WO2016006792A1 - 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트 - Google Patents

관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트 Download PDF

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WO2016006792A1
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membrane
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culture sheet
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김규만
진희경
배재성
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions

Definitions

  • the present invention relates to a detachable cell culture sheet to which a penetrating membrane is attached. More specifically, the through-type membrane is placed on a soft culture substrate, the cells are placed in an array shape, and then cultured. It is about.
  • cells are cultured by attaching the cells to the entire bottom of the container using a culture vessel.
  • a culture vessel because the cell culture area is large, not only the consumption of materials necessary for cultivation, including the culture medium is large, but also hassles of culturing the cells many times in a large amount of culture vessels for various analysis and inspection required after the culture.
  • micromachining techniques such as cutting, photolithography, etching, and transfer using molding.
  • the material can be obtained only at the pore location, allowing local deposition and synthesis of material in areas ranging from micrometers to millimeters. Can be.
  • the cells By culturing the cells using this method, the cells can be cultured only in the penetrated region, and the cells can be cultured in various pattern shapes according to the position, shape, and size of the penetrating holes on the membrane.
  • holes may be fabricated on the membrane by mechanical processing or chemical etching, or by casting the membrane material from a master mold.
  • the base material on which the cells are cultured is generally a polystyrene-based plastic, and has a culture vessel form such as petri dishes and micro wells.
  • plastics which are the materials of these cell culture containers, are difficult to cut or flake. Therefore, the entire container must be used to analyze cells cultured in the container. And there is a problem that the consumption of labor is also large.
  • the present invention is to culture the cells locally on a flexible polymer substrate using a membrane having a through-type pattern, and to culture them in a micropattern, and to easily cut the polymer substrate in which the cells are cultured to be divided into several pieces. It is an object of the present invention to provide a detachable cell culture sheet with a penetrating membrane.
  • the present invention in order to achieve the above object is formed of a flexible polymer material; And a through-hole formed therein, wherein the membrane is attached to the upper surface of the base material.
  • the base material is characterized in that the cutting groove is formed on the upper surface.
  • the membrane may be formed of a polymer material.
  • the membrane is characterized in that formed of polydimethylsiloxane (poly (dimethylsiloxane), PDMS).
  • the cutting groove may be formed in a straight shape.
  • the base material may include a plurality of cutting slits that penetrate the base material in a vertical direction along a direction in which the cutting groove is formed.
  • the base material is characterized by having a cutting slit penetrating the base material in the vertical direction.
  • the present invention has the effect of efficiently performing cell analysis by locally culturing cells at a designated position and shape through a membrane having a through-type pattern.
  • the present invention by using a flexible polymer material as a base material for cell culture can be easily fragmented the culture base material as needed to efficiently analyze the cultured cell array, by increasing the cell analysis efficiency cell culture, including the culture medium Minimize the consumption of necessary materials.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a detachable cell culture sheet with a penetrating membrane according to the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view of a detachable cell culture sheet with a penetrating membrane according to the present invention.
  • Figure 3 is a plan view of a detachable cell culture sheet with a permeable membrane of the present invention having a cut slit.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG. 2.
  • Figure 5 is a view for explaining the application example of the removable cell culture sheet attached to the permeable membrane according to the present invention.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a detachable cell culture sheet with a penetrating membrane according to the present invention
  • FIG. 2 is a perspective view of a detachable cell culture sheet with a penetrating membrane according to the present invention
  • FIG. 4 is a plan view of a detachable cell culture sheet having a penetrating membrane of the present invention
  • FIG. 4 is a sectional view taken along line AA ′ of FIG. 2.
  • the detachable cell culture sheet 100 having the penetrating membrane attached according to the present invention includes a base material 110 on which cells are cultured and a membrane 120 attached to an upper part of the base material 110.
  • the base material 110 is formed of a soft polymer material having flexibility, and the base material 110 formed of a flexible polymer material can be easily cut out by a cutter or the like after the cells are cultured and used in an experiment according to the required use.
  • the upper surface of the base material 110 is provided with a cutting groove 112 formed by recessing.
  • the cutting groove 112 serves as a guideline for cutting when cutting the base material 110 in which cell culture is completed with a cutter, etc., thereby preventing the cutter from deflecting in an unintended direction during the cutting operation. .
  • the cutting groove 112 is formed in a straight line on the base material 110 to more easily cut the base material (110).
  • the upper surface of the base material 110 has a grid-shaped pattern by the plurality of cutting grooves 112.
  • the base material 110 having the grid pattern formed on the upper surface has a culture surface partitioned by the cutting groove 112, and has an advantage of easily distinguishing the cultured cells through the partitioned culture surface.
  • the arrangement interval of the cutting grooves 112 formed in a straight shape on the upper surface of the base material 110 is equal to the horizontal and vertical spacing as shown in Figure 1 so that the upper surface of the base material 110 is a square lattice
  • a rectangular grid pattern may be formed by varying the spacing of the cutting grooves 112, and in various cases, the angle of intersection between the cross cutting grooves 112 may be adjusted in various ways. It is also possible to form the pattern in a polygonal shape instead of the grid pattern.
  • the base material 110 includes a plurality of cutting slits 114 penetrating the base material 110 in the vertical direction along the direction in which the cutting groove 112 is formed.
  • the cutting slit 114 is formed by cutting a portion of the base material 110 in a broken line along the cutting groove 112 in order to easily cut the base material 110.
  • This cutting slit 114 serves to make it easier to cut the base material 110.
  • the cutting slit 114 is illustrated as being formed inside the cutting groove 112 along the cutting groove 112, but the cutting slit 114 is formed only inside the cutting groove 112.
  • the base material 110 may be easily cut by having only the cutting slit 114 without the cutting groove 112.
  • the membrane 120 is attached to the upper surface of the base material 110, and a plurality of through holes 122 penetrating the membrane 120 in a vertical direction are disposed in the membrane 120 in a pattern.
  • the membrane 120 may be formed of a polymer material.
  • the membrane 120 is formed of a polydimethylsiloxane (PDMS) that is easily molded as a polymer for cell culture.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the material is not limited thereto and may be formed of any material as long as the material does not have a negative effect on cell culture and can form a thin film.
  • the membrane 120 serves as a micro stencil for culturing cells cultured on the base material 110 in a pattern of several millimeters to a micrometer size.
  • the through hole 122 of the membrane 120 is disposed to match 1: 1 with the culture surface of the base material 110 partitioned by the cutting groove 112.
  • Figure 5 is a view for explaining the application example of the removable cell culture sheet attached to the permeable membrane according to the present invention.
  • the cell culture sheet 100 in which the base material 110 and the membrane 120 are coupled is prepared, and the cells are cultured in the cell culture sheet (FIG. 5 (b)).
  • the membrane 120 is separated from the base material 110 (FIG. 5 (c)), and the base material 110 is cut along the cutting groove 112 using a cutting means such as a cutter ( (D) of FIG.
  • the cutting form of the base material 110 may have a matrix form of N ⁇ M as needed, as shown in Figure 5 (e), cut into pieces or the shape of the pattern by the cutting groove 112 It is possible to cut in various forms depending on.
  • the detachable cell culture sheet 100 having the penetrating membrane according to the present invention efficiently conducts cell analysis by locally culturing the cells at designated positions and shapes through the membrane 120 having the penetrating pattern.
  • the culture base material 110 can be easily fragmented as necessary to efficiently analyze the cultured cell array.

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Abstract

본 발명은 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트에 관한 것으로, 유연한 폴리머 재질로 형성된 모재; 및 관통홀이 형성되어 상기 모재의 상부면에 부착되는 멤브레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트를 제공한다. 이러한 본 발명은 관통형 패턴을 지닌 멤브레인을 통하여 세포를 지정된 위치와 형상에 국부적으로 배양함으로써 세포 분석을 효율적으로 수행할 수 있으며, 세포 배양용 모재로 유연한 폴리머 소재를 이용함으로써 필요에 따라 배양 모재를 쉽게 조각내어 배양된 세포 어레이의 분석을 효율적으로 수행할 수 있는 효과가 있다.

Description

관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트
본 발명은 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 관통형 멤브레인을 연질의 배양 모재위에 올려 놓고 세포를 어레이 형상으로 위치하여 배양한 후, 배양된 어레이형 세포패턴들을 서로 분리할 수 있도록 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트에 관한 것이다.
일반적으로 세포는 배양용기를 이용하여 용기바닥면 전체에 세포를 부착하여 배양한다. 이러한 경우 세포배양 면적이 넓기 때문에 배양액을 비롯하여 배양에 필요한 물질의 소모가 클 뿐만 아니라, 배양 이후 필요한 다양한 분석, 검사를 위하여 다량의 배양용기에 세포를 여러 번 배양해야 하는 번거로움이 있다.
절삭, 포토리소그래피, 식각, 몰딩을 이용한 전사 등 다양한 마이크로 가공 기술을 이용하여 마이크로미터 크기의 미세구조물을 제작하는 기술이 빠르게 발달하고 있다. 특히 멤브레인 상에 관통형 구멍을 만들고, 이 멤브레인을 모재 위에 올려놓고 물질을 증착하거나 합성하면 구멍 위치에만 물질을 얻을 수 있어 마이크로 미터에서 수 밀리미터의 크기를 가지는 영역에서 국부적으로 물질을 증착 및 합성할 수 있다.
이러한 방법을 이용하여 세포를 배양하면 관통된 영역에 국한하여 세포를 배양할 수 있으며, 멤브레인 상에 관통된 구멍의 위치, 형상 및 크기에 따라 다양한 패턴 형상으로 세포를 배양할 수 있다.
관통형 구멍을 지닌 멤브레인의 제조를 위해서는 멤브레인 상에 기계적 가공이나 화학적 식각을 이용하여 구멍을 제작하거나, 마스터 몰드로부터 멤브레인 재료를 캐스팅(casting)하여 제작 할 수 있다.
세포가 배양되는 모재는 일반적으로 폴리스티렌 계열의 플라스틱으로, 페트리 디시, 마이크로 웰 등의 배양용기 형태를 지닌다. 그런데 이들 세포 배양 용기의 재질인 플라스틱은 자르거나 조각을 내기 어려워 용기에 배양된 세포를 분석하기 위해서는 용기 전체를 사용해야 하며, 따라서 분석 후 전량 폐기함에 따른 세포의 소모가 크고 세포배양에 필요한 배양액, 시간 및 노동력의 소모 역시 크다는 문제점이 있다.
본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위해 관통형 패턴을 지닌 멤브레인을 이용하여 유연한 폴리머 모재위에 세포를 국부적으로 배양하여 마이크로패턴으로 배양하고, 세포가 배양된 폴리머 모재를 쉽게 커팅하여 여러 개의 조각으로 나눌 수 있는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 유연한 폴리머 재질로 형성된 모재; 및 관통홀이 형성되어 상기 모재의 상부면에 부착되는 멤브레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트를 제공한다.
여기서 상기 모재는 상부면에 커팅홈이 형성된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 멤브레인은 폴리머 재질로 형성될 수 있다.
또한, 상기 멤브레인은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)으로 형성된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 커팅홈은 직선형으로 형성될 수 있다.
또한, 상기 모재는 상기 커팅홈이 형성된 방향을 따라 상기 모재를 상하방향으로 관통하는 복수의 절취슬릿을 구비할 수 있다.
또한, 상기 모재는 상기 모재를 상하방향으로 관통하는 절취슬릿을 구비한 것을 특징으로 한다.
본 발명은 관통형 패턴을 지닌 멤브레인을 통하여 세포를 지정된 위치와 형상에 국부적으로 배양함으로써 세포 분석을 효율적으로 수행할 수 있도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 세포 배양용 모재로 유연한 폴리머 소재를 이용함으로써 필요에 따라 배양 모재를 쉽게 조각내어 배양된 세포 어레이의 분석을 효율적으로 수행할 수 있으며, 세포분석 효율을 높임으로써 배양액을 비롯한 세포배양에 필요한 물질의 소모를 최소화 할 수 있다.
도1은 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 분해사시도이다.
도2는 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 사시도이다.
도3은 절취슬릿이 형성된 본 발명의 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 평면도이다.
도4는 도2의 A-A' 단면도이다.
도5는 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 활용예를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세하게 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 첨가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 실시될 수 있음은 물론이다.
도1은 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 분해사시도이고, 도2는 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 사시도이며, 도3은 절취슬릿이 형성된 본 발명의 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 평면도이고, 도4는 도2의 A-A' 단면도이다.
이하, 도1 내지 도4를 참고하여 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트(100)를 설명한다.
본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트(100)는 세포가 배양되는 모재(110)와 모재(110)의 상부에 부착되는 멤브레인(120)을 포함한다.
구체적으로 모재(110)는 유연성을 가지는 연질의 폴리머 재질로 형성되는데, 유연한 폴리머 재질로 형성된 모재(110)는 세포가 배양된 후 커터 등으로 쉽게 잘라내어 필요한 용도에 따라 실험에 활용할 수 있다.
모재(110)의 상부면에는 오목하게 패여서 형성되는 커팅홈(112)이 구비된다. 커팅홈(112)은 세포배양이 완료된 모재(110)를 커터(cutter) 등으로 자를 때 커팅(cutting)을 위한 가이드 라인의 역할을 하여 커팅 작업 시 커터가 의도하지 않은 방향으로 비껴 나가는 것을 방지한다.
바람직하게 커팅홈(112)은 모재(110) 위에 직선형으로 형성하여 모재(110)를 더욱 용이하게 커팅할 수 있도록 한다.
또한, 복수의 커팅홈(112)이 구비되는 경우 모재(110)의 상부면은 복수의 커팅홈(112)에 의해 격자 형태의 패턴을 가지도록 한다.
상부면에 격자 패턴이 형성된 모재(110)는 커팅홈(112)에 의해 구획된 배양면을 가지게 되며, 구획된 배양면을 통해 배양된 세포들을 쉽게 구분지을 수 있는 장점이 있다.
이때, 모재(110)의 상부면에 직선형으로 형성되는 커팅홈(112)의 배치간격은 도1에 도시된 바와 같이 가로 및 세로의 간격을 동일하게 하여 모재(110)의 상부면이 정사각형의 격자패턴을 갖도록 할 수 있으나, 경우에 따라서는 커팅홈(112)의 간격을 달리하여 직사각형의 격자패턴을 형성할 수도 있고, 교차되는 커팅홈(112)들 간의 교차되는 각도를 다양하게 조절하여 사각형의 격자패턴이 아닌 다각형 형태로 패턴을 형성하는 것도 가능하다.
모재(110)는 도3 및 도4에 도시된 바와 같이 커팅홈(112)이 형성된 방향을 따라 모재(110)를 상하방향으로 관통하는 복수의 절취슬릿(114)을 구비한다.
절취슬릿(114)은 모재(110)를 용이하게 커팅할 수 있도록 하기 위해 모재(110)의 일부분이 커팅홈(112)을 따라 파선형으로 커팅되어 형성된다.
이러한 절취슬릿(114)은 모재(110)의 절단을 더욱 용이하게 수행할 수 있도록 하는 역할을 한다.
도3 및 도4에서는 절취슬릿(114)이 커팅홈(112)을 따라 커팅홈(112)의 내측에 형성된 것으로 도시되어 있으나, 절취슬릿(114)은 커팅홈(112)의 내측에만 형성되는 것은 아니며 모재(110)는 커팅홈(112) 없이 절취슬릿(114)만을 구비하여 용이하게 절단되도록 하는 것이 가능하다.
멤브레인(120)은 모재(110)의 상부면에 부착되는 것으로, 멤브레인(120)에는 멤브레인(120)을 상하방향으로 관통하는 복수의 관통홀(122)이 패턴을 이루어 배치된다.
멤브레인(120)은 폴리머 재질로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 세포배양을 위한 폴리머로서 성형이 용이한 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)으로 형성된다. 그러나, 재질이 이에 한정되는 것은 아니며 세포배양에 부정적인 영향을 미치지 않는 재질로서 박막의 형태를 이룰 수 있는 것이라면 어떠한 재질로 형성되어도 무방하다.
이와 같은 멤브레인(120)은 모재(110) 위에 배양되는 세포를 수 밀리미터에서 마이크로미터 크기의 패턴으로 배양할 수 있도록 하는 마이크로 스텐실(micro stencil)의 역할을 하게 된다.
바람직하게 멤브레인(120)의 관통홀(122)은 커팅홈(112)에 의해 구획된 모재(110)의 배양면과 1:1 로 매칭되도록 배치한다.
도5는 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트의 활용예를 설명하기 위한 도면이다.
먼저, 도5의 (a)와 같이 모재(110)와 멤브레인(120)이 결합된 세포배양 시트(100)를 준비하고, 세포배양 시트에서 세포를 배양한다(도5의 (b)). 세포배양이 완료되면 멤브레인(120)을 모재(110)에서 분리시킨 후(도5의 (c)), 커터 등의 절단수단을 이용하여 커팅홈(112)을 따라 모재(110)를 절단한다(도5의 (d)). 이때, 모재(110)의 절단 형태는 도5의 (e)와 같이 필요에 따라 N×M 의 매트릭스(matrix) 형태를 갖도록 할 수 있으며, 낱개로 절취하거나 커팅홈(112)에 의한 패턴의 형상에 따라 다양한 형태로 절취하는 것이 가능하다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트(100)는 관통형 패턴을 지닌 멤브레인(120)을 통하여 세포를 지정된 위치와 형상에 국부적으로 배양함으로써 세포 분석을 효율적으로 수행할 수 있으며, 세포 배양용 모재로 유연한 폴리머 소재를 이용함으로써 필요에 따라 배양 모재(110)를 쉽게 조각내어 배양된 세포 어레이의 분석을 효율적으로 수행할 수 있는 장점이 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구 범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. 유연한 폴리머 재질로 형성된 모재; 및
    관통홀이 형성되어 상기 모재의 상부면에 부착되는 멤브레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 모재는 상부면에 커팅홈이 형성된 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인은 폴리머 재질로 형성된 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)으로 형성된 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 커팅홈은 직선형으로 형성된 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 모재는 상기 커팅홈이 형성된 방향을 따라 상기 모재를 상하방향으로 관통하는 절취슬릿을 구비한 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 모재는 상기 모재를 상하방향으로 관통하는 절취슬릿을 구비한 것을 특징으로 하는 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트.
PCT/KR2015/002785 2014-07-08 2015-03-23 관통형 멤브레인이 부착된 분리형 세포배양 시트 Ceased WO2016006792A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

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