WO2015155491A1 - Procédé de génération de lumière par électro-chimiluminescence par une dispersion de particules électriquement conductrices dans un solvant - Google Patents

Procédé de génération de lumière par électro-chimiluminescence par une dispersion de particules électriquement conductrices dans un solvant Download PDF

Info

Publication number
WO2015155491A1
WO2015155491A1 PCT/FR2015/050983 FR2015050983W WO2015155491A1 WO 2015155491 A1 WO2015155491 A1 WO 2015155491A1 FR 2015050983 W FR2015050983 W FR 2015050983W WO 2015155491 A1 WO2015155491 A1 WO 2015155491A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bipyridine
phosphor
molecule
ligand
electrodes
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/050983
Other languages
English (en)
Inventor
Neso Sojic
Alexander Kuhn
Stéphane ARBAULT
Laurent BOUFFIER
Mica SENTIC
Original Assignee
Université De Bordeaux
Institut Polytechnique De Bordeaux
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Université De Bordeaux, Institut Polytechnique De Bordeaux, Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs - filed Critical Université De Bordeaux
Publication of WO2015155491A1 publication Critical patent/WO2015155491A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/66—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light electrically excited, e.g. electroluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention relates generally to a method of generating electrochemiluminescent light (generally referred to by the acronym ECL), in which an emission is induced by electrochemiluminescence (generally referred to by the acronym ECL), in which an emission is induced.
  • ECL electrochemiluminescent light
  • ECL electrochemiluminescence
  • ECL electrochemiluminescence
  • Electrochemiluminescence is an analytical technique in which, at the present time, the luminescence (or ECL emission) produced by a phosphor is the result of an initial electrochemical reaction (by electron transfer) on the surface of the phosphor. an electrode located inside an electrochemical reactor filled with an electrolytic solution, the ECL emission occurring only in the immediate vicinity of this electrode, therefore in a two-dimensional space.
  • Electrochemiluminescence differs from classical photoluminescence, in which generation of the emissive state occurs by photon absorption.
  • the electron transfer reaction on the surface of the electrode will generate very reactive species that will bring the phosphor in the excited state. It is therefore a method where the light is typically generated on the surface of the electrode.
  • the luminous intensity constitutes the analytical signal and depends directly on the concentration of the phosphor.
  • the most widely used phosphor is Ru (bpy) 3 2+ ruthenium complex, which is generally associated with tripropylamine as a co-reactant. This ruthenium complex is currently used commercially to label biomolecules, especially for immunoassay.
  • the ECL intensity is proportional to the concentration of the marker and therefore the antigen in a "sandwich" format. Because of its remarkable sensitivity and overall analytical performance, ECL technology is marketed primarily by the companies Roche Diagnostics (marketing devices including under the trade name Cobas) and Mesoscale Discovery (or MSD).
  • Roche currently dominates the market for diagnostic applications of ECL technology. In fact, it markets a large number of immunoassays based on this technology for the detection of biomarkers in pathologies as varied as cardiac or infectious diseases, thyroid dysfunction, oncology, etc.
  • the technology marketed by Roche is illustrated in Figure 1.
  • This technology uses magnetic beads of 3 ⁇ m in diameter, which are functionalized with a capture antigen. The beads are incubated with a sample and then with a detection antibody labeled with Ru (bpy) 3 2+ ruthenium complex. The beads must be immobilized on the surface of the electrode to induce the ECL emission that allows the assay. Only balls in contact with the electrode produce ECL, so this is a two-dimensional surface technique.
  • Electrode array surfaces are modified with capture antibodies and a "sandwich" type assay is performed with the same ruthenium complex as a label.
  • the spatial location of the ECL emission in these devices makes it possible to perform multiplexed immunoassays.
  • the ECL emission is generated at the interface between the electrolyte solution and the electrode. It is therefore a two-dimensional process that is very spatially limited and for which the intensity of the signal depends directly on the geometrical surface of the working electrode.
  • ECL is a powerful technique whose applications in clinical diagnosis (immunoassay) are known to those skilled in the art [1] [2] [3] [4] [5] [6] and widely marketed ( notably by Roche Diagnostics and Mesoscale Discovery). Current applications are however limited by:
  • Bipolar electrochemistry is a technique for polarizing a conductive particle placed in an electric field. Polarization is proportional to the intensity of the applied field and the size of the object. If the polarization is sufficient, electrochemical reactions occur at the two ends of the object which thus acts as a bipolar electrode: anodic reaction at one pole and cathodic reaction at the other pole ( Figure 2).
  • bipolar electrochemistry and ECL [8] [9] [10] [12] [13] .
  • bipolar electrochemistry and ECL have recently been associated by applicants [8] to make "bipolar ECL swimmers".
  • bipolar electrochemistry induces simultaneously: the production of gas bubbles to propel the object and the ECL emission.
  • this concerns only one ball inside the capillary and not a plurality of particles dispersed in a solvent.
  • the object of the present invention is therefore to overcome all or part of the disadvantages of the art prior, by the establishment of a truly three-dimensional process, which allows the generation of an ECL emission at a set of stable conductive particles in solution (and no longer of a single particle), in order to induce a three-dimensional ECL emission, that is to say simultaneously by a whole set of micro / nano-obj and conductors in solution without being in contact with the electrodes; these last ones serve to impose the electric field and thus to polarize all the conductive objects dispersed in the solution.
  • the subject of the present invention is a method for generating light by ECL comprising the following steps:
  • At least one phosphor-soluble substance is introduced into a solvent medium and a coreactant capable of being oxidized in contact with an electrode and to react with said phosphor in an electrochemiluminescence reactor comprising a photo-detection system, two electrodes and whose interior is filled with an electrolytic solution comprising a solvent medium, disposed between the two electrodes;
  • a difference in potential ⁇ is applied between the two electrodes, which creates an electric field E, so as to bring the phosphor substance (s) to an excited state by transfer of electrons to one of the electrodes and generate light;
  • the electric field E is between 2 kV / m and 40 MV / m, for polarizing said electrically conductive particles and causing on their surface (including in the vicinity of their surface) the transfer of electrons making it possible to bring to an excited state the phosphor substance (s), which are in solution near said bipolar electrodes and thereby generate light in the electrolytic solution.
  • phosphor means any substance producing electrochemiluminescence.
  • the ECL light generation method according to the invention allows a three-dimensional emission of ECL by a multitude of electrically conductive particles (in particular micro- or nano-objects) in stable dispersion in a solvent, leading to the obtaining of an ECL signal much more intense than that usually obtained on the surface of an electrode, as is generally the case in commercial two-dimensional devices.
  • the ECL light generation method according to the invention has, compared to current two-dimensional methods, the following advantages:
  • the process according to the invention is suitable for continuous measurement in a microfluidic system
  • the method according to the invention allows short analysis times, and
  • the substance (s) phosphor (s) are in solution near said bipolar electrodes, and not immobilized on the bipolar electrodes. This simplifies the process, since it is not necessary to use luminophorescent substances authorizedized on the surface.
  • the generation of ECL light is not limited by the number of phosphor substances fixed on the bipolar electrodes: all of the phosphor substances in solution can be addressed by the method according to the invention by reacting either directly on the surface of the phosphors. bipolar electrodes, either with the radicals resulting from the oxidation of the co-reactive on the bipolar electrodes. These radicals can diffuse over distances of several micrometers, excite the phosphor substances located at these micrometric distances around the bipolar electrodes and generate the ECL.
  • the intensity of the electric field E is sufficiently high to polarize said electrically conductive particles and to cause electron transfer.
  • the electrically conductive particles do not polarize sufficiently and only the luminophores in the vicinity of one of the supply electrodes are brought to an excited state and generate an ECL emission.
  • parasitic reactions of oxidation or reduction of the solvent or of the support electrolyte can occur at the level of the bipolar electrodes which will greatly reduce or annihilate the ECL emission.
  • the duration of application of the electric field E and / or the quantity of charges injected are preferably adjusted so as not to reach the point at which there is a "flash" linked to a short circuit.
  • the duration of application of the electric field is equal to the discharge duration of a previously charged capacitor. This makes it possible to limit the duration of application of the electric field and to be able to observe the light emission without flash.
  • the solvent medium of the electrochemiluminescence reactor used in the process according to the invention may be an aqueous medium, or a non-aqueous medium.
  • it is a non-aqueous medium, it is preferably composed of an organic solvent or a mixture of organic solvents or a water / organic solvent mixture.
  • organic solvents that may be used in the context of the present invention, mention may notably be made of methanol, ethanol, acetonitrile, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, acetone, acetic acid and ethyl acetate.
  • ether pentane, cyclopentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene, 1,4-dioxane, chloroform, dichloromethane, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, propylene carbonate,
  • the solvent is an aqueous medium consisting of a buffer solution whose pH is between 4 and 12.
  • aqueous buffers that may be used in the context of the present invention, mention may especially be made of PBS buffer (phosphate), HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulphonic acid), TRIS-HC1 buffer, TRIS-borate buffer, TRIS-acetate buffer, HPCE buffer (citric acid-NaOH), triethylammonium acetate buffer, and triethylammonium bicarbonate buffer.
  • PBS buffer phosphate
  • HEPES buffer 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulphonic acid
  • TRIS-HC1 buffer TRIS-borate buffer
  • TRIS-acetate buffer TRIS-acetate buffer
  • HPCE buffer citric acid-NaOH
  • triethylammonium acetate buffer triethylammonium bicarbonate buffer.
  • a solvent in a substantially gelled form whose viscosity is between 5.10 -4 Pa.s and 10 Pa.s.
  • the substantially gelled form makes it possible to keep the particles, in particular those of micrometric size longer in suspension, avoiding their too rapid sedimentation. In addition, this makes it possible to improve the efficiency of the separation step of the free phosphor.
  • metal balls metal balls, metal oxides and semiconductor balls, - metal or semiconductor microwires and nanowires,
  • the particles electrically
  • Conductors can be chosen from:
  • the beads of the following elements Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO (oxides of tin and antimony), FTO (tin and fluorine oxides, Cu, Fe, Ir, Ni, Pd,
  • microfilms or nanowires of the following elements Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO, FTO (tin and fluorine oxides), Cu, Fe, Ir, Ni, Pd, and
  • microtubes or nanotubes of the following elements Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO, FTO, Cu, Fe, Ir, Ni, Pd,
  • carbon leaflets graphite, graphite oxide, graphene, graphene oxides and the like doped with nitrogen or boron).
  • the molecular complexes comprising the following compounds: tris (2,2'-bipyridine) ruthenium, tris (2,2'-bipyridine) iridium, tris (2,2'-bipyridine) osmium, tris (1,10-phenanthroline) ruthenium, tris (1,10-phenanthroline) iridium, tris (2,2'-bipyridine) osmium, 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, tris (2-phenylpyridine) iridium, bis (2 , 2'-bipyridine) (2,2'-bipyridine-biotin) ruthenium, bis (2,2'-bipyridine) (2,2'-bipyridine-biotin) iridium, bis (2,2'-bipyridine) (2'-bipyridine) (2'-bipyridine-biotin) , 2' bipyridine
  • the coreacts associated with the phosphor substance and which can be used in the context of the present invention may advantageously be chosen from tri-n-propylamine, oxalate, tri-n-ethanolamine, 2- (dibutylamino) ethanol and nicotinamide adenine. dinucleotide, hydrogen peroxide, peroxydisulfate, hydrazine, benzoyl peroxide.
  • the phosphor may be attached to a first specific ligand of a molecule to be assayed for the solvent medium, to form a complex.
  • the luminophore substance-first ligand complex is in solution near the bipolar electrodes and not immobilized on said bipolar electrodes.
  • the electrically conductive particles are in contact with a second specific ligand of a molecule to be assayed for the solvent medium, said second ligand being in solution near the conductive electrodes.
  • the first and second ligands are different, that is, they bind to different parts of the same molecule.
  • they are antibodies with different paratopes thus binding different epitopes of the same molecule.
  • the ligand may be an antibody and / or the molecule to be assayed may be selected from the group consisting of an antigen and a DNA molecule.
  • the present invention also relates to the use of the method according to the invention for the immunoassay of a molecule of the solvent medium.
  • the method according to the invention may advantageously comprise the following steps:
  • the method according to the invention may advantageously comprise the following steps:
  • a first ligand specific for said molecule to be assayed
  • the method used for this immunoassay may advantageously comprise the following steps:
  • a first ligand specific for said molecule to be assayed
  • the method used for this immunoassay may advantageously comprise the following steps:
  • the step of removing the free phosphor substance may be carried out by application a potential difference ⁇ between the two electrodes creating an electric field between 1 and 5000 V / m.
  • the ligand may be an antibody and / or the molecule to be assayed may be selected from the group consisting of an antigen and a DNA molecule.
  • the complex [Ru (bpy) 3] 2+ and tri-n-propylamine (TPrA) can advantageously be used as a phosphor substance as a coreactant.
  • FIG. 1 represents a schematic diagram of the ECL device marketed by the company
  • FIG. 2 represents a schematic diagram of the operation of the bipolar electrochemistry used to polarize a ball in solution
  • FIG. 3a is a white light image of a dispersion of carbon particles with a diameter of 30 ⁇ m within a capillary
  • o Figure 3b is an image of the ECL emission by all of these particles during the implementation of the method according to the invention.
  • FIG. 4 represents a schematic diagram of the test implemented in example 2: In particular, scheme A) of FIG. 2 illustrates the binding of a labeled antibody to the antigen, while scheme B) of FIG. 2 illustrates the binding of an unlabeled primary antibody to the antigen, and a secondary antibody labeled with the primary antibody.
  • the distance between the two graphite electrodes is 3 cm
  • the external diameter of the capillary is 6 mm
  • the average diameter of the carbon balls used as bipolar electrode is 30 ⁇ m
  • the photodetector completing the reactor
  • ECL is a CCD camera.
  • the applied voltage is 2500 V between the 2 electrodes.
  • This three-dimensional ECL technology is applicable to the measurement of different antigens, for example IL-8 (interleukin 8), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) and PSA (prostate-specific antigen).
  • Example 2 Detection of an antibody / antigen complex in solution.
  • This example demonstrates the feasibility of 3-dimensional electrochemiluminescence using non-functionalized electrically conductive particles, and the formation of a complex in solution.
  • the first strategy involves a single antibody, the detection antibody, specific for the antigen of interest. This antibody is biotinylated, which allows it to be labeled with the Ru (bpy) 3 2+ phosphor via the biotin-streptavidin interaction, Ru (bpy) 3 2+ being bound to streptavidin ( Figure 4A).
  • the second strategy involves a primary antibody specific for the antigen of interest but unlabeled, and a secondary antibody labeled with ruthenium but not specific for the antigen of interest (Figure 4B).
  • the antigen used for the demonstration is the recombinant GM-CSF protein.
  • the second strategy ( Figure 4B) is chosen to introduce greater size variation between the free antibodies and the complex, and thus facilitate separation.
  • the antigen / primary antibody / secondary antibody complex is formed in solution.
  • a concentration range of antigen from ⁇ to nM.
  • a mixture of agarose gel, DBAE solution (2- (dibutylamino) ethanol) and complex solution is then produced in respective volume proportions 50%, 25% and 25%.
  • the complex and unbound antibodies are separated by electrophoresis, which takes advantage of the difference in size and thus mobility between the complex and the free species.
  • the conductive particles homogeneously dispersed in the support are carbon balls of diameter between 20 and 30 ⁇ m whose final concentration is 5 mg.mL -1 , or about 300,000 beads. mL -1 .
  • the co-reagent used to generate the electrochemiluminescence is 2-dibuthylaminoethanol (DBAE) present at the concentration final of 20 mM.
  • DBAE 2-dibuthylaminoethanol
  • a potential difference of 2.2 kV is applied between the two electrodes for a duration of 150 ms.
  • the light emission is detected by a photomultiplier, and the result can be expressed as the evolution over time of a current proportional to the luminous intensity.

Abstract

La présente invention concerne un procédé de génération de lumière par électrochimiluminescence (généralement désignée par l'acronyme ECL), dans lequel on induit une émission ECL par un ensemble de particules (notamment micro-ou nanométriques) électriquement conductrices en solution. La présente invention concerne également l'utilisation d'un tel procédé pour l'immunodosage d'une molécule présente dans lemilieu solvant.

Description

PROCÉDÉ DE GÉNÉRATION DE LUMIÈRE PAR ÉLECTRO- CHIMILUMINESCENCE PAR UNE DISPERSION DE PARTICULES ÉLECTRIQUEMENT CONDUCTRICES DANS UN SOLVANT La présente invention concerne de manière générale un procédé de génération de lumière par électrochimiluminescence (généralement désignée par l'acronyme ECL) , dans lequel on induit une émission ECL par un ensemble de particules (notamment micro- ou nanométriques ) électriquement conductrices en solution.
L' électrochimiluminescence (ECL) est une technique analytique dans laquelle, à l'heure actuelle, la luminescence (ou émission ECL) produite par une substance luminophore résulte d'une réaction initiale électrochimique (par transfert d'électrons), à la surface d'une électrode se trouvant à l'intérieur d'un réacteur électrochimique rempli d'une solution électrolytique, l'émission ECL se produisant uniquement au voisinage immédiat de cette électrode, donc dans un espace bidimensionnel .
L' électrochimiluminescence diffère de la photoluminescence classique, dans laquelle la génération de l'état émissif se produit par absorption de photons.
En électrochimiluminescence, la réaction de transfert d'électrons à la surface de l'électrode va générer des espèces très réactives qui vont porter la substance luminophore à l'état excité. Il s'agit donc d'une méthode où la lumière est typiquement générée à la surface de l'électrode. L'intensité lumineuse constitue le signal analytique et dépend directement de la concentration du luminophore. La substance luminophore la plus employée est le complexe de ruthénium Ru(bpy)32+, qui est généralement associé à la tripropylamine en tant que co-réactif. Ce complexe de ruthénium est actuellement employé commercialement pour marquer des biomolécules, notamment pour 1 ' immunodosage . Dans ce cas, l'intensité ECL est proportionnelle à la concentration du marqueur et donc de l'antigène dans un format de type « sandwich ». Du fait de sa remarquable sensibilité et de l'ensemble de ses performances analytiques, la technologie ECL est commercialisée principalement par les sociétés Roche Diagnostics (commercialisant des dispositifs notamment sous la dénomination commerciale Cobas) et Mesoscale Discovery (ou MSD) .
La société Roche domine actuellement le marché des applications en diagnostic de la technologie ECL. En effet, elle commercialise notamment un grand nombre d' immunodosages basés sur cette technologie pour la détection de biomarqueurs dans des pathologies aussi variées que les maladies cardiaques ou infectieuses, les dysfonctionnements de la thyroïde, l'oncologie, etc.. La technologie commercialisée par la société Roche est illustrée par la figure 1. Cette technologie utilise des billes magnétiques de 3 ym de diamètre, qui sont fonctionnalisées avec un antigène de capture. Les billes sont incubées avec un échantillon, puis avec un anticorps de détection marqué avec le complexe de ruthénium Ru(bpy)32+. Les billes doivent être immobilisées à la surface de l'électrode pour induire l'émission ECL qui permet le dosage. Seules les billes au contact de l'électrode produisent de l'ECL, donc il s'agit d'une technique de surface bidimensionnelle . La société Mesoscale Discovery (également désignée par l'acronyme MSD) commercialise également des appareils pour 1 ' immunodosage basé sur l'ECL. Dans ces dispositifs, les surfaces de réseaux d'électrodes sont modifiées par des anticorps de capture et un dosage de type « sandwich » est réalisé avec le même complexe de ruthénium comme marqueur. La localisation spatiale de l'émission ECL dans ces dispositifs permet de réaliser des immunodosages multiplexés.
Que ce soit dans les dispositifs pour 1 ' immunodosage commercialisés par la société Roche ou dans ceux commercialisés par la société MSD, l'émission ECL est générée à l'interface entre la solution électrolytique et l'électrode. Il s'agit donc d'un processus bidimensionnel très limité spatialement et pour lequel, l'intensité du signal dépend directement de la surface géométrique de l'électrode de travail.
L'ECL est une technique performante dont les applications en diagnostic clinique (immuno-analyse) sont connues de l'homme de l'art [1] [2] [3] [4] [5] [6] et largement commercialisées (notamment par Roche Diagnostics et Mesoscale Discovery) . Les applications actuelles sont cependant limitées par :
• la sensibilité qui est liée intrinsèquement au fait que l'ECL est une méthode de surface,
• la nécessité d' immobiliser, à la surface des électrodes, le matériel biologique (les anticorps de capture et de détection) marqué avec un complexe induisant l'ECL.
Ces désavantages limitent l'extension des champs d'applications de l'ECL et la détection ultrasensible qui est requise pour détecter les étapes initiales de certaines pathologies. Pour ne citer qu'un exemple, la détection des biomarqueurs de la maladie d'Alzheimer requiert, pour un diagnostic précoce, une grande sensibilité puisque la concentration de ces biomarqueurs dans le sang est au moins 100 à 1000 fois plus faible que dans le fluide cérébrospinal.
Pour résoudre ce problème de processus bidimensionnel d'émission ECL, les demandeurs ont mis au point un procédé de génération de lumière par ECL utilisant les principes de 1 ' électrochimie bipolaire [9] .
L' électrochimie bipolaire (BE) est une technique permettant de polariser une particule conductrice placée dans un champ électrique. La polarisation est proportionnelle à l'intensité du champ appliqué et à la dimension de l'objet. Si la polarisation est suffisante, des réactions électrochimiques se produisent aux 2 extrémités de l'objet qui agit donc comme une électrode bipolaire : réaction anodique à un pôle et réaction cathodique à l'autre pôle (Figure 2) .
II est connu de l'homme de l'art d'associer
1' électrochimie bipolaire et 1 ' ECL [8] [9] [10] [12] [13] . En particulier, 1 ' électrochimie bipolaire et l'ECL ont été récemment associées par les demandeurs [8] pour fabriquer des "nageurs ECL bipolaires". Dans ce cas, 1 ' électrochimie bipolaire induit simultanément : la production de bulles de gaz pour propulser l'objet et l'émission ECL. Toutefois, cela ne concerne qu'une seule bille à l'intérieur du capillaire et non une pluralité de particules en dispersion stable dans un solvant.
Le but de la présente invention vise donc à pallier tout ou partie des inconvénients de l'art antérieur, par la mise en place d'un procédé véritablement tridimensionnel, qui permet la génération d'une émission ECL au niveau d'un ensemble de particules conductrices stables en solution (et non plus d'une seule particule), afin d'induire une émission ECL tridimensionnelle, c'est-à-dire simultanément par tout un ensemble de micro/nano-obj ets conducteurs en solution sans qu' ils soient en contact avec les électrodes ; ces dernières servent à imposer le champ électrique et donc à polariser tous les objets conducteurs dispersés dans la solution.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un procédé de génération de lumière par ECL comprenant les étapes suivantes :
- on introduit au moins une substance luminophore soluble dans un milieu solvant et un coréactif apte à s'oxyder au contact d'une électrode et à réagir avec ledit luminophore, dans un réacteur d' électrochimiluminescence comprenant un système de photo-détection, deux électrodes et dont l'intérieur est rempli d'une solution électrolytique comprenant un milieu solvant, disposé entre les deux électrodes ;
- on applique une différence de potentiel Δυ entre les deux électrodes qui crée un champ électrique E, de manière à porter la ou les substance (s) luminophore ( s ) à un état excité par transfert d'électrons à l'une des électrodes et générer de la lumière ;
ledit procédé étant caractérisé en ce qu' il comporte en outre les étapes suivantes :
- on introduit dans ledit réacteur, des particules électriquement conductrices formant dans le milieu solvant une dispersion, de sorte que lesdites particules électriquement conductrices constituent chacune une électrode bipolaire (31) grâce à leur polarisation générée par le champ électrique E ;
- le champ électrique E est compris entre 2 kV/m et 40 MV/m, pour polariser lesdites particules électriquement conductrices et provoquer à leur surface (y compris au voisinage de leur surface) le transfert d'électrons permettant de porter à un état excité la ou les substance (s) luminophore ( s ) , qui sont en solution à proximité desdites électrodes bipolaires et générer ainsi de la lumière dans la solution électrolytique .
Par substance luminophore, on entend, au sens de la présente invention, toute substance produisant de 1' électrochimiluminescence .
Le procédé de génération de lumière ECL selon l'invention permet une émission tridimensionnelle d'ECL par une multitude de particules électriquement conductrices (notamment des micro- ou des nano-objets) en dispersion stable dans un solvant, conduisant à l'obtention d'un signal ECL nettement plus intense que celui que l'on obtient habituellement à la surface d'une électrode, comme c'est généralement le cas dans les dispositifs bidimensionnels commerciaux.
Du fait de son caractère tridimensionnel, le procédé de génération de lumière ECL selon l'invention présente, par rapport aux procédés bidimensionnels actuels, les avantages suivants :
• l'émission 3D d'ECL conduit à une amélioration conséquente de la sensibilité de la mesure, • il n'y a pas d'immobilisation à la surface de l'électrode des substances luminophores portées à un état excité,
• le procédé selon l'invention est adapté à la mesure en continu dans un système microfluidique,
• le procédé selon l'invention permet des durées d'analyse courtes, et
• enfin, il s'agit d'un procédé en phase homogène.
En outre, dans le procédé de génération de lumière par ECL selon l'invention, les substance (s) luminophore ( s ) sont en solution à proximité desdites électrodes bipolaires, et non immobilisées sur les électrodes bipolaires. Cela permet de simplifier le procédé, car il n'est alors pas nécessaire d'utiliser des substances luminophores imobilisées en surface. Enfin, la génération de lumière ECL n'est pas limitée par le nombre de substances luminophores fixées sur les électrodes bipolaires : l'ensemble des substances luminophores en solution peut être adressé par le procédé selon l'invention en réagissant soit directement à la surface des électrodes bipolaires , soit avec les radicaux issus de l'oxydation du co-réactif sur les électrodes bipolaires. Ces radicaux peuvent diffuser sur des distances de plusieurs micromètres, exciter les subtances luminophores situées à ces distances micrométriques autour des électrodes bipolaires et générer l'ECL.
L'intensité du champ électrique E, comprise entre 2 kV/m et 40 MV/m, est suffisamment élevée pour polariser lesdites particules électriquement conductrices et provoquer le transfert d'électrons. En-dessous de 2 kV/m, les particules électriquement conductrices ne se polarisent pas de façon suffisante et seules les substances luminophores au voisinage de l'une des électrodes d'alimentation sont portées à un état excité et génèrent une émission ECL. Au-dessus de 40 MV/m, des réactions parasites d'oxydation ou de réduction du solvant ou de 1 ' électrolyte support peuvent se produire au niveau des électrodes bipolaires ce qui va fortement diminuer ou annihiler l'émission ECL.
La durée d'application du champ électrique E et/ou la quantité de charges injectées sont de préférence ajustées de sorte à ne pas atteindre le point auquel on a un « flash » lié à un court-circuit. Dans un mode de réalisation préféré, la durée d'application du champ électrique est égale à la durée de décharge d'un condensateur préalablement chargé. Ceci permet de limiter la durée d'application du champ électrique et de pouvoir observer l'émission lumineuse sans flash.
Le milieu solvant du réacteur d'électro- chimiluminescence utilisé dans le procédé selon l'invention peut être un milieu aqueux, ou un milieu non aqueux.
S'il s'agit d'un milieu non aqueux, il est de préférence constitué d'un solvant organique ou d'un mélange de solvants organiques ou d'un mélange eau/solvant organique.
A titre de solvants organiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer le méthanol, l'éthanol, l' acétonitrile, le diméthylsulfoxyde, le tétrahydrofurane, l'acétone, l'acide acétique, l'acétate d'éthyle, l'éther, le pentane, le cyclopentane, l'hexane, le cyclohexane, le benzène, le toluène, le 1,4-dioxane, le chloroforme, le dichlorométhane, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le carbonate de propylène,
1 ' isopropanol ou un mélange d'au moins un de ces solvants, y compris avec l'eau.
De manière avantageuse, le solvant est un milieu aqueux constitué d'une solution tampon dont le pH est compris entre 4 et 12.
A titre de tampons aqueux utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer le tampon PBS (phosphate) , le tampon HEPES (acide 4- (2- Hydroxyéthyl) piperazine-1-ethanesulfonique) , le tampon TRIS-HC1, le tampon TRIS-borate, le tampon TRIS-acétate, le tampon HPCE (acide citrique-NaOH) , le tampon triéthylammonium acétate, et le tampon triéthylammonium bicarbonate .
De manière avantageuse, ou pourra utiliser un solvant se présentant sous une forme sensiblement gélifiée dont la viscosité est comprise entre 5.10-4 Pa.s et 10 Pa.s. La forme sensiblement gélifiée permet de maintenir les particules, notamment celles de dimension micrométrique plus longtemps en suspension en évitant leur sédimentation trop rapide. De plus, cela permet d'améliorer l'efficacité de l'étape de séparation du luminophore libre.
Les particules électriquement conductrices utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être avantageusement choisies parmi :
- les billes magnétiques,
- les billes métalliques, d'oxydes métalliques et les billes de semi-conducteurs, - les microfils et les nanofils métalliques ou de semi-conducteurs ,
- les microtubes ou nanotubes métalliques ou de semi-conducteurs, et
- les feuillets métalliques ou de semi-conducteurs,
De préférence, les particules électriquement
conductrices peuvent être choisies parmi :
- les billes des éléments suivants : Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO (oxydes d'étain et d'antimoine), FTO (oxydes d'étain et de fluorine, Cu, Fe, Ir, Ni, Pd,
les microfils ou les nanofils des éléments suivants : Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO, FTO (oxydes d'étain et de fluorine) , Cu, Fe, Ir, Ni, Pd, et
les microtubes ou les nanotubes des éléments suivants : Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO, FTO, Cu, Fe, Ir, Ni, Pd,
les feuillets de carbone (graphite, oxyde de graphite, graphène, oxydes de graphène et analogues dopés à l'azote ou au bore) .
A titre de substance luminophores utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer :
• les complexes moléculaires comprenant les composés suivants : tris (2 , 2 ' -bipyridine) ruthénium, tris (2 , 2 ' -bipyridine) iridium, tris (2 , 2 ' -bipyridine) osmium, tris (1, 10-phenanthroline) ruthénium, tris (1, 10-phenanthroline) iridium, tris (2,2 '- bipyridine) osmium, 5-Amino-2 , 3-dihydro-l , 4- phthalazinedione, tris (2-phenylpyridine) iridium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine-biotine) ruthénium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine- biotine) iridium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2,2'- bipyridine-biotine) osmium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine-streptavidine) ruthénium, bis (2,2 '- bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine- streptavidine) iridium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine- streptavidine) osmium, tris (2 , 2 ' -bipyridine) ruthénium - NHS ester, tris (2 , 2 ' -bipyridine) ruthénium - phosphoramadite, tris (2 , 2 ' -bipyrazine) ruthénium, et leurs dérivés et/ou mélanges,
• les particules de silice dopées avec lesdits complexes moléculaires, et
• les nanoparticules d'un matériau semi-conducteur choisi parmi le germanium Ge, le sulfure de cadmium CdS, le sélénure de cadmium CdSe, le sulfure de plomb PbS, et les particules à structure cœur-écorce CdSe/ZnS .
Les coréactifs associés à la substance luminophore et utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être avantageusement choisis parmi la tri-n- propylamine, l'oxalate, la tri-n-éthanolamine, le 2- (dibutylamino) éthanol, la nicotinamide adénine dinucléotide, le peroxyde d'hydrogène, le peroxydisulfate, l'hydrazine, le peroxyde de benzoyle.
Si l'on souhaite réaliser un dosage d'une molécule spécifique contenue dans un solvant donné à l'aide du procédé selon l'invention, la substance luminophore peut être fixée sur un premier ligand spécifique d'une molécule à doser du milieu solvant, de manière à former un complexe.
De façon préférée, dans ce cas, le complexe substance luminophore - premier ligand est en solution à proximité des électrodes bipolaires et non immobilisé sur lesdites électrodes bipolaires. Alternativement, les particules électriquement conductrices sont en contact avec un second ligand spécifique d'une molécule à doser du milieu solvant, ledit second ligand étant en solution à proximité des électrodes conductrices.
Les premier et second ligands sont différents, à savoir qu' ils se fixent à différentes parties de la même molécule. Par exemple, dans le cas d'un ligand anticorps, il s'agit d'anticorps avec des paratopes différents donc liant des épitopes différents de la même molécule.
Le ligand peut être un anticorps et/ou la molécule à doser peut être choisie parmi le groupe constitué d'un antigène et d'une molécule ADN.
Dans le cadre d'un dosage d'une molécule spécifique contenue dans un solvant donné, on pourra avantageusement utiliser comme substance luminophore le complexe [Ru(bpy)3]2+ ou l'un de ses dérivés et la tri-n- propylamine (TPrA) en tant que coréactif.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention pour 1 ' immunodosage d'une molécule du milieu solvant.
De manière avantageuse, afin de réaliser un tel immunodosage, le procédé selon l'invention pourra avantageusement comporter les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant la molécule à doser avec des particules électriquement conductrices fonctionnalisées avec un premier ligand spécifique de ladite molécule à doser et un second ligand spécifique de ladite molécule marqué avec la substance luminophore, pour la formation d'un complexe ;
- élimination de la substance luminophore libre ; ajout du coréactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ;
application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de sorte à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ;
- mesure de la lumière générée.
De manière avantageuse, afin de réaliser un tel immunodosage, le procédé selon l'invention pourra avantageusement comporter les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant la molécule à doser avec :
• des particules électriquement conductrices non fonctionnalisées,
• un premier ligand spécifique de ladite molécule à doser, et
• un second ligand spécifique de ladite molécule marqué avec la substance luminophore,
pour la formation d'un complexe ;
- élimination de la substance luminophore libre ; ajout du coréactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ;
application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de sorte à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ;
- mesure de la lumière générée.
De manière avantageuse, le procédé utilisé pour cet immunodosage pourra avantageusement comprendre les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant ladite molécule à doser avec : • des particules électriquement conductrices non fonctionnalisées ;
• un premier ligand spécifique de ladite molécule à doser, et
• un second ligand marqué avec la substance luminophore (4) et spécifique du premier ligand,
pour la formation d'un complexe ;
- élimination du second ligand libre ;
ajout du coréactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ;
application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de sorte à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ;
- mesure de la lumière générée.
De manière avantageuse, le procédé utilisé pour cet immunodosage pourra avantageusement comprendre les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant une molécule à doser avec des particules électriquement conductrices et un ligand spécifique de ladite molécule marquée avec la substance luminophore, pour la formation d'un complexe ;
- élimination de la substance luminophore libre ; ajout du co-réactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ;
application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de manière à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ; et
- mesure de la lumière générée.
De préférence, l'étape d'élimination de la substance luminophore libre pourra être réalisée par application d'une différence de potentiel Δυ entre les deux électrodes créant un champ électrique compris entre 1 et 5000 V/m.
De préférence, si le procédé de l'invention est utilisé pour un immunodosage, le ligand peut être un anticorps et/ou la molécule à doser peut être choisie parmi le groupe constitué d'un antigène et d'une molécule ADN.
De préférence, si le procédé de l'invention est utilisé pour un immunodosage, on pourra avantageusement utiliser comme substance luminophore le complexe [Ru(bpy)3]2+ et la tri-n-propylamine (TPrA) en tant que coréactif .
D' autres avantages et particularités de la présente invention résulteront de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif et faite en référence aux exemples suivant et aux figures correspondantes annexées :
o La figure 1 représente un schéma de principe du dispositif ECL commercialisé par la société
Roche Diagnostics,
o la figure 2 représente un schéma de principe du fonctionnement de 1 ' électrochimie bipolaire utilisée pour polariser une bille en solution, o La figure 3a est une image en lumière blanche d'une dispersion de particules de carbone de diamètre 30 ym au sein d'un capillaire, et o La figure 3b est une image de l'émission ECL par l'ensemble de ces particules lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention. o La figure 4 représente un schéma de principe du test mis en œuvre dans l'exemple 2 : en particulier, le schéma A) de la figure 2 illustre la liaison d'un anticorps marqué à l'antigène, tandis que le schéma B) de la figure 2 illustre la liaison d'un anticorps primaire non marqué à l'antigène, et d'un anticorps secondaire marqué à l'anticorps primaire .
Les figures 1 et 2 sont commentées dans la description de l'art antérieur.
EXEMPLES
Exemple 1
Nous avons réussi à provoquer l'émission ECL au niveau d'une dispersion de billes de carbone de diamètre 30 ym (comme illustré sur les figures 3a et 3b) , en utilisant le procédé de génération de lumière selon l'invention dans lequel :
- la distance entre les 2 électrodes de graphite est de 3 cm,
- le diamètre externe du capillaire est de 6 mm,
- le diamètre moyen des billes de carbone utilisées comme électrode bipolaire est de 30 ym,
- en plus des billes de carbone, la solution remplissant le capillaire est composée d'un tampon PBS 4 mM (pH = 7,4) contenant le complexe Ru (bpy) 32+ à une concentration de 2 mM et le coréactif TPrA à une concentration de 100 mM. Le photodétecteur complétant le réacteur
ECL est une caméra CCD. La tension appliquée est de 2500 V entre les 2 électrodes. Cette technologie ECL tridimensionnelle est applicable à la mesure de différents antigènes, par exemple, IL-8 ( interleukine 8), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) et PSA (prostate- specific antigen) .
Exemple 2 : Détection d' un complexe anticorps / antigène en solution.
Cet exemple démontre la faisabilité de 1 ' électrochimiluminescence en 3 dimensions en utilisant des particules électriquement conductrices non fonctionnalisées, et la formation d'un complexe en solution.
Selon l'antigène d'intérêt, deux stratégies peuvent être envisagées afin de trouver le meilleur compromis entre le coût, la facilité de séparation, et la sensibilité de la méthode. La première stratégie fait intervenir un unique anticorps, l'anticorps de détection, spécifique de l'antigène d'intérêt. Cet anticorps est biotinylé, ce qui permet son marquage avec le luminophore Ru (bpy) 32+ via l'interaction biotine-streptavidine, le Ru (bpy) 32+ étant lié à la streptavidine (Figure 4 A) . La seconde stratégie fait intervenir un anticorps primaire spécifique de l'antigène d'intérêt mais non marqué, et un anticorps secondaire marqué au ruthénium mais non spécifique de l'antigène d'intérêt (Figure 4 B) .
L'antigène utilisé pour la démonstration est la protéine recombinante GM-CSF. La seconde stratégie (figure 4 B) est choisie pour introduire une plus grande variation de taille entre les anticorps libres et le complexe, et donc faciliter la séparation .
Le complexe antigène // anticorps primaire // anticorps secondaire est formé en solution. Les anticorps primaire et secondaire et l'antigène, tous trois en solution dans du tampon phosphate 3 mM à pH = 7,4 contenant une fraction de détergent (1%), sont mélangés dans des proportions stœchiométriques à une concentration d' 1 μΜ et agités pendant 2 heures à température ambiante. On peut dans un premier temps envisager une gamme de concentration de l'antigène allant du μΜ au nM.
Un mélange de gel d'agarose, de solution de DBAE (2- (dibutylamino) éthanol) et de solution de complexe est ensuite réalisé dans des proportions volumiques respectives 50%, 25% et 25%. Le complexe et les anticorps non liés sont séparés par électrophorèse, qui tire profit de la différence de taille et donc de mobilité entre le complexe et les espèces libres.
Dans la cellule d' électrochimie bipolaire, outre le complexe antigène // anticorps primaire // anticorps secondaire libre dans la solution support, les différents éléments sont alors les suivants : le support est un mélange 50/50 v/v de gel d'agarose (4 %) et de tampon phosphate 3 mM à pH = 7,4. Les particules conductrices dispersées de façon homogène dans le support sont des billes de carbone de diamètre compris entre 20 et 30 ym dont la concentration finale est de 5 mg.mL-1, soit environ 300 000 billes. mL-1. Le co-réactif utilisé pour générer 1 ' électrochimiluminescence est le 2- dibuthylaminoéthanol (DBAE) présent à la concentration finale de 20 mM. Une différence de potentiel de 2,2 kV est appliquée entre les deux électrodes pendant une durée de 150 ms . L'émission lumineuse est détectée par un photomultiplicateur, et le résultat peut être exprimé comme l'évolution au cours du temps d'un courant proportionnel à l'intensité lumineuse. On observe l'apparition d'un créneau correspondant à la durée d'application du potentiel.
Liste des références
Immunodosage basé sur l'ECL : [1] Yang, H.; Leland, J. K.; Yost, D.; Massey, R. J. Nat . Biotechnol. 1994, 12, 193-194.
[2] Blackburn, G. F.; Shah, H. P.; Kenten, J. H.;
Leland, J.; Kamin, R. A.; Link, J.; Peterman, J.; Powell, M. J . ; Shah, A. ; Talley, D. B . ; Tyagi, S. K.; Wilkins, E.; Wu, T. -G.; Massey, R. J . Clin. Chem. 1991, 37, 1534- 1539.
[3] Miao, W. Chem. Rev. 2008, 108, 2506-2553.
[4] Miao, W.; Bard, A. J. Anal. Chem. 2004, 76, 7109-
7113.
[5] Deiss, F.; LaFratta, C. . ; Symer, M.; Blicharz, T. M.; Sojic, N.; Walt, D. R. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 6088-6089.
[6] Komori, K.; Takada, K.; Hatozaki, 0.; Oyama, N.
Langmuir 2007, 23, 6446-6452
Electrochimie bipolaire
[7] PCT/FR2011/053001 de Kuhn et al. Electrochimie bipolaire et ECL :
[8] Sentie M., Loget G., Manojlovic D., Kuhn A., Sojic N. Angew. Chem. Int. Ed., 51, 11284-11288, 2012
[9] Loget G., Zigah D., Bouffier L., Sojic N., Kuhn A. Acc. Chem. Res., 2013, 46, 2513-2523 [10] Bouffier L . , Zigah D . , Adam C, Sentie M., Fattah Z., Manojlovic D., Kuhn A., Sojic N. ChemElectroChem, 2014, 1, 95-98.
[11] F. Mavré, R . K. Anand, D. R . Laws, K.-F. Chow, B.-Y. Chang, J. A . Crooks, R . M . Crooks, Anal. Chem., 2010, 82, 8766-8774
[12] Kwok-Fan Chow, François Mavré and Richard M. Crooks. J. Am. Chem. Soc, 2008, 130, 7544-7545
[13] Kwok-Fan Chow, François Mavré, John A. Crooks,
Byoung-Yong Chang and Richard M. Crooks. J. Am. Chem. Soc, 2009, 131, 8364-8365

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de génération de lumière par électro- chimiluminescence comprenant les étapes suivantes :
- on introduit au moins une substance luminophore soluble dans un milieu solvant et un coréactif apte à s'oxyder au contact d'une électrode et à réagir avec ledit luminophore, dans un réacteur d'électro- chimiluminescence comprenant un système de photo- détection et deux électrodes et dont l'intérieur est rempli d'une solution électrolytique comprenant un milieu solvant, disposé entre les deux électrodes ;
- on applique une différence de potentiel Δυ entre les deux électrodes qui crée un champ électrique E, de manière à porter la ou les substance (s) luminophore ( s ) à un état excité par transfert d'électrons à l'une des électrodes et générer de la lumière ;
ledit procédé étant caractérisé en ce qu' il comporte en outre les étapes suivantes :
- on introduit dans ledit réacteur, des particules électriquement conductrices formant dans le milieu solvant une dispersion, de sorte que lesdites particules électriquement conductrices constituent chacune une électrode bipolaire grâce à leur polarisation générée par le champ électrique E ;
- le champ électrique E est compris entre 2 kV/m et 40 MV/m, pour polariser lesdites particules électriquement conductrices et provoquer à leur surface le transfert d'électrons permettant de porter à un état excité la ou les substance (s) luminophore ( s ) , qui sont en solution à proximité desdites électrodes bipolaires et générer ainsi de la lumière dans la solution électrolytique .
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les particules électriquement conductrices sont choisies parmi :
- les billes magnétiques,
- les billes métalliques, d'oxydes métalliques et les billes de semi-conducteurs,
- les microfils et les nanofils métalliques ou de semi-conducteurs,
les microtubes ou nanotubes métalliques ou de semi-conducteurs, et
- les feuillets métalliques ou de semi-conducteurs,
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les particules électriquement conductrices sont choisies parmi :
- les billes des éléments suivants : Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO (oxydes d'étain et d'antimoine), FTO (oxydes d'étain et de fluorine) , Cu, Fe, Ir, Ni, Pd,
les microfils ou les nanofils des éléments suivants : Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO, FTO, Cu, Fe, Ir, Ni, Pd, et
les microtubes ou les nanotubes des éléments suivants : Au, Pt, C, Ag, ITO, ATO, FTO, Cu, Fe, Ir, Ni, Pd,
- les feuillets de carbone.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la substance luminophore est choisie parmi :
• les complexes moléculaires comprenant les composés suivants : tris (2 , 2 ' -bipyridine) ruthénium, tris (2 , 2 ' -bipyridine) iridium, tris (2 , 2 ' -bipyridine) osmium, tris (1, 10-phenanthroline) ruthénium, tris (1, 10-phenanthroline) iridium, tris (2,2 '- bipyridine) osmium, 5-Amino-2 , 3-dihydro-l , 4- phthalazinedione, tris (2-phenylpyridine) iridium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine-biotine) ruthénium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine- biotine) iridium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2,2'- bipyridine-biotine) osmium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine-streptavidine) ruthénium, bis (2,2'- bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine- streptavidine) iridium, bis (2 , 2 ' -bipyridine) (2 , 2 ' -bipyridine- streptavidine) osmium, tris (2 , 2 ' -bipyridine) ruthénium - NHS ester, tris (2 , 2 ' -bipyridine) ruthénium - phosphoramadite, tris (2 , 2 ' -bipyrazine) ruthénium, et leurs dérivés et/ou mélanges,
• les particules de silice dopées avec lesdits complexes moléculaires, et
• des nanoparticules d'un matériau semi-conducteur choisi parmi le germanium Ge, le sulfure de cadmium
CdS, le sélénure de cadmium CdSe, le sulfure de plomb PbS, et les particules à structure cœur-écorce CdSe/ZnS .
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ladite substance luminophore est fixée sur un premier ligand spécifique d'une molécule à doser du milieu solvant, de manière à former un complexe.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le complexe formé par la substance luminophore sur laquelle est fixé ledit premier ligand spécifique est en solution à proximité des électrodes bipolaires.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel lesdites particules électriquement conductrices sont en contact avec un second ligand spécifique d'une molécule à doser du milieu solvant, ledit second ligand étant en solution à proximité des électrodes conductrices.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel le ligand est un anticorps et/ou la molécule à doser est choisie parmi le groupe constitué d'un antigène et d'une molécule ADN.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, dans lequel la substance luminophore est le complexe [Ru(bpy)3]2+ et son coréactif est la tri-n-propylamine (TPrA) .
10. Utilisation d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour 1 ' immunodosage d'une molécule présente dans le milieu solvant .
11. Utilisation d'un procédé selon la revendication 10, pour 1 ' immunodosage d'une molécule présente dans le milieu solvant, ledit procédé comprenant en outre les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant ladite molécule à doser avec : • des particules électriquement conductrices non fonctionnalisées ;
• un premier ligand spécifique de ladite molécule à doser, et
· un second ligand spécifique de ladite molécule marqué avec la substance luminophore (4),
pour la formation d'un complexe ;
- élimination de la substance luminophore libre ; - ajout du coréactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ;
application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de sorte à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ;
- mesure de la lumière générée.
12. Utilisation du procédé selon la revendication 11, dans laquelle le complexe est en solution à proximité des électrodes bipolaires.
13. Utilisation d'un procédé selon la revendication 10, pour 1 ' immunodosage d'une molécule présente dans le milieu solvant, ledit procédé comprenant en outre les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant une molécule à doser avec des particules électriquement conductrices et un ligand spécifique de ladite molécule marqué avec la substance luminophore, pour la formation d'un complexe ;
- élimination de la substance luminophore libre ; ajout du co-réactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ; application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de sorte à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ;
- mesure de la lumière générée.
14. Utilisation d'un procédé selon la revendication 10, pour 1 ' immunodosage d'une molécule présente dans le milieu solvant, ledit procédé comprenant en outre les étapes suivantes :
- mise en contact du milieu solvant contenant ladite molécule à doser avec :
• des particules électriquement conductrices non fonctionnalisées ;
• un premier ligand spécifique de ladite molécule à doser, et
• un second ligand marqué avec la substance luminophore (4) et spécifique du premier ligand,
pour la formation d'un complexe ;
- élimination du second ligand libre ;
ajout du coréactif réagissant avec ladite substance luminophore liée ;
application d'une différence de potentiel AU entre les deux électrodes de sorte à créer un champ électrique E compris entre 2 kV/m et 40 MV/m ;
- mesure de la lumière générée.
15. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, dans lequel l'étape d'élimination de la substance luminophore libre ou du second ligand libre est réalisée par application d'une différence de potentiel Δυ entre les deux électrodes créant un champ électrique compris entre 1 V/m et 5000 V/m.
16. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, où le ligand est un anticorps et/ou la molécule à doser est choisie parmi le groupe constitué d'un antigène et d'une molécule ADN.
17. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, où la substance luminophore est le complexe [Ru(bpy)3]2+ et son co-réactif est la tri- n-propylamine (TPrA) .
PCT/FR2015/050983 2014-04-11 2015-04-13 Procédé de génération de lumière par électro-chimiluminescence par une dispersion de particules électriquement conductrices dans un solvant WO2015155491A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1453274A FR3019897A1 (fr) 2014-04-11 2014-04-11 Procede de generation de lumiere par electro-chimiluminescence par une dispersion de particules electriquement conductrices dans un solvant
FR1453274 2014-04-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015155491A1 true WO2015155491A1 (fr) 2015-10-15

Family

ID=51483543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2015/050983 WO2015155491A1 (fr) 2014-04-11 2015-04-13 Procédé de génération de lumière par électro-chimiluminescence par une dispersion de particules électriquement conductrices dans un solvant

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3019897A1 (fr)
WO (1) WO2015155491A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110082412A (zh) * 2019-05-22 2019-08-02 苏州健雄职业技术学院 一种基于生物传感器的检测痕量银离子的方法
CN113588950A (zh) * 2021-06-21 2021-11-02 南京大学 一种单细胞内抗原的无线电化学可视化分析方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4280815A (en) * 1979-06-18 1981-07-28 Technicon Instruments Corporation Electrochemiluminescent immunoassay and apparatus therefor
WO1999063347A2 (fr) * 1998-06-03 1999-12-09 Mark Howard Jones Procedes, instruments et marqueurs relatifs a des essais electrochimiques
WO2000003233A1 (fr) * 1998-07-10 2000-01-20 Imperial College Of Science, Technology And Medicine Cellule electrochimiluminescente a electrodes de reaction hydrostatiques flottantes
WO2004113891A1 (fr) * 2003-06-13 2004-12-29 Applera Corporation Electrode electrochimioluminescente

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4280815A (en) * 1979-06-18 1981-07-28 Technicon Instruments Corporation Electrochemiluminescent immunoassay and apparatus therefor
WO1999063347A2 (fr) * 1998-06-03 1999-12-09 Mark Howard Jones Procedes, instruments et marqueurs relatifs a des essais electrochimiques
WO2000003233A1 (fr) * 1998-07-10 2000-01-20 Imperial College Of Science, Technology And Medicine Cellule electrochimiluminescente a electrodes de reaction hydrostatiques flottantes
WO2004113891A1 (fr) * 2003-06-13 2004-12-29 Applera Corporation Electrode electrochimioluminescente

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLACKBURN, G. F.; SHAH, H. P.; KENTEN, J. H.; LELAND, J.; KAMIN, R. A.; LINK, J.; PETERMAN, J.; POWELL, M. J.; SHAH, A.; TALLEY, D, CLIN. CHEM., vol. 37, 1991, pages 1534 - 1539
BOUFFIER L.; ZIGAH D.; ADAM C.; SENTIC M.; FATTAH Z.; MANOJLOVIC D.; KUHN A.; SOJIC N., CHEMELECTROCHEM, vol. 1, 2014, pages 95 - 98
DEISS, F.; LAFRATTA, C. N.; SYMER, M.; BLICHARZ, T. M.; SOJIC, N.; WALT, D. R., J. AM. CHEM. SOC., vol. 131, 2009, pages 6088 - 6089
F. MAVRÉ; R. K. ANAND; D. R. LAWS; K.-F. CHOW; B.-Y. CHANG; J. A. CROOKS; R. M. CROOKS, ANAL. CHEM., vol. 82, 2010, pages 8766 - 8774
KOMORI, K.; TAKADA, K.; HATOZAKI, 0.; OYAMA, N., LANGMUIR, vol. 23, 2007, pages 6446 - 6452
KWOK-FAN CHOW; FRANÇOIS MAVRÉ; JOHN A; CROOKS; BYOUNG-YONG CHANG; RICHARD M. CROOKS, J. AM. CHEM. SOC., vol. 131, 2009, pages 8364 - 8365
KWOK-FAN CHOW; FRANÇOIS MAVRÉ; RICHARD M. CROOKS, J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, 2008, pages 7544 - 7545
LOGET G.; ZIGAH D.; BOUFFIER L.; SOJIC N.; KUHN A., ACC. CHEM. RES., vol. 46, 2013, pages 2513 - 2523
MIAO, W, CHEM. REV., vol. 108, 2008, pages 2506 - 2553
MIAO, W.; BARD, A. J., ANAL. CHEM., vol. 76, 2004, pages 7109 - 7113
PETRA JUSKOVÁ ET AL: "Detection of electrochemiluminescence from floating metal platelets in suspension", LAB ON A CHIP, vol. 13, no. 5, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 781, XP055203910, ISSN: 1473-0197, DOI: 10.1039/c2lc41086a *
SENTIC M.; LOGET G.; MANOJLOVIC D.; KUHN A.; SOJIC N., ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 51, 2012, pages 11284 - 11288
YANG, H.; LELAND, J. K.; YOST, D.; MASSEY, R. J., NAT. BIOTECHNOL., vol. 12, 1994, pages 193 - 194
YANG, H.; LELAND, J. K.; YOST, D.; MASSEY, R. J., NAT. BIOTECHNOL., vol. 12, 1994, pages 193 - 194, XP000901615 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110082412A (zh) * 2019-05-22 2019-08-02 苏州健雄职业技术学院 一种基于生物传感器的检测痕量银离子的方法
CN113588950A (zh) * 2021-06-21 2021-11-02 南京大学 一种单细胞内抗原的无线电化学可视化分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR3019897A1 (fr) 2015-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hesari et al. Electrogenerated chemiluminescence: light years ahead
Sentic et al. 3D electrogenerated chemiluminescence: from surface-confined reactions to bulk emission
Ye et al. Dual-wavelength ratiometric electrochemiluminescence immunosensor for cardiac troponin I detection
Wei et al. Recent advances in aggregation‐induced electrochemiluminescence
Ye et al. Label-free photoelectrochemical “Off–On” platform coupled with G-wire-enhanced strategy for highly sensitive MicroRNA sensing in cancer cells
Cui et al. Serial silver clusters biomineralized by one peptide
Zhang et al. Spectrum-based electrochemiluminescent immunoassay with ternary CdZnSe nanocrystals as labels
Suk et al. Electrochemistry, electrogenerated chemiluminescence, and excimer formation dynamics of intramolecular π-stacked 9-naphthylanthracene derivatives and organic nanoparticles
Liu et al. Multiplex electrochemiluminescence DNA sensor for determination of hepatitis B virus and hepatitis C virus based on multicolor quantum dots and Au nanoparticles
Zhang et al. In situ activation of CdS electrochemiluminescence film and its application in H2S detection
Liu et al. A novel electrochemiluminescent immunosensor based on CdS-coated ZnO nanorod arrays for HepG2 cell detection
Dutta et al. Reactivity mapping of luminescence in space: Insights into heterogeneous electrochemiluminescence bioassays
Guo et al. Imaging analysis based on electrogenerated chemiluminescence
JP2012242394A (ja) 標的物質検出用キット及びこれを利用した標的物質検出方法
Wang et al. Quasi-photonic crystal light-scattering signal amplification of SiO2-nanomembrane for ultrasensitive electrochemiluminescence detection of cardiac troponin I
Bertoncello Nanomaterials for biosensing with electrochemiluminescence (ECL) detection
Liu et al. Electrochemiluminescent biosensor with DNA link for selective detection of human IgG based on steric hindrance
Li et al. A sensitive signal-off aptasensor for adenosine triphosphate based on the quenching of Ru (bpy) 32+-doped silica nanoparticles electrochemiluminescence by ferrocene
Mesgari et al. Enhanced electrochemiluminescence of Ru (bpy) 32+ by Sm2O3 nanoparticles decorated graphitic carbon nitride nano-sheets for pyridoxine analysis
Qiu et al. A positively charged QDs-based FRET probe for micrococcal nuclease detection
Barhoum et al. Electrochemiluminescence biosensors for detection of cancer biomarkers in biofluids: Principles, opportunities, and challenges
Monteiro et al. Highly sensitive photoelectrochemical immunosensor based on anatase/rutile TiO 2 and Bi 2 S 3 for the zero-biased detection of PSA
Salminen et al. Immunoassay of C-reactive protein by hot electron-induced electrochemiluminescence at polystyrene-carbon black composite electrodes
WO2015155491A1 (fr) Procédé de génération de lumière par électro-chimiluminescence par une dispersion de particules électriquement conductrices dans un solvant
Richter Electrochemiluminescence

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15725731

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15725731

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1