WO2015167062A1 - 폴리에틸렌 글리콜 합성 물질을 이용한 췌장 소도 표면을 개질하는 방법 및 이를 이용한 표면 개질된 췌장 소도 - Google Patents

폴리에틸렌 글리콜 합성 물질을 이용한 췌장 소도 표면을 개질하는 방법 및 이를 이용한 표면 개질된 췌장 소도 Download PDF

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pancreatic islet
pancreatic islets
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변영로
김지웅
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0613—Cells from endocrine organs

Definitions

  • the present invention relates to a method for surface modification of pancreatic islets using a polyethylene glycol (PEG) synthetic material.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG Polyethylene glycol
  • PEG conjugates with drugs that have bioactivity such as proteins, peptides, and genes increase the half-life in the blood due to the high hydrodynamic volume in aqueous solution of PEG.
  • PEG bioactive materials and conjugates in the form of linear, double, triple, dendron and dendrimers in the structural aspect of PEG to show differences in hydrodynamic volume to form more effective conjugates.
  • the reaction was carried out to synthesize a dendrimer-like structure PEG (20-120 kDa) containing a carboxyl group using -lysine as the core, and purified by chromatography.
  • the combination of pharmacologically active proteins such as alpha-2b with dendrimer-like PEG has been tested in vivo and in vitro to increase stability in vivo.
  • the biggest problem in the transplantation of porcine pancreatic islets for the treatment of type 1 diabetes is the breakdown of pancreatic islets after separation of porcine pancreatic islets. Unlike other species, swine pancreatic islet produces little collagen after separation, so it is easily broken.
  • pancreatic islets In order to maintain the function of the pancreatic islets, the pancreatic islets should not be broken but exist in the form of a rigid cluster. Therefore, if the pancreatic islets are made of gelatin, which is similar to collagen secreted by the pancreatic islets, art if icial extra A cel lular matrix (A.ECM) can be conjugated to the surface of porcine pancreatic islets to prevent pancreatic islets from breaking.
  • A.ECM icial extra A cel lular matrix
  • Porcine pancreatic islet clusters with artificial extracellular matrix have a rigid structure that reduces fracture, but when implanted into recipients, the immune system of the recipients is activated to produce strong immune response. And eventually destroy.
  • A.ECM artificial extracellular matrix
  • 6-arm PEG which is the most optimal substance that leads to improved survival rate of porcine islet cells among various PEG derivatives using PEG thereon. Additional surface modification of —SH, 6-arm PEG-D0PA, and 1 inear PEG-SH, to dramatically improve post-transplant stability (stabi li ty) and viability (viabi li ty) of porcine islet cells. Can be.
  • Another object of the present invention is to provide pancreatic islets that have been surface modified by the above method.
  • the present invention is a high-order polyethylene glycol (polyethylene glycol, PEG)
  • step 2 Binding the complex of the high-order PEG-lipid and gelatin and catechol derivatives of step 1 (step 2); And
  • pancreatic islet cell surface modification method comprising the step (step 3) of binding a PEG derivative to the hydroxy group of the unbound catechol derivative of PEG-lipid of step 2.
  • the present invention also provides complexes of higher order PEG, gelatin and catechol derivatives, and surface modified pancreatic islets in which one or more PEG or derivatives thereof are sequentially bound to the pancreatic islet cell surface.
  • FIG. 1 is a view showing the PEG lpid (C18) conjugated to the phospholipid double worms of porcine pancreatic islets.
  • Figure 2 is a diagram showing the form of the artificial extracellular matrix conjugated to the outskirts of porcine pancreatic islets.
  • Figure 4 is a microscopic image of the pancreatic islet cells after staining the pancreatic islets cells with di thizone and the surface of the pancreatic islets cells modified surface.
  • Figure 5 shows the degree of surface modification of the pancreatic islet after modifying the surface of the pig pancreatic islet extracellular with artificial phosphorus, 6-arm PEG SH, 6-arm PEG DOPA and l inear PEG SH using a PEG introduced fluorescent material Observed by confocal laser scanning microscope, opt ical image is before fluorescence dye observation, central is fluorescence image focusing on the middle part of pancreatic islets, and merge is a combination of several focus images It is a three-dimensional fluorescence image.
  • Figure 6 is a microscopic observation of the cell viability of pure pancreatic islet cells and surface-modified pancreatic islet cells using LIVE / DEAD Viabi 1 i ty / Cytotoxici ty kit, green fluorescence is a living cell, red fluorescence Is a diagram showing dead cells.
  • FIG. 7 is a graph of blood glucose measurement after transplantation of c57bl / 6 mice with 5000 IEQ each of pure pig pancreatic islets and modified surface groups.
  • (A) is a blood glucose graph after transplantation of pure porcine islets with no treatment as a control
  • (B) is an experimental group with artificial extracellular matrix.
  • FIG. 8 is a graph of blood glucose measurement after transplantation of c57bl / 6 mice with 8000 IEQ mice treated with pure pig pancreatic islets and a modified surface of pig pancreatic islets, respectively:
  • (A) is a blood glucose graph after transplantation of untreated pure porcine islet cells as a control
  • (B) is an experimental group using 6-armPEGSH, 6-armPEGDOPA and linear PEG SH together with artificial extracellular matrix. This is a graph of blood glucose after modification and transplantation.
  • Figure 9 shows porcine pancreatic islet 6-arm PEG SH, 6—arm with artificial extracellular matrix.
  • 10 is a blood pancreatic islet after the surface modification using 6-arm PEG SH, 6-arm PEG DOPA and linear PEG SH with artificial extracellular matrix transplanted into SCID mice by 4000 IEQ, 8000 IEQ by measuring blood glucose It is a graph.
  • the present invention comprises the steps of binding a high-order PEG-lipid, lipid-bound polyethylene glycol (PEG) to the pancreatic islet surface (step 1);
  • step 2 Binding the complex of the high-order PEG-lipid and gelatin and catechol derivatives of step 1 (step 2); And
  • pancreatic islet cell surface modification method comprising the step (step 3) of binding a PEG derivative to the hydroxy group of the unbound catechol derivative of PEG-lipid of step 2.
  • step 3 of binding a PEG derivative to the hydroxy group of the unbound catechol derivative of PEG-lipid of step 2.
  • Steps 1 to 2 combine artificial PEG-l ipid with gelatin and catechol derivatives to form an extracellular matrix by binding to a phospholipid layer on the surface of the pancreatic islets. Step.
  • the lipid of step 1 is a phospholipid (phosphol ipid), and the higher order structure and PEG-ipid are preferably combined with a phospholipid bilayer on the surface of pancreatic islet cells, and the catechol derivative of step 2 is
  • D0PA 4-dihydroxypheny lacet acid
  • the bond of step 2 is any one of a functional group selected from the group consisting of a catechol group, an amine group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a thiol group, and a sulfone group of a PEG-1 lpid having a higher order, and a hydroxyl group of a gelatin and a catechol complex. It is preferable to bind, and it is more preferable to bind covalently to the hydroxy group of gelatin and catechol complex with the thiol group of the higher order PEG-l ipid.
  • the method further comprises the step of gelling after binding.
  • the step 3 is to bind the PEG derivative to the artificial extracellular matrix prepared in steps 1 to 2 biopolymer (mul ti— ayer) graft
  • the pancreatic islets are the steps to make cells.
  • the PEG derivative serves to reduce the pancreatic islets, thereby reducing the immune response and to prolong the survival of the pancreatic islets.
  • the PEG derivatives include PEG, learear PEG, PEG-dopa (PEG-D0PA), monomethoxy PEGOnonomethoxy polyethylene glycol, PEG succinimide of PEG propionic acid, PEGbuta Succinimide of PEG butanoi c acid with PEG-HNS branched PEG-NHS, PEG succinimidyl succinate (PEG succinimidyl succinate, 7 ⁇ ⁇ succinimide of carboxymethylated PEG, benzotr iazole carbonate of PEG, PEG-glycidyl ether, PEG-oxycarbonyl imidazole; PEG nitrophenyl carbonates, PEG-aldehydes, PEG succinimidyl carboxymethyl esters, PEG Succinimidyl ester and the like can be used.
  • the method further includes the step of introducing different PEG derivatives into the PEG derivative residues not bound to the hydroxy group of the catechol derivative, and additionally introducing linear PEG or a bioactive material into the PEG derivative.
  • the bioactive substance is recombinant heparin, heparin oil! "Hepar in an logue " may be used, but heparin is preferred.
  • porcine pancreatic islets are isolated to modify the cell membrane surface of porcine pancreatic islet surface cells, and 6-arm PEG- lipid, gelatin -DOPA and 6-arm PEG-D0PA are prepared to prepare the pancreatic islet cell membrane.
  • Lipids with 6-arm PEG lipids intercalate between phospholipids present in the phospholipids to form tight bonds, thereby binding 6-arm PEG to the pancreatic islet membrane surface (see FIG. 1).
  • D0PA and SH form a covalent bond and bind firmly.
  • gelation occurs, and the gelatine is formed to enclose the periphery of the pancreatic islets to artificially form an extracellular matrix (see FIG. 2).
  • 6-arm additionally using D0PA remaining in the gelatin residue PEG—SH can be covalently bound and 6-arm PEG-D0PA can be linked to the residue of 6-arm PEG-SH remaining after binding.
  • surface modification of porcine pancreatic islets can be completed by covalently binding 1 inear PEG-SH to the remaining D0PA of 6-arm PEG-D0PA in stomach (see FIG. 3).
  • pancreatic islet cells have similar morphology and insulin secretion levels as compared to the existing pure pancreatic islet cells (see FIG. 4).
  • porcine pancreatic islets was confirmed using LIVE / DEAD Viabi 1 i ty / Cytotoxi ci ty Ki t.
  • the cell viability of the pure pancreatic islets and the surface-modified pancreatic islets were similar to those of the surface modifiers. It was confirmed that there is little toxicity due to (see Figure 6).
  • pancreatic bovine 5000 IEQ when the surface-modified pancreatic bovine 5000 IEQ was implanted into diabetes-induced c57bl / 6 mice, the change in blood glucose was observed and the maintenance period of blood glucose concentration was increased (see FIG. 7).
  • pancreatic bovine 8000 IEQ when the surface-modified pancreatic bovine 8000 IEQ was implanted into diabetic-induced c57bl / 6 mice, the change in blood glucose was observed and the maintenance period of blood glucose was increased (see FIG. 8).
  • pancreatic cattle in diabetic-induced Balb / c nude mice also had 8000
  • the method of modifying the surface of the porcine pancreatic islet membrane according to the present invention does not show a change in the shape of the pancreatic islets and the degree of insulin secretion and cell viability compared to the pure pancreatic islets without any treatment, and the maintenance period of blood glucose is increased.
  • the present invention provides complexes of higher order PEG, gelatin and catechol derivatives, and surface modified pancreatic islets in which one or more PEG or derivatives thereof are sequentially bound to the pancreatic islet cell surface.
  • the surface-modified pancreatic islets of the present invention have no change in the shape of the pancreatic islets, the degree of insulin secretion and cell viability compared to the pure pancreatic islets without any treatment, and the stability of the pancreatic islets by confirming that the maintenance period of blood glucose is increased. And it can be used as a surface-modified pancreatic islet by improving the survival to confirm that pancreatic islets can also be useful in transplantation.
  • the present invention provides a preventive and therapeutic treatment for diabetes comprising a complex of higher-order PEG, gelatin and catechol derivatives, and surface-modified pancreatic islets in which one or more PEGs or derivatives thereof are sequentially bound to the pancreatic islet cell surface. It provides a pharmaceutical composition.
  • the present invention is a surface-modified complex of a higher order PEG, gelatin and catechol derivatives for use as a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes, and one or more PEG or derivatives thereof are sequentially bound to the surface of pancreatic islet cells.
  • a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes and one or more PEG or derivatives thereof are sequentially bound to the surface of pancreatic islet cells.
  • pancreatic islets Provides the use of pancreatic islets.
  • the composition using the surface-modified pancreatic islets as an active ingredient of the present invention may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar functions in addition to the above ingredients.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate. , Lactose, Mannitle, Peel, Arabian rubber, Pregelatinized starch, Corn starch, Powdered cellulose, Hydroxypropyl cellulose, Opadry, Starch glycolate natto, Carnauba lead, Synthetic aluminum silicate, Stearic acid, Magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, sucrose, dextrose, sorbitol and talc may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered in various forms, oral and parenteral, in actual or clinical administration, and when formulated, diluents such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc., which are commonly used, or It can be formulated using excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and such solid preparations comprising at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the composition. , Lactose (Lactose) or gelatin can be prepared by mixing.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral suspensions Solvents, emulsions and syrups may be used. In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients may be included, for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as eurib oil, and injectable esters such as ethyl acrylate may be used.
  • the suppository base includes wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, Laurin, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally according to the desired method, the external or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intramuscular injection in parenteral administration It is preferable to select. Dosage varies according to the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, and severity of disease.
  • Dosage units may contain, for example, 1 ⁇ 2, 3, or 4 times the individual dose or may contain 1/2, 1/3 or 1/4 times.
  • Individual dosages specifically contain the amount in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to the total, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • the effective dose of the composition of the present invention may be 0.0001 ⁇ 10 g / kg, specifically 0.001 ⁇ 1 g / kg, may be administered 1 to 6 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological reaction modulators for neuroprotection. Therefore, the surface-modified pancreatic islets of the present invention have no change in the shape of the pancreatic islets, the degree of insulin secretion and cell viability compared to the pure pancreatic islets without any treatment, and the pancreatic islets are confirmed by increasing the maintenance period of blood glucose. The stability and survival rate of the pancreatic islets were confirmed to be useful for transplantation, and the surface-modified pancreatic islets could be used as a composition for preventing and treating diabetes.
  • an Example demonstrates this invention further in detail.
  • Example 1 Cell Membrane Surface Modification of Surface Cells of Porcine Pancreas
  • RPMI-1640 cultures manufactured by: Sigma, 11.1 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate, 6 mM HEPES, 10% FBS,) after collecting and washing pancreatic islets present between 20% and 23% layers and between 11% and 20% layers 1% penicillin / streptomycin) was transferred to a petri dish containing 37 ° C. and cultured with 5% carbon dioxide. The culture was replaced with a new one at a time, and pancreatic islets were isolated from it.
  • 6-arm PEG-SH (mw 15000, Sunbio), 6-ma 1 eimi dohexanoic acid Nhydroxysuccinimide ester (EMCS; mw 308.29, Sigma), phospholipid (phosphol ipid; ⁇ 744.063, Avant i Polar Lipids) and triethylamine ( 6-arm PEG-1 ipid was prepared using Tr iethylamine, TEA; # 101.19, Sigma).
  • the pig pancreatic islets After 1 hour of reaction in a cell culture medium (37 ° C, 5% carbon dioxide) by adding PEG-l ipid to pig pancreatic islets, the pig pancreatic islets are washed with fresh pH 7 HBSS complete solution to prevent further reaction. After reaction for 30 minutes in a cell incubator (37 ° C., 5% carbon dioxide) with M199, the pig pancreatic islets were washed with fresh pH 7 HBSS buffer to prevent further reaction.
  • gelation occurs in a form in which gelatin -D0PA and 6-arm PEG-l ipid are combined to form an artificial extracellular matrix (A. ECM) (FIG. 2).
  • PH 8 HBSS dissolved in the above 6_arm PEG-SH conjugated pig pancreatic islet cells were added to the cell incubator (37 ° C, 5% carbon dioxide) for 1 hour and then the new pH to prevent further reaction 7 Washing the pig pancreatic islets with HBSS buffer binds 6-arm PEG-DOPA to the pancreatic islets. 10 mg of l inear PEG-SH is dissolved in 1 ml of pH 8 HBSS. Is added to porcine pancreatic islet cells bound to cells (37 ° C, 5% After 1 hour of reaction, the pig pancreatic islet is washed with fresh pH 7 HBSS buffer to prevent further reaction and l inear PEG—SH binds to the pancreatic islet.
  • porcine pancreatic islets As a result, the surface modification of porcine pancreatic islets is completed after l inear PEG-SH is finally bound as shown in FIG. 3 (FIG. 3).
  • ⁇ cells of the pancreas in order to confirm the form of pancreatic islets and the degree of insulin secretion compared with the pure pig pancreatic islets without surface modification Staining was performed using a D. T. zone.
  • pancreatic islet cells without surface modification and the pancreatic islet cells whose surface was modified by the method of Example ⁇ 1-5> were dissolved in DMSCXdimethyl sul foxi de) at a weight ratio of 1% by volume, and then After treating at a concentration of 2 ug / ml and reacting for 10 minutes, the result was observed under a microscope.
  • pancreatic islet cells were similar in form and degree of insulin secretion as compared with the conventional pure pancreatic islet cells (FIG. 4).
  • FIG. 4 Example 3 Identification of Porcine Pancreatic Cell Surfaces Using Confocal Laser Scanning Microscopy
  • the PEG was labeled with fluorescent material (FITC) in the same manner as in Example ⁇ 1-5> and confocal laser injection was performed. The image was confirmed by a microscope (Confocal Laser Scanning Mi croscopy).
  • FITC fluorescent material
  • Example ⁇ 1-5> the viability of pure pancreatic islets and pancreatic islets whose surface was modified by the method of Example ⁇ 1-5> was changed to red by using LIVE / DEAD Vial bi / ty cytotoxic kit.
  • Living cells are stained green. Living cells have high intracellular esterase activity and complete plasma membranes, whereas dead cells have low fluorescence and two different fluorescences that can discriminate them based on their breakdown properties. It is a way to determine cells and dead cells at the same time. Two fluorescences are used Cakein AM and Ethd-l (Ethidhim homodimer-1).
  • Calcein AM remains in the cell with green fluorescence when the non-fluorescent substance is degraded by the esterase in living cells, and EthD-1 enters only the dead cell where the plasma membrane is damaged and binds to the nucleic acid, bright red fluorescence It becomes
  • Example 5 Blood Glucose Verification after Transplantation of Pancreatic Islet Cells 5000 IEQ into c57bl / 6 Mice
  • a surface-modified pancreatic islet is transplanted into a c57bl / 6 mouse induced with diabetes, the method of Example ⁇ 1-5>, Changes in blood glucose were observed.
  • mice when 160 mg / kg of streptozocin is administered to normal c57bl / 6 mice and the blood glucose is measured to be 350 mg / dl or more, diabetes is induced c57bl / 6 mice.
  • the pig pancreatic islet cells 5000 IEQ which were not treated as a control group, were transplanted into the space between the kidney capsule and the kidney.
  • Example 6 Blood Glucose Verification after Transplantation of Pancreatic Islet Cells 8000 IEQ into c57bl / 6 Mice Glucose Levels When the surface-modified pancreatic islets were implanted in the method of Example ⁇ 1-5> into c57bl / 6 mice with diabetes-induced diabetes The change of was observed.
  • the maintenance period of blood glucose was increased in the group in which the surface-modified pancreatic islets 8000 IEQ were transplanted compared to the group treated with the 8000 IEQ transplanted without any treatment (FIG. 8). ).
  • streptozocin 110 mg / kg was normal Bal . If blood glucose is measured above 350 mg / dl when administered to b / c nude mice, Balb / c induced diabetes Become a nude mouse. This mouse was implanted with a pig pancreatic islet 8000 IEQ whose surface was modified by the method of Example ⁇ 1-5> in the space between the renal capsule and the kidney, and 8 blood glucose changes were confirmed.
  • FIG. 9 blood glucose changes were observed in various subjects after 8000 IEQ transplantation of the surface-modified pancreatic cattle into nude mice induced with diabetes, but it was confirmed that blood sugar was maintained for about 5 days (FIG. 9).
  • Example 8 Blood Glucose Verification after Transplantation of Pancreatic Islet Cells 4000 and 8000 IEQ into SCID Mice Glucose was obtained when the surface-modified pancreatic islets were transplanted into the SCID nude mice with diabetes induced by the method of Example ⁇ 1-5>. The change of was observed.

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Abstract

본 발명은 6-arm PEG에 lipid 및 DOPA를 합성하고 젤라틴에 DOPA를 합성하여 lipid가 가지는 지용성을 이용해 돼지 췌장 소도의 표면 세포 인지질층 사이에 lipid가 끼어들어 결합하도록 유도하고, DOPA와 SH간의 공유 결합을 이용하여 6-arm PEG-SH, DOPA, 젤라틴-DOPA 및 linear PEG-SH 간의 결합을 통해 돼지 췌장 소도 막 표면을 개질하는 방법으로 아무런 처리를 하지 않은 순수 췌장 소도에 비해 췌장 소도 모양과 인슐린 분비 정도 및 세포 생존성의 변화가 나타나지않고, 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인함으로써 췌장 소도의 안정성(Stability) 및 생존율(viablilty)을 향상시켜서 췌장 소도 이식에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
[발명의 명칭】
폴리에틸렌 글리콜 합성 물질을 이용한 췌장 소도 표면을 개질하는 방법 및 이를 이용한 표면 개질된 췌장소도
[기술분야】
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 합성 물질을 이용한 췌장 소도의 표면 개질 방법에 관한 것이다. 【배경기술】
폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol , PEG)은 물분자와 수소 결합을 효과적으로 하는 대표적인 친수성 고분자로 알려져 있다. 수용액뿐만 아니라 많은 종류의 유기용매에도 녹는 성질이 있으며， 화학적 안정성을 가진다.
또한，단백질，펩타이드，유전자와 같은 생체활성을 지니는 약품과 PEG의 접합체는 PEG의 수용액 상에서 높은 유체역학적 부피로 인해 혈액 내에서 반감기가 증가되며， 생체 면역계에 의한 인식이 저해되는 특징올 보인다.
좀 더 효과적인 접합체를 형성하기 위해 유체역학적 부피에 있어 차이를 보이게 하기 위해 PEG의 구조적인 측면에서 선형， 이중가지， 삼중가지， 덴드론, 덴드리머 형태의 고차구조를 가지는 PEG와 생체활성 물질과 접합체에 대한 연구가 바이오 분야에서 현재까지 꾸준히 이루어지고 있다.
Dong Keun Han et al . , Bioact ive and Compat ible Polymers , 2009 , 24, 316-328에서는 티타늄 -니켈 합금으로된 스텐트 (stent ) 표면을 선형의 아이소시아네이트 PEG(2 kDa)로 표면처리하여， 전임상 실험에서 PEG로 변형된 스텐트에서 비특이적 단백질 결합과 혈소판의 부착이 억제됨을 개시하고 있고， 대한민국 공개특허 2008-0072960호에서는 숙신이미딜 카르보네이트를 활성화 그룹으로 갖는 선형의 모노에톡시— PEG(5~30 kDa)를 리신에 반웅시켜 -리신을 중심부 (core)로 하여 카르복시기를 포함하는 덴드리머-유사구조 PEG (20-120 kDa)를 합성하고 크로마토그래피를 이용하여 정제하여， 인터페론 알파 -2b 등 약리적 활성을 지닌 단백질들과 덴드리머-유사구조 PEG와의 결합체를 생체 내， 외에서 테스트하여 생체 내 안정성 증가를 개시하고 있다. 제 1형 당뇨병의 치료를 위한 돼지 췌장 소도 이식에 있어서 가장 큰 문제점은 돼지 췌장 소도 분리 후 췌장 소도의 부서짐 현상이다. 돼지의 췌장 소도는 다른 종과는 달리 분리 후 콜라겐을 거의 생성하지 않아서 쉽게 부서지는 현상이 관측된다. 췌장 소도의 기능 유지를 위해서는 췌장 소도가 부서지지 않고 단단한 클러스터 (cluster) 형태로 존재하여야 하므로， 췌장 소도가 분비하는 콜라겐과 유사한 성분인 젤라틴 (gelat in)을 이용한 인조 세포 외 기질 (art i f icial extra cel lular matrix, A.ECM)을 돼지 췌장 소도의 표면에 접합시켜 췌장 소도의 부서짐올 방지할 수 있다.
인조 세포 외 기질 (A.ECM)을 접목한 돼지 췌장 소도 클러스터 (cluster)는 단단한 구조를 지니게 되어 부서짐 현상은 줄어드나， 이를 수여자에게 이식하였을 경우 수여자의 면역체계를 활성화시켜 강한 면역반웅을 일으키고 결국 파괴되게 된다. 이에 본 발명자들은 상기 문제점들을 극복하기 위하여， 인조 세포 외 기질 (A.ECM)을 만들고 그 위에 PEG을 이용한 여러 종류의 PEG 유도체 중 돼지 췌도 세포의 생존율 향상을 이끄는 가장 최적의 물질인 6-arm PEG—SH, 6-arm PEG-D0PA및 1 inear PEG-SH를 차례로 접목한 추가적인 표면 개질을 통해 이식한 돼지 췌도 세포의 이식 후 안정성 (stabi l i ty) 및 생존율 (viabi l i ty)을 비약적으로 향상시킬 수 있다.
즉， 인조 세포 외 기질 (A.ECM)을 돼지 췌도 세포에 우선 접목해 표면을 개질하여 돼지 췌도 세포의 구조상의 안정성을 획득한 후， 추가적으로 PEG 유도체들인 6-arm PEG-SH, 6-arm PEG-D0PA 및 l inear PEG— SH를 이용한 이차적 표면 개질을 통하여 이식한 후의 돼지 췌도 세포의 안정성 및 생존을을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고， 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 췌장 소도 세포의 안정성 (stability) 및 생존율 (viability)을 향상시키기 위한 췌장 소도의 표면 개질 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 표면 개질된 췌장 소도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법]
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 고차구조의 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)에 지질이 결합된 고차구조의
PEG-lipid를 췌장 소도 표면에 결합시키는 단계 (단계 1);
상기 단계 1의 고차구조의 PEG-lipid와 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체를 결합시키는 단계 (단계 2); 및
상기 단계 2의 PEG-lipid의 결합되지 않은 카테콜 유도체의 하이드록시 (hydroxy)기에 PEG 유도체를 결합시키는 단계 (단계 3)를 포함하는 췌장 소도 세포 표면 개질 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 고차구조의 PEG, 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체， 및 하나 이상의 PEG 또는 이의 유도체가 순차적으로 췌장 소도 세포 표면에 결합된 표면 개질된 췌장 소도를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명의 6-arm PEG에 lipid 및 D0PA를 합성하고， 젤라틴에 D0PA를 합성하여 lipid가 가지는 지용성을 이용해 돼지 췌장 소도의 표면 세포 인지질층 사이에 lipid가 끼어들어 결합하도록 유도하고， D0PA와 SH간의 공유 결합을 이용하여 6-armPEG-SH, D0PA, 젤라틴 -DOPA및 1 inear PEG-SH간의 결합을 통해 돼지 췌장 소도 막 표면을 개질하는 방법은 아무런 처리를 하지 않은 순수 췌장 소도에 비해 췌장 소도 모양과 인슐린 분비 정도 및 세포 생존성의 변화가 나타나지않고, 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인함으로써 췌장 소도의 안정성 (Stabi l i ty) 및 생존율 (viabl i l ty)을 향상시켜서 췌장 소도 이식에 있어서 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 돼지 췌장 소도 세포의 인지질 이중충에 PEG l ipid(C18)가 접합하는 모습올 나타낸 도이다.
도 2는 돼지 췌장 소도의 외곽에 인조 세포 외 기질이 접합하는 형태를 나타낸 도이다.
도 3은 인조 세포 외 기질 위에 6-arm PEG SH, 6-arm PEG DOPA및 l inear
PEG SH을 차례로 도입하여 표면을 개질한 모식도이다.
도 4는 췌장 소도 세포를 디티존 (di thizone)으로 염색한 후 순수 췌장 소도 세포와 표면을 개질한 췌장 소도 세포를 현미경으로 관찰한 이미지이다. 도 5는 돼지 췌장 소도를 형광물질을 도입한 PEG를 이용하여 인조 세포 외 가질， 6-arm PEG SH, 6-arm PEG DOPA 및 l inear PEG SH로 표면을 개질한 뒤 췌장 소도의 표면 개질 정도를 공초점 레이저 주사 현미경 로 관찰한 이미지로, opt ical 이미지는 형광 염료를 관측하기 전 이미지이고, central은 췌장 소도의 중간 부분에 초점을 맞춰 형광을 촬영한 이미지이고， merge는 여러 장의 초점 이미지를 합쳐 입체적으로 형광을 촬영한 이미지이다.
도 6은 LIVE/DEAD Viabi 1 i ty/Cytotoxici ty Ki t를 이용하여 순수 췌장 소도 세포와 표면을 개질한 췌장 소도 세포의 세포 생존성을 현미경으로 관찰한 이미지로， 녹색 형광은 살아있는 세포, 붉은 형광은 죽은 세포를 나타낸 도이다.
도 7은 아무 처리도 하자 않은 순수한 돼지 췌장 소도 그룹과 돼지 췌장 소도 표면을 개질한 그룹을 각각 5000 IEQ 씩 c57bl /6 마우스에 이식한 후 혈당을 측정한 그래프이다:
(A)는 대조군으로써 아무런 처리를 하지 않은 순수한 돼지 췌도 세포를 이식한 후 혈당 그래프이고, (B)는 실험군으로써 인조 세포 외 기질과 함께 6-armPEGSH, 6-armPEGDOPA및 linear PEG SH을 이용해 표면을 개질하여 이식한 후의 혈당 그래프이다.
도 8은 아무 처리도 하지 않은 순수한 돼지 췌장 소도 그룹과 돼지 췌장 소도 표면을 개질한 그룹을 각각 8000 IEQ 씩 c57bl/6 마우스에 이식한 후 혈당을 측정한 그래프이다:
(A)는 대조군으로써 아무런 처리를 하지 않은 순수한 돼지 췌도 세포를 이식한 후 혈당 그래프이고, (B)는 실험군으로써 인조 세포 외 기질과 함께 6-armPEGSH, 6-armPEGDOPA및 linear PEG SH을 이용해 표면을 개질하여 이식한 후의 혈당 그래프이다. . 도 9는 돼지 췌장 소도를 인조 세포 외 기질과 함께 6-arm PEG SH, 6— arm
PEG DOPA 및 linear PEG SH을 이용해 표면을 개질하여 8000 IEQ 씩 balb/c 누드마우스에 이식한 후 혈당을 측정한 그래프이다.
도 10은 돼지 췌장 소도를 인조 세포 외 기질과 함께 6-arm PEG SH, 6-arm PEG DOPA및 linear PEG SH을 이용해 표면을 개질하여 4000 IEQ, 8000 IEQ 씩 SCID마우스에 이식한 후 혈당을 측정한 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 고차구조의 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)에 지질이 결합된 고차구조의 PEG-lipid를 췌장 소도 표면에 결합시키는 단계 (단계 1);
상기 단계 1의 고차구조의 PEG-lipid와 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체를 결합시키는 단계 (단계 2); 및
상기 단계 2의 PEG-lipid의 결합되지 않은 카테콜 유도체의 하이드록시 (hydroxy)기에 PEG 유도체를 결합시키는 단계 (단계 3)를 포함하는 췌장 소도 세포 표면 개질 방법을 제공한다. 이하， 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 췌장 소도의 표면개질 방법에 있어서, 상기 단계 1 내지 2는 췌장소도 표면의 인지질층에 고차구조의 PEG-l ipid와 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체를 결합시켜 인조 세포 외 기질을 만드는 단계이다.
상기 단계 1의 지질은 인지질 (phosphol ipid)인 것이 바람직하고， 고차구조와 PEG— l ipid는 췌장 소도 세포 표면의 인지질 이중층과 결합되는 것이 바람직하며， 상기 단계 2의 카테콜 유도체는
D0PA(3 , 4-dihydroxypheny lacet i c acid)인 것이 바람직하다.
상기 단계 2의 결합은 고차구조의 PEG— l ipid의 카테콜기， 아민기, 히드록실기， 카르복실기， 티올기 및 설폰기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 관능기와 젤라틴 및 카테콜 복합체의 하이드록시기가 결합하는 것이 바람직하고， 고차구조의 PEG-l ipid의 티을기와 젤라틴 및 카테콜 복합체의 하이드록시기로 공유결합하는 것이 보다 바람직하다ᅳ 상기 고차구조의 PEG-l ipid와 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체를 결합시킨 후 젤화 (gel at ion)시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 췌장 소도의 표면개질 방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 1 내지 2에서 만들어진 인조 세포 외 기질에 PEG 유도체를 결합시켜 생체고분자 (biopolymer )가 다층 (mul t i— l ayer ) 그라프트된 췌장 소도 세포를 만드는 단계이다.
상기 PEG 유도체는 췌장 소도를 이식 시 발생하는 면역반웅을 감소시켜 췌장 소도의 생존기간을 연장시키는 역할을 한다. 상기 PEG 유도체로는 고차구조의 PEG, l inear PEG , PEG-도파 (PEG-D0PA)， 모노메록시 PEGOnonomethoxy polyethylene glycol ) , PEG 프로피론산의 숙시니미드 ( succinimide of PEG propioni c ac id) , PEG부타논산의 숙시니미드 (succinimide of PEG butanoi c acid) 가지달린 PEG-HNS branched PEG-NHS) , PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succinate) , 7}·복시메틸화 PEG의 숙시니口 1드 (succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트뫼아졸 카보네이트 (benzotr iazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸 (PEG-oxycarbonyl imidazole；)， PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드 (PEG-aldehyde) , PEG 숙시니미딜 카르복시쩨틸 에스테르 (PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르 (PEG succinimidyl ester) 등을 사용할 수 있다.
상기 카테콜 유도체의 하이드록시기에 결합하지 않은 PEG 유도체 잔기에 서로 다른 PEG 유도체를 도입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하고，추가적으로 도입된 PEG유도체에 linear PEG또는 생체 활성 물질을 추가적으로 도입하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고， 생체 활성 물질은 재조합 해파린 (recombinant heparin) , 헤파린 유 ! "처 hepar in an logue) '등을 사용할 수 있으나， 해파린을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 linear PEG-SH대신에 UFH-SH(unfracturated heparin)， LMWH-SH(low molecular weight heparin)등을 추가적으로 도입하는 것을 특징으로 한다. 아울러， 본 발명에서의 모든 반응은 pH 8 정도의 약염기 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 돼지 췌장 소도 표면 세포의 세포막 표면 개질하기 위해 돼지 췌장 소도를 분리하고， 6— arm PEG- lipid, 젤라틴 -DOPA 및 6-arm PEG-D0PA를 제조하여 췌장 소도의 세포막에 존재하는 인지질 사이에 6-arm PEG lipid가 지니는 지질이 끼어들어 단단한 결합을 형성하여 6-arm PEG가 췌장 소도 막 표면에 결합된다 (도 1 참조). 그리고 PEG의 잔기에 존재하는 티을기에 젤라틴 -D0PA를 적용하면， D0PA와 SH가 공유결합을 형성하여 단단히 결합한다. 이를 M199 배지를 이용해서 30분간 배양하면 젤화 (gel at ion)가 일어나서 젤라틴이 췌장 소도의 외곽을 감싸는 형태로 되어 인공적으로 세포 외 기질을 형성할 수 있게 된다 (도 2 참조).
이후 젤라틴의 잔기에 남아있는 D0PA를 이용해 추가적으로 6-arm PEG— SH을 공유결합으로 결합시킬 수 있으며, 결합 후 남은 6-arm PEG-SH의 잔기에 6-arm PEG-D0PA를 결합시킬 수 있다. 최종적으로 1 inear PEG-SH을 위.의 6-arm PEG-D0PA의 잔여 D0PA에 공유결합시켜서 돼지 췌장 소도의 표면 개질을 완성할 수 있다 (도 3 참조) .
또한， 돼지 췌장 소도의 표면을 개질한 이후， 표면 개질을 하지않은 순수한 돼지 췌장 소도와 비교했을 때 췌장 소도의 형태와 인슐린 분비 정도를 확인하기 위하여 췌장의 β 세포에 반웅하는 디티존을 이용하여 염색을 하였고, 표면을 개질한 췌장 소도세포가 기존의 순수 췌장 소도세포와 비교해서 형태나 인슐린 분비 정도가 유사함을 확인하였다 (도 4 참조) .
또한， 췌장 소도 표면에 결합된 인조 세포 외 기질과 3층의 PEG유도체의 확인을 위해서 형광물질 (FITC)로 표지된 PEG을 사용하여 초점 레이저 주사 현미경 (Confocal Laser Scanning Mi croscopy)으로 이미지를 확인하였고， 인조 세포 외 기질과 6-arm PEG-SH, 6-arm PEG-DOPA , 1 inear PEG-SH이 돼지 췌장 소도 표면에 잘 결합하는 것을 확인하였다 (도 5 참조) .
또한， LIVE/DEAD Viabi 1 i ty/Cytotoxi ci ty Ki t를 이용하여 돼지 췌장 소도의 생존성을 확인하였고， 순수 췌장 소도와 표면을 개질한 췌장 소도의 세포 생존성이 비슷하게 나타남으로 표면 개질 물질로 인한 독성이 거의 없음을 확인하였다 (도 6 참조) .
또한, 당뇨가 유도된 c57bl/6 마우스에 표면 개질한 췌장 소도 5000 IEQ를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였고， 혈중 포도당 농도의 유지기간이 상승하는 것을 확인하였다 (도 7 참조) .
또한， 당뇨가 유도된 c57bl /6 마우스에 표면 개질한 췌장 소도 8000 IEQ를 이식하였을 때, 혈당의 변화를 관찰하였고， 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인하였다 (도 8 참조) .
또한， 당뇨가 유도된 Balb/c 누드 마우스에 표면 개질한 췌장 소도 8000
IEQ를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였고， 혈당변화가 개체별로 다양하게 관찰되었지만， 약 5일간은 혈당이 유지되는 것을 확인하였다 (도 9 참조) . 아울러 , 당뇨가 유도된 SCID누드 마우스에 표면 개질한 췌장 소도 4000， 8000 IEQ를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였고， 4마리 중 1마리를 제외하고는 모두가 60일 이상 혈당이 정상수치로 유지됨을 확인하였다 (도 10 참조) .
따라서， 본 발명에 따른 돼지 췌장 소도 막 표면을 개질하는 방법은 아무런 처리를 하지 않은 순수 췌장 소도에 비해 췌장 소도 모양과 인슐린 분비 정도 및 세포 생존성의 변화가 나타나지않고， 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인함으로써 췌장 소도의 안정성 및 생존율을 향상시켜서 췌장 소도 이식에 있어서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 고차구조의 PEG, 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체， 및 하나 이상의 PEG 또는 이의 유도체가 순차적으로 췌장 소도 세포 표면에 결합된 표면 개질된 췌장 소도를 제공한다.
본 발명의 표면 개질된 췌장 소도는 아무런 처리를 하지 않은 순수 췌장 소도에 비해 췌장 소도 모양과 인슐린 분비 정도 및 세포 생존성의 변화가 나타나지않고， 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인함으로써 췌장 소도의 안정성 및 생존을을 향상시켜서 췌장 소도 이식에 있어서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 표면 개질된 췌장 소도로 이용할 수 있다. 또한， 본 발명은 고차구조의 PEG, 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체， 및 하나 이상의 PEG 또는 이의 유도체가 순차적으로 췌장 소도 세포 표면에 결합된 표면 개질된 췌장 소도를 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 고차구조의 PEG , 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체， 및 하나 이상의 PEG 또는 이의 유도체가 순차적으로 췌장 소도 세포 표면에 결합된 표면 개질된 췌장 소도의 용도를 제공한다. 본 발명의 표면 개질된 췌장 소도를 유효성분으로 하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀를로오스, 유당， 포비돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슘， 락토스， 만니틀， 엿， 아라비아고무， 전호화전분， 옥수수전분， 분말셀를로오스, 히드록시프로필셀를로오스， 오파드라이, 전분글리콜산나트톱， 카르나우바 납, 합성규산알루미늄， 스테아린산， 스테아 산마그네슘， 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슴， 백당， 덱스트로스， 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉， 본 발명의 조성물은 실제— 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제， 결합제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제， 산제, 과립제, 캡슐제 둥이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate) , 수크로스 (Sucrose) , 락토오스 (Lactose)또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한， 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제. 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제, 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제, 동결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜， 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸을레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골， 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사， 직장내주사， 피하주사， 정맥주사， 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중， 연령， 성별， 건강상태， 식이， 투여시간, 투여방법， 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는， 예를 들면 개별 투약량의 1ᅳ 2， 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2， 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며， 이는 통상 1일 투여량의 전부， 1/2， 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/ kg일 수 있고， 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며， 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나， 투여 경로， 질병의 중증도, 성별， 체중， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 신경보호를 위하여 단독으로， 또는 수술， 방사선 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 따라서， 본 발명의 표면 개질된 췌장 소도는 아무런 처리를 하지 않은 순수 췌장 소도에 비해 췌장 소도 모양과 인슐린 분비 정도 및 세포 생존성의 변화가 나타나지않고， 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인함으로써 췌장 소도의 안정성 및 생존율을 향상시켜서 췌장 소도 이식에 있어서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였으며 상기 표면 개질된 췌장 소도를 당뇨 예방 및 치료용 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.
단， 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다. <실시예 1>돼지 췌장소도 표면 세포의 세포막 표면 개질
<1-1>돼지 췌장소도의 분리
췌장소도를 분리하기 하루 전부터 금식시킨 체중 250 내지 300 g의 SD 랫트 (대한실험동물센터， 한국)를 케타민 (ketamine)과 자일라진 (xylazine)의 흔합용액으로 피하주사하여 마취시켰다. 복강을 개복한 후 췌장을 부풀리기 위해 콜라게네이즈 (collagenase; 1.5 mg 콜라게네이즈 /HBSS lmL, 12.5 mL/SD 래트)를.담즙관 (bileduct)을 통해 주입하였고， 주입이 끝남과 동시에 즉시 부풀려진 췌장을 적출하였다. 적출한 췌장을 가위로 잘게 부수고， 37°C 수조 내에서 흔들어주면서 분해시킨 후 더 이상의 분해를 막기 위하여 넁각된 HBSS를 첨가하였다. 분해된 췌장 조직을 채로 거른 후 여러 번 세척하였다. 이를 약 1400 rpm에서 3분간 원심분리를 수행하여 상층액을 제거하고， 27， 23， 20 및 11 %의 피콜 (ficoll) 농도 구배를 준 후 약 2400 rpm에서 24분간 원심분리를 실시하였다. 20 %와 23 % 층 사이 및 11 %와 20 % 층 사이에 존재하는 췌도를 모아 세척한 후 RPMI-1640 배양액 (제조사: Sigma, 11.1 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate, 6 mM HEPES, 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin)이 첨가된 배양 접시로 옮겨 37°C , 5 % 이산화탄소를 공급하면서 배양하였다. 배양액은 이를에 한 번씩 새것으로 교체해 주었고 이로부터 췌장 소도를 분리하였다.
<1-2> 6-arm PEG"lipid의 제조
6-arm PEG-SH(mw 15000 , 선바이오)， 6-ma 1 e i m i dohexano i c acid Nhydroxysuccinimide ester(EMCS; mw 308.29, Sigma) , 인지질 (phosphol ipid; 隱 744.063, Avant i Polar Lipids)및 트리에틸아민 (Tr iethylamine, TEA;匿 101.19， Sigma)을 이용하여 6— arm PEG-1 ipid를 제조하였다.
먼저， 500 mg 인지질을 1 ml 클로로포름에 용해시키고 등근 바닥 플라스크에 넣는다. 염기성 조건에서 반웅액에 140 ul TEA를 천천히 넣어준다. 인지질에 EMCS를 결합시키기 위해 249 mgEMCS를 클로로포름에 용해시키고 등근 바닥 플라스크에 넣고 24시간동안 섞어준다. 반응한 용액을 동결건조하여 인지질 -EMCS를 얻었다.
6-arm PEG-SH 1000 mg을 클로로포름에 용해시키고 이전에 합성한 인지질 -EMCS 168.38 mg을 넣고， 24시간동안 섞어준다. 정제를 위해 차가운 에테르를 준비하고， 침전시키기 위해 반웅액에 에테르를 천천히 넣어주었다. 6-arm PEG—SH는 에테르에 녹지않으므로 반웅하지않은 인지질 -EMCS만 에테르에 녹고 합성된 물질은 침전시켰다. 펠렛은 동결건조하고 상등액은 버렸다. 이러한 방법으로 6-arm PEG-l ipid를 얻었다. <1-3>젤라틴 -D0PA의 제조
젤라틴 (gelat in; Sigma) , EDC (N-(3-Dimethylami nopr opy 1 )-N ' -ethyl car bodi imide hydrochlor ide ; Sigma)， NHS ( N-hydr oxy sue c i n i m i de； Sigma) 및 DOPA ( 3 , 4-d i hydr oxypheny 1 ac e t i c acid ; Sigma)를 이용하여 gelat in-DOPA를 제조하였다.
젤라틴 1 g을 50 ml증류수에 용해하고， pH 5 EDC 110 mg, NHS 70 mg및 DOPA
100 mg을 넣고 50°C에서 24시간동안 섞어준다. 반웅이 끝난 후, pH 5， 50 °C 미만에서 반웅액을 투석한다 (분획분자량: 1 , 000 , SpectraPor ) . 정제 후， 동결건조하여 gel at in-DOPA를 얻었다. <1-4> 6-arm PEXHXFA의 제조
6-arm PEG 1000 mg을 클로로포름에 용해시키고， pH 5 EDC( 110 mg) , 丽 S(70 mg) 및 D0PA( 100 mg)를 넣고 24시간동안 섞어준다. 반웅한 용액은 멤브래인 튜브 (membrane tube)에 주입한 후 3일동안 투석시키면서 반웅하지 않은 D0PA를 제거한 후 동결건조하여 6-arm PEG-D0PA를 얻었다.
<1-5> 생체고분자 (biopolymer)가 다층 (mult i-layer) 그라프트된 췌장 소도세포의 제조
돼지 췌장 소도 세포의 세포막 표면에 6-arm PEG-l ipid를 결합시키고， 젤라틴 -DOPA를 그 위에 결합해 인조 세포 외 기질을 형성하였고， 이 위로 6-arm PEG—SH, 6-arm PEG-DOPA 및 l inear PEG-SH을 차례로 결합시켜 돼지 췌장 소도 세포의 세포막 표면올 개질하였다.
구체적으로， 6-arm PEG- l ip id 10 mg을 1 ml의 pH 8 HBSS에 녹인 완충액을 돼지 췌장 소도세포에 첨가하여 세포배양기 (37°C , 5 % 이산화탄소)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 더 이상의 반웅을 막기 위해 새 pH 7 HBSS 완충액으로 이 돼지 췌장 소도를 세척하였다.
그 결과， 도 1에 나타낸 바와 같이 6-arm PEG—l ipid가 췌장소도에 결합된다 (도 1) .
또한， 젤라틴 -D0PA 10 mg를 1 ml pH 8 HBSS에 녹인 완충액을 위의 6-arm
PEG-l ipid가 결합된 돼지 췌장 소도에 첨가하여 세포배양기 (37°C , 5 % 이산화탄소)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 더 이상의 반웅을 막기 위해 새 pH 7 HBSS 완층액으로 이 돼지 췌장 소도를 세척하고 M199로 세포배양기 (37°C , 5 % 이산화탄소)에서 30분 동안 반웅시킨 후 더 이상의 반웅을 막기 위해 새 pH 7 HBSS 완충액으로 이 돼지 췌장 소도를 세척하였다.
그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이 젤라틴 -D0PA와 6-arm PEG-l ipid가 결합한 형태로 젤화 (gelat ion)가 일어나 인조 세포 외 기질 (A. ECM)이 형성된다 (도 2) .
또한， 6-arm PEG-SH 10 mg을 1 ml의 pH 8 HBSS에 녹인 완층액을 위의 인조 세포 외 기질이 형성된 돼지 췌장 소도세포에 첨가하여 세포배양기 (37°C , 5 % 이산화탄소)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 더 이상의 반웅을 막기 위해 새 pH 7 HBSS 완층액으로 이 돼지 췌장 소도를 세척하면 6-arm PEG—SH가 췌장소도에 결합되고， 6-arm PEG-D0PA 10 mg을 1 ml.의 pH 8 HBSS에 녹인 완충액을 위의 6_arm PEG-SH이 결합된 돼지 췌장 소도세포에 첨가하여 세포배양기 (37°C , 5 % 이산화탄소)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 더 이상의 반응을 막기 위해 새 pH 7 HBSS 완충액으로 이 돼지 췌장 소도를 세척하면 6-arm PEG-DOPA가 췌장 소도에 결합되며， l inear PEG-SH 10 mg을 1 ml의 pH 8 HBSS에 녹인 완충액을 위의 6-arm PEG-DOPA가 결합된 돼지 췌장 소도세포에 첨가하여 세포배양기 (37°C , 5 % 이산화탄소)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 더 이상의 반웅을 막기 위해 새 pH 7 HBSS 완충액으로 이 돼지 췌장 소도를 세척하면 l inear PEG—SH가 췌장 소도에 결합된다.
그 결과， 도 3에 나타낸 바와 같이 마지막에 l inear PEG-SH가 결합하고 나면 돼지 췌장 소도의 표면 개질이 완성된다 (도 3) .
<실시예 2> 디티존 (dithizone) 염색을 이용한 췌장소도 모양 관측
상기 실시예 <1-5>의 방법으로 돼지 췌장 소도의 표면을 개질한 이후， 표면 개질을 하지않은 순수한 돼지 췌장 소도와 비교했을 때 췌장 소도의 형태와 인슐린 분비 정도를 확인하기 위하여 췌장의 β 세포에 반웅하는 디티존을 이용하여 염색을 하였다.
구체적으로， 표면 개질을 하지않은 순수 췌장 소도세포와 실시예 <1-5>의 방법으로 표면을 개질한 췌장 소도세포를 DMSCXdimethyl sul foxi de)에 디티존을 1 % 부피당 무게비로 녹인 후， 세포에 2 ug/ml의 농도로 처리하여 10분간 반웅시킨 후， 현미경으로 관찰하였다.
그 결과， 도 4에 나타낸 바와 같이 표면을 개질한 췌장 소도세포가 기존의 순수 췌장 소도세포와 비교해서 형태나 인슐린 분비 정도가 유사함을 확하였다 (도 4) . <실시예 3>공초점 레이저 주사 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscopy)을 이용한돼지 췌장소도 세포막 표면 확인
췌장소도 표면에 결합된 인조 세포 외 기질과 3층의 PEG 유도체의 확인을 위해서 형광물질 (FITC)로 표지된 PEG을 사용하여 상기 실시예 <1-5〉와 같은 방식으로 반웅시키고 공초점 레이저 주사 현미경 (Confocal Laser Scanning Mi croscopy)으로 이미지를 확인하였다.
그 결과， 도 5에 나타낸 바와 같이 인조 세포 외 기질과 6-arm PEG-SH , 6-arm PEG-D0PA , l inear PEG—SH이 돼지 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것을 확인하였다 (도 5) . <실시예 4> LIVE/DEAD Viabi lity/Cytotoxicity Kit를 이용한 돼지 췌장소도의 생존성 확인
LIVE/DEAD Viabi l i ty/Cytotoxi ci ty Ki t를 이용하여 돼지 췌장 소도의 생존성을 확인하였다.
구체적으로， 순수 췌장 소도와 상기 실시예 <1-5〉의 방법으로 표면을 개질한 췌장 소도의 생존성을 LIVE/DEAD Vi abi l i ty/Cytotoxici ty Ki t를 이용하면 죽은 세포는 붉은색으로， 살아있는 세포는 녹색으로 염색된다. 살아있는 세포는 세포 내 에스테르가수분해효소 (esterase) 활성이 높고 원형질막 (plasma membrane)이 완전한 반면， 죽은 세포는 esterase 활성이 낮고 원형질막이 망가지는 성질을 토대로 이를 감별할 수 있는 두 가지 형광을 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 동시에 결정할 수 있는 방법이다. 두 가지 형광으로 Cakein AM과 Ethd-l(Ethidhim homodimer-1)이 사용된다. Calcein AM은 비형광물질이었던 것이 살아있는 세포에서 에스트라제 (estrase)에 의해 분해될 경우， 녹색 형광을 띠면서 세포 내에 남게되고， EthD-1은 원형질막이 손상된 죽은 세포에만 들어가 핵산과 결합하면서 밝은 붉은색 형광을 띠게 된다.
그 결과， 도 6에 나타낸 바와 같이 순수 췌장 소도와 표면을 개질한 췌장 소도의 세포 생존성이 비슷하게 나타남으로 표면 개질 물질로 인한 독성이 거의 없음을 확인하였다 (도 6) .
<실시예 5> 췌장소도세포 5000 IEQ를 c57bl/6마우스에 이식 후 혈당 확인 당뇨가 유도된 c57bl /6 마우스에 상기 실시예 <1— 5〉의 방법으로 표면 개질한 췌장 소도를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였다.
구체적으로， streptozocin 160 mg/kg을 정상 c57bl /6마우스에 투여하여 혈당이 350 mg/dl 이상으로 측정되면， 당뇨가 유도된 c57bl/6마우스가 된다. 이 마우스에 대조군으로 아무런 처리를 하지 않은 돼지 췌장 소도 세포 5000 IEQ를 신피막 (kidney capsule)과 신장의 사이 공간에 이식하고， 같은 방법으로 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면을 개질한 돼지 췌장 소도를 이식한 후 여러 종의 면역억제제 (FK506 , Rapamycin, MR- 1( ant i CD— 15½Ab)， c lodrosome 및 ant i CD19 mAb 둥)를 함께 투여하여 각각 두마리씩 혈당의 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 아무런 처리 하지 않은 췌장 소도를 5000 IEQ 이식한 군에 비하여 표면을 개질한 췌장 소도를 5000 IEQ 이식한 군에서 혈중 포도당 농도의 유지기간아상승하는 것을 확인하였다 (도 7) .
<실시예 6 췌장소도세포 8000 IEQ를 c57bl/6마우스에 이식 후 혈당 확인 당뇨가 유도된 c57bl /6 마우스에 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면 개질한 췌장 소도를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였다.
구체적으로， streptozocin 160 mg/kg을 정상 c57bl /6마우스에 투여하여 혈당이 350 mg/dl 이상으로 측정되면， 당뇨가 유도된 c57bl/6 마우스가 된다. 이 마우스에 대조군으로 아무런 처리를 하지 않은 돼지 췌장 소도 세포 8000 IEQ를 신피막과 신장의 사이 공간에 이식하고， 같은 방법으로 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면을 개질한 돼지 췌장 소도를 이식한 후 여러 종의 면역억제제 (FK506 , Rapamyc in, MR- 1( ant i CD-154mAb) , c lodrosome 및 ant i CD19 mAb 등)를 함께 투여하여 각각 두마리씩 혈당의 변화를 확인하았다.
그 결과， 도 8에 나타낸 바와 같이 아무런 처리 하지 않은 췌장 소도를 8000 IEQ 이식한 군에 비하여 표면을 개질한 췌장 소도를 8000 IEQ 이식한 군에서 혈중 포도당의 유지기간이 상승하는 것을 확인하였다 (도 8) .
<실시예 1> 췌장 소도 세포 8000 IEQ를 Balb/c 누드 마우스에 이식 후 혈당 확인
당뇨가 유도된 Balb/c 누드 마우스에 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면 개질한 췌장 소도를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였다.
구체적으로, streptozocin 110 mg/kg 을 정상 Bal.b/c 누드 마우스에 투여하여 혈당이 350 mg/dl 이상으로 측정되면， 당뇨가 유도된 Balb/c 누드마우스가 된다. 이 마우스에 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면을 개질한 돼지 췌장 소도 8000 IEQ를 신피막과 신장의 사이 공간에 이식하고 8마리의 혈당 변화를 확인하였다.
그 결과， 도 9에 나타낸 바와 같이 당뇨가 유도된 누드마우스에 표면을 개질한 췌장 소도 8000 IEQ 이식한 후 혈당변화가 개체별로 다양하게 관찰되었지만， 약 5일간은 혈당이 유지되는 것을 확인하였다 (도 9) .
<실시예 8>췌장소도 세포 4000， 8000 IEQ를 SCID마우스에 이식 후 혈당 확인 당뇨가 유도된 SCID 누드 마우스에 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면 개질한 췌장 소도를 이식하였을 때， 혈당의 변화를 관찰하였다.
구체적으로， streptozocin 130 mg/kg 을 정상 SCID 마우스에 투여하여 혈당이 350 mg/dl 이상으로 측정되면， 당뇨가 유도된 SCID 마우스가 된다. 이 마우스에 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 표면을 개질한 돼지 췌장 소도 4000 , 8000 IEQ를 신피막과 신장의 사이 공간에 이식하고 혈당의 변화를 관측하였다. 그 결과， 도 10에 나타낸 바와 같이 표면을 개질한 췌장 소도 4000 또는
8000 IEQ를 이식하였을 때， 4마리 중 1마리를 제외하고는 모두가 60일 이상 혈당이 정상수치로 유지됨을 확인하였다 (도 10) .

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
고차구조의 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol , PEG)에 지질이 결합된 고차구조의 PEG-l ipid를 췌장 소도 표면에 결합시키는 단계 (단계 1) ; 상기 단계 1의 고차구조의 PEG-l ipid와 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체를 결합시키는 단계 (단계 2) ; 및
상기 단쩨 2의 PEG-l ipid의 결합되지 않은 카테콜 유도체의 하이드록시 (hydroxy)기에 PEG 유도체를 결합시키는 단계 (단계 3)를 포함하는 췌장 소도 세포 표면 개질 방법 .
[청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 단계 1의 지질은 인지질 (phosphol ipid)인 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법 .
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 단계 1의 고차구조의 PEG-l ipid는 췌장 소도 세포 표면의 인지질 이중층과 결합되는 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 카테콜 유도체는
D0PA( 3 , 4-d ihydroxypheny 1 acet i c acid)인 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법.
【청구항 5]
제 1항에 있어서， 상기 단계 2의 결합은 고차구조의 PEG-l ipid의 관능기와 젤라틴-카테콜 복합체의 하이드록시기가 결합하는 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법 .
【청구항 6】 제 5항에 있어서， 상기 관능기는 카테콜기， 아민기, 히드록실기， 카르복실기， 티을기 및 설폰기인 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법 .
【청구항 7】
제 1항에 있어서， 상기 고차구조의 PEG-lipid와 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체를 결합시킨 후 젤화 (gelation)시키는 단계를 추가적으로 포함하는 표면 개질 방법 .
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 단계 3의 PEG 유도체는 고차구조의 PEG, linear
PEG, PEG-도파 (PEG-D0PA), 모노메톡시 PEG(monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드 (succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드 (succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS( branched PEG-NHS) , PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succinate) , ？ ]■복入 1메틸화 PEG의 숙 1니口 1드 (succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트 (benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether),
PEG-옥시카보닐이미다졸 (PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드 (PEG-aldehyde)， PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르 (PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르 (PEG succinimidyl ester)인 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법ᅳ
【청구항 9】
제 1항에 있어서, 단계 3의 카테콜 유도체의 하이드록시기에 결합하지 않은 PEG 유도체 잔기에 서로 다른 PEG 유도체를 도입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법 .
【청구항 10】
제 9항에 있어서， 추가적으로 도입된 PEG유도체에 l inear PEG또는 생체 활성 물질을 추가적으로 도입하는 단계를 포함하는 표면 개질 방법.
[청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 생체 활성 물질은 헤파린인 것을 특징으로 하는 표면 개질 방법 .
【청구항 12】
고차구조의 PEG, 젤라틴 및 카테콜 유도체의 복합체， 및 하나 이상의 PEG 또는 이의 유도체가 순차적으로 췌장 소도 세포 표면에 결합된 표면 개질된 췌장 소도.
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