WO2015193588A1 - Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations - Google Patents
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Definitions
- Cellulose is a polymer made up of glucose molecules linked by beta 1-4 bonds, which are highly resistant to degradation or depolymerization. Once the cellulose is converted to glucose, it is easily fermented to biofuel, for example ethanol, using yeast.
- vector is intended to mean any DNA sequence in which it is possible to insert foreign nucleic acid fragments, the vectors making it possible to introduce foreign DNA into a host cell.
- Non-exhaustive vectors include: plasmids, cosmids, artificial chromosomes of yeasts (YAC), artificial chromosomes of bacteria (BAC), artificial chromosomes derived from bacteriophage PI (PAC) or vectors derived from virus.
- the biomass to be hydrolysed is suspended in the aqueous phase
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Abstract
La présente invention porte sur l'expression et l'optimisation d'enzymes impliquées dans la dégradation de la biomasse lignocellulosique. La présente invention porte plus particulièrement sur des variants de l'exoglucanase 2 de Trichoderma reesei, ainsi que sur l'utilisation de ces variants à performance améliorée dans des procédés de dégradation de la cellulose et de production de biocarburant.
Description
VARIANTS D'EXOGLUCANASES A ACTIVITE AMELIOREE ET LEURS
UTILISATIONS
La possibilité de produire de l'éthanol à partir de la cellulose a reçu beaucoup d'attention en raison de la disponibilité de grandes quantités de matière première ainsi que de l'intérêt de l'éthanol à titre de carburant. Les matières premières naturelles cellulosiques pour un tel processus sont désignées par le terme "biomasse". De nombreux types de biomasse, par exemple le bois, les résidus agricoles, les cultures herbacées et les déchets solides municipaux, ont été considérés comme des matières premières potentielles pour la production de biocarburant. Ces matières sont constituées principalement de cellulose, d'hémicellulose et de lignine.
La cellulose est un polymère constitué de molécules de glucose reliées par des liens beta 1-4, qui sont très résistants à la dégradation ou à la dépolymérisation. Une fois la cellulose convertie en glucose, celui-ci est facilement fermenté en biocarburant, par exemple l'éthanol, en utilisant une levure.
Les plus anciennes méthodes étudiées pour convertir la cellulose en glucose sont basées sur l'hydrolyse acide. Ce processus peut se faire en présence d'acides concentrés ou dilués. Cependant, plusieurs inconvénients tels que la mauvaise récupération de l'acide lors de l'utilisation d'acides concentrés et la faible production de glucose dans le cadre de l'utilisation d'acides dilués nuisent à l'économie du processus d'hydrolyse acide. Pour surmonter les inconvénients du processus d'hydrolyse acide, les processus de conversion de la cellulose ont porté plus récemment sur l'hydrolyse enzymatique, à l'aide d'enzymes de type cellulase. Cette hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique (par exemple, la cellulose) présente cependant l'inconvénient d'être un procédé industriel coûteux. De ce fait, il est nécessaire d'utiliser des souches de microorganismes sécréteurs de cellulases de plus en plus performantes. À ce titre, beaucoup de microorganismes comportent des enzymes qui hydrolysent la cellulose, tels que les champignons Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium ainsi que des bactéries telles que Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas et Streptomyces. Les enzymes sécrétées par ces microorganismes possèdent trois types d'activités utiles dans
la conversion de la cellulose en glucose et se divisent en trois groupes: les endoglucanases, qui attaquent les fibres de celluloses aléatoirement en interne, les exoglucanases qui vont attaquer les extrémités des fibres en libérant du cellobiose, et les beta-glucosidases qui vont hydrolyser ce cellobiose en glucose. D'autres classes d'enzymes telles que les hémicellulases ou la classe d'enzymes récemment découverte des polysaccharides mono-oxygénases peuvent jouer également un rôle dans l'efficacité de l'hydrolyse.
Il y a un intérêt industriel fort pour la diminution du coût de l'hydrolyse enzymatique, et cette diminution passe par l'utilisation d'une dose réduite d'enzymes et donc des cocktails d'enzymes plus efficaces. En conséquence, plusieurs demandes de brevets décrivent des enzymes naturelles aux capacités supérieures à celles de Trichoderma reesei, ou des variants améliorés par génie génétique. On peut citer les demandes de brevet US2010304464, WO2010066411 et WO2013029176 concernant les exoglucanases, les demandes WO2007109 41, WO2012149192 et WO2010076388 concernant les endoglucanases, les demandes WO2010029259, WO2010135836 ou WO2010022518 concernant les beta-glucosidases, ou encore les demandes W012135659, W012149344 concernant les polysaccharides mono-oxygénases. Les enzymes hydrolysant la biomasse lignocellulosique sont classées dans le système CAZy (Cantarel, B. L., Coutinho, P. M., Rancurel, C, Bernard, T., Lombard, V., & Henrissat, B. (2009). The Carbohydrate- Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic acids research, 37, D233-8) sur des critères principalement structuraux. Les exoglucanases peuvent appartenir aux familles GH 6, 7, 9, 48, et 74.
Pour qu'une hydrolyse de la biomasse lignocellulosique soit efficace et économiquement rentable, le mélange enzymatique doit comporter des proportions équilibrées d'enzymes ayant des activités enzymatiques diverses, entre autres, mais non exclusivement, du type exoglucanases, endoglucanases, xylanases et beta-glucosidases. A titre d'exemple, dans les mélanges natifs de Trichoderma reesei on constate généralement la présence de 60-70% d'exoglucanases, 15-20% d'endoglucanases, quelques pourcentages d'hémicellulases et environ 5-10% de beta-glucosidases. Ce mélange convient pour hydrolyser la majorité des substrats prétraités (ex. type paille de
blé explosée à la vapeur en conditions acides) avec des rendements acceptables. La proportion déjà importante des exoglucanases dans le mélange indique qu'il sera difficile d'augmenter la quantité de ces enzymes sans pénaliser les autres activités. Le génome de Trichoderma reesei comporte deux exoglucanases, l'une issue de la famille 6 (CBH2, celôa) et l'autre issue de la famille 7 (CBH1, Cel7a). Elles hydrolysent en cellobiose respectivement les extrémités non réductrices (EC3.2.1.176) et réductrices (EC3.2.1.91) de la cellulose.
L'hydrolyse et la fermentation peuvent être réalisées suivant différents schémas. Le plus courant consiste en une hydrolyse et une fermentation séparées (SHF - Separate Hydrolysis and Fermentation). Cette méthode permet d'optimiser chaque étape par le maintien des conditions optimales de réaction. Cette fermentation s'effectue de manière extemporanée, à une température comprise entre environ 28°C et environ 30°C, tandis que l'hydrolyse a lieu généralement à une température d'au moins 45 °C. Cependant, en SHF, les sucres libérés en fin de réaction sont présents à très forte concentration et entraînent une inhibition des enzymes, ralentissant l'efficacité du procédé. Pour éviter ces inconvénients, un autre type de procédé peut être envisagé. En SSF, les deux étapes (hydrolyse et fermentation des hexoses) ont lieu de manière simultanée, empêchant l'accumulation des sucres à des concentrations inhibitrices pour les enzymes. Les coûts d'investissement sont également réduits grâce à l'utilisation d'un seul réacteur. Le taux d'hydrolyse est plus élevé suite à l'absence d'inhibition car les sucres libérés sont utilisés immédiatement pour la fermentation en éthanol. Dans cette méthode, la température du réacteur constitue nécessairement un compromis entre les températures optimales d'hydrolyse et de fermentation, typiquement entre environ 30°C et environ 35°C. Cependant, à une telle température, l'activité des enzymes cellulolytiques est diminuée de 30% environ.
La SSF permet également l'expression d'enzymes dégradant la cellulose dans l'organisme fermentant les sucres, ce qui permet de limiter, ou dans un cas extrême de supprimer le recours aux enzymes produites lors d'une étape séparée.
En conséquence, l'obtention d'enzymes maintenant une activité exoglucanase efficace aux températures optimales d'hydrolyse et de fermentation (soit entre 30°C et 50°C) tout en gardant la proportion de l'ensemble des enzymes du mélange serait un
gain significatif pour le procédé de conversion de biomasse lignocellulosique en biocarburant.
Les inventeurs ont développé un polypeptide ayant une activité exoglucanase améliorée, notamment par rapport à l'activité exoglucanase de la protéine de référence CBH2 de séquence SEQ ID NO :2. CBH2 correspond à l'exoglucanase 2 de Trichoderma reesei.
Dans cette optique, les déposants, ont eu le grand mérite de trouver, après de nombreuses recherches, un polypeptide isolé ou purifié ayant une activité exoglucanase améliorée par rapport à l'activité exoglucanase de la protéine de référence CBH2 (SEQ ID NO :2).
L'invention concerne donc un polypeptide choisi dans le groupe consistant en : i. une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6,
SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28 ; et
ii. une séquence d'acides aminés présentant un pourcentage de résidus identiques par rapport à la séquence SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ
ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28, (pourcentage d'identité) d'au moins 70%, préférentiellement d'au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%.
De préférence, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que son expression dans un organisme fermentaire est au moins égale à l'expression de la protéine de référence CBH2 (SEQ ID NO :2). Selon l'invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à
SEQ ID NO :4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28 correspond au nombre de résidus identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO :4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28 divisé par le nombre de résidus dans SEQ ID NO :4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide de l'invention a une activité exoglucanase améliorée d'au moins 10%, préférentiellement d'au moins 20%, préférentiellement d'au moins 30%, encore plus préférentiellement d'au moins 40%, à une température d'environ 35°C et/ou d'environ 50°C, par rapport à l'activité exoglucanasse du polypeptide CBH2 de séquence d'acides aminés SEQ ID N°2.
L'homme du métier pourra par exemple déterminer l'augmentation ou autrement dit l'amélioration de l'activité enzymatique soit à l'aide d'un substrat comme la cellulose Avicel®, la cellulose PASC ou avec un substrat chromogénique (p- Nitrophenyl glycoside), par exemple le pNP lactose. L'activité enzymatique sera respectivement révélée par dosage colorimétrique des sucres réducteurs ou bien du nitrophénol libérés.
Un exemple de protocole, que l'homme du métier pourra utiliser pour déterminer si un polypeptide selon l'invention présente une activité enzymatique améliorée par rapport à celle de la protéine de référence CBH2 (SEQ ID NO :2), est le suivant :
préparation d'une culture stock de Y. lipolytica exprimant une enzyme recombinante selon l'invention pendant toute la nuit à 28°C ; ensemencement d'un milieu d'expression avec un volume de culture stock permettant d'avoir une densité optique à 600 nm égale à 0.2 au début de la culture ;
culture desdites cellules à 28 °C pendant 96 heures ;
centrifugation à 8000 rpm pendant 5 minutes ;
incubation de 100 μΐ^ de surnageant avec 100 μΐ^ de tampon citrate phosphate 0.1 M pH 6 contenant 1 % de cellodextrines (CD) réduites pendant 4 heures à 35°C et 50°C ;
prélèvement de 100 μΐ^ de réaction ;
ajout de 100 de réactif DNS ;
incubation 5 minutes à 100°C ;
incubation 3 minutes sur la glace ;
centrifugation 10 minutes à 3000 rpm ;
lecture de la DO à 540 nm sur 150 μL·
L'invention a également pour objet, un acide nucléique purifié ou isolé codant au moins un polypeptide tel que décrit précédemment. Le TABLEAU 1 ci-dessous comprend les identifications des séquences nucléiques et peptidiques pour le gène de référenceCBH2 de T. reesei , les exoglucanases putatives de Nectria haematococca (NH) et de Giberella zeae (GZ), ainsi que pour les polypeptides et polynucléotides de l'invention.
TABLEAU 1
L'invention a également pour objet un acide nucléique purifié ou isolé codant au moins un polypeptide tel que décrit précédemment. De préférence, ledit acide nucléique purifié ou isolé peut être choisi parmi les séquences suivantes: SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :9,
SEQ ID NO : 11; SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :25 et SEQ ID NO :27.
Selon l'invention, l'acide nucléique tel que décrit précédemment pourra être lié opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans une cellule hôte.
L'invention porte également sur un vecteur comprenant au moins un acide nucléique tel que décrit précédemment.
Selon l'invention, on entend par « vecteur » toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. On peut citer de manière non-exhaustive comme vecteurs : les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC), les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage PI (PAC) ou les vecteurs dérivés de virus.
Le vecteur selon l'invention pourra également porter un marqueur de sélection. On entend par « marqueur de sélection » un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques.
L'invention a également pour objet une cellule hôte isolée comprenant soit au moins l'un des polypeptides tels que décrit précédemment, soit au moins l'un des acides nucléiques tels que décrit précédemment soit au moins l'un des vecteurs tels que décrits précédemment.
L'homme du métier pourra introduire l'un des polypeptides, l'un des acides nucléiques ou l'un des vecteurs tels que décrits précédemment dans la cellule hôte par des méthodes conventionnelles bien connues. Par exemple, on peut citer le traitement au chlorure de calcium, l'électroporation, l'utilisation d'un pistolet à particules.
Selon un mode de réalisation, l'homme du métier pourra introduire dans la cellule hôte et par des méthodes conventionnelles plusieurs copies d'un acide nucléique codant un polypeptide ayant une activité exoglucanase améliorée selon l'invention. Selon un mode de réalisation, la cellule hôte isolée telle que décrite précédemment est choisie parmi Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Myceliophthora, Chrysosporium, Pénicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia et Saccharomyces.
Selon un mode de réalisation préféré, la cellule hôte isolée telle que décrite précédemment est choisie parmi Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Humicola grisae, Pénicillium pinophilum, Pénicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca et Saccharomyces cerevisiae. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule hôte isolée telle que décrite précédemment est choisie parmi Trichoderma reesei et Saccharomyces cerevisiae.
L'invention a également pour objet l'utilisation de l'un quelconque des polypeptides décrits précédemment pour l'hydrolyse de la cellulose.
L'invention a également pour objet, l'utilisation de l'un quelconque des polypeptides décrits précédemment pour la production de biocarburant.
Selon l'invention, le terme biocarburant peut être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D'une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d'exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol selon le type d'organisme fermentaire utilisé),
des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d'acides gras), ainsi que l'hydrogène.
De manière préférée, le biocarburant selon l'invention est un alcool, par exemple l'éthanol, le butanol et/ou isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l'invention est l'éthanol.
Dans un autre mode de réalisation, le biocarburant est du biogaz. Dans un autre mode de réalisation, le produit est une molécule intéressant l'industrie chimique, comme par exemple, un autre alcool tel que le 1,2-propane diol, le 1,3-propane diol, le 1,4-butane diol, le 2,3-butane diol, des acides organiques comme l'acide acétique, propionique, acrylique, butyrique, succinique, malique, fumarique, citrique, itaconique, ou des hydroxyacides comme l'acide glycolique, hydroxypropionique, ou lactique.
On décrit ci-dessous un mode de réalisation de production d'un cocktail enzymatique utile pour l'hydrolyse de la lignocellulose. Les souches de champignons filamenteux, de préférence Trichoderma, plus préférentiellement T. reesei, capables d'exprimer au moins un polypeptide selon l'invention sont cultivées en fermenteurs, en présence d'un substrat carboné, tel que le lactose ou le glucose, choisi pour la croissance du microorganisme. Dans un mode de réalisation, ce substrat carboné, selon sa nature, est introduit dans le fermenteur avant stérilisation ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation de ce dernier pour obtenir une concentration initiale de 20 à 35 g / L.
Une solution aqueuse contenant le substrat choisi pour la production des enzymes est ensuite ajoutée. Une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique produite par les champignons est enfin récupérée par filtration du milieu de culture. Dans cette composition, on retrouve notamment, la beta-glucosidase, l'endoglucanase et l'exoglucanase selon l'invention.
Dans un mode de réalisation, la solution aqueuse contenant le substrat choisi pour la production des enzymes est préparée à la concentration de 200-250 g / L. Cette
solution contient en outre de préférence un substrat inducteur tel que le lactose. Cette solution aqueuse est injectée après l'épuisement du substrat carboné initial de façon à apporter une quantité optimisée, comprise entre 35 et 45 mg / g de cellules ("fed batch"). Pendant cette phase de "fed batch", la concentration résiduelle en sucre dans le milieu de culture est inférieure à 1 g / L et les enzymes agissant sur la biomasse lignocellulosique sont sécrétées par le champignon. Ces dernières peuvent être récupérées par filtration du milieu de culture.
L'invention a pour objet une composition enzymatique apte à agir sur la biomasse lignocellulosique, ladite composition enzymatique étant produite par des champignons filamenteux et comprenant au moins un polypeptide ayant une activité exoglucanase améliorée par rapport à l'activité exoglucanase de la protéine de référence CBH2. Par « champignons filamenteux », on entend notamment Trichoderma, plus préférentiellement T. reesei.
Enfin, l'invention a pour objet un procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse comprenant les étapes successives suivantes :
- on met en suspension en phase aqueuse la biomasse à hydrolyser;
- on hydrolyse la biomasse lignocellulosique en présence d'une composition enzymatique telle que décrite précédemment de manière à produire un hydrolysat contenant du glucose;
- on fermente en présence d'un organisme fermentaire le glucose de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation;
- on sépare le biocarburant du moût de fermentation.
Dans un mode de réalisation, la biomasse à hydrolyser est mise en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40 % de matière sèche, de préférence 20 à 30 %. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45°C et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout de la composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique ; la quantité habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution de
sucres est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation et ensuite traitée dans une unité de fermentation.
Après l'étape de fermentation, le biocarburant est séparé du moût de fermentation par exemple par distillation.
Un autre objet de l'invention est un procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
- on met en suspension en phase aqueuse la biomasse à hydrolyser ;
- on ajoute simultanément à la suspension une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique telle que définie précédemment et un organisme fermentaire et on fermente le mélange de manière à produire un moût de fermentation ;
- on sépare le biocarburant du moût de fermentation.
De préférence, la composition enzymatique et l'organisme fermentaire sont ajoutés simultanément puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans la biomasse est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire (par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène.
Dans un autre mode de réalisation, l'organisme fermentaire produit le polypeptide objet de l'invention par sécrétion ou en surface de sa cellule, éventuellement conjointement à d'autres enzymes agissant sur la biomasse lignocellulosique, limitant ou supprimant ainsi le besoin en enzymes produites par le champignon filamenteux. De préférence, l'organisme fermentaire est une cellule hôte telle que décrite précédemment.
De préférence, les cellules hôtes avec la composition enzymatique et/ou l'organisme fermentaire, sont ajoutés puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. L'utilisation du polypeptide présentant une meilleure activité exoglucanase selon la présente invention présente ainsi l'avantage d'obtenir un meilleur rendement de production de glucose tout en employant moins d'enzyme qu'auparavant, ce qui présente également un avantage économique. D'autres aspects, objets, avantages et caractéristiques de l'invention, seront présentés à la lecture de la description non restrictive qui suit et qui décrit des modes de réalisation préférés de l'invention donnés par le biais d'exemples et des figures.
La Figure 1 est un spectre de masse MALDI-TOF représentant les cellodextrines DP3 à DPI 1 utilisées pour le criblage.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Préparation de cellodextrines réduites (DP 3-11)
1 -Hydrolyse de la cellulose (Adapté de Y-H. Percival Zhang, L. R. Lynd Analytical Biochemistry 322 (2003), 225-232.)
4h , 25°C
Avicel + HC1 + H2S04 ► Cellodextrines 20 g de cellulose (Avicel. CAS Number 9004-34-6, Sigma-Aldrich Saint-
Quentin Fallavier) sont ajoutés par portions et sous forte agitation à 160 mL d'une solution refroidie à 0°C d'acide chlorhydrique. De l'acide sulfurique, préalablement refroidi, est ajouté à la solution en plusieurs fois (4 x 10 mL). La réaction est maintenue sous agitation pendant 4 heures à 25 °C avant d'être versée dans 1.8 L d'acétone refroidie à -20°C. Après 2 heures d'agitation, le précipité est filtré, repris dans 400 mL d'acétone refroidie puis filtré à nouveau. Le solide est alors repris dans 600 mL d'eau, puis agité pendant une nuit pour solubiliser les cellodextrines. Après filtration du solide, la fraction soluble contenant les cellodextrines est neutralisée avec 300 g de résine Amberlite IRA 400 OH"' puis lyophilisée. Le lyophilisât est ensuite re-suspendu dans
500 mL de méthanol en présence d'ultra-sons pendant 30 minutes pour solubiliser les sucres de bas poids moléculaire avant d'être filtré puis lyophilisé à nouveau pour conduire à 6.8 g de cellodextrines de DP 3-11. Pour le criblage, il a été choisi de travailler avec des substrats de plus haut poids moléculaire possible pour mimer au mieux la structure de la cellulose. Mais, les cellodextrines de haut poids moléculaire ne sont pas solubles, ceci empêchant une bonne reproductibilité des tests. Une gamme de cellodextrines de DP 5-7 a donc été choisie, ce qui représente un bon compromis entre le haut poids moléculaire nécessaire et la solubilité des cellodextrines.
La Figure 1 présente un spectre de masse MALDI-TOF typiquement obtenu selon le procédé décrit ci-dessus.
La Figure 1 montre que les oligosaccharides isolés sont majoritairement de DP
5-7.
2-Réduction des cellodextrines
400 mg de borohydrure de sodium sont ajoutés à 2 g de cellodextrines DP 3-11 dilués dans 120 mL d'eau. Après 3 heures sous agitation à température ambiante, la solution est neutralisée par addition de résine Amberlite H+ IR 120, filtrée, puis lyophilisée, pour conduire à 2 g de cellodextrines réduites de manière quantitative. (C. Schou, G. Rasmussen, M-B. Kaltoft, B. Henrissat, M. Schulein Eur. J. Biochem. 217, 947-953 (1993)). Un dosage au BCA (acide bicinchoninique) des cellodextrines isolées permet de vérifier la réduction totale des extrémités réductrices (Y. -H. Percival Zhang, L. R. Lynd Biomacromolecules 2005, 6, 1510-1515).
EXEMPLE 2 : évolution par L-shuffling
La séquence du gène de la cellobiohydrolase 2 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO : 1) a été soumise à un tour de L-shuffling selon le procédé breveté décrit dans le brevet EPI 104457 avec les gènes d'une exoglucanase putative de Giberella zeae PH-1 (SEQ ID NO :29) et d'une protéine hypothétique NECHADRAFT_73991 de Nectria haematococca mpVI (SEQ ID NO :31) présentant respectivement 63% et 69% d'homologie avec le gène parental CBH2 (SEQ ID NO : 1). La séquence nucléique codant le peptide signal (SEQ ID NO :33) a été délétée lors du clonage, et remplacée par celle de la levure, de séquence SEQ ID NO :34 (séquence du peptide signal correspondant : SEQ ID NO :35).
1- Criblage à haut débit Un test de criblage à haut débit a été mis au point afin de sélectionner les meilleurs clones issus du L-shuffling, c'est-à-dire ceux présentant au moins 20% d'amélioration de l'activité cellobiohydrolase par rapport à l'enzyme de référence CBH2 (SEQ ID NO :2). Le test de criblage à haut débit a été réalisé selon les étapes suivantes :
isolement sur gélose des clones de Y. lipolytica exprimant les variants de L-shuffling de l'enzyme selon l'invention et mise en pré-cultures en milieu YNBcasa (yeast nitrogen base 1.7 g / L, NH4C1 10 g / L, glucose 10 g / L, casamino acids 2 g / L, pH7) desdites colonies pendant 36 heures à 28°C ; inoculation d'un milieu YTD (extrait de levure 10 g / L, tryptone 20 g / L, glucose 2.5 g / L, pH 6.8) additionné de tétracycline à 12.5 μg / mL à 5% avec la pré-culture puis incubation 20 heures à 28 °C ;
inoculation du milieu d'expression contenant l'inducteur (acide oléique) à raison de 20 g / L à 10% avec la culture précédente puis incubation 96 heures à 28 °C ;
centrifugation 5 minutes à 1500 rpm ;
prélèvement de 100 μΐ^ de surnageant ;
ajout de 100 μΐ^ de CD réduites à 1 g / L dans du tampon citrate phosphate 0.1 M à pH 6 ;
incubation 24 heures à 35°C ;
centrifugation pendant 5 minutes à 2500 rpm ;
prélèvement de 80 μΐ^ de surnageant ;
ajout de 80 de réactif DNS ;
incubation 12 minutes à 105°C puis 5 minutes sur la glace ;
- lecture de la densité optique (DO) à 540 nm sur 120 μL·
Dans ces conditions de criblage, une amélioration de l'activité cellobiohydrolase (augmentation de la DO à 540 nm) par rapport à l'enzyme de référence CBH2 (SEQ ID NO :2) a été trouvée dans plusieurs clones. Parmi ces clones, on peut citer les clones 35B7 , 95B7, 100F11, 139F12, 157B11, 161A1, 161C12, 189H8, 196D9, 198E11, 251B4, 251C4 et 382A2, codant respectivement pour les enzymes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28. 2-Détermination de l'amélioration de l'activité cellobiohydrolase
2-1/ Sur le substrat cellodextrines réduites
Afin d'estimer le kcat relatif des variants sélectionnés au premier tour de L- shuffling par rapport à l'enzyme de référence CBH2 (SEQ ID NO :2), on procède de la façon suivante :
préparation d'une culture stock de Y. lipolytica exprimant une enzyme recombinante selon l'invention pendant toute la nuit à 28°C ; ensemencement d'un milieu d'expression avec un volume de culture stock permettant d'avoir une densité optique à 600 nm égale à 0.2 au début de la culture ;
culture desdites cellules à 28 °C pendant 96 heures ;
centrifugation à 8000 rpm pendant 5 minutes ;
incubation de 100 μΐ^ de surnageant avec 100 μΐ^ de tampon citrate phosphate 0.1 M pH 6 contenant 1 % de CD réduites pendant 4 heures à
35°C et 50°C ;
prélèvement de 100 μΐ^ de réaction ;
ajout de 100 de réactif DNS ;
incubation 5 minutes à 100°C ;
incubation 3 minutes sur la glace ;
centrifugation 10 minutes à 3000 rpm ;
lecture de la densité optique à 540 nm sur 150 μΐ^.
Selon l'invention, le calcul des kcat est fait de la façon suivante :
tracé de la courbe des DO à 540 nm en fonction du volume de surnageant de culture dans le test ;
soustraction de la valeur du témoin négatif ;
division par le coefficient de la gamme étalon de glucose (différentes quantités de glucose sont révélées avec le DNS) ;
division par le temps de réaction (240 minutes).
Le tableau 2 présente la valeur des kcat ainsi que les facteurs d'amélioration obtenus pour les clones 35B7, 95B7, 100F11, 139F12, 157B 11, 161A1, 161C12, 189H8, 196D9, 198E11, 251B4, 251C4 et 382A2 codant respectivement les enzymes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28 par rapport à la protéine de référence CBH2 (SEQ ID NO :2) dans ces conditions expérimentales.
TABLEAU 2 : amélioration de l'activité cellobiohydrolase sur CD réduites
35°C 50 °C
Facteur Facteur
Clone Kcat (min-1) Kcat (min-1)
amélioration amélioration
35B7 0,166 3,8 0,2345 1,6
95B7 0,287 6,6 0,715 4,8 lOOFll 0,0508 1,2 0,1375 0,9
139F12 0,1719 3,9 0,2328 1,6
157B11 0,113 2,6 0,2061 1,4
161A1 0,0577 1,3 0,1175 0,8
Clones du premier tour 161C12 0,1086 2,5 0,2162 1,4
189H8 0,0872 2,0 0,1792 1,2
196D9 0,1055 2,4 0,1969 1,3
198E11 0,1218 2,8 0,1757 1,2
251B4 0,0495 1,1 0,0865 0,6
251C4 0,0623 1,4 0,1315 0,9
382A2 0,315 7,2 0,552 3,7
Protéine de référence cbh2 0,0436 1 0,1501 1
Les résultats montrent une amélioration d'activité enzymatique par rapport à l'enzyme de référence CBH2 (SEQ ID No :2) pour les clones 35B7, 95B7, 100F11, 139F12, 157B 11, 161A1, 161C12, 189H8, 196D9, 198E11 , 251B4, 251C4 et 382A2 codant respectivement pour les enzymes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28 que ce soit à 35°C ou à 50°C.
2-2/ Sur le substrat Avicel
L'amélioration d'activité des clones 35B7, 95B7, 100F11, 139F12, 157B 11 , 161A1, 161C12, 189H8, 196D9, 198E11, 251B4, 251C4 et 382A2 codant respectivement pour les enzymes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28 a ensuite été confirmée sur un second substrat : Avicel.
La détermination de l'amélioration de l'activité sur ce substrat est effectuée en mesure en point final selon le protocole suivant :
- préparation d'une culture stock de Y. lipolytica exprimant une enzyme recombinante selon l'invention pendant toute la nuit à 28°C ; ensemencement d'un milieu d'expression avec un volume de culture stock permettant d'avoir une densité optique à 600 nm égale à 0.2 au début de la culture ;
- culture desdites cellules à 28 °C pendant 96 heures ;
centrifugation à 8000 rpm pendant 5 minutes ;
incubation de 100 μΐ^ de surnageant avec 100 μΐ^ de tampon citrate phosphate 0.1 M pH 6 contenant 1 % d' Avicel pendant 18 heures à 35 et 50°C ;
- prélèvement de 100 μΐ^ de réaction ;
ajout de 100 de réactif DNS ;
incubation 5 minutes à 100°C ;
incubation 3 minutes sur la glace ;
centrifugation 10 minutes à 3000 rpm ;
lecture de la densité optique à 540 nm sur 150 μΐ^.
Le tableau 3 présente la valeur des DO à 540 nm (après soustraction de la valeur du témoin négatif) ainsi que le facteur d'amélioration obtenus pour les clones 35B7, 95B7, 100F11, 139F12, 157B11, 161A1, 161C12, 189H8, 196D9, 198E11, 251B4, 251C4 et 382A2 dans ces conditions expérimentales.
TABLEAU 3 : amélioration de l'activité cellobiohydrolase sur A icel
Les résultats du tableau 3 montrent une amélioration de l'activité enzymatique par rapport à l'enzyme de référence CBH2 (SEQ ID No :2) à 35°C pour les clones 198E11 et 251B4 (respectivement SEQ ID No :22 et 24) ainsi qu'une amélioration de l'activité enzymatique par rapport à l'enzyme de référence CBH2 (SEQ ID No :2) à 35°C et à 50°C pour le clone 382A2 (SEQ ID No :28).
Claims
REVENDICATIONS
Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il a une activité exoglucanase améliorée par rapport à l'activité exoglucanase de la protéine de référence CBH2 de séquence SEQ ID NO :2, ledit polypeptide étant choisi dans le groupe consistant en :
i. une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28 ; et
i. une séquence d'acides aminés présentant, par rapport à la séquence SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :28, un pourcentage d'identité d'au moins 70%, préférentiellement d'au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%.
Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il code au moins un polypeptide selon la revendication 1.
Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 2 choisi parmi les séquences suivantes: SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO : 11; SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :25 et SEQ ID NO :27.
Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend au moins un acide nucléique selon l'une des revendications 2 ou 3.
Cellule hôte isolée caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide selon la revendication 1, ou au moins un acide nucléique selon l'une des revendications 2 ou 3, ou au moins un vecteur selon la revendication 4.
Cellule hôte isolée selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Pénicillium, Fusarium, Thermomonospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia et Saccharomyces.
Cellule hôte isolée selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Pénicillium pinophilum, Pénicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium sac char olyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca et Saccharomyces cerevisiae.
Utilisation dudit polypeptide selon la revendication 1 pour l'hydrolyse de la cellulose.
Utilisation dudit polypeptide selon la revendication 1 pour la production de biocarburant.
Composition enzymatique apte à agir sur la biomasse lignocellulosique, ladite composition enzymatique étant produite par des champignons filamenteux et comprenant au moins un polypeptide selon la revendication 1.
Procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
- on met en suspension en phase aqueuse la biomasse à hydrolyser ;
- on hydrolyse la biomasse en présence d'une composition enzymatique selon la revendication 10 la biomasse lignocellulosique de manière à produire un hydrolysat contenant du glucose ;
- on fermente en présence d'un organisme fermentaire le glucose de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation ;
- on sépare le biocarburant du moût de fermentation.
Procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
- on met en suspension en phase aqueuse la biomasse à hydrolyser ;
- on ajoute simultanément à la suspension une composition enzymatique selon la revendication 10 et un organisme fermentaire et on fermente le mélange de manière à produire un moût de fermentation ;
- on sépare le biocarburant du moût de fermentation.
Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, dans lequel l'organisme fermentaire est une cellule hôte selon l'une des revendications 5 à 7.
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