WO2016019572A1

WO2016019572A1 - 基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法及系统

Info

Publication number: WO2016019572A1
Application number: PCT/CN2014/083985
Authority: WO
Inventors: 阮贇杰; 朱松明
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2016-02-11
Anticipated expiration: 2017-02-08

Abstract

公开了一种基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法及系统，实现协同调控循环水养殖系统的生物滤器与微生物响应。通过获取功能微生物氨氧化菌AOB的mRNA实时表达量，在AOB的mRNA响应高表达时间段，提高系统流速，在响应低表达时间段，降低系统流速。从工厂化养殖水处理工艺与微生物响应协同调控的角度出发，解决了现有养殖水处理生物滤器处理效率低、运行能耗偏大等问题。

Description

，尤其涉及一种工 Γ化循环水养殖系统生法。工厂化循环水养殖系统因具有资源节约、环境友好的特点，己成为世界范围内大力推崇发展的水产养殖模式。在超高密度集约化养殖条件下，其系统的核心处理技术为生物过滤，方式主要为通过配置生物滤器，利用定向富集在滤料表面的微生物完成水体主要污染物总氨氮 TA Total Ammonia Nitrogen)与亚硝酸盐 (ΝΌ₂-— N)的去除。其过程主要通过功能微生物群的硝化作，将总氮氮 TAN等通过氨氧化细菌 AOB(Ammonia Oxidizing Bacteria)具有的氨单加氧酶催化氧化为羟胺，再由羟胺氧化为中间产物亚硝酸盐，最后由亚硝酸盐氧化菌： OB(Nitrite Oxidizing Bacteria)将亚硝酸氧化成对养殖对象相对无害的硝酸盐(]^₀₃^，全反应限速步奏为式①，相关化学简式如下：

NH₃ + 0₂ + 2H⁺ ■→ NH₂OH + H₂0 ①

N¾OH + H₂0 ― N0₂- + 5H— ②

NO²" + C0₂ + 0.5 0₂— NO^3- ③ 在实际生产实践中，系统养殖规模（饵料投喂量）与生物滤器的有效容积均已固定，其生物滤器总处理性能主要与流速有关。为维持高密度养殖负荷下较适宜的水质条件，系统运行过程需要较高的流速，通常循环水养殖系统的水力停留时间 HRT(Hydraulic Retention Time)为 0„5- lh，即生物滤器日均循环 24 48次。

然而上述生物滤器恒速运行方法仍然面临如下弊端：在稳定运行的循环水养殖系统内，生物滤器内污染物总氨氮 ΊΆΝ主要源于养殖对象排氨，而相关的排氨速率则主要与饲料量及投喂节律有关，系统水质日变化呈现相对 "峰 - 谷"浓度，因此维持系统较高恒速流动，虽可确保水质稳定，但在污染物浓度峰值时间段内，生物滤器基质来源因流速恒定受限，在谷值时间段，则因低基质浓度使其处于低效运行，故生物滤器单次循环处理效率偏低。为达到总污染物处理量，系统需维持较高流速，从而造成整体能耗偏高。

由于循环水养殖系统水体始终处于内部循环，故其某时间节点的污染物浓度僮为养殖对象排氨、生物滤器处理后的最终结果，若以此为依据实现变速流控制，其信息来源滞后，仅从表观层面被动改变系统流速，无法有效提高系统生物滤器单次处理效能，其需依靠牺牲系统水质实现节能。

、本明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于 mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法及系统，从而实现循环水养殖系统运行节能降耗。

本发明通过检测单投喂周期内循环水养殖系统生物滤器内滤料表面功能微生物 AOB编码氨单加氧酶的画 A基因的 mRNA响应表达量，在其高表达时间段提髙系统流速，以供应更多基质于其 mRNA转录，在低表达时间段，降低流速实现节能。由于 amoA基因的 mRNA编码产物为氨单加氧酶（功能蛋白质），其作用为硝化过程催化总氨氮氧化为羟胺的限速步奏关键酶，且蛋白质的半衰期长于 mRNA半衰期，故通过提升 mRNA高表达段的流速，可促使功能微生物 AOB实现氨单加氧酶的有效积累，从而可为降低流速时间段生物滤器仍具有较高处理性能奠定物质基础。本发明依据上述原理，进行生物滤器精准调控与变速流运行，通过提升其单次处理效能，实现循环水养殖系统总流量削减与节能。

一种基于 mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法，协同调控循环水养殖系统的生物滤器与微生物响应，获取功能微生物 AOB的 mRNA实时表达量，在 AOB的 mRNA响应高表达时间段，提高系统流速，在响应低表达时间段，降低系统流速。

其实施的基本流程为：

1 )、对投喂周期内的系统水质进行监测；

2 )、对投喂周期内生物滤器的滤料表面功能微生物 AOB的 mRNA响应表达水平进行监 »

3 )、分析得到投喂周期内功能微生物 AOB的 mRNA高表达与低表达时间段;

4)、综合水质数据，对功能微生物 AOB的 mRNA高表达峰值前后 lh时间段提高系统流速 10-30%，对 mRNA低表达时间段降低流速 20-50%。

所述的循环水养殖系统，主要采用固液分离-生物净化两级处理手段去除系统污染物，且运行稳定。所述的循环水养殖系统，其单投喂周期内饵料投加量 A (kg>与生物滤器有效容积 B (m³)间的比值, A/B < 6。67。

所述的 AOB的 mRNA响应高表达与低表达判断依据，高表达值 C 与低表达值 D 间的比值 C/D≥5，或具有统计学差异 ( Ρ < 0Λ )，所述的表达僮单位为碱基拷贝数 4ig RNA。

所述的系统内水体总氨氮 TAN(Tbtal Ammonia Nitrogen)浓度≥ 3.0mg/L时，无论生物滤器功能微生物 AOB的 mR A响应表达情况，系统运行均不减速。

一种采用所述方法的循环水养殖系统，采用变速流控制的装置。

本发明的有益效果是，通过改变传统循环水养殖系统生物滤器的恒定流速策略，基于单喂食周期内功能微生物 AOB的 mRNA表达响应水平为参考，以分别提升 mRNA高表达段流速及降低 mRNA低表达段流速为控制措施，实现生物滤器单次循环处理效率提升。本发明克服了传统循环水养殖系统运行过程生物滤器运行策略粗放、整体能耗偏高等弊端，具有节能增效、可实现工程化运用等诸多优点。

fi图说明

图 1是基于 mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法实施流程图。

、 Ϊ附图 1所示，本发明可以通过以下技术方案来实现的：

1、本发明的实施对象为循环水养殖系统，其主要为系统污染物去除依靠固液分离-生物净化两级处理手段，且运行稳定。系统内养殖生物量波动小，投喂周期与节律固定。

2、循环水系统单投喂周期水质状况监测，方法为至投喂时间点伊始，每间隔 111测定水质中 TAN含量，取样点一般建议需至少包括 3处 (养殖池 2处、生物滤器 1处)，测定持续时间 24h，测定方法可采用萘氏试剂法等国标标准方法，要求测定精度为 0.1 mg/L。

3、生物滤器内功能微生物 AOB的 mRNA响应表达监测，其实施方法为：一、样品前处理

(1) 至投喂时间点伊始，每间隔 Ih取生物滤器内环装滤料 3个或微珠滤料 30ml, 并立即加入商用 RNA保护液 5ml。 (2)将样品放置在磁力振荡器上震荡 lOmin后，在离心机上高速离心 5min后 (运行条件 4Ό， 12000转)，弃去上清液后，将生物膜泥样重悬浮至 2ml商 RNA保护液，并存储在- 80 C待用。

二、样品 RN A提取与反转录 cDNA (1)采用商用 RNA试剂盒进行样品 RNA提取，流程依照试剂盒说明书操作。（2)将提取的总 RNA采用商用试剂盒反转录为 cDNA，反应条件为 42。 (， lb; 70 °C, 15min; 8°C， +∞。

三、功能微生物氨氧化细菌 AOB的 mR A的绝对定量 (Rt- qPCR)

(1) 以功能微生物氨氧化细菌 AOB的氨单加氧醇编码段 amoA基因为目标区，选用弓 I物为 amoA- 1 F /amoA-2R (GGGGTTTCTACTGGTGGT/

CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)进行扩增， PCR反应条件为: (i) 95。C， 5mm； (ii)95°C,20s; (iii) 55°C, 30s_; (iv)72°C,30s; (v) 重复 (ii)〜(iv)步奏 40个循环； (vi) 72°C,7min; (vii)8°C, +∞. (2) 标准曲线制备方法为；（i)在 ΙΟμΙϋΝΑ溶液中加入 ΙΟΟμΙ感受态细胞中，冰上放置 30min。然后 42Ό加热 45s后，再在冰中放置 Imin; (ii)加入 890μ1 SOC培养基， 37°C振荡培养 60min; (iii)取 ΙΟΟμΙ 细菌培养液均匀涂布在含有氨青霉素的 LB琼脂培养基平板上， 37C倒置过夜培养；（w)挑选白色菌落，使用 PCR法确认载体中插入片段的长度大小。（V) 采用商用质粒提取试剂盒提取克隆质粒，并用微量紫外外分光光度计测定质粒浓度，以梯度稀释的克隆质粒制备标注曲线。（3) 以标准曲线计算各样品氨氧化功能菌 AOB的 mRNA绝对丰度，单位为（碱基拷贝数 / g RNA：。

4、单喂食周期内样品功能菌 AOB的 mRNA表达程度鉴定

(1)将各时间节点监测的功能菌 AOB的 mRNA绝对表达量以日寸间序列绘制曲线图，寻找曲线上的 "高表达值"与 "低表达值"。 (2)将高表达值 C (碱基拷贝数 / gRNA)与低表达值 D (碱基拷贝数 / gRNA)间的比值进行计算，若 C/D≥5，或具有统 ·学差异 (P<0.1)，则认为该时间点即为高表达值与低表达值。连续 2个以上高表达值或低表达值即可认为是高表达时间段或低表达时间段。

5、基于 mRNA响应的生物滤器流速调节

(1) 综合水质数据，对功能微生物 AOB的 mR A高表达峰僮前后 lh时间段提高系统流速约 1030%，对 mRNA低表达时间段降低流速约 2050%。(2) 当系统内水体总氨氮 ΊΆΝ浓度≥ 3.0mg/L时，无论生物滤器功能微生物 mRNA 响应表达情况，系统运行均不减速。依据本发明方法，对养殖对象为尼罗罗非鱼 (OreochromisNiloticus) 的循环水养殖系统进行了效果检验。其中恒速运行时间 33天，变速运行时间 36天，变速控制以某变频器（VFD- 015M) 实现，效果如表 1所示。表 1 实际循环水养殖系统变速流实施效果

最后需要说明的是：以上实施例仅以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所描述的技术方案进行修改或对其中部分技术进行同等替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施技术方案的精神和范围。

Claims

1、一种基于 mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法，其特征在于，协同调控循环水养殖系统的生物滤器与微生物响应，获取功能微生物 AOB的

A响应高表达时间段，提高系统流速，在

2、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，实施的基本流程为：

1 )、对投喂周期内的系统水质进行监测；

2 )、对投喂周期内生物滤器内滤料表面功能微生物 AOB的 mRNA响应表达水平进行监测；

3 )、分析得到投喂周期内功能微生物 AOB的 mRNA高表达与低表达时间段；

4)、综合水质数据，对功能微生物 AOB的 mRNA高表达峰值前后 111时间段提高系统流速 10-30%，对 mRNA低表达时间段降低流速 20-50%。

3、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述的循环水养殖系统，主要采用固液分离-生物净化两级处理手段去除系统污染物， i运行稳定。

4、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述的循环水养殖系统，其单投喂周期内饵料投加量 A (kg)与生物滤器有效容积 B (m³)间的比值, A/B < 6.67。

5、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述的 AOB的 mRNA响应高表达与低表达判断依据，高表达值 C 与低表达值 D 间的比值 C/D≥5，或具有统计学差异（P < 0.1 )，所述的表达值单位为碱基拷贝数 /fig RNA。

6、根据权利要求〗

AOB的 mRNA响应表达情况，系统运行均不减速。

7、一种采用如权利要求 1所述方法的循环水养殖系统，其特征在于，采 ^变速流控制的装置。