out by appropriately modifying or altering the method described in the examples.
  • the detection kit using the immunochromatography of the present invention only needs to include the immunochromatographic test strip.
  • the detection kit may further include a reagent necessary for detection, a sample diluent, a test tube, a swab for collecting stool, an instruction manual, a housing for storing a test strip, and the like.
  • upstream or downstream is used to mean the upstream side or the downstream side in the direction of sample flow.
  • the test pad of the present invention is laminated so that the sample pad, conjugate pad, third pad, and insoluble membrane partially overlap from the top, the sample pad is the most upstream and the insoluble membrane is the downstream.
  • the end pad may be stacked on the downstream side of the insoluble membrane so as to overlap with each other. In this case, the end pad is the most downstream.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of the immunochromatographic test strip of the present invention. Place the insoluble membrane (b) on the plastic adhesive sheet (a), then place and install the third pad (g), conjugate pad (d), sample pad (e) in this order, and the absorbent pad on the opposite end. (f) was placed and mounted.
  • the conjugate pad is impregnated with a conjugate of gold colloid sensitized with an anti-adenovirus monoclonal antibody, and the insoluble membrane contains anti-adenovirus monoclonal antibody (c1) and control reagent (c2) in the flow direction. It is fixed on the line vertically.
  • Each pad is laminated so that the upper and lower pads are in contact with a part thereof.
  • a line made of the anti-adenovirus monoclonal antibody (c1) is called a test line, and a line made of the control reagent (c2) is called a control line.
  • Test results are shown in Table 1. From this result, when a third pad made of polysulfone and cellulose acetate was used as the third pad, the nonspecific reaction could be suppressed, and in particular, the case of polysulfone could suppress the nonspecific reaction better. In this case, the average pore diameter of the porous holes of the third pad was 20 to 50 ⁇ m. On the other hand, when a third pad made of polyamide, polycarbonate, polyethersulfone, or glass fiber was used, the nonspecific reaction could not be suppressed. In addition, even when the third pad itself was not used, coloring was observed on the test line, and the nonspecific reaction could not be suppressed (not shown in the table).
  • the immunochromatographic test strip including a third pad made of a specific material according to the present invention can detect a substance to be detected in a stool-derived sample without causing a non-specific reaction peculiar to stool. Therefore, the substance to be detected in stool can be accurately detected using immunochromatography.

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Abstract

　糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便に特有の非特異反応を抑制する方法および、これに用いるイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することを課題とする。　ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッドを、不溶性メンブレンの上流に配置したテストストリップを利用することにより、糞便由来サンプルにおいても、非特異反応を抑制する方法および、これに用いるイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供する。

Description

イムノクロマトグラフィー用テストストリップ
　本発明はイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびこれを利用した検出方法に関する。特に、糞便由来のサンプル中の被検出物質を検出するのに適したテストストリップおよびこれを利用した検出方法に関する。さらに、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを利用した検出における、非特異反応の抑制方法に関する。
　イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法は、特異性や感度の高い検出が可能であることから広く普及している。イムノクロマトグラフィーを利用した検出に適用されるサンプルとしては、尿、糞便、唾液、血液、血清などが挙げられ、これらは臨床検査サンプルとして好適であり、診断上有用なサンプルとして広く利用されている。
　これらのサンプル中に含まれる被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出するためには、サンプル中に含まれるさまざまな検出妨害物質を排除する必要がある。妨害物質としては、イムノクロマトグラフィーによるサンプルの展開そのものの妨げになるような、展開用の不溶性メンブレンの詰まりの原因となるような物質や、被検出物質が存在しないにも拘わらず、呈色反応を示すような、いわゆる非特異反応の原因となるような物質がある。この非特異反応の原因としては種々の要因が考えられるが、未だ明らかではない。
　一般に、不溶性メンブレン中の詰まりの原因となるような物質を排除するためには、サンプルパッドにその分離機能を担保させたり、全血をサンプルとする場合には、血球を排除するために血球分離膜をサンプル添加部の下流に配置する方法が知られている。
　また、特許文献１には、非特異反応を抑制するために、特定のポリマーを含有する緩衝液をイムノクロマトグラフィーの展開溶媒として用いる方法が開示されている。
　また、特許文献２には、非特異反応を抑制するために、血清アルブミンおよび直鎖状水溶性ポリマーをコンジュゲートと共存配置させたイムノクロマトグラフィー検出装置が開示されている。
　さらにまた、抗原抗体反応における非特異的反応をブロッキングする試薬としてゼラチン、カゼイン、ウシ血清アルブミンなどが一般に知られており、これらをイムノクロマト反応の系内に共存させる方法も種々知られている。
　このように、検出妨害物質による影響を排除するための方法は種々知られているが、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便由来のサンプルを適用する場合にこれらの非特異反応を抑制する方法について検討されたものはこれまでなかった。
特開2003-344406号公報 特開2002-148266号公報
　本発明は、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便に特有の非特異反応を抑制する方法および、これに用いるイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッドを、不溶性メンブレンの上流に配置したテストストリップを利用することにより、糞便由来サンプルにおいても、非特異反応を抑制し、正確に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。これらの材質は、全血をサンプルとして展開させるためのイムノクロマトグラフィーにおいて血球分離膜としては利用されることはあったが、糞便由来のサンプルを展開させるためのイムノクロマトグラフィーにおいては今まで全く利用されたことがなく、またその可能性についても検討されたことがないものである。本発明者らは、このようなもっぱら血球分離に適した材料を使って、糞便由来サンプルとコンジュゲートとの複合体を通過させることで、意外にも非特異反応が抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成（１）～（３）を有する前記テストストリップ。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されるポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッド
（３）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
＜２＞
コンジュゲートが、コンジュゲートパッドに含浸されており、該コンジュゲートパッドはサンプルパッドの下流であってサードパッドの上流に配置されている、前記＜１＞に記載のテストストリップ。
＜３＞
多孔質性サードパッドの平均孔径が１～１００μｍである前記＜１＞または＜２＞に記載のテストストリップ。
＜４＞
糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体をポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッドを通過させる工程
（ｃ）サードパッドを通過した前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
＜５＞
コンジュゲートが、コンジュゲートパッドに含浸されており、該コンジュゲートパッドはサンプルパッドの下流であってサードパッドの上流に配置されている、前記＜４＞に記載の検出方法。
＜６＞
多孔質性サードパッドの平均孔径が１～１００μｍである前記＜４＞または＜５＞に記載の検出方法。
＜７＞
糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
（ｂ）前記複合体をポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッドを通過させて非特異反応物質を低減させる工程
（ｃ）サードパッドを通過した前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
　本発明の、特定の材質からなるサードパッドを含むイムノクロマトグラフィー用テストストリップによれば、糞便由来のサンプル中の被検出物質を糞便に特有の非特異反応を起こさずに検出することができる。したがって、糞便中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して、正確に検出することが可能となった。
本発明のサードパッドを配置したテストストリップの模式構成図である。 サードパッド無しのテストストリップの模式構成図である。
（サンプル）
　本発明において、サンプルとしては糞便を用いる。糞便は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。
（被検出物質）
　本発明の被検出物質としては、サンプルである糞便中に含まれ、抗原抗体反応を利用して検出し得るものであればいずれでもよく、ウイルス、寄生虫、タンパク質などが挙げられる。
　例えば感染性胃腸炎は、ウイルスおよび寄生虫が主な原因であり、被検出物質となるウイルスとしては、ノロウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、エンテロウイルス等があげられ、被検出物質となる寄生虫としてはクリプトスピリジウム、アメーバ赤痢、ジアルジア等があげられる。このほかにも、被検出物質となるウイルスとしてインフルエンザウイルス、被検出物質となるタンパク質としては、ヒトヘモグロビン、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップ）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップであって、以下の構成（１）～（３）を有している。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されるポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッド
（３）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
　コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
　サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度あるいは反射光を検出する手段により検出される。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
　上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、検体希釈液を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。
（サンプルパッド）
　本発明に用いられるサンプルパッドとは、サンプルを受け入れる部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。　
（サードパッド）
　サードパッドは、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよいが、本発明では、糞便由来の非特異反応物質を捕捉することを目的とするため、サードパッドは、ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性の部材である必要がある。これらの材質のサードパッドは、理由は定かではないがコンジュゲートと被検出物質の複合体を通過させるものの、糞便サンプルに起因する非特異反応物質を捕捉し、非特異反応を低減させることができる。一方で、ポリスルホンおよびセルロースアセテート以外の材質からなるサードパッドでは非特異反応を低減させる効果は認められなかった。すなわち、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン、グラスファイバーにはそのような捕捉機能はなかった。
　また、本発明の多孔質性サードパッドの平均孔径は、下限としては１μｍ以上が例示され、５μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましく、１５μｍ以上がさらに好ましく、２０μｍ以上が特に好ましく、２５μｍ以上が最も好ましい。上限としては、１００μｍ以下が例示され、８０μｍ以下が好ましく、６０μｍ以下がより好ましく、５５μｍ以下がさらに好ましく、５０μｍ以下が特に好ましく、４５μｍ以下が最も好ましい。また、平均孔径の範囲としては、上記下限と上限の組み合わせである１～１００μｍが例示され、５～８０μｍが好ましく、１０～６０μｍがより好ましく、１５～５５μｍがさらに好ましく、２０～５０μｍが特に好ましく、２５～４５μｍが最も好ましい。１μｍ未満では詰まりの原因となり、検体の流れ自体が遅くなるからであり１００μｍより大きいと前記非特異反応物質を捕捉する機能が低下するためと思われるからである。
　上記平均孔径は、サードパッドの表面又は裏面の電子顕微鏡写真から求めたものである。
（不溶性メンブレン）
　本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体または抗原の濃度は０．１～５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５～２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５～２μＬ／ｃｍが好適である。
　なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
　また、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体または抗原を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
　不溶性メンブレンに抗体または抗原を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体または抗原を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
　なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたKLHをコントロール試薬として含む場合には、抗KLH抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
　本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。
　上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
（被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原）
　本発明で用いられる被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、被検出物質に結合可能な抗体または抗原であり、被検出物質がウイルスや抗原の場合は抗体、被検出物質が抗体の場合は抗原が好ましい。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、後述する標識体および検出部に固定化される。標識体および検出部に固定化される抗体または抗原は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。
（標識体）
　本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
（コンジュゲート）
　本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されたものである。コンジュゲートは、被検出物質がロタウイルスおよびアデノウイルスを検出する場合、金コロイド粒子に抗ロタウイルスモノクローナル抗体および抗アデノウイルスモノクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
　被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
（その他）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、さらに測定条件、サンプルに応じて他の試薬や構成を含み得る。
　他の試薬としては、例えば非特異反応を防止するブロッキング剤が挙げられる。
　他の構成としては、例えば、不溶性メンブレンを移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する吸収パッドが挙げられる。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
（キット）
　本発明のイムノクロマトグラフィーを利用した検出キットは、前記イムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むものであればよい。本検出キットは、他に検出に必要な試薬、サンプルの希釈液、試験用チューブ、便採取用の綿棒、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
(その他)
　本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
１．試験方法
（i）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
　図１に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
　プラスチック製粘着シート（a）に不溶性メンブレン（b）を貼り、次いで、サードパッド(g)、コンジュゲートパッド（d)、サンプルパッド（e）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(ｆ)を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗アデノウイルスモノクローナル抗体を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗アデノウイルスモノクローナル抗体（ｃ１）およびコントロール試薬（ｃ２）が流れ方向に対して垂直にライン上に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗アデノウイルスモノクローナル抗体（ｃ１）からなるラインをテストライン、コントロール試薬（ｃ２）からなるラインをコントロールラインという。
　このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。
　比較例の「サードパッドなし」のテストストリップを図２に示す。本テストストリップはサードパッドが存在しないため、コンジュゲートパッドの流れ方向下流端部が不溶性メンブレンと、上流端部がサンプルパッドとそれぞれ接するように、サンプルパッドの長さが長いものに代えて配置装着した。
（ii）サードパッドの平均孔径の求め方　
　適当な大きさに切り取ったサードパッドを試料台に固定し、Ptスパッタコーティングを施して検鏡用試料とした。日立製走査電子顕微鏡　S-4800を用い、加速電圧1.5ｋV、観察倍率200～2000倍でサードパッドの表面及び裏面の写真撮影を行った。
　表面および裏面上に観察される孔を６ポイントずつ選択し、これらの孔の直径を測定して、最大値及び最小値を除いた４ポイントの孔の直径の平均値を求めた。ここで、ポリスルホンからなる膜は、表裏で非対称膜のため、上流側として使う面の平均孔径を求めた。
測定結果を表１に示す。
（iii）試験手順
　正常成人４人の糞便を検体として用いた（検体はいずれもアデノウイルスフリーの陰性検体である）。各検体０．１ｍｇを検体希釈液１０００ｍｌに懸濁し、その上清をサンプルとした。
　表１に記載の素材からなるサードパッドを配置したテストストリップにサンプル１２０μＬを滴下し、１０分後にテストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて評価した。カラーチャートによる発色強度は0～4まで0.25刻みの値で数値化されており、0.25未満の極めて弱い非特異反応についてはさらに、SS（非常に弱い）、S(弱い)という基準にて評価した。発色強度の評価結果から、非特異反応の強さの評価を行い、さらに、４検体の結果から総合評価を行った。各評価基準は、表１の下に示した。
２．試験結果
　試験結果を表１に示す。
　本結果より、サードパッドとしてポリスルホンおよびセルロースアセテートからなるサードパッドを用いた場合には、非特異反応を抑制することができ、特にポリスルホンの場合により良く非特異反応を抑制することができた。この場合のサードパッドの多孔質の孔の平均孔径は２０～５０μｍであった。
　一方、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン、ガラスファイバーからなるサードパッドを用いた場合は、非特異反応を抑制することができなかった。また、サードパッド自体を用いなかった場合も、テストラインに着色が観察され、非特異反応を抑制することができなかった（表中に示さず）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の、特定の材質からなるサードパッドを含むイムノクロマトグラフィー用テストストリップによれば、糞便由来のサンプル中の被検出物質を糞便に特有の非特異反応を起こさずに検出することができる。したがって、糞便中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して、正確に検出することが可能となった。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）検出対象に対する抗体
（ｃ２）コントロール試薬
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド
 

Claims (7)

  1. 糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成（１）～（３）を有する前記テストストリップ。
    （１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
    （２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されるポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッド
    （３）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
  2. コンジュゲートが、コンジュゲートパッドに含浸されており、該コンジュゲートパッドはサンプルパッドの下流であってサードパッドの上流に配置されている、請求項１に記載のテストストリップ。
  3. 多孔質性サードパッドの平均孔径が１～１００μｍである請求項１または２に記載のテストストリップ。
  4. 糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）の工程を含む方法。
    （ａ）サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
    （ｂ）前記複合体をポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッドを通過させる工程
    （ｃ）サードパッドを通過した前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
  5. コンジュゲートが、コンジュゲートパッドに含浸されており、該コンジュゲートパッドはサンプルパッドの下流であってサードパッドの上流に配置されている、請求項４に記載の検出方法。
  6. 多孔質性サードパッドの平均孔径が１～１００μｍである請求項４または５に記載の検出方法。
  7. 糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）の工程を含む方法。
    （ａ）サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
    （ｂ）前記複合体をポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性サードパッドを通過させて非特異反応物質を低減させる工程
    （ｃ）サードパッドを通過した前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
     
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