WO2016006241A1 - Anti-canine pd-1 antibody or anti-canine pd-l1 antibody - Google Patents

Anti-canine pd-1 antibody or anti-canine pd-l1 antibody Download PDF

Info

Publication number
WO2016006241A1
WO2016006241A1 PCT/JP2015/003444 JP2015003444W WO2016006241A1 WO 2016006241 A1 WO2016006241 A1 WO 2016006241A1 JP 2015003444 W JP2015003444 W JP 2015003444W WO 2016006241 A1 WO2016006241 A1 WO 2016006241A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
canine
sequence shown
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/003444
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
拓也 水野
麗葉 正司
Original Assignee
日本全薬工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本全薬工業株式会社 filed Critical 日本全薬工業株式会社
Priority to JP2016532441A priority Critical patent/JP6279733B2/en
Priority to US15/320,412 priority patent/US10280223B2/en
Priority to EP15819249.2A priority patent/EP3168236B1/en
Publication of WO2016006241A1 publication Critical patent/WO2016006241A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

The present invention addresses the problem of providing: an anti-canine PD-1 antibody or an anti-canine PD-L1 antibody; an agent for inhibiting binding of canine PD-1 and canine PD-L1 that contains said antibody; a method for inhibiting binding of canine PD-1 and canine PD-L1 that uses said antibody; and a gene that codes said antibody. An anti-canine PD-1 antibody that binds specifically to canine PD-1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an anti-canine PD-L1 antibody that binds specifically to canine PD-L1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 are produced. Furthermore, an agent for inhibiting binding of canine PD-1 and canine PD-L1 that contains said antibody is produced.

Description

抗イヌＰＤ－１抗体又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体Anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody
　本発明は、抗イヌＰＤ－１抗体又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体や、かかる抗体を含有するイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤や、かかる抗体を用いるイヌＰＤ－１とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害方法や、かかる抗体をコードする遺伝子に関する。 The present invention relates to an anti-canine PD-1 antibody or an anti-canine PD-L1 antibody, a binding inhibitor between canine PD-1 and canine PD-L1 containing such an antibody, and canine PD-1 and canine using such an antibody. The present invention relates to a method for inhibiting binding to PD-L1, and a gene encoding such an antibody.
　ヒトにおいては、近年、免疫抑制性分子である免疫チェックポイント分子を標的とした抗体医薬が注目されており、多くの臨床試験が実施されている。特にＰＤ－１（Programmed cell death 1）及びＰＤ－Ｌ１（programmed cll death 1 ligand-1）を標的としたヒトのがんを対象とした臨床試験では優れた成績をおさめており、次世代のがん治療として着目されている（非特許文献１、２参照）。 In humans, in recent years, antibody drugs targeting immune checkpoint molecules, which are immunosuppressive molecules, have attracted attention, and many clinical trials have been conducted. Especially in clinical trials targeting human cancer targeting PD-1 (Programmed cell death-1) and PD-L1 (programmed cell death-1) and the next generation, It is attracting attention as a cancer treatment (see Non-Patent Documents 1 and 2).
　ＰＤ－１はＴ細胞の表面に存在する受容体である。Ｔ細胞の活性化を抑制する機能を有しており、自己に対する免疫反応を抑制するなどの機能が明らかにされている。かかる免疫反応の抑制は、ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合することによって行われる。一方、がん細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、発現したＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合することによってＴ細胞の活性化を抑制し、免疫反応から逃れる能力を獲得している。したがって、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を阻害することが、がんの治療に有効であると考えられる。 PD-1 is a receptor present on the surface of T cells. It has a function of suppressing activation of T cells, and functions such as suppression of immune response to self have been clarified. Suppression of such an immune reaction is performed by PD-L1, which is a ligand of PD-1, binding to PD-1. On the other hand, cancer cells express PD-L1, and the expressed PD-L1 binds to PD-1, thereby suppressing the activation of T cells and acquiring the ability to escape immune responses. Therefore, inhibiting the binding between PD-1 and PD-L1 is considered effective for the treatment of cancer.
　これまでに、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を有効成分として含み、インビボにおいてがん細胞の増殖を抑制する作用を有するがん治療剤（特許文献１参照）や、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアレルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させる抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗がん剤（特許文献２参照）が提案されている。また、メラノーマ、非小細胞肺がん、腎細胞がんの治療剤として抗ＰＤ－１抗体の開発が進められている（非特許文献３参照）。 Until now, allergy has been induced by administration of a cancer therapeutic agent (see Patent Document 1) having an anti-PD-L1 antibody as an active ingredient and suppressing the growth of cancer cells in vivo and iNKT cell ligand. In addition, an anticancer agent containing an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody that restores the reactivity of iNKT cells (see Patent Document 2) has been proposed. In addition, anti-PD-1 antibodies are being developed as therapeutic agents for melanoma, non-small cell lung cancer, and renal cell cancer (see Non-Patent Document 3).
　一方、ペットの長寿化に伴い、近年、件数が急増しているのがペットのがんである。人間同様、ペットのがん治療も進歩を遂げ、外科療法、放射線治療、化学療法（抗がん剤）の三大療法が積極的に行われている。 On the other hand, the number of pet cancers has increased rapidly in recent years as pets have longevity. Like humans, pet cancer treatment has made progress, and three major therapies, surgical treatment, radiation treatment, and chemotherapy (anticancer drugs), are being actively carried out.
　ペットの中ではイヌの飼育率が高く、日本国内において約１３００万頭が飼われている。そのため、イヌのがんの発生件数が増加している。イヌのがんの治療においては、従来から用いられている上記３大療法では限界があり、それに代わる、又は同時に用いることができる新たな治療法として、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイント分子を標的とした治療が期待されるが、ヒトのＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１に対する抗体医薬はイヌに対しては作用しないという問題があった。そこで、イヌＰＤ－１やイヌＰＤ－Ｌ１に対する抗体の開発が求められていた。しかしながら、イヌにおいては、ＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１についての研究が進んでおらず、イヌにおけるＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１のｃＤＮＡの発現も確認されていない状況であり、イヌのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を認識する抗体の作製は困難であるのが現状であった。 The dog breeding rate is high among pets, and about 13 million are kept in Japan. As a result, the number of cancers in dogs is increasing. In the treatment of canine cancer, the above three major therapies used so far have limitations, and as a new treatment that can be used instead or simultaneously, immune check such as PD-1, PD-L1, etc. Although treatment targeting a point molecule is expected, there is a problem that antibody drugs against human PD-1 and PD-L1 do not act on dogs. Therefore, development of antibodies against canine PD-1 and canine PD-L1 has been demanded. However, in dogs, research on PD-1 and PD-L1 has not progressed, and the expression of PD-1 and PD-L1 cDNA in dogs has not been confirmed. At present, it is difficult to produce an antibody that recognizes PD-L1.
特開２０１４－６５７４８号公報JP 2014-65748 A 特開２０１０－８３８６３号公報JP 2010-83863 A
　本発明の課題は、抗イヌＰＤ－１抗体又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体や、かかる抗体を含有するイヌＰＤ－１とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤や、かかる抗体を用いるイヌＰＤ－１とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害方法や、かかる抗体をコードする遺伝子を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody, a binding inhibitor between canine PD-1 and canine PD-L1 containing such an antibody, and canine PD-1 using such an antibody. It is an object to provide a method for inhibiting the binding of canine PD-L1 and a gene encoding such an antibody.
　発明者らは、まずイヌＰＤ－１及びイヌＰＤ－Ｌ１のｃＤＮＡのクローニングに成功し、塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。次に、イヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１のｃＤＮＡを用いてイヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１発現細胞株を作製し、かかる細胞株を用いてイヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１に対するラットモノクローナル抗体の作製に成功した。さらに、得られたラットモノクローナル抗体はイヌＰＤ－１とイヌＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する能力を有することを見いだし、本発明を完成した。 The inventors first succeeded in cloning canine PD-1 and canine PD-L1 cDNA, and determined the nucleotide sequence and amino acid sequence. Next, a canine PD-1 or canine PD-L1-expressing cell line is prepared using canine PD-1 or canine PD-L1 cDNA, and a rat against canine PD-1 or canine PD-L1 is produced using such a cell line. Successfully produced monoclonal antibody. Furthermore, the obtained rat monoclonal antibody was found to have the ability to inhibit the binding between canine PD-1 and canine PD-L1, thereby completing the present invention.
　すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合する、以下の（ａ）又は（ｂ）記載の抗イヌＰＤ－１抗体。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体。
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
（ｄ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合する、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載の抗イヌＰＤ－１抗体。
（ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
（ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体。
（ｇ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
（ｈ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
（５）上記（１）～（４）のいずれか記載の抗体を含有することを特徴とするイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤。
（６）上記（１）～（４）のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とするイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害方法。
（７）上記（１）～（４）のいずれか記載の抗体をコードする遺伝子。 That is, the present invention is as disclosed below.
(1) The anti-canine PD-1 antibody described in (a) or (b) below, which specifically binds to canine PD-1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(B) the heavy chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 having 90% or more identity, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
(2) The anti-canine PD-L1 antibody described in (c) or (d) below, which specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(C) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(D) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, or An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
(3) The anti-canine PD-1 antibody described in (e) or (f) below, which specifically binds to canine PD-1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(E) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, An anti-canine PD-1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16. antibody;
(F) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, An anti-canine PD-1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 antibody;
(4) The anti-canine PD-L1 antibody described in (g) or (h) below, which specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(G) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25; An anti-canine PD-L1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 antibody;
(H) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, An anti-canine PD-L1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 antibody;
(5) A binding inhibitor between canine PD-1 and canine PD-L1, comprising the antibody according to any one of (1) to (4) above.
(6) A method for inhibiting binding between canine PD-1 and canine PD-L1, comprising using the antibody according to any one of (1) to (4) above.
(7) A gene encoding the antibody according to any one of (1) to (4) above.
　本発明の抗体は、イヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１の発現解析や機能解析が可能となるほか、イヌＰＤ－１とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤として用いることが可能となる。 Since the antibody of the present invention can recognize and bind to canine PD-1 or canine PD-L1, it enables expression analysis and functional analysis of canine PD-1 or canine PD-L1, and canine PD- 1 can be used as a binding inhibitor between canine PD-L1.
イヌＰＤ－１（ｃａｎｉｎｅＰＤ－１、以後「ｃＰＤ１」ともいう）の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す図である。FIG. 2 is a view showing the base sequence of canine PD-1 (canine PD-1, hereinafter also referred to as “cPD1”) and the amino acid sequence encoded by the base sequence. イヌＰＤ－Ｌ１（ｃａｎｉｎｅＰＤ－Ｌ１、以後「ｃＰＤＬ１」ともいう）の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す図である。FIG. 2 is a view showing the base sequence of canine PD-L1 (canine PD-L1, hereinafter also referred to as “cPDL1”) and the amino acid sequence encoded by the base sequence. （Ａ）はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体とＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果を示す図であり、（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体とＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果を示す図である。(A) is a figure which shows the result of having investigated the coupling | bonding of the rat monoclonal antibody with respect to cPD1, and NRK / cPD1, (B) is the figure which shows the result of having investigated the coupling | bonding of the rat monoclonal antibody with respect to cPDL1, and NRK / cPDL1. is there. （Ａ）はヒトのＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤＬ１）－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果を示す図であり、（Ｂ）はｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果を示す図である。(A) shows the results of examining the binding between human PD-L1 (hPDL1) -hIg and NRK / cPD1, and (B) shows the results of examining the binding between cPD1-hIg and NRK / cPDL1. FIG. （Ａ）ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｈＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合阻害を調べた結果を示す図であり、（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果を示す図である。(A) shows the results of examining the inhibition of binding between hPDL1-hIg and NRK / cPD1 by a rat monoclonal antibody against cPD1, and (B) shows the binding between cPD1-hIg and NRK / cPDL1 by a rat monoclonal antibody against cPDL1. It is a figure which shows the result of having investigated inhibition. ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having investigated the binding inhibition of cPD1-hIg and NRK / cPDL1 by the rat monoclonal antibody with respect to cPD1. 末梢血単核細胞にＰＤ－１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ－１：４Ｆ１２－Ｅ６又はｃＰＤ－Ｌ１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１：Ｇ１１－６）を加えて、さらにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を加えて刺激培養し、得られた培養上清中のイヌＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。A rat monoclonal antibody against PD-1 (anti-PD-1: 4F12-E6 or a rat monoclonal antibody against cPD-L1 (anti-PD-L1: G11-6) was added to peripheral blood mononuclear cells, and concanavalin A ( FIG. 7 is a view showing the results of measuring canine IFN-γ in an obtained culture supernatant by ELISA by adding ConA) to stimulation culture. イヌＰＢＭＣをＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ又はＣｏｎＡ存在下で培養し、ＰＢＭＣを回収後、ＣＤ３陽性分画（Ｔ細胞)におけるＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１の発現を、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２－Ｅ６）又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１－６）を用いてフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。Canine PBMC is cultured in the presence of PMA / ionomycin or ConA, and after recovery of PBMC, expression of PD-1, PD-L1 in the CD3 positive fraction (T cell) is determined by rat monoclonal antibody against cPD1 (4F12-E6) or It is a figure which shows the result of having analyzed the flow cytometry using the rat monoclonal antibody (G11-6) with respect to cPDL1. イヌＰＢＭＣより磁気ビーズにより分離したＣＤ１４陽性単球をＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦ存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を誘導し、かかる未成熟樹状細胞（ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩＩ抗体陽性）におけるＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の発現を、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２－Ｅ６）、又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１－６）を用いてフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。CD14 positive monocytes separated from canine PBMC by magnetic beads were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 6 days to induce immature dendritic cells, and in such immature dendritic cells (MHC Class II antibody positive) It is a figure which shows the result of having analyzed the expression of PD-1 or PD-L1 using the rat monoclonal antibody (4F12-E6) with respect to cPD1, or the rat monoclonal antibody (G11-6) with respect to cPDL1.
　本発明の抗イヌＰＤ－１抗体としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合し、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
の（ａ）又は（ｂ）記載の抗イヌＰＤ－１抗体であれば特に制限されないが、
（ａ’）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；（ｂ’）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
の（ａ’）又は（ｂ’）記載の抗イヌＰＤ－１抗体であることが好ましく、かかる抗イヌＰＤ－１抗体はイヌＰＤ－１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ－１の発現解析や機能解析が可能となるほか、イヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合を阻害することが可能となる。 The anti-canine PD-1 antibody of the present invention specifically binds to canine PD-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(B) the heavy chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 having 90% or more identity, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
The anti-canine PD-1 antibody described in (a) or (b) is not particularly limited,
(A ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, Or an anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (b ′) SEQ ID NO: 4 A heavy chain variable region comprising the amino acid sequence shown, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the amino acid shown in SEQ ID NO: 5 An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the sequence;
It is preferable that the anti-canine PD-1 antibody described in (a ′) or (b ′) of the above is used, and since such anti-canine PD-1 antibody can recognize and bind to canine PD-1, In addition to the expression analysis and functional analysis of 1, it is possible to inhibit the binding between canine PD-1 and canine PD-L1.
　また、本発明の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
（ｄ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
の（ｃ）又は（ｄ）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体であれば特に制限されないが、
（ｃ’）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；（ｄ’）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
の（ｃ’）又は（ｄ’）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体であることが好ましく、かかる抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体はイヌＰＤ－Ｌ１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ－Ｌ１の発現解析や機能解析が可能となるほか、イヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合を阻害することが可能となる。 The anti-canine PD-L1 antibody of the present invention specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
(C) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(D) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, or An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
The anti-canine PD-L1 antibody described in (c) or (d) is not particularly limited,
(C ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, Or an anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; (d ′) shown in SEQ ID NO: 9 A heavy chain variable region comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence having 90% identity or greater;
The anti-canine PD-L1 antibody described in (c ′) or (d ′) is preferably used. Since such an anti-canine PD-L1 antibody can recognize and bind to canine PD-L1, In addition to being able to analyze the expression and function of L1, it is possible to inhibit the binding between canine PD-1 and canine PD-L1.
　本発明の抗イヌＰＤ－１抗体の他の態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合し、
（ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
（ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
の（ｅ）又は（ｆ）記載の抗イヌＰＤ－１抗体を挙げることができる。 As another aspect of the anti-canine PD-1 antibody of the present invention, it specifically binds to canine PD-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(E) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, An anti-canine PD-1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16. antibody;
(F) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, An anti-canine PD-1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 antibody;
(E) or (f) of the anti-canine PD-1 antibody.
　本発明の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体の他の態様としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、
（ｇ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
（ｈ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
の（ｇ）又は（ｈ）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体を挙げることができる。 In another embodiment of the anti-canine PD-L1 antibody of the present invention, the anti-canine PD-L1 antibody specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
(G) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25; An anti-canine PD-L1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 antibody;
(H) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, An anti-canine PD-L1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 antibody;
(G) or (h) of the anti-canine PD-L1 antibody.
　上記抗イヌＰＤ－１抗体や抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体（以後、これらを総称して「本件抗イヌ抗体」ともいう）の種類としては特に制限されないが、モノクローナル抗体を挙げることができ、モノクローナル抗体の配列から組換えタンパクとして作製されるキメラ抗体、イヌ化抗体や、抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）２、抗体をパパインで消化して得られるＦａｂ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを、アミノ酸架橋によって連結させたＳｃＦｖ、ＳｃＦｖが二量体化したｄｉａｂｏｄｙなどの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。 The types of the above-mentioned anti-canine PD-1 antibody and anti-canine PD-L1 antibody (hereinafter collectively referred to as “the anti-canine antibody”) are not particularly limited, but include monoclonal antibodies. A chimeric antibody produced as a recombinant protein from the above sequence, a canine antibody, F (ab ′) 2 obtained by digesting the antibody with pepsin, a Fab obtained by digesting the antibody with papain, a heavy chain variable region, Also included are antibody fragments consisting of a part of an antibody such as ScFv in which the light chain variable region is linked by an amino acid bridge, or diabodies of ScFv.
　本発明において、「９０％以上の同一性」とは、同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を意味する。 In the present invention, “90% or more identity” means that the identity is 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more. Means.
　本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子としては、例えば、上記抗イヌＰＤ－１抗体をコードする遺伝子として、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号３５に示される塩基配列と、配列番号３６に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号１１～１３に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号１４～１６に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。 Examples of the gene encoding the anti-canine antibody include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by 90% or more as the gene encoding the anti-canine PD-1 antibody. A gene encoding an amino acid sequence having sex, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a gene encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. And a gene that specifically binds to canine PD-1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in an antibody obtained by such a gene. Specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35 And a gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 36. In addition, it encodes the amino acid sequence of CDR1-3 of the heavy chain variable region shown in SEQ ID NOs: 11 to 13 and the amino acid sequence of CDR1-3 of the light chain variable region shown in SEQ ID NOs: 14-16. A gene with a gene can be mentioned.
　また、上記抗イヌＰＤ－１抗体をコードする遺伝子の他の態様としては、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号３７に示される塩基配列と、配列番号３８に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号１７～１９に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号２０～２２に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。 As another embodiment of the gene encoding the anti-canine PD-1 antibody, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 A gene comprising a coding gene and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a gene encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, A gene that specifically binds to canine PD-1 in which the obtained antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned. Specifically, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37 and the sequence shown in SEQ ID NO: 38 And a gene having the nucleotide sequence shown. In addition, it encodes the amino acid sequence of CDR1-3 of the heavy chain variable region shown in SEQ ID NOs: 17 to 19 and the amino acid sequence of CDR1-3 of the light chain variable region shown in SEQ ID NOs: 20-22. A gene with a gene can be mentioned.
　上記抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体をコードする遺伝子としては、配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号３９に示される塩基配列と、配列番号４０に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号２３～２５に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号２６～２８に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。 The gene encoding the anti-canine PD-L1 antibody includes a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a sequence A gene comprising the amino acid sequence shown in No. 8, or a gene encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 8, wherein an antibody obtained by such a gene is SEQ ID No. A gene that specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 6, specifically, a base sequence shown in SEQ ID NO: 39 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 40. Mentioned genes can be mentioned. In addition, it encodes the amino acid sequence of CDR1-3 of the heavy chain variable region shown in SEQ ID NOs: 23 to 25 and the amino acid sequence of CDR1-3 of the light chain variable region shown in SEQ ID NOs: 26-28. A gene with a gene can be mentioned.
　上記抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体をコードする遺伝子の他の態様としては、配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子とを備えた遺伝子であって、かかる遺伝子によって得られる抗体が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する遺伝子を挙げることができ、具体的には、配列番号４１に示される塩基配列と、配列番号４２に示される塩基配列とを備えた遺伝子を挙げることができる。このほか、配列番号２９～３１に示される重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号３２～３４に示される軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を備えた遺伝子を挙げることができる。 As another embodiment of the gene encoding the anti-canine PD-L1 antibody, it encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. A gene comprising a gene and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, or a gene encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and obtained by such a gene Examples thereof include a gene that specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and specifically, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 and the sequence shown in SEQ ID NO: 42. And a gene having a base sequence. In addition, it encodes the amino acid sequence of CDR1-3 of the heavy chain variable region shown in SEQ ID NOs: 29-31 and the amino acid sequence of CDR1-3 of the light chain variable region shown in SEQ ID NOs: 32-34. A gene with a gene can be mentioned.
　上記抗イヌＰＤ－１抗体又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体をコードする遺伝子をベクターに組み込むことによって、上記抗イヌＰＤ－１抗体又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体をコードする遺伝子の発現ベクターを作製することができる。かかる発現ベクターに用いるベクターとしては、上記抗イヌＰＤ－１抗体又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体をコードする遺伝子を発現できるものであればよく、プラスミドベクターでも、ファージベクターでもよい。 An expression vector for a gene encoding the anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody is prepared by incorporating the gene encoding the anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody into a vector. Can do. Any vector can be used as such an expression vector as long as it can express the gene encoding the anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody, and it may be a plasmid vector or a phage vector.
　上記モノクローナル抗体は、慣用のプロトコールに従って作製することが可能である。たとえば、遺伝子組換え技術により、上記本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、組換え抗体として作製することが可能である。組換え抗体を作製する方法としては、例えば本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、かかる発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などの宿主細胞へ導入して、宿主細胞において組換え抗体を生産させる方法を挙げることができる（Peter J. Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, WILEY, 1997参照）。発現ベクターに組み込む本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子の塩基配列は、発現させる宿主細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。 The above monoclonal antibody can be prepared according to a conventional protocol. For example, a recombinant antibody can be produced by expressing a gene encoding the anti-canine antibody of the present invention by a gene recombination technique. As a method for producing a recombinant antibody, for example, a gene encoding the present anti-canine antibody is incorporated into an expression vector, and such expression vector is incorporated into a mammalian cell line such as Chinese hamster ovary (CHO) cell, Escherichia coli, yeast cell, insect cell. And a method of introducing a recombinant antibody in a host cell such as a plant cell (see Peter J. Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, WILEY, 1997). The base sequence of the gene encoding the present anti-canine antibody to be incorporated into the expression vector may be optimized for the codon sequence according to the host cell to be expressed.
　また、トランスジェニック動物作製技術を用いて本件抗イヌ抗体をコードする遺伝子が組み込まれたマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ブタなどのトランスジェニック動物を作製し、かかるトランスジェニック動物の血液、ミルク中などから大量に産生することも可能である。 In addition, transgenic animals such as mice, cows, goats, sheep, chickens, pigs, etc., into which the gene encoding the anti-canine antibody has been incorporated, are produced using transgenic animal production technology, and blood, milk of such transgenic animals are produced. It is also possible to produce large quantities from inside.
　さらに、上記モノクローナル抗体は、配列番号１又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を発現する細胞を抗原としてマウス、ラットなどのヒト以外の動物へ投与し、本件抗イヌ抗体を産生する細胞クローンを細胞融合技術（ハイブリドーマ法（Kohler G, et al., Nature 256:495-497, 1975参照）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Danuta Kozbor, et al., Immunology Today 4, 72-79, 1983参照）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY:77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）参照）によりスクリーニングすることにより作製することが可能である。 Further, the monoclonal antibody is prepared by administering a cell expressing a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 6 to a non-human animal such as a mouse or a rat as an antigen, and producing a cell clone that produces the anti-canine antibody. Cell fusion technology (see hybridoma method (Kohler G, et al., Nature 256: 495-497, 1975), trioma method, human B cell hybridoma method (Danuta Kozbor, et al., Immunology Today 4, 72-79, 1983) And the EBV-hybridoma method (see Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY: 77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)).
　上記イヌ化抗体は、たとえば重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体の定常領域をイヌ抗体の定常領域に置換することにより作製することが可能である。イヌ抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。 The above canine antibody can be produced, for example, by substituting the constant region of an antibody having a heavy chain variable region and a light chain variable region with a constant region of a canine antibody. Known constant regions of canine antibodies can be employed.
　作製した本件抗イヌ抗体は、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。 The produced anti-canine antibody can be purified using, for example, chromatography using Protein A and Protein G columns, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, ammonium sulfate salting out method, gel filtration, affinity chromatography, and the like.
　本件抗イヌ抗体を含有することを特徴とするイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤としては、本件抗イヌ抗体を含有していれば特に制限されず、抗イヌＰＤ－１抗体及び／又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体を複数種類含んでいてもよい。かかる結合阻害剤は、イヌＰＤ－１とイヌＰＤ－Ｌ１との結合を阻害することから、ＰＤ－Ｌ１を発現しているイヌのがんの治療剤として用いることもできる。なお、本発明における結合阻害には、in vivoにおける結合阻害もin vitroにおける結合阻害も含まれる。 The binding inhibitor between canine PD-1 and canine PD-L1 characterized by containing the present anti-canine antibody is not particularly limited as long as it contains the present anti-canine antibody, and anti-canine PD-1 antibody And / or a plurality of anti-canine PD-L1 antibodies. Since such a binding inhibitor inhibits the binding between canine PD-1 and canine PD-L1, it can also be used as a therapeutic agent for canine cancers expressing PD-L1. The binding inhibition in the present invention includes both binding inhibition in vivo and binding inhibition in vitro.
　上記結合阻害剤は、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの添加物を含んでいてもよい。また、上記結合阻害剤をイヌに投与する場合の投与方法としては、経口投与のほか、注射や点滴、塗布、坐剤、鼻腔内スプレーなどによる非経口投与とすることもでき、適宜任意の形態に製剤することができる。 The above binding inhibitors are commonly used for formulation and are pharmaceutically acceptable excipients, binders, lubricants, disintegrants, preservatives, isotonic agents, stabilizers, dispersants, oxidation agents. Additives such as an inhibitor, a colorant, a flavoring agent, and a buffer may be included. In addition to oral administration, the binding inhibitor can be administered parenterally by injection, infusion, application, suppository, intranasal spray, etc. Can be formulated.
　上記結合阻害剤中に含まれる本件抗体の量は、０．０００１～５０重量％、好ましくは０．００１～５重量％を挙げることができる。 The amount of the present antibody contained in the binding inhibitor may be 0.0001 to 50% by weight, preferably 0.001 to 5% by weight.
　本件抗イヌ抗体を用いることを特徴とするイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害方法としては、本件抗イヌ抗体を用いるかぎり特に制限されず、抗イヌＰＤ－１抗体及び／又は抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体を複数種類用いてもよい。 The method for inhibiting the binding between canine PD-1 and canine PD-L1, characterized by using the present anti-canine antibody, is not particularly limited as long as the present anti-canine antibody is used. A plurality of canine PD-L1 antibodies may be used.
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
　なお、以下の実施例におけるＰＣＲに用いるプライマーを表１に示す。 The primers used for PCR in the following examples are shown in Table 1.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、以下の実施例で用いたラット腎臓細胞株であるＮＲＫ細胞、及びヒト腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５５μＭの２－メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地で維持した。これらの細胞株は加湿インキュベーターにより、５％ＣＯ2ガス濃度下、３７℃で培養したものを用いた。 In addition, the rat kidney cell line NRK cell and the human kidney cell line HEK293T cell used in the following examples are 10% FBS, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 55 μM 2-mercapto. Maintained in DMEM medium supplemented with ethanol. These cell lines used were cultured in a humidified incubator at 37 ° C. under 5% CO 2 gas concentration.
［ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体の作製］
１．ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１のｃＤＮＡクローニング
（プライマーの設計）
　ｃＰＤ１のｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー（YTM1142：配列番号４３）とリバースプライマー（YTM1143：配列番号４４）は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＭ＿５４３３３８の配列に基づいて設計し、ｃＰＤＬ１のｃＤＮＡｓを増幅するためのフォワードプライマー（YTM1144：配列番号４５）とリバースプライマー（YTM1145：配列番号４６）は、ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＭ＿００５６１５９３６．１の配列に基づいて設計した。なお、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＭ＿５４３３３８及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＭ＿００５６１５９３６．１の配列は、イヌにおいて発現が確認されていない遺伝子である。 [Production of rat monoclonal antibody against cPD1 or cPDL1]
1. cDNA cloning of cPD1 or cPDL1 (design of primers)
The forward primer (YTM1142: SEQ ID NO: 43) and reverse primer (YTM1143: SEQ ID NO: 44) for amplifying the cDNA of cPD1 are NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) Accession No. . A forward primer (YTM1144: SEQ ID NO: 45) and a reverse primer (YTM1145: SEQ ID NO: 46) for amplifying cPDL1 cDNAs designed based on the sequence of XM — 543338 are NCBI Accession No. Designed based on the sequence of XM — 005615936.1. In addition, Accession No. XM — 543338 and Accession No. The sequence of XM — 005615936.1 is a gene whose expression has not been confirmed in dogs.
（ＰＣＲ反応）
　上記プライマー対を用い、正常なイヌの胸腺のｃＤＮＡをテンプレートとし、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）を用い、その添付のプロトコールに従ってｃＰＤ１遺伝子とｃＰＤＬ１遺伝子を増幅した。ＰＣＲは、プレ変性を９４℃で２分行い、その後９８℃で１０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリング、６８℃で６０秒の伸長を３５サイクル行い、さらに最終伸長を６８℃で１０分行った。 (PCR reaction)
Using the above primer pair, normal canine thymus cDNA was used as a template, and KPD-Plus-Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used to amplify the cPD1 gene and the cPDL1 gene according to the attached protocol. In PCR, pre-denaturation was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 35 cycles of denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, annealing at 58 ° C. for 30 seconds, extension at 68 ° C. for 60 seconds, and final extension at 68 ° C. I went for a minute.
（ベクターへの挿入及び塩基配列の決定）
　上記で調製したＰＣＲ産物をゲル精製し、pBluescript SK(-)ベクターのＳｍａＩ部位に挿入し、インサートとしてｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１遺伝子を含むコンストラクトベクター(pBS-cPD1、pBS-cPDL1)を作製した。かかるコンストラクトベクターはフォワードプライマー（M13(-20)：配列番号４７）とリバースプライマー（M13 reverse：配列番号４８）を用い、BigDye（登録商標）Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer社製)及びABI Prism（登録商標）３７７自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems社製)によって塩基配列を決定した。得られたｃＰＤ１の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を図１に、ｃＰＤＬ１の塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を図２に示すと共に、ｃＰＤ１の塩基配列を配列番号４９、アミノ酸配列を配列番号１に、ｃＰＤＬ１の塩基配列を配列番号５０、アミノ酸配列を配列番号６に示す。 (Insertion into vector and determination of nucleotide sequence)
The PCR product prepared above was gel-purified and inserted into the SmaI site of the pBluescript SK (−) vector, and construct vectors (pBS-cPD1, pBS-cPDL1) containing cPD1 or cPDL1 gene as inserts were prepared. Such a construct vector uses a forward primer (M13 (-20): SEQ ID NO: 47) and a reverse primer (M13 reverse: SEQ ID NO: 48), and BigDye (registered trademark) Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (manufactured by Perkin-Elmer). The nucleotide sequence was determined using an ABI Prism (registered trademark) 377 automatic DNA sequencer (Applied Biosystems). The resulting cPD1 base sequence and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in FIG. 1, the base sequence of cPDL1 and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in FIG. 2, and the base sequence of cPD1 is SEQ ID NO: 49, The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence of cPDL1 is shown in SEQ ID NO: 50, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
２．ラットモノクローナル抗体の作製
（ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１発現ベクターの構築）
　ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１タンパク質を過剰発現するレトロウイルスベクターを構築した。まず、ｃＰＤ１の配列とｃＰＤＬ１の配列のＣ末端に２つのＦＬＡＧタグ配列を加えるため、ｃＰＤ１の増幅には、pBS-cPD1をテンプレートとし、フォワードプライマー（YTM1142：配列番号４３）と、ｃＰＤ１配列のＣ末端にＦＬＡＧタグ配列を含むリバースプライマー（YTM1167：配列番号５１）とを用い、ｃＰＤＬ１の増幅には、pBS-cPDL1をテンプレートとし、フォワードプライマー（YTM1144：配列番号４５）と、ｃＰＤＬ１配列のＣ末端にＦＬＡＧタグ配列を含むリバースプライマー（YTM1168：配列番号５２）を用いて一次ＰＣＲを行った。 2. Preparation of rat monoclonal antibody (construction of cPD1 or cPDL1 expression vector)
Retroviral vectors that overexpress cPD1 or cPDL1 protein were constructed. First, since two FLAG tag sequences are added to the C-terminus of the cPD1 sequence and the cPDL1 sequence, the amplification of cPD1 uses pBS-cPD1 as a template, a forward primer (YTM1142: SEQ ID NO: 43), and the CPD1 sequence C A reverse primer containing a FLAG tag sequence at the end (YTM1167: SEQ ID NO: 51) was used. For amplification of cPDL1, pBS-cPDL1 was used as a template, forward primer (YTM1144: SEQ ID NO: 45), and C-terminal of the cPDL1 sequence. Primary PCR was performed using a reverse primer containing a FLAG tag sequence (YTM1168: SEQ ID NO: 52).
　次に、各一次ＰＣＲ産物をテンプレートとし、一次ＰＣＲと同様のフォワードプライマーと、１ｓｔＦＬＡＧタグ配列にアニールするダブルＦＬＡＧタグ配列を含むリバースプライマー（YTM838：配列番号５３）を用いて、二次ＰＣＲを行った。得られた各ＰＣＲ産物をpMxs-IPベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位に挿入し、pMx-IP-cPD1-FL、pMx-IP-cPDL1-FL#9を作製した。 Next, using each primary PCR product as a template, secondary PCR is performed using a forward primer similar to the primary PCR and a reverse primer (YTM838: SEQ ID NO: 53) containing a double FLAG tag sequence that anneals to the 1st FLAG tag sequence. It was. The obtained PCR products were inserted into the EcoRI and NotI sites of the pMxs-IP vector to prepare pMx-IP-cPD1-FL and pMx-IP-cPDL1-FL # 9.
（形質導入細胞の作製）
　一般的なトランスフェクション方法によって、pMx-IP-cPD1-FL、pMx-IP-cPDL1-FL#9をＮＲＫ細胞にトランスフェクトし、ｃＰＤ１を安定発現するＮＲＫ細胞、ｃＰＤＬ１を安定発現するＮＲＫ細胞を作製した。まず、トランスフェクションを行う１日前にＮＲＫ細胞（３．５×１０5個）を６ウェルディッシュに播種した。細胞のトランスフェクションは、Lipofectamine 2000(Invitrogen社製)を用い、添付のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後の細胞を４８時間インキュベートし、その後、安定な形質導入細胞を得るために７．５μｇ／ｍｌのプロマイシン（Sigma-Aldrich社製）の存在下で培養し、ｃＰＤ１を安定発現するＮＲＫ細胞（ＮＲＫ／ｃＰＤ１）、ｃＰＤＬ１を安定発現するＮＲＫ細胞（ＮＲＫ／ｃＰＤＬ１）を作製した。 (Production of transduced cells)
Using general transfection methods, pKx-IP-cPD1-FL and pMx-IP-cPDL1-FL # 9 are transfected into NRK cells to produce NRK cells that stably express cPD1 and NRK cells that stably express cPDL1. did. First, one day before transfection, NRK cells (3.5 × 10 5 cells) were seeded in a 6-well dish. Transfection of cells was performed using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the attached protocol. The transfected cells were incubated for 48 hours, and then cultured in the presence of 7.5 μg / ml puromycin (Sigma-Aldrich) to obtain stable transduced cells, and NRK stably expressing cPD1. Cells (NRK / cPD1) and NRK cells (NRK / cPDL1) stably expressing cPDL1 were prepared.
　上記ＮＲＫ／ｃＰＤ１及びＮＲＫ／ｃＰＤＬ１において、ｃＰＤ１及びｃＰＤＬ１が安定発現していることは、一次抗体として、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（1:1000希釈、Sigma-Aldrich社製）、二次抗体としてＩｇＧ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４８８－標識抗マウス(Biolegend社製)を用いた免疫蛍光法によって確認した。 In NRK / cPD1 and NRK / cPDL1, cPD1 and cPDL1 are stably expressed as anti-FLAG M2 antibody (1: 1000 dilution, manufactured by Sigma-Aldrich) as primary antibody and IgG-Dylight as secondary antibody. This was confirmed by immunofluorescence using (registered trademark) 488-labeled anti-mouse (Biolegend).
（ラットモノクローナル抗体の作製）
　ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体を作製するために、上述で作製したＮＲＫ／ｃＰＤ１又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（５００μｌの上記ＤＭＥＭ培地中、１×１０7個）を等量のTiter Max（登録商標）Gold(CytRx社製)で乳化し、７週齢のSprague－Dawleyラット（九動社製）の後足蹠に皮肉投与した。投与から２週間後に、膝窩のリンパ節細胞を単離し、Ｐ３Ｕ１細胞と融合させた。すなわち、リンパ節単球細胞（１×１０8個）とＰ３Ｕ１細胞（２×１０7個）と混合し、無血清のＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。上澄みを除去後、細胞を３７℃で２分インキュベートし、３７℃の０．５ｍｌポリエチレングリコール１５００（Roche Diagnostics社製）を加え、さらに３７℃の９ｍｌ無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、９００ｒｐｍで５分、室温にて遠心した。上澄みを除去後、１０％ＦＢＳとhypoxanthine-aminopterin-thymidine（HAT：Life Technologies社製）を含む３６ｍｌのＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）で懸濁し、加湿インキュベーターにより、５％ＣＯ2ガス濃度下、３７℃で１時間培養した。４ｍｌのBM-Condimed H1培地（Roche Diagnostics社製）を加え、細胞を４つの９６ウェル組織培養プレートに播種（１００μｌ／ウェル）して培養した。コロニーが得られた後、ｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１を発現するＮＲＫ細胞陽性ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ法やフローサイトメトリーで同定し、かかるハイブリドーマを限定希釈によりクローニングし、ｃＰＤ１を発現するＮＲＫ細胞陽性ハイブリドーマとしてハイブリドーマ３Ｂ７－Ｄ９、ハイブリドーマ４Ｆ１２－Ｅ６、ｃＰＤＬ１を発現するＮＲＫ細胞陽性ハイブリドーマとしてハイブリドーマＨ７－９、ハイブリドーマＧ１１－６を得た。以後、ハイブリドーマ３Ｂ７－Ｄ９によって産生された抗体を「３Ｂ７－Ｄ９」、ハイブリドーマ４Ｆ１２－Ｅ６によって産生された抗体を「４Ｆ１２－Ｅ６」、ハイブリドーマＨ７－９によって産生された抗体を「Ｈ７－９」、ハイブリドーマＧ１１－６によって産生された抗体を「Ｇ１１－６」ともいう。なお、ハイブリドーマ３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６、Ｈ７－９、Ｇ１１－６は国立大学法人山口大学共同獣医学部に保管されており、一定の条件下で分譲可能である。 (Production of rat monoclonal antibody)
In order to produce a rat monoclonal antibody against cPD1 or cPDL1, NRK / cPD1 or NRK / cPDL1 prepared above (1 × 10 7 cells in 500 μl of the above-mentioned DMEM medium) was used in an equal amount of Titer Max® Gold ( CytRx) was emulsified and sarcastically administered to the hind footpad of 7-week-old Sprague-Dawley rats (Kudo Co., Ltd.). Two weeks after administration, popliteal lymph node cells were isolated and fused with P3U1 cells. Specifically, lymph node monocytic cells (1 × 10 8 cells) and P3U1 cells (2 × 10 7 cells) were mixed and washed twice with serum-free RPMI 1640 medium. After removing the supernatant, the cells were incubated at 37 ° C. for 2 minutes, 0.5 ml polyethylene glycol 1500 (Roche Diagnostics) at 37 ° C. was added, 9 ml serum-free RPMI 1640 medium at 37 ° C. was added, and 900 rpm for 5 minutes. Centrifuge at room temperature. After removing the supernatant, it is suspended in 36 ml of GIT medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% FBS and hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT: manufactured by Life Technologies), and 5% CO 2 gas concentration by a humidified incubator. Then, the cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour. 4 ml of BM-Condimed H1 medium (Roche Diagnostics) was added, and the cells were seeded (100 μl / well) in four 96-well tissue culture plates and cultured. After colonies are obtained, NRK cell positive hybridomas expressing cPD1 or cPDL1 are identified by ELISA or flow cytometry, and such hybridomas are cloned by limited dilution and hybridomas 3B7-D9 as NRK cell positive hybridomas expressing cPD1. Hybridoma H7-9 and hybridoma G11-6 were obtained as NRK cell positive hybridomas expressing hybridoma 4F12-E6 and cPDL1. Hereinafter, the antibody produced by the hybridoma 3B7-D9 is “3B7-D9”, the antibody produced by the hybridoma 4F12-E6 is “4F12-E6”, the antibody produced by the hybridoma H7-9 is “H7-9”, The antibody produced by the hybridoma G11-6 is also referred to as “G11-6”. The hybridomas 3B7-D9, 4F12-E6, H7-9, and G11-6 are stored in the National University Corporation Yamaguchi University Joint Veterinary School and can be distributed under certain conditions.
［抗ｃＰＤ１抗体又は抗ｃＰＤＬ１抗体であることの確認］
（抗体濃度及び細胞数）
　ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体である３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６と、上記で作製したＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合や、ｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体であるＨ７－９、Ｇ１１－６と、上記で作製したＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を、以下に示すフローサイトメトリー解析により調べた。各ラットモノクローナル抗体の濃度は０、０．０４、０．１５６、０．６２５、２．５、１０μｇ／ｍｌであり、ＮＲＫ／ｃＰＤ１（２×１０5個）又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（２×１０5個）を用いた。 [Confirmation of anti-cPD1 antibody or anti-cPDL1 antibody]
(Antibody concentration and cell number)
Binding of rat monoclonal antibodies against cPD1 3B7-D9, 4F12-E6 to NRK / cPD1 prepared above, rat monoclonal antibodies H7-9, G11-6 against cPDL1, and NRK / Binding to cPDL1 was examined by flow cytometry analysis shown below. The concentration of each rat monoclonal antibody is 0, 0.04, 0.156, 0.625, 2.5, 10 μg / ml, and NRK / cPD1 (2 × 10 5 cells) or NRK / cPDL1 (2 × 10 5 cells). Were used.
（フローサイトメトリー解析）
　フローサイトメトリー解析に用いる細胞株の染色は次の文献（Mizuno et al., J Vet Med Sci, 71(12):1561-1568, 2009）に記載の方法に従って行った。一次抗体としては、精製したｃＰＤ１又はｃＰＤＬ１に対する各ラットモノクローナル抗体を用いた。二次抗体としては抗ラットＩｇＧ－ＰＥ（Southern biotech社製)を用いた。サンプルはBD AccuriC6 (BD Bioscience社製)を用いて解析し、得られた結果をFlowJo software (Treestar社製)によって解析した。 (Flow cytometry analysis)
Staining of cell lines used for flow cytometry analysis was performed according to the method described in the following literature (Mizuno et al., J Vet Med Sci, 71 (12): 1561-1568, 2009). As the primary antibody, each rat monoclonal antibody against purified cPD1 or cPDL1 was used. As a secondary antibody, anti-rat IgG-PE (manufactured by Southern biotech) was used. Samples were analyzed using BD AccuriC6 (BD Bioscience), and the obtained results were analyzed using FlowJo software (Treestar).
（結果）
　結果を図３に示す。図３（Ａ）はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（anti-cPD1 mAb）とＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果であり、図３（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（anti-cPD-L1 mAb）とＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果である。横軸は作製した抗体に対する蛍光標識二次抗体の蛍光強度、縦軸は各ラットモノクローナル抗体の濃度を示す。図３に示すように、いずれのラットモノクローナル抗体を用いた場合でも蛍光強度が増加しており、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体である３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６はＮＲＫ／ｃＰＤ１と結合し、ｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体であるＨ７－９、Ｇ１１－６は、ＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に結合することが確認された。すなわち、３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６は抗ｃＰＤ１抗体であり、Ｈ７－９、Ｇ１１－６は、抗ｃＰＤＬ１抗体であることが明らかとなった。 (result)
The results are shown in FIG. FIG. 3 (A) shows the results of examining the binding of rat monoclonal antibody (anti-cPD1 mAb) against cPD1 and NRK / cPD1, and FIG. 3 (B) shows the rat monoclonal antibody against cPDL1 (anti-cPD-L1 mAb). It is the result of having investigated the coupling | bonding of NRK / cPDL1. The horizontal axis represents the fluorescence intensity of the fluorescently labeled secondary antibody with respect to the prepared antibody, and the vertical axis represents the concentration of each rat monoclonal antibody. As shown in FIG. 3, the fluorescence intensity increased when any of the rat monoclonal antibodies was used, and 3B7-D9 and 4F12-E6, which are rat monoclonal antibodies against cPD1, bind to NRK / cPD1 and rat against cPDL1. Monoclonal antibodies H7-9 and G11-6 were confirmed to bind to NRK / cPDL1. That is, it was revealed that 3B7-D9 and 4F12-E6 are anti-cPD1 antibodies, and H7-9 and G11-6 are anti-cPDL1 antibodies.
［ラットモノクローナル抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合阻害試験］
１.ｃＰＤ１とヒトＩｇＦｃ領域との融合タンパク質、ヒトのＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤＬ１）とヒトＩｇＦｃ領域との融合タンパク質の作製
（ｈＰＤＬ１発現プラスミドの構築）
　ｈＰＤＬ１発現プラスミドを構築するため、ヒトのバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）由来のｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワードプライマー（YTM1150：配列番号５４）とリバースプライマー（YTM1151：配列番号５５）を用いてｈＰＤＬ１を増幅した。ＰＣＲによる増幅は上記実施例１と同様に行った。増幅したＰＣＲ産物をpBluescript SK(-)ベクターのＳｍａＩ部位に導入した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断し、得られた断片をpMxs-IPベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位に連結し、ｈＰＤＬ１発現プラスミドであるpMx-IP-hPDL1#21を作製した。 [Binding inhibition test of PD-1 and PD-L1 by rat monoclonal antibody]
1. Preparation of fusion protein of cPD1 and human IgFc region, and preparation of fusion protein of human PD-L1 (hPDL1) and human IgFc region (construction of hPDL1 expression plasmid)
In order to construct an hPDL1 expression plasmid, cDNA from human Burkitt lymphoma cell line (Raji) was used as a template and hPDL1 was amplified using a forward primer (YTM1150: SEQ ID NO: 54) and a reverse primer (YTM1151: SEQ ID NO: 55) did. Amplification by PCR was performed in the same manner as in Example 1 above. The amplified PCR product was introduced into the SmaI site of the pBluescript SK (−) vector. This plasmid was digested with EcoRI and NotI, and the resulting fragment was ligated to the EcoRI and NotI sites of the pMxs-IP vector to prepare pMx-IP-hPDL1 # 21, an hPDL1 expression plasmid.
（融合タンパク質発現ベクターの作製）
　ｃＰＤ１又はｈＰＤＬ１の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２　Ｆｃ領域との融合タンパク質とを発現するベクターを構築した。かかる発現ベクターを作製するために、実施例１で作製したpMx-IP-cPD1-FLをテンプレートとしてフォワードプライマー（YTM1153：配列番号５６）とリバースプライマー（YTM1154：配列番号５７）を用いてＰＣＲを行うことでｃＰＤ１の細胞外領域を増幅し、上述で作製したpMx-IP-hPDL1#21をテンプレートとしてフォワードプライマー（YTM1157：配列番号５８）とリバースプライマー（YTM1158：配列番号５９）を用いてＰＣＲを行うことでｈＰＤＬ１の細胞外領域を増幅した。それぞれのＰＣＲ産物は、ｃＰＤ１についてはＢａｍＨＩ、ｈＰＤＬ１についてはＢｇｌＩＩで切断し、pFUSE-hIgG2-Fc2ベクター(Invivogen社製)のＥｃｏＲＶとＢｇＩＩＩ部位にクローニングし、ｃＰＤ１の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２　Ｆｃ領域との融合タンパク質とを発現するベクター（pFUSE-cPD1-hIg#2）、ｈＰＤＬ１の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２　Ｆｃ領域との融合タンパク質とを発現するベクター（pFUSE-hPDL1-hIg#9）を作製した。 (Fusion protein expression vector production)
A vector expressing a fusion protein of the extracellular region of cPD1 or hPDL1 and the human IgG2 Fc region was constructed. In order to prepare such an expression vector, PCR is performed using the forward primer (YTM1153: SEQ ID NO: 56) and reverse primer (YTM1154: SEQ ID NO: 57) using the pMx-IP-cPD1-FL prepared in Example 1 as a template. As a result, the extracellular region of cPD1 is amplified, and PCR is performed using the forward primer (YTM1157: SEQ ID NO: 58) and reverse primer (YTM1158: SEQ ID NO: 59) using the pMx-IP-hPDL1 # 21 prepared above as a template. This amplified the extracellular region of hPDL1. Each PCR product was cleaved with BamHI for cPD1 and BglII for hPDL1, and cloned into the EcoRV and BgIII sites of the pFUSE-hIgG2-Fc2 vector (Invivogen). The extracellular region of cPD1 and the human IgG2 Fc region A vector (pFUSE-cPD1-hIg # 2) that expresses a fusion protein and a vector that expresses a fusion protein of the extracellular region of hPDL1 and the human IgG2 Fc region (pFUSE-hPDL1-hIg # 9) did.
（融合タンパク質の作製及び精製）
　上述で作製したベクターpFUSE-cPD1-hIg#2、pFUSE-hPDL1-hIg#9、又は空ベクターのpFUSE-hIgG2-Fc2をＨＥＫ２９３Ｔ細胞株にトランスフェクトした。まず、トランスフェクションを行う１日前に、２×１０6個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４つの１０ｃｍディッシュに播種した。次に、７．５μｇの各ベクターと３０μｌの１ｍｇ／ｍｌ　PEI Maxを含む３７５μｌのOPTI-MEMを混合して室温で１５分インキュベートし、細胞に加えた。トランスフェクションから２４時間後に、培地をＧＩＴ無血清培地（和光純薬工業社製）に置換し、さらに細胞を４８時間培養した。４日目と８日目の各トランスフェクト細胞から上澄みを集め、rProtein A agarose（GE healthcare社製）によって精製した。続いて、可溶性タンパク質を透析によって脱塩し、ｃＰＤ１の細胞外領域とｈＩｇＧ２　Ｆｃ領域との融合タンパク質（ｃＰＤ１－ｈＩｇ）、及び、ｈＰＤＬ１の細胞外領域とｈＩｇＧ２　Ｆｃ領域との融合タンパク質（ｈＰＤＬ１－ｈＩｇ）を作製した。上記融合タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって確認した。 (Production and purification of fusion protein)
The HEK293T cell line was transfected with the vector pFUSE-cPD1-hIg # 2, pFUSE-hPDL1-hIg # 9 prepared above or the empty vector pFUSE-hIgG2-Fc2. First, one day before transfection, 2 × 10 6 HEK293T cells were seeded in four 10 cm dishes. Next, 375 μl of OPTI-MEM containing 7.5 μg of each vector and 30 μl of 1 mg / ml PEI Max was mixed, incubated at room temperature for 15 minutes, and added to the cells. 24 hours after transfection, the medium was replaced with a GIT serum-free medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the cells were further cultured for 48 hours. Supernatant was collected from each of the transfected cells on the 4th and 8th days and purified by rProtein A agarose (manufactured by GE healthcare). Subsequently, the soluble protein was desalted by dialysis, and a fusion protein of the extracellular region of cPD1 and the hIgG2 Fc region (cPD1-hIg) and a fusion protein of the extracellular region of hPDL1 and the hIgG2 Fc region (hPDL1-hIg) ) Was produced. The purity of the fusion protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting.
２．ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合試験
　後述するラットモノクローナル抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との阻害試験の予備試験として、ｈＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合、又はｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を、上記フローサイトメトリー解析と同様の方法で調べた。ｈＰＤＬ１－ｈＩｇ、ｃＰＤ１－ｈＩｇの濃度は０、０．０４、０．１５６、０．６２５、２．５、１０、４０μｇ／ｍｌとし、ＮＲＫ／ｃＰＤ１（２×１０5個）又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（２×１０5個）を用いた。結果を図４に示す。図４（Ａ）はｈＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合を調べた結果であり、図４（Ｂ）はｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合を調べた結果である。横軸は作製した融合タンパク質に対する蛍光標識二次抗体の蛍光強度、縦軸はｈＰＤＬ１－ｈＩｇ又はｃＰＤ１－ｈＩｇの濃度を示す。図４に示すように、ｈＰＤＬ１－ｈＩｇはＮＲＫ／ｃＰＤ１に結合し、ｃＰＤ１－ｈＩｇはＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に結合することが明らかとなった。 2. Binding test of PD-1 and PD-L1 As a preliminary test of inhibition test of PD-1 and PD-L1 by rat monoclonal antibody described later, binding of hPDL1-hIg and NRK / cPD1, or cPD1-hIg and NRK The binding to / cPDL1 was examined by the same method as in the flow cytometry analysis. The concentrations of hPDL1-hIg and cPD1-hIg were 0, 0.04, 0.156, 0.625, 2.5, 10, 40 μg / ml, and NRK / cPD1 (2 × 10 5 ) or NRK / cPDL1 ( 2 × 10 5 ) was used. The results are shown in FIG. FIG. 4A shows the result of examining the binding between hPDL1-hIg and NRK / cPD1, and FIG. 4B shows the result of examining the binding between cPD1-hIg and NRK / cPDL1. The horizontal axis represents the fluorescence intensity of the fluorescently labeled secondary antibody for the prepared fusion protein, and the vertical axis represents the concentration of hPDL1-hIg or cPD1-hIg. As shown in FIG. 4, it was revealed that hPDL1-hIg binds to NRK / cPD1, and cPD1-hIg binds to NRK / cPDL1.
３．ラットモノクローナル抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合阻害試験
（フローサイトメトリー解析）
　（１）ＮＲＫ／ｃＰＤ１に、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６）を反応させ、その後ｈＰＤＬ１－ｈＩｇを反応させることで、ｈＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体が阻害するか、（２）ＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に、ｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｈ７－９、Ｇ１１－６）を反応させ、その後ｃＰＤ１－ｈＩｇを反応させることで、ｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体が阻害するか、又は（３）ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６）とｃＰＤ１－ｈＩｇを反応させ、その後その混合反応物をＮＲＫ／ｃＰＤＬ１に反応させることで、ｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体が阻害するか、の３点をそれぞれ調べた。各抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合阻害は上記フローサイトメトリー解析と同様に調べた。各ラットモノクローナル抗体の濃度は０、０．０４、０．１５６、０．６２５、２．５、１０μｇ／ｍｌとし、ｈＰＤＬ１－ｈＩｇ、ｃＰＤ１－ｈＩｇの濃度は４０μｇ／ｍｌとし、ＮＲＫ／ｃＰＤ１（２×１０5個）又はＮＲＫ／ｃＰＤＬ１（２×１０5個）を用いた。 3. Binding inhibition test of PD-1 and PD-L1 with rat monoclonal antibody (flow cytometry analysis)
(1) By reacting NRK / cPD1 with a rat monoclonal antibody against cPD1 (3B7-D9, 4F12-E6), and then reacting with hPDL1-hIg, the binding of hPDL1-hIg and NRK / cPD1 to rat against cPD1 (2) By reacting NRK / cPDL1 with rat monoclonal antibodies against cPDL1 (H7-9, G11-6) and then reacting with cPD1-hIg, cPD1-hIg and NRK / cPDL1 Or the rat monoclonal antibody against cPDL1 inhibits the binding with (3) the rat monoclonal antibody against cPD1 (3B7-D9, 4F12-E6) and cPD1-hIg, and the mixed reaction product is then converted to NRK / cPDL1. React It is examined CPD1-hIg and NRK / cPDL1 the coupling or rat monoclonal antibodies against CPD1 is inhibition of the three points, respectively. The inhibition of the binding between PD-1 and PD-L1 by each antibody was examined in the same manner as in the flow cytometry analysis. The concentration of each rat monoclonal antibody was 0, 0.04, 0.156, 0.625, 2.5, 10 μg / ml, the concentration of hPDL1-hIg, cPD1-hIg was 40 μg / ml, and NRK / cPD1 (2 × 10 5 ) or NRK / cPDL1 (2 × 10 5 ) was used.
（結果）
　結果を図５、６に示す。図５（Ａ）はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｈＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合阻害を調べた結果であり、図５（Ｂ）はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果であり、図６はｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体によるｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合阻害を調べた結果である。横軸は作製した抗体に対する蛍光標識二次抗体の蛍光強度、縦軸左は各ラットモノクローナル抗体の濃度、縦軸右はｈＰＤＬ１－ｈＩｇ又はｃＰＤ１－ｈＩｇの有り（＋）／無し（－）を示す。図５（Ａ）、（Ｂ）、図６に示すように、ｈＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤ１との結合や、ｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体である３Ｂ７－Ｄ９、４Ｆ１２－Ｅ６が阻害し、ｃＰＤ１－ｈＩｇとＮＲＫ／ｃＰＤＬ１との結合をｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体であるＨ７－９、Ｇ１１－６が阻害することが明らかとなった。 (result)
The results are shown in FIGS. FIG. 5 (A) shows the results of examining the inhibition of binding between hPDL1-hIg and NRK / cPD1 by a rat monoclonal antibody against cPD1, and FIG. 5 (B) shows the results of cPD1-hIg and NRK / cPDL1 produced by a rat monoclonal antibody against cPDL1. FIG. 6 shows the results of examining the binding inhibition between cPD1-hIg and NRK / cPDL1 by a rat monoclonal antibody against cPD1. The abscissa indicates the fluorescence intensity of the fluorescently labeled secondary antibody with respect to the prepared antibody, the ordinate indicates the concentration of each rat monoclonal antibody, and the ordinate indicates the presence (+) / absence (-) of hPDL1-hIg or cPD1-hIg. . As shown in FIGS. 5 (A), (B) and FIG. 6, the binding between hPDL1-hIg and NRK / cPD1 or the binding between cPD1-hIg and NRK / cPDL1 is 3B7-D9 which is a rat monoclonal antibody against cPD1. It was revealed that 4F12-E6 inhibited, and the binding of cPD1-hIg and NRK / cPDL1 was inhibited by rat monoclonal antibodies H7-9 and G11-6 against cPDL1.
［ラットモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の塩基配列の決定］
　トータルＲＮＡを実施例１で得られた各ハイブリドーマ細胞株から単離し、全ての可変領域と定常領域の５’領域を含む、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ２ａ）の塩基配列とκ軽鎖の塩基配列を５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲ法によって得た。 [Determination of the base sequences of the heavy and light chains of rat monoclonal antibody]
Total RNA was isolated from each hybridoma cell line obtained in Example 1, and the nucleotide sequence of the immunoglobulin heavy chain (IgG2a) and the nucleotide sequence of the kappa light chain including the 5 ′ region of all variable regions and constant regions were determined. Obtained by 5'RACE PCR method.
　まず、単離したＲＮＡを逆転写酵素Superscript（登録商標）IIIを用いて逆転写した。プライマーとしては、軽鎖の増幅にはYTM171（配列番号６０)、重鎖の増幅にはYTM172（配列番号６１）を用いた。逆転写反応後、ＴｄＴ酵素反応によりｐｏｌｙＣを付加し、その後、軽鎖の増幅にはフォワードプライマー（YTM166：配列番号６２）とリバースプライマー（YTM171：配列番号６０）、重鎖の増幅にはフォワードプライマー（YTM166：配列番号６２）とリバースプライマー（YTM172：配列番号６１）を用いて一次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、軽鎖又は重鎖の全ての可変領域を増幅するために、フォワードプライマー（YTM170：配列番号６３）とリバースプライマー（YTM173：配列番号６４）、又はフォワードプライマー（YTM170：配列番号６３）とリバースプライマー（YTM174：配列番号６５）を用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ハイブリドーマ３Ｂ７－Ｄ９及びハイブリドーマＧ１１－６においては、５’ＲＡＣＥや一次ＰＣＲにおけるプライマーとしてYTM171の代わりにYTM1224（配列番号４２）、を用いた。Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ産物をpBluescript SK(-)ベクターにクローニングし、その塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定した。 First, the isolated RNA was reverse transcribed using reverse transcriptase Superscript (registered trademark) III. As primers, YTM171 (SEQ ID NO: 60) was used for light chain amplification, and YTM172 (SEQ ID NO: 61) was used for heavy chain amplification. After reverse transcription reaction, polyC is added by TdT enzyme reaction, then forward primer (YTM166: SEQ ID NO: 62) and reverse primer (YTM171: SEQ ID NO: 60) for light chain amplification, and forward primer for heavy chain amplification. Primary PCR was performed using (YTM166: SEQ ID NO: 62) and reverse primer (YTM172: SEQ ID NO: 61). In order to gel-purify the PCR product and amplify all variable regions of the light chain or heavy chain, the forward primer (YTM170: SEQ ID NO: 63) and reverse primer (YTM173: SEQ ID NO: 64), or the forward primer (YTM170: sequence) No. 63) and reverse primer (YTM174: SEQ ID NO: 65) were used for nested PCR. In hybridoma 3B7-D9 and hybridoma G11-6, YTM1224 (SEQ ID NO: 42) was used instead of YTM171 as a primer in 5'RACE or primary PCR. The nested PCR product was cloned into the pBluescript SK (−) vector, and the base sequence and the amino acid sequence encoded by the base sequence were determined.
　３Ｂ７－Ｄ９の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３５に、アミノ酸配列を配列番号２に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３６に、アミノ酸配列を配列番号３に、４Ｆ１２－Ｅ６の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３７に、アミノ酸配列を配列番号４に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３８に、アミノ酸配列を配列番号５に、Ｈ７－９の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３９に、アミノ酸配列を配列番号７に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４０に、アミノ酸配列を配列番号８に、Ｇ１１－６の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号４１に、アミノ酸配列を配列番号９に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４２に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。 The nucleotide sequence of the heavy chain variable region of 3B7-D9 is SEQ ID NO: 35, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 36, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 3, and the sequence of 4F12-E6 The nucleotide sequence of the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 37, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 38, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 5, and the heavy chain variable region of H7-9. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, the light chain variable region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and the heavy chain variable region of G11-6 of In SEQ ID NO: 41, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 9, the light chain variable region base sequence is shown in SEQ ID NO: 42, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
　さらに、それぞれの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。３Ｂ７－Ｄ９の重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１～１３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４～１６に、４Ｆ１２－Ｅ６の重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７～１９、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２０～２２に、Ｈ７－９の重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２３～２５、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６～２８に、Ｇ１１－６の重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２９～３１、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３２～３４に示す。 Furthermore, the CDR amino acid sequences of each heavy chain variable region and light chain variable region were identified by comparing them with known antibody amino acid sequences. The amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of the heavy chain variable region of 3B7-D9 are respectively SEQ ID NOs: 11 to 13, the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of the light chain variable region are respectively SEQ ID NOs: 14 to 16, and the heavy chain variable of 4F12-E6. The amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the region are respectively SEQ ID NOs: 17 to 19, the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the light chain variable region are respectively SEQ ID NOs: 20 to 22, and the amino acids of CDR1 to CDR3 of the heavy chain variable region of H7-9 The sequence is SEQ ID NO: 23 to 25, the light chain variable region CDR 1 to 3 amino acid sequence is SEQ ID NO: 26 to 28, and the G11-6 heavy chain variable region CDR 1 to 3 amino acid sequence is SEQ ID NO: 29 to 31, the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the light chain variable region are shown in SEQ ID NOs: 32 to 34, respectively.
［ＩＦＮ－γの産生増強］
　３頭のイヌ（Ａ，Ｂ，Ｃ）より末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収し、ＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート中にウェル当たり２×１０５個、ｉｓｏｔｙｐｅ（ラットＩｇＧ２ａ：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＤ－１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ－１：４Ｆ１２－Ｅ６）、又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１：Ｇ１１－６）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるように加えて、さらにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍｌとなるように加えて３日間刺激培養し、得られた培養上清中のイヌＩＦＮ－γをcanine IFN-gamma DuoSet ELISA（R&D社製)により測定した。結果を図７に示す。 [Enhanced production of IFN-γ]
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected from 3 dogs (A, B, C), and 2 × 10 5 PBMCs per well in a 96-well round bottom plate, isotype (rat IgG2a: manufactured by eBioscience) A rat monoclonal antibody against PD-1 (anti-PD-1: 4F12-E6) or a rat monoclonal antibody against cPDL1 (anti-PD-L1: G11-6) was added to a concentration of 10 μg / ml, Furthermore, concanavalin A (ConA) was added to 5 μg / ml and stimulated for 3 days, and canine IFN-γ in the obtained culture supernatant was measured by canine IFN-gamma DuoSet ELISA (manufactured by R & D). The results are shown in FIG.
　図７から明らかなように、ＣｏｎＡ刺激により産生されるＩＦＮγは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１である４Ｆ１２－Ｅ６やａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１であるＧ１１－６の存在下で産生増強される傾向がみられた。このことから、ＣｏｎＡ刺激によりイヌのＴ細胞ではＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現が増強し、それらがそのＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合することで過剰なＴ細胞の活性化を防いでいる可能性が示唆され、得られたＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体は、イヌの細胞上に発現するＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１両分子の相互作用を阻害できることが示唆された。 As is clear from FIG. 7, IFNγ produced by ConA stimulation tends to be enhanced in the presence of anti-PD-1 4F12-E6 and anti-PD-L1 G11-6. It was. This suggests that ConA stimulation enhances PD-1 and PD-L1 expression in canine T cells, and that PD-L1 binds to PD-1 to prevent excessive T cell activation. It was suggested that the obtained PD-1 and PD-L1 antibodies can inhibit the interaction of both PD-1 and PD-L1 molecules expressed on canine cells.
［ＰＭＡ（Phorbol-12-myristate-13-acetate）／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ｉｏｎｏ）又はＣｏｎＡ存在下でのＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の発現誘導］
　イヌＰＢＭＣをＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ又はＣｏｎＡ存在下で３日間培養し、ＰＢＭＣを回収後、ＣＤ３陽性分画(Ｔ細胞)におけるＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１の発現を、ｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２－Ｅ６）又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１－６）を用いてフローサイトメトリー解析した。結果を図８に示す。 [Induction of expression of PD-1 or PD-L1 in the presence of PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) / ionomycin (iono) or ConA]
Canine PBMC was cultured in the presence of PMA / ionomycin or ConA for 3 days, and after PBMCs were collected, the expression of PD-1 and PD-L1 in the CD3-positive fraction (T cells) was compared with the rat monoclonal antibody against cPD1 (4F12-E6 ) Or a rat monoclonal antibody (G11-6) against cPDL1 was analyzed by flow cytometry. The results are shown in FIG.
　図８から明らかなように、活性化イヌＴ細胞には、ＰＤ－１もＰＤ－Ｌ１も発現が誘導されていることが明らかとなった。このように、本発明の抗体を用いることで、Ｔ細胞におけるＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の発現を調べることが可能であること、換言すれば、イヌの細胞における細胞表面に発現するＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１の発現を調べることが可能であることが明らかとなった。 As is clear from FIG. 8, it was revealed that expression of PD-1 and PD-L1 was induced in activated canine T cells. Thus, by using the antibody of the present invention, it is possible to examine the expression of PD-1 or PD-L1 in T cells, in other words, PD-1 expressed on the cell surface in canine cells. It was revealed that the expression of PD-L1 can be examined.
［ＩＬ－４又はＧＭ－ＣＳＦ存在下でのＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の発現誘導］
　イヌＰＢＭＣより磁気ビーズにより分離したＣＤ１４陽性単球をＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦ存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を誘導した。未成熟樹状細胞であることは、ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩＩ抗体（eBioscience社製）を同時に染色することで確認した。得られた未成熟樹状細胞におけるＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の発現をｃＰＤ１に対するラットモノクローナル抗体（４Ｆ１２－Ｅ６）、又はｃＰＤＬ１に対するラットモノクローナル抗体（Ｇ１１－６）を用いてフローサイトメトリー解析した結果を図９に示す。 [Induction of PD-1 or PD-L1 expression in the presence of IL-4 or GM-CSF]
CD14 positive monocytes separated from canine PBMC by magnetic beads were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 6 days to induce immature dendritic cells. The immature dendritic cells were confirmed by staining with MHC Class II antibody (manufactured by eBioscience) at the same time. Results of flow cytometry analysis of PD-1 or PD-L1 expression in the obtained immature dendritic cells using a rat monoclonal antibody against cPD1 (4F12-E6) or a rat monoclonal antibody against cPDL1 (G11-6) Is shown in FIG.
　図９に示すとおり、ＰＤ－１は発現しておらず、ＰＤＬ－１が発現していることが確認できた。このように、本発明の抗体を用いることで、未成熟樹状細胞におけるＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の発現を調べることが可能であることが明らかとなった。 As shown in FIG. 9, PD-1 was not expressed, and it was confirmed that PDL-1 was expressed. Thus, it was revealed that the expression of PD-1 or PD-L1 in immature dendritic cells can be examined by using the antibody of the present invention.
　本発明で得られたラットモノクローナル抗体は、イヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１を認識して結合可能であることから、イヌＰＤ－１又はイヌＰＤ－Ｌ１の発現解析や機能解析に用いることができるほか、イヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤として用いることができる。 Since the rat monoclonal antibody obtained in the present invention can recognize and bind to canine PD-1 or canine PD-L1, it can be used for expression analysis or functional analysis of canine PD-1 or canine PD-L1. In addition, it can be used as a binding inhibitor between canine PD-1 and canine PD-L1.

Claims (7)

  1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合する、以下の（ａ）又は（ｂ）記載の抗イヌＰＤ－１抗体。
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
    （ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；     The anti-canine PD-1 antibody described in (a) or (b) below, which specifically binds to canine PD-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
    (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
    (B) the heavy chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 having 90% or more identity, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or An anti-canine PD-1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  2. 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体。
    （ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
    （ｄ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；     The anti-canine PD-L1 antibody described in (c) or (d) below, which specifically binds to canine PD-L1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
    (C) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
    (D) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or the heavy chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, or An anti-canine PD-L1 antibody comprising a light chain variable region having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
  3. 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－１に特異的に結合する、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載の抗イヌＰＤ－１抗体。
    （ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；
    （ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－１抗体；     The anti-canine PD-1 antibody described in (e) or (f) below, which specifically binds to canine PD-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
    (E) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, An anti-canine PD-1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16. antibody;
    (F) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, An anti-canine PD-1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 antibody;
  4. 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるイヌＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載の抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体。
    （ｇ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；
    （ｈ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体；     The anti-canine PD-L1 antibody described in (g) or (h) below, which specifically binds to canine PD-L1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
    (G) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25; An anti-canine PD-L1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 antibody;
    (H) a heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, An anti-canine PD-L1 comprising a light chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence shown, CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, and CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 antibody;
  5. 請求項１～４のいずれか記載の抗体を含有することを特徴とするイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤。 A binding inhibitor of canine PD-1 and canine PD-L1, comprising the antibody according to any one of claims 1 to 4.
  6. 請求項１～４のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とするイヌＰＤ－1とイヌＰＤ－Ｌ１との結合阻害方法。 A method for inhibiting the binding between canine PD-1 and canine PD-L1, wherein the antibody according to any one of claims 1 to 4 is used.
  7. 請求項１～４のいずれか記載の抗体をコードする遺伝子。 A gene encoding the antibody according to any one of claims 1 to 4.
PCT/JP2015/003444 2014-07-09 2015-07-08 Anti-canine pd-1 antibody or anti-canine pd-l1 antibody WO2016006241A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016532441A JP6279733B2 (en) 2014-07-09 2015-07-08 Anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody
US15/320,412 US10280223B2 (en) 2014-07-09 2015-07-08 Anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody
EP15819249.2A EP3168236B1 (en) 2014-07-09 2015-07-08 Anti-canine pd-1 antibody or anti-canine pd-l1 antibody

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-140982 2014-07-09
JP2014140982 2014-07-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016006241A1 true WO2016006241A1 (en) 2016-01-14

Family

ID=55063893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/003444 WO2016006241A1 (en) 2014-07-09 2015-07-08 Anti-canine pd-1 antibody or anti-canine pd-l1 antibody

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10280223B2 (en)
EP (1) EP3168236B1 (en)
JP (1) JP6279733B2 (en)
WO (1) WO2016006241A1 (en)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632676A (en) * 2017-01-20 2017-05-10 新乡学院 Mouse anti-swine PD-L1 (Programmed Death 1 Ligand 1) monoclonal antibody and application thereof
US9920123B2 (en) 2008-12-09 2018-03-20 Genentech, Inc. Anti-PD-L1 antibodies, compositions and articles of manufacture
US9944704B2 (en) 2013-12-20 2018-04-17 Intervet Inc. Antibodies against canine PD-1
CN108350082A (en) * 2016-06-13 2018-07-31 爱迈博 PD-L1 antibody and application thereof
WO2018181064A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 国立大学法人北海道大学 Anti-pd-l1 antibody for detecting pd-l1
US10336824B2 (en) 2015-03-13 2019-07-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PDL1 antibodies, activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of thereof
WO2020103885A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Anti-pd-1 antibodies and uses thereof
US11091556B2 (en) 2015-12-18 2021-08-17 Intervet Inc. Caninized human antibodies to human IL-4R alpha
US11168144B2 (en) 2017-06-01 2021-11-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10348432B2 (en) 2013-06-11 2019-07-09 Texas Instruments Incorporated Network signaling for network-assisted interference cancellation and suppression
WO2016050721A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Intervet International B.V. Pd-l1 antibodies binding canine pd-l1
KR20180040138A (en) 2015-07-13 2018-04-19 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. Anti-PD-1 antibodies, activatable anti-PD-1 antibodies, and methods of using them
BR112018008904A2 (en) 2015-11-03 2018-11-27 Janssen Biotech Inc antibodies specifically binding to tim-3 and their uses
CN109452229B (en) * 2018-11-19 2021-10-22 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Preparation method and application of caninized PD-1 gene modified animal model
CN112920276B (en) * 2019-06-03 2021-11-12 北京希诺谷生物科技有限公司 Anti-canine PD-1 antibody and preparation method thereof
CA3177921A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 Inhibrx, Inc. Canine pd-1-binding polypeptides and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173223A1 (en) * 2012-05-15 2013-11-21 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI2206517T3 (en) 2002-07-03 2023-10-19 Ono Pharmaceutical Co Immunopotentiating compositions comprising anti-PD-L1 antibodies
KR101050829B1 (en) 2008-10-02 2011-07-20 서울대학교산학협력단 Anticancer agents comprising an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173223A1 (en) * 2012-05-15 2013-11-21 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEAEKAWA ET AL.: "Expression of PD-L1 on canine tumor cells and enhancement of IFN-gamma production from tumor-infiltrating cells by PD-L1 blockade", PLOS ONE, vol. 9, no. Issue 6, June 2014 (2014-06-01), pages e98415, XP055179324 *
See also references of EP3168236A4 *

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9920123B2 (en) 2008-12-09 2018-03-20 Genentech, Inc. Anti-PD-L1 antibodies, compositions and articles of manufacture
US10711061B2 (en) 2013-12-20 2020-07-14 Intervet Inc. Antibodies against canine PD-1
US11248047B2 (en) 2013-12-20 2022-02-15 Intervet Inc. Caninized antibodies
US10023636B2 (en) 2013-12-20 2018-07-17 Intervet Inc. Caninized murine antibodies to human PD-1
US9944704B2 (en) 2013-12-20 2018-04-17 Intervet Inc. Antibodies against canine PD-1
US10927172B2 (en) 2013-12-20 2021-02-23 Intervet Inc. Caninized murine antibodies to human PD-1
US10106607B2 (en) 2013-12-20 2018-10-23 Intervet Inc. Caninized antibodies
US11680097B2 (en) 2013-12-20 2023-06-20 Intervet Inc. Antibodies against canine PD-1
US10336824B2 (en) 2015-03-13 2019-07-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PDL1 antibodies, activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of thereof
US11174316B2 (en) 2015-03-13 2021-11-16 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PDL1 antibodies, activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
US10669339B2 (en) 2015-03-13 2020-06-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PDL1 antibodies, activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
US11091556B2 (en) 2015-12-18 2021-08-17 Intervet Inc. Caninized human antibodies to human IL-4R alpha
CN108350082B (en) * 2016-06-13 2021-09-24 天境生物科技(上海)有限公司 PD-L1 antibodies and uses thereof
CN108350082A (en) * 2016-06-13 2018-07-31 爱迈博 PD-L1 antibody and application thereof
CN106632676A (en) * 2017-01-20 2017-05-10 新乡学院 Mouse anti-swine PD-L1 (Programmed Death 1 Ligand 1) monoclonal antibody and application thereof
CN106632676B (en) * 2017-01-20 2020-05-29 新乡学院 Mouse-anti-pig PD-L1 monoclonal antibody and application thereof
RU2758723C2 (en) * 2017-03-27 2021-11-01 Нэшнл Юниверсити Корпорейшн Хоккайдо Юниверсити Anti-pd-l1 antibody for pd-l1 detection
US10865246B2 (en) 2017-03-27 2020-12-15 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Anti-PD-L1 antibody for detecting PD-L1
US11697686B2 (en) 2017-03-27 2023-07-11 National University Corporation Hokkaido University Anti-PD-L1 antibody for detecting PD-L1
KR102402398B1 (en) 2017-03-27 2022-05-25 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠 Anti-PD-L1 Antibody for PD-L1 Detection
KR20190132651A (en) * 2017-03-27 2019-11-28 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠 Anti-PD-L1 Antibody for PD-L1 Detection
WO2018181064A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 国立大学法人北海道大学 Anti-pd-l1 antibody for detecting pd-l1
US11168144B2 (en) 2017-06-01 2021-11-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
US11352429B2 (en) 2018-11-19 2022-06-07 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-PD-1 antibodies and uses thereof
WO2020103885A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Anti-pd-1 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2016006241A1 (en) 2017-04-27
US20170158764A1 (en) 2017-06-08
EP3168236A1 (en) 2017-05-17
EP3168236A4 (en) 2018-01-10
EP3168236B1 (en) 2019-09-04
US10280223B2 (en) 2019-05-07
JP6279733B2 (en) 2018-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6279733B2 (en) Anti-canine PD-1 antibody or anti-canine PD-L1 antibody
US11198730B2 (en) Anti-LAG-3 antibody
KR102512934B1 (en) Chimeric antigen receptors targeting BCMA and methods for their use
TWI744242B (en) Antibody constructs for egfrviii and cd3
JP7361610B2 (en) Anti-PD-L1 antibody and its use
CN114774444A (en) Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells, methods of making and therapeutic uses thereof
US9676858B2 (en) Human bispecific EGFRvIII antibody and CD3 engaging molecules
JP2021519610A (en) Multivalent antibody
EP3019532B1 (en) Human bispecific egfrviii antibody engaging molecules
TW201938586A (en) Continuous manufacturing process for bispecific antibody products
JP2019193652A (en) Antibodies against prostate-specific stem cell antigen and uses thereof
US20240050568A1 (en) Fully human single-domain tandem chimeric antigen receptor (car) targeting cd5, and use thereof
CN115812081A (en) anti-CTLA-4 antibodies and uses thereof
IL285909B2 (en) Anti-bcma single chain variable fragments
CN113045661B (en) Novel anti-CD 4 antibodies
RU2744862C2 (en) Antibody against pd-l1
WO2015172341A1 (en) Bispecific antibody for glypican-3 and t cell antigen
WO2023273762A1 (en) Spatial conformational epitope mediating efficient retention of cd3 within cells and application thereof
WO2022152282A1 (en) Anti-human cd22 monoclonal antibodies and use thereof
US20230159652A1 (en) Transferrin receptor 1 targeting for carcinogenesis prevention
WO2020078149A1 (en) Anti-cd137 antibody and uses thereof
TW202340240A (en) Multi-specific antibody and its pharmaceutical uses
CN116568709A (en) CD 5-targeting fully human antibodies, fully human Chimeric Antigen Receptor (CAR) and uses thereof
KR20230154235A (en) Antibodies against NKp46 and their applications
JP2023549977A (en) Chimeric antigen receptor containing anti-mesothelin scFv and its uses

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15819249

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016532441

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015819249

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015819249

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15320412

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE