WO2015176951A1 - Verfahren zur quantitativen analyse von organischen molekülen in einer probe - Google Patents

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WO2015176951A1
WO2015176951A1 PCT/EP2015/059809 EP2015059809W WO2015176951A1 WO 2015176951 A1 WO2015176951 A1 WO 2015176951A1 EP 2015059809 W EP2015059809 W EP 2015059809W WO 2015176951 A1 WO2015176951 A1 WO 2015176951A1
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fluorine
sample
molecules
molecule
atoms
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PCT/EP2015/059809
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English (en)
French (fr)
Inventor
Mao Dong HUANG
Michael Okruss
Sebastian Geisler
Stefan Florek
Original Assignee
Leibniz - Institut Für Analytische Wissenschaften - Isas - E.V.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative analysis of organic molecules, in particular of biomolecules in a sample.
  • molecules which can be quantified by the method are complex biomolecules such as proteins, peptides and nucleic acids or other organic molecules such as amines, amino acids, alcohols, aldehydes, ketones and carbohydrates.
  • RIA immunoimmunassay
  • Enzyme Linked Immunosorbent Assay enzymes are used as markers, which catalyze enzymatic reactants. The resulting changes can be detected as color or fluorescence.
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • ICP-MS Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers
  • metal chelates and covalently bound marks are used.
  • the binding of metal I markers to protein can be done in two steps. The metal is first bound in a complex, which is subsequently bound to the protein molecule using its active group. An example of this is disclosed in DE 10227599 A1.
  • Metal chelate markers have the disadvantage that they are very voluminous and can therefore disturb the structure of the protein. Therefore, only a small part of the proteins is labeled even with long reaction times and a large excess of marker complexes. It would therefore be advantageous to bind the marrow directly to the molecule with a covalent bond.
  • mercury is mercury and environmentally harmful and has a low ionization in the range of 20% due to its high ionization energy in the plasma. Mercury can therefore only be detected with low sensitivity.
  • a method with mercury is suitable. Mercury binds only to the thiol group of a peptide or protein molecule. Without thiol group, the process with mercury can not be realized.
  • Atomic absorption spectroscopy for example in the Journal of Anaiyticai Atomic Spectrometry, Vol. 27, 201 2, 982-988.
  • the group also succeeded in detecting fluorine as a diatomic molecule.
  • This evidence is published in M.D. Huang, H. Becker-Ross, S. Florek, U. Heitmann and M. Okruss, Spectrochimca Acta Part B, Vol. 61, 2006, 572-578 and U. Heitmann, I.I. Becker-Ross, S. Florek, MD Huang, M. Okruss, Journal of Anaiyticai Atomic Spectrometry, Vol. 21, 2006, 1 14-1 20. In the following dissertation of II.
  • Gleisner published under http: //www.db- tlnieringen.de/servlets/DerivateSetvlet/Derivate-2391 1 Gleisner / Dissertation. and Z.W. Qin, A. Raab, E. Krupp, H. Deng, J. Feldmann, J. Anal. At. Spectrom., 201 3, 28, 877-882 describes the determination of fluorine by atomic absorption spectroscopy as a detector for chromatography. Here, the natural, already existing fluorine content in samples examined.
  • Disclosure of the invention It is an object of the invention to provide a quantitative detection method for organic non fluorhaitige molecules, which has a high sensitivity and a low 'detection limit and is suitable for a large number of molecules.
  • the object is achieved in that the method comprises the following steps:
  • the molecule to be analyzed is not labeled with a metal or a chelated metal but with the non-metal l fluorine.
  • a fluorine atom is very small and therefore resembles the hydrogen atom in its properties.
  • the substitution of atoms or groups in protein, peptide or other complex organic molecules therefore does not lead to significant disruptions in the geometry of the modified structures.
  • the labeling reaction takes place rapidly and, after derivatization, the chromium tographic behavior of the labeled molecule changes only slightly.
  • fluorine-containing substances as a marker reagent available. Labeled molecules often contain several fluorine atoms after labeling and even the use of fluoropolymers with a large number of fluorine atoms is possible. This can significantly increase the sensitivity of the process.
  • the labeling reaction can be done in several ways.
  • the marker reagent can be covalently bound to any desired active site of the molecule, including the term in us, C term and side chain groups.
  • the present invention not only enables easy and rapid labeling, but also their reliable quantitative determination.
  • the ionization energy of fluorine at 1 7.42 eV is still above that of argon (15.76 eV), so that fluorine is not suitable for determination in an argon plasma by means of ICP-MS.
  • the determination of atomic fluorine with atomic absorption and atomic emission spectroscopy is also not possible due to the position of the resonance line in the VUV below 100 nm.
  • a metal-containing molecular binder is added, with which the fluorine is heated together.
  • the etal l is not used as a marker but as a molecule binder. Upon heating to high temperatures, all organic structures are lost and a diatomic metal fluoride is formed. Examples of suitable metals are the metals of the second and third main groups of the Periodic Table. These binary diatomic molecules, such as GaF or CaF, whose rotational bands can be detected very specifically and sensitively by means of high-resolution continuum absorption spectroscopy (HR CSAS).
  • HR CSAS high-resolution continuum absorption spectroscopy
  • metals of the second and third main groups in particular aluminum (Al), barium (Ba), beryllium (Be), calcium (Ca), gallium (Ga), iodine (In), magnesium (Mg ) and strontium (Sr) are well suited as molecular binders.
  • the metals may be added as ions dissolved, for example from a nitrate or acetate salt.
  • the determination is preferably carried out by means of graphite tube atomizers.
  • the graphite tube is gradually heated to high temperatures between 1300 and 2500 C. Then the sample evaporates and the complex molecule is atomized almost completely. Some of the resulting atoms and ions in the resulting sample cloud react with each other.
  • the metal lmolekül brieflyners for example a Gallium or calcium compound, the fluorine reacts to a diatomic molecule.
  • the reaction yield and reaction rate are particularly high because fluorine has high electron negativity.
  • other molecules in the graphite tube can often be corrected out in the HR CS AS in the case of line interference as a spectral background in a known manner.
  • the atomization takes place in a miniaturized graphite tube with a reduced inner diameter.
  • a miniaturized graphite tube with a reduced inner diameter Unlike when using Hohikathodenlampen have usually used at HR CS AS ended high-pressure xenon lamps a so-called hotspot.
  • the radiation is thus emitted from a very small volume and can be focused without loss shadows loss-free by graphite tube, which have a smaller diameter.
  • the use of a miniaturized graphite tube with diameters of less than 2 mm enables the determination of very small sample quantities with significantly increased sensitivity. In this way, very low absolute Nachw ice thresholds for a variety of chemical elements in complex organic biomolecules can be achieved as in proteins.
  • HR CS AS allows sufficient separation of the lines of interest from the absorptions caused by other matrix elements contained in the sample.
  • a complex sample matrix can therefore be dosed directly and without pretreatment in this method and analyzed correctly.
  • a marker is all fluorine-containing compounds, such as esters, aldehydes. Ketones, alcohols. Fluoro rz ezo 1 c h I r i d e, fluorobenzamides, pentafluorophenyl trifluoroacetate,
  • Pentafluorophenyl isothiocyanate etc. Labeling may be at the N-terminus or the ⁇ -amino group of lysines of peptides or at the C-terminus or functional groups of chains, such as a sulfhydryl group of cysteine or the aromatic groups of phenylanine, tryptophan or histidine.
  • HR CS AS the sample is fractionated. For this purpose, a chromatographic column is used.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • LC liquid chromatography
  • FPLC fast protein liquid chromatography
  • affinity chromatography size exclusion chromatography
  • hydrophobic interaction chromatography ion exchange chromatography
  • electrophoresis electrophoresis
  • capillary electrophoresis capillary electrophoresis
  • fractions are collected separately in a fraction collector in several containers. Fractions in which the biomolecules of interest are expected are, for example, transferred to an autosampler and one or more samples taken from the container and placed in the absorption region of the atomic absorption spectrometer. The relevant fractions can also be taken directly from the fraction collector through a precision dosing device (sampler) preferably in a graphite furnace atomizer.
  • the method described is simple, fast and flexible.
  • the labeling with fluorine is particularly simple, requires only one step and has a high yield compared to other markers. Unwanted by-products can be avoided or easily taken into account.
  • an internal standard is used, provided that there are measurable atoms in the biomolecule elsewhere.
  • foreign atoms such as iron, which are also present in the molecule, can be measured simultaneously in the HR CSAS and provide information on the correctness of the measurement.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a structure for quantitative
  • FIG. 2 is a representation of the temporally integrated measured with HR-CSAS
  • FIG. 3 is a representation of the time-lapse measured by HR-CSAS
  • the content of traces of amphetamines and methamphetamines in a sample is determined.
  • the sample was enriched with solid phase extraction (SPE). It is added 1 ⁇ solvent of SPE 40 ⁇ 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl chloride in a concentration of 3000iig'ml and ⁇ ⁇ triethylamine in a concentration of 1 000iig ml.
  • SPE solid phase extraction
  • the sample was prepared in a conventional manner, such as Zhi vei Qin et. AI., J. Anal. At. Spectrom., 2013, 28, page 888 on a chromatographic column 1 2 given. 30 ⁇ !
  • the resulting sample solution was injected into the HPLC column (Agilent 1200) for this purpose.
  • the Agilent 1 200 system is equipped with a C8 column (Agilent, 1 0 ⁇ , 4.6 x 150 mm). 2.5% to 25% ethanol in water was used as a gradient Mobiiphase. A flow rate of 1 .0 ml min 1 was selected. and for 1 0 minutes, fractions were collected for 30 seconds each. The fractions of the chromatographic procedure were collected sequentially in a fraction collector 14.
  • the M o 1 ek I I from so far as the GaF wu de with a wavelength of 21 1.248 nm detekliert.
  • the radiation of a continuum beam 20 was passed through the graphite furnace atomizer 18 and detected with a high-resolution echelle spectrometer 22.
  • FIG. 2 shows the course of the extinction in the spectral range around 21 1, 2 nm.
  • the absorption line 24 of gallium fluoride and the absorption 26 of atomic Galium on a weak gallium line can be seen.
  • the Gal lium line can be used to check whether a sufficient excess of gallium is present and thus fluoride has been sufficiently bound.
  • a standard solution of sodium fluoride was used for the calibration.
  • a simple calibration curve for fluorine quantification is sufficient.
  • the method proved to be very sensitive and detection limits in the range of 1 pg could be achieved if the labeled sample molecule was labeled with only one fluorine atom. When labeled with further fluorine atoms, the ' detection limit decreases accordingly.
  • Another embodiment relates to the labeling of a term on a peptide.
  • commercially available peptides were dissolved to 10 - 100 ng ml 1 in 10 mM HEPES, pH 8.0 to a final volume of 200 ⁇ . Cysteine residues were reduced and alkylated with 5 mM TCEP and 5 mM iodoacetamide.
  • a third embodiment relates to the labeling of the thiol group of a cysteinyl peptide.
  • the commercially available peptides (Bachem, Weil am Rhein, Germany) were dissolved in 10-100 ng ml -1 in 10 mM HEPES, pH 8.0 to a final volume of 200 ⁇ M, 5 ⁇ M of a 0.5 M solution of N- ( 1H, 1H, 2H, 2H-perfiuorodecyl). Iodoacetamide in THF was added and the solution reacted in the dark for 30 minutes at 37 ° C.
  • the potash brat ion was carried out with aF solution similar to that of GaF.
  • An exemplary spectrum of the Ca F absorptive ions at 606.44 nm is shown in FIG. 3.
  • no extra modifier is needed, since Ca itself acts as a good modifier.
  • the sensitivity of GaF is about a factor of 10 higher than that of CaF.

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Abstract

Ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Biomolekülen und anderen organischen Molekülen in einer Probe enthält die Schritte: Markieren der zu analysierenden Moleküle in der Probe mit einem Fluor-enthaltenden Marker; Trennen der Probenbestandteile mittels eines chromatographischen Verfahrens in Fraktionen; und Quantitative Bestimmung des Fluorgehalts in der Fraktion mit den markierten Molekülen mittels hochauflösender Kontinuum-Absorptionsspektroskopie, wobei die einer Fraktion entnommene Probe für die Messung zusammen mit einem metallhaltigen Molekülbildner auf eine Temperatur erhitzt wird, bei der Fluoratome der markierten Moleküle mit Atomen des Molekülbildners zu zweiatomigen Fluor-Molekülen reagieren.

Description

Verfahren zur quantitativen Analyse von organischen Molekülen in einer Probe
Technisches Gebiet Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Analyse von organischen Molekülen, insbesondere von Biomolekülen in einer Probe.
Die absolute quantitative Analyse von Biomolekülen ist eine Schlüsseltechnologie für die b i o t ec h n o I o g i sc h e Forschung und kl inische Diagnostik. Trotz erheblicher technischer und methodischer Fortschritte in der analytischen Chemie bleibt es ein Bedürfnis, die bekannten Verfahren zu verbessern und alternative Lösungen im Feld der Proteinanalyse zu finden.
Beispiele für mit dem Verfahren quantifizierbarc Moleküle sind komplexe Biomoleküle wie Proteine, Peptide und ukleinsäuren oder andere organische Moleküle wie Amine, Aminosäuren, Alkohole, Aldehyde, Ketone und Kohlenhydrate.
Stand der Technik
Es sind verschiedene Verfahren zur P ro t e i n b e s t i m m u n g bekannt. Bei dem unter dem Begriff „ adioimmunassay" ( RIA ) bekannten Verfahren werden Antikörper an die zugehörigen Antigene gebunden. Die quantitative Bestimmung wird durch Markierung (tagging) mit radioaktiven Isotopen und Messung ihrer Radioaktiv ität erreicht. Das Verfahren ist sehr spezifisch und erreicht sehr geringe Nachweisgrenzen . Das Erfordernis, radioaktive Marker (tags) zu verwenden, begrenzt aber den A n wen d u ngsberei ch des Verfahrens.
Bei dem unter dem Begriff Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bekannten Verfahren werden Enzyme als Marker verw endet, die E nzy m - Rea kt io neu katalysieren. Die sich daraus ergebenden Änderungen können als Farbe oder Fluoreszenz erfasst werden. Nachteil ig bei diesem Verfahren und bei RIA ist es, dass die zugehörigen Antikörper verw endet w erden müssen.
Es ist ferner bekannt, organische M assenspek t rom et ri e zu verwenden, die auf Matrix- unterstützter Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) und El ekt rospray- Ion isat ion (ESI) basiert. Diese Protein-Analyse ist jedoch lediglich für die qual itative Analyse geeignet.
Aus der Veröffentlichung „Quantitative analysis of comp lex protein mix tu res using Isotope-Coded Affinity Tags" von S.P.Gygi, S.A.Gerber, F.Turecek, M .H.Gelb und R.Aebersold in Nat.Biotechnology, Vol. 1 7 ( 1999), Seiten 994-999 ist es bekannt spezifische Aminosäurereste in Peptiden und Proteinen chemisch mit Isotopen zu markieren (Tagging) und so annähernd quantitative Ergebnisse zu erhalten.
Aus der Veröffentlichung von Ch. Giesen, L.Waentig, U.Panne und N.Jakiibowski in Spectrochimica Acta, Part B, Vol. 76 (2012), Seiten 27 - 39 ist es bekannt Massenspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) als selektiv en Detektor für Fleteroatome in Proteinen zu verwenden. Nachteilig bei diesem Verfahren ist es, dass Schwefel, der in Aminosäurecysteinen und Methionin auftritt und für die Analyse v erwendet wird, nur schwer ionisierbar ist und div ersen spektralen Interferenzen unterliegt. Andere, gut detektierbare Heteroatome treten nur in wenigen Biomolekülen auf, wodurch das Verfahren auf wenige Anwendungsfäl le begrenzt ist.
Derzeit werden Metallchelatc und kovalent gebundene Mark er verwendet. Die Bindung von Metal l-Markern an Protein kann in zwei Schritten erfolgen. Das Metal l wird erst in einem Komplex gebunden, der anschließend unter Verwendung seiner aktiv en Gruppe an das Protein-Molekül gebunden wird. Ein Beispiel hierfür ist in der DE 10227599 A 1 offenbart. Metallchelat-Marker haben den Nachteil, dass sie sehr voluminös sind und daher die Struktur des Proteins stören können. Es wird daher auch bei langen Reaktionszeiten und großem Überschuss an Markerkomplexen nur ein kleiner Teil der Proteine markiert. Es wäre daher vorteilhaft, den Mark er mit einer kovalenten Bindung direkt an das Molekül zu binden.
Es gibt nur wenige Beispiele für Elemente, die sowohl mit ICP-MS detektierbar sind, als auch kovalent als Marker an ein Protein gebunden werden können. Eines der Beispiele ist Quecksilber. Al lerdings ist Quecksilber gi ftig und umweltschädlich und hat aufgrund seiner hohen lonisationsenergie im Plasma einen geringen lonisationsgrad im Bereich von 20%. Quecksilber kann daher nur mit geringer Empfindl ichkeit nachgewiesen werden. Für Proteine mit einer Thiol-Gruppe ist ein Verfahren mit Quecksilber geeignet. Quecksilber bindet nur mit der Thiol-Gruppe eines Peptid- oder Proteinmoieküls. Ohne Thiol-Gruppe kann das Verfahren mit Quecksilber nicht verwirklicht werden.
M. D. Huang, I I. Becker-Ross, S. Florek, U. Heitmann, S. Geisler und M. Okruss veröffentlichten mehrere Arbeiten über Continuum-Source
Atomabsorptionsspektroskopie, beispielsweise im Journal of Anaiyticai Atomic Spectrometry, Vol. 27, 201 2, 982-988. Der Gruppe gelang dabei auch der Nachweis von Fluor als zweiatomiges Molekül . Dieser Nachweis ist veröffentlicht in M. D. Huang, H. Becker-Ross, S. Florek, U. Heitmann and M. Okruss, Spectrochimca Acta Part B, Vol . 61 , 2006, 572-578 und U. Heitmann, I I. Becker-Ross, S. Florek, M. D. Huang, M. Okruss, Journal of Anaiyticai Atomic Spectrometry, Vol. 2 1 , 2006, 1 14- 1 20. In der nachfolgenden Dissertation von I I . Gleisner, veröffentlicht unter http://www.db- tlnieringen.de/servlets/DerivateSetvlet/Derivate-2391 1 Gleisner/Dissertation. pdf und in Z. W. Qin, A. Raab, E. Krupp, H. Deng, J. Feldmann, J. Anal. At. Spectrom., 201 3, 28, 877-882 ist die Bestimmung von Fluor mittels Atomabsorptionsspektroskopie als Detektor für die Chromatographie beschrieben. Dabei wi d der natürliche, ohnehin vorhandene Fluorgehalt in Proben untersucht.
Offenbarung der Erfindung Es ist Aufgabe der Erfindung, ein quantitatives Nachweisverfahren für organische nicht- fluorhaitige Moleküle zu schaffen, das eine hohe Empfindlichkeit und eine niedrige 'Nachweisgrenze hat und für eine große Anzahl von Molekülen geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Markieren der zu analysierenden Moleküle in der Probe mit einem Fiuor- enthaltenden Marker;
(b) Trennen der Probenbestandteile mittels eines chromatographischen Verfahrens in Fraktionen; und
(c) Quantitative Bestimmung des Fluorgehalts der Fraktionen mit den markierten Molekülen mittels hochauflösender Kontinuum-Absorptionsspektroskopie, wobei
(d) die einer Fraktion entnommene Probe für die Messung zusammen mit einem metallhaltigen Molekülbildner auf eine Temperatur erhitzt wird, bei der Fluoratome der markierten Moleküle mit Atomen des Molekülbildners zu zweiatomigen Fluor-Molekülen reagieren.
Anders als bei bekannten Verfahren wird das zu analysierende Molekül nicht mit einem Metal latom oder einem Chelat markiert sondern mit dem Nichtmetal l Fluor. Ein Fluoratom ist sehr klein und ähnelt daher in seinen Eigenschaften dem Wasserstoffatom. Die Substitution von Atomen oder Gruppen in Protein-, Peptid- oder anderen komplexen organischen Molekülen führt daher nicht zu signifikanten Störungen bei der Geometrie der modifizierten Strukturen. Die Markierungsreaktion erfolgt schnell und nach der Derivatisierung ändert sich das ch rom a togra ph i sch c Verhalten des markierten Moleküls nur geringfügig.
In besonders vorteilhafter Weise wi d nicht nur ein Fluor- Atom als Markierung an einem Molekül eingesetzt, sondern mehrere. Es steht eine Vielzahl von geeigneten. Fluorenthaltenden Substanzen als Markerreagenz zur Verfügung. Markierte Moleküle enthalten nach der Markierung oft mehrere Fluoratome und selbst die Anwendung von Fluor- Polymeren mit einer großen Anzahl an Fluor-Atomen ist mögl ich. Dadurch kann die Empfindlichkeit des Verfahrens signifikant erhöht werden. Die Markierungsreaktion kann auf verschiedene Weise erfolgen. Das Markerreagenz kann kovalent an jede bel iebige aktive Stel le des Moleküls gebunden werden, einsch l ießl ich der -Term in us, C -Terminus und Seitenkettengruppen.
Während bekannte Verfahren trotz dieser Vorteile nicht auf Fluor als Marker zurückgreifen konnten, ermöglicht die vorl iegende Erfindung nicht nur eine leichte und schnelle Markierung, sondern auch deren zuverlässige quantitative Bestimmung. Die lon isationsenergie v on Fluor l iegt mit 1 7,42 eV noch über der v on Argon (15,76 eV), so dass Fluor nicht für die Bestimmung in einem Argon-Plasma mittels ICP-MS geeignet ist. Auch die Bestimmung v on atomarem Fluor m it der Atomabsorptions- und Atomemissionsspektroskopie ist durch die Lage der Resonanzlinie im VUV unterhalb von 100 nm nicht möglich. Bei der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass bei der Quantifizierung mittels Absorptionsspektroskopie im Atomisierer ein metallhaltiger Molekülbi ldner zugesetzt wird, mit dem das Fluor gemeinsam erhitzt wird. Das etal l wird nicht als Marker, sondern als Molekül bi ldner eingesetzt. Beim Erhitzen auf hohe Temperaturen gehen sämtliche organische Strukturen verloren und es bildet sich ein zweiatomiges Metali fluorid. Beispiele für geeignete Metal le sind die Metal le der zweiten und dritten Hauptgruppe des Periodensystems. Diese bi lden zweiatomige Moleküle, etwa GaF oder CaF, deren Rotationsbanden mittels hochauflösender Kontinuums- Absorptionsspektroskopie (HR CSAS) sehr spezifisch und empfindlich nachgewiesen werden können. Bei den Metal len der zweiten und dritten Hauptgruppe sind insbesondere Al uminium (AI), Barium (Ba), Beryl l ium (Be), Kalzium (Ca), Gal l ium (Ga), I ndium (In), Magnesium (Mg) und Strontium (Sr) als Molekülbi ldner gut geeignet. Die Metal le können als Ionen gelöst zugesetzt werden, beispielsweise aus einem Nitrat- oder Acetat-Salz.
Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung mitteis Graphitrohr-Atomisierer. Das Graphitrohr wird schrittweise auf hohe Temperaturen zwischen 1300 und 2500 C erhitzt. Dann v erdampft die Probe und das komplexe Molekül wird fast v ol lständig atomisiert. Einige der so entstandenen Atome und Ionen in der so entstehenden Probenwolke reagieren untereinander. Durch die Zugabe des Metal lmolekülbildners, beispielsweise einer Gallium- oder Kalziumverbindung, reagiert das Fluor zu einem zweiatomigen Molekül. Die Reaktionsausbeute und Reaktionsgeschwindigkeit ist besonders hoch, weil Fluor eine hohe Eiektronegativität aufweist. Neben diesen gewünschten Molekülen entstehen im Graphitrohr oft weitere Moieküiederen Spektren sich in der HR CS AS im Falle einer Linieninterferenz als spektraler Untergrund in bekannter Weise herauskorrigieren lassen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Atomisierung in einem miniaturisierten Graphitrohr mit verkleinertem Innendurchmesser. Anders als bei Verwendung von Hohikathodenlampen haben die bei HR CS AS üblicherweise verw endeten Hochdruck-Xenon-Lampen einen sogenannten Hotspot. Die Strahlung wird also aus einem sehr kleinen Volumen abgestrahlt und lässt sich bei geeigneter Optik ohne Abschattungen verlustfrei durch Graphit röhre fokussieren, die einen geringeren Durchmesser aufweisen. Die Verwendung eines miniaturisierten Graphitrohrs mit Durchmessern unterhalb v on 2 mm ermöglicht die Bestimmung v on sehr kleinen Probenmengen mit wesentlich erhöhter Empfindlichkeit. Auf diese Weise können sehr geringe absolute Nachw eisgrenzen für eine Vielzahl chemischer Elemente auch in komplexen organischen Biomolekülen wie in Proteinen erreicht werden.
Die Verw endung der HR CS AS ermöglicht eine ausreichende Trennung der interessierenden Analysenlinien von den Absorptionen, die durch andere in der Probe enthaltene Matrix-Elemente verursacht werden. Eine komplexe Probenmatrix kann daher bei diesem Verfahren direkt und ohne Vorbehandlung dosiert und korrekt analysiert werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst eine Probe, die eine Mischung aus Substanzen enthält, mit einem Marker v ersehen. Als Marker-Reagenzien eignen sich alle Fluor-enthaltcnden Verbindungen, wie Ester, Aldehyde. Ketone, Alkohole. Flu o rb e n zo 1 c h I o r i d e , Fluorbenzamide, Pentafluorophenyltrifluoracetat,
Pentafluorphenylisothiocyanat etc. Die Markierung kann an den N-Terminus oder der ε- amino-Gruppe von Lysinen von Peptiden oder an dem C -Terminus oder den funktionel len Gruppen v on Ketten erfolgen, wie etwa einer Sul fliydrv gruppe von Cystein oder den aromatischen Gruppen von Phenylanin, Tryptophan oder Histidin. Vor der Bestimmung von Fluor mittels HR CS AS wird die Probe fraktioniert. Hierzu wird eine chromatographische Säule verwendet. Besonders geeignet sind insbesondere High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Flüssigchromatographie (LC), Fast Protein Flüssigchromatographie (FPLC), Affinitätschromatographie, Size Exclusion Chromatographie, Hydrophobische Wechselwirkung Chromatographie, lonentausch Chromatographie, Elektrophorese und Kapiiiar-Eiektrophorese.
Die Fraktionen werden getrennt voneinander in einem Fraktionssammler in mehreren Behältern aufgefangen. Fraktionen, in denen die interessierenden Biomoleküle erw artet werden, werden beispielsweise in einen Autosampier überführt und eine oder mehrere Proben aus dem Behälter entnommen und in den Absorptionsbereich des Atomabsorptionsspektrometers gegeben. Die relevanten Fraktionen können auch direkt aus dem Fraktionssammler durch einen Präzisionsdosierer (Sampler) vorzugsweise in einen Graphitrohr- Atomisator verbracht werden.
Das beschriebene Verfahren ist einfach, schnell und flexibel. Die Markierung mit Fluor ist besonders einfach, erfordert nur einen Schritt und hat eine hohe Ausbeute im Vergleich zu anderen Markern. Unerwünschte Nebenprodukte können vermieden oder leicht berücksichtigt werden.
Bei einer Ausgestaltung der Erfindung wird ein interner Standard verwendet, sofern an anderen Stellen messbare Atome im Biomolekül vorliegen. So können etwa Fremdatome wie Eisen, die ebenfalls im Molekül vorhanden sind, gleichzeitig bei der HR CSAS gemessen werden und l iefern Hinweise zur Richtigkeit der Messung.
In einigen analytischen Spezial äl len, bei denen gering strukturierte Spektralbereiche des Fluor-Moleküls bei fehlenden spektralen Störungen genutzt werden können, z.B. bei der Messung von Fluor über Kalziumfluorid im roten Spektralbereich, kann die Messung der Molekülabsorption auch kostengünstig mit einem Spektrameter geringerer spektraler Auflösung erfolgen. Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Ein Ausführungsbeispiel ist nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. l ist eine schematische Darstellung eines Aufbaus zur quantitativen
Bestimmung von Biomolekülen. Fig.2 ist eine Darstellung der mit HR-CSAS gemessenen zeitlich integrierten
Extinktion im Bereich um 2 1 1 ,2 nm bei Gall ium und GaF in Abhängigkeit von der Wel lenlänge.
Fig.3 ist eine Darstellung der mit HR-CSAS gemessenen zeitl ich integrierten
Extinktion im Bereich um 606 nm mit Rotationsl inien von CaF in
Abhängigkeit von der Wel lenlänge.
Beschreibung des Ausführungsbeispiels Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird als Beispiel für die Analyse von kleineren organischen Molekülen der Gehalt an Spuren von Amphetaminen und Methamphetaminen in einer Probe bestimmt. Die Probe wurde mit Festphasenextraktion (SPE) angereichert. Es werden 1 ΟΟμΙ Lösungsmittel des SPE 40μΙ 2,3.4,5,6-Pentafluorbenzoylchlorid in einer Konzentration v on 3000iig'ml und Ι ΟμΙ Triethylamin in einer Konzentration v on 1 OOOiig ml hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 65 C gehalten. Die Reaktionsmischung wurde anschl ießend abgekühlt und unter Stickstoffstrom getrocknet. Der getrocknete Rest wurde w ieder mit 50 μΙ Ethyl Acetate versetzt. Die so erhaltene Probe ist in Figur 1 mit 1 0 bezeichnet. Die Probe wurde in üblicher Weise, wie beispielsweise bei Zhi vei Qin et. AI ., J. Anal. At. Spectrom., 2013, 28, Seite 888 auf eine Chromatograph ische Säule 1 2 gegeben. 30 μ! der erhaltenen Proben lösung wurden hierfür in die HPLC Säule (Agilent 1200) einspritzt. Das Agilent 1 200 System ist mit einer C8 Säule (Agilent, 1 0 μπι, 4,6 x 150 mm ) ausgestattet. 2.5% bis 25%iger Ethanol in Wasser wurde als Gradient-Mobiiphase genutzt. Ein Flussrate v on 1 .0 ml min 1 wurde gewählt, und 1 0 Minuten lang wurden Fraktionen jeweils 30 Sekunden lang eingesammelt. Die Fraktionen des Chromatograph ischen Verfahrens wurden nacheinander in einem Fraktionssammler 14 aufgefangen.
Fraktionen, deren etentionszeiten den Retentionszeiten der einschlägigen Amphetamine entsprechen, wurden mitteis eines Dosierautomaten in den Graphitrohrofen-Atomisierer 18 pipettiert. Die Detektion erfolgt mitteis HR-CSAS. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde ein kommerzielles Gerät verwendet, das unter der Produktbezeichnung cont AA 600 von der Fi ma Analytik Jena, Deutschland vertrieben wird.
Zur quantitativen Analyse mittels HR-CSAS im Graphitofen wurden neben 0.2 μΙ Probelösung 0.06 μΐ einer 0.5% igen Gal I iumnitrat-Lösung als Molekülbildner und 0.06 μΐ einer 0.5% igen. Kalziumnitrat-Lösung als Modifier in das Graphitrohr pipettiert. Die Probe mit dem Modifier und eventuell einer Pufferlösung wurde, wie bei der Graphitrohranaiyse übl ich, einem Temperaturprogramm unterzogen. Hierzu gehört, dass die Probe bei 100 °C getrocknet und dann bei 500 °C pyrolysiert wurde. Die Temperatur wu de anschl ießend auf 1400 °C erhöht. Bei dieser Temperatur bildet sich zweiatomiges GaF in der Gasphase aus dem Gal lium des Molekülbildners und der Fluormarkierung in der Probe. Die M o 1 e k ü I a b so r p t i o n des GaF wu de bei einer Wel lenlänge von 21 1.248 nm detekliert. Hierzu wurde die Strahlung eines K o n t i n u u m strahle rs 20 durch den Graphitofenatomisierer 18 geleitet und mit einem hochauflösenden Echelle-Spektrometer 22 detektiert. Figur 2 zeigt den Verlauf der Extinktion im Spektralbereich um 21 1 ,2 nm. Man erkennt sowohl die Absorptionslinie 24 v on Galiiumfluorid als auch die Absorption 26 v on atomarem Gal lium auf einer schwachen Galliumlinie. Anhand der Gal lium-Linie kann überprüft werden, ob ein ausreichender Überschuss an Gal lium v orliegt und somit Fluorid in ausreichendem Maß gebunden wurde. Eine Standardlösung aus Natriumfluorid wurde für die Kalibration eingesetzt. Eine einfache Kalibrationskurve für die Fluor- Quantifizierung ist hierbei ausreichend. Das Verfahren stellte sich als sehr empfindlich heraus und Nachweisgrenzen im Bereich von 1 pg konnten erreicht werden, wenn das markierte Probenmolekül nur mit einem Fluor- Atom markiert wurde. Bei Markierung mit weiteren Fluoratomen sinkt die 'Nachweisgrenze entsprechend. Ein weiteres Ausführungsbeispiel betrifft die Markierung eines -Terminus an einem Peptid. Hierfür wurden kommerziell verfügbare Peptide zu 10 - 1 00 ng ml 1 in 10 mM HEPES, pH 8.0 gelöst zu einem Endvolumen von 200 μΙ. Cysteinreste wurden reduziert und mit 5 mM TCEP und 5 mM Jodacetamid alkyliert. Die Lösung wurde im Dunkeln für 1 5 Minuten bei Raumtemperatur in kubiert. 6 μΐ einer 0. 1 M Pentafluorphenyl isothioeyanat (PFPITC) in Acetonitril w urden der Lösung zugefügt und diese 20 min bei 37 °C inkubiert. Ι μΐ konzentrierte Ameisensäure wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Proteine können auf diese Weise direkt oder nach Ausschluss zu einer Peptid- Mischung markiert werden. Nach der Markierung der Proteine erfolgten eine chromatographische Trennung und die Detektierung mit H R-CSAS w ie bei dem oben aufgeführten A u s f ü h r u n gs b e i s i e 1. Dabei wurde GaF als zweiatomiges Molekül zur Detektion verwendet. Zunächst w urde das Graphitrohr mit ZrC beschichtet. 0.2 μΐ F- Marker enthaltende Eluate aus der HPLC-Trennung wurden zusammen mit 0.06 μΐ 0.5% Ga 11 i u mn i t rat- Lösu n g zur Bildung der GaF-Moieküle und 0.06 μΐ 0.5% Kaiziumnitrat- Lösung als Modifier in ein miniaturisiertes Graphitrohr mit verringertem Durchmesser pipettiert. Das Lösungsgemisch w urde bei 100 °C getrocknet und bei 500 °C pyrolysiert. Die Temperatur w urde dann auf 1400 °C erhöht. Die Detektion des GaF-Moieküis erfolgte bei einer Wel len länge von 21 1.248 um. Zur Kalibration wurde eine Standardlösung aus Natriumfluorid eingesetzt und eine einfache Kal ibrationskurve wurde für die F- Quanti fizierung verwendet.
Ein drittes Ausführungsbeispiel betrifft die Markierung der Thiolgruppc eines Cysteinylpeptids. Die kommerziell verfügbaren Peptide (Bachem, Weil am Rhein, Germany ) w urden in 10 - 100 ng ml" 1 in 10 mM HEPES, pH 8.0 gelöst zu einem endgültigen Volumen von 200 μΙ. 5 μΐ einer 0.5 M-Lösung aus N-(1H, 1H,2H,2H- Perfiuordecyl ).Iodacetamid in THF wurde zugefügt. Die Lösung reagierte im Dunkeln für 30 Minuten bei 37 °C. Die Fraktionierung erfolgte mit Fl üssigehromatograph ie (LC). Die Detektion erfolgte wie bei den obigen Beispielen mit HR-CSAS. In einem mit ZrC beschichteten Graphitrohr mit 2 mm innerem Durchmesser wurden 1 μΙ Probelösung zusammen mit 0.06 μΐ einer 0.5%igen Ka I z i u m n i t rat - Lös u n g als Modifier und Molekülbildner pipettiert. Die Probe w urde bei 100 °C getrocknet und bei 1000 °C pyrolysiert. Die Temperatur w urde anschließend auf 2300 °C erhöht. Bei dieser Temperatur bildet sich zw eiatomiges CaF in der Gasphase aus dem Molekülbildner Kalzium und der Fluormarkierung in der Probe. Die Molekülabsorption des CaF wurde bei einer Wel lenlänge von 606,44 nm detektiert. Die Kali brat ion erfolgte mit aF-Lösung ähnlieh wie bei GaF. Ein beispielhaftes Spektrum der Ca F- Absorpt ionsl i n ien bei 606.44 nm ist in Figur 3 dargestel lt. Im vorl iegenden A u s f ü h r u n gs b e i s p i e I braucht man keinen Extra-Modifikator zuzugeben, da Ca selbst als guter Modifikator w irkt. Auf der anderen Seite ist die Empfindl ichkeit von GaF um etwa einen Faktor 10 höher als bei der Analyse über CaF.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur quantitativen Analyse von Biomolekülen und anderen organischen
Molekülen in einer Probe mit den Schritten:
(a) Markieren der zu analysierenden Moleküle in der Probe mit einem Fluorenthaltenden Marker;
(b) Trennen der Probenbestandteile mittels eines chromatographischen Verfahrens in Fraktionen; und
(c) Quantitative Bestimmung des Fluorgehalts der Fraktionen mit den markierten Molekülen mittels hochauflösender ontinuum-Absorptionsspektroskopie, wobei
(d) die einer Fraktion entnommene Probe für die Messung zusammen mit einem metallhaltigen Molekülbildnet" auf eine Temperatur erhitzt wird, bei der Fluoratome der markierten Moleküle mit Atomen des Molekülbildners zu zweiatomigen Fluor-Molekülen reagieren.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative
Bestimmung der Fluormenge mitteis Graphitofen- Absorptionsspektroskopie erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Graphitofen auf eine Temperatur im Bereich zwischen 1300°C und 2500 C erhitzt wird.
Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Molekülbildner ein Metal l der zweiten oder dritten Hauptgruppe enthält, mit dem ein zweiatomiges Fluorid gebildet wird.
5. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe Ester, Aldehyde, Ketone, Alkohole, Fluorbenzolchloride, Fluorbenzamide, Pentafluorophenyltrifluoracetat,
Pentafluorphenylisothiocyanat.
Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurc gekennzeichnet, dass die Markierung erfolgt an N-Terminus oder der ε-amino-Gruppe von Lysinen von Peptiden oder an dem C-Terminus oder der Suifhydryigruppe von Cystein oder den aromatischen Gruppen von Phenylanin, Tryptophan oder Histidin oder anderen funktioneilen Gruppen v on Ketten erfolgen.
Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das chromatographische Verfahren ausgewählt ist aus High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Flüssigkchromatographie ( LC), Fast Protein F I üss i gcli rom a tograph i e (FPLC), Affinitätschromatographie, Ionentausch
Chromatographie, Elektrophorese und Kapiilar-Eiektrophorese.
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