WO2015140077A1 - Traitement de la reponse inflammatoire et dysimmunitaire - Google Patents

Traitement de la reponse inflammatoire et dysimmunitaire Download PDF

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Bernard BONNOTTE
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Universite De Bourgogne
Chu De Dijon
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    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)

Definitions

  • the present invention relates to a medicament and more particularly to a medicament for inhibiting or reducing the immune and inflammatory response.
  • the present invention also relates to a medicament for the treatment of diseases for which the immune or inflammatory response is deleterious to the patient such as graft-versus-host disease, autoimmune diseases and auto-inflammatory diseases.
  • GvHD graft-versus-host disease
  • autoimmune and auto-inflammatory diseases are a complication of transplantation caused by transplantation of allogeneic hematopoietic cells.
  • immunosuppressants corticosteroids, chemotherapy
  • these immunosuppressive treatments expose the patient to possible infections and relapses of his hematopathy.
  • Treg regulatory T cells
  • MDSC myeloid derived suppressor cells
  • This cellular subtype is rare or absent in healthy individuals and found in case of pathology and especially in case of cancer. The injection of these cells has allowed the animal to promote the tolerance of transplants after transplantation, but the scarcity of these cells makes their use in the clinic difficult.
  • the present invention proposes the use of a new cellular subtype of suppressive myeloid cells generated from circulating cells isolated from patients' blood and usable for treating autoimmune and auto-inflammatory diseases and graft disease against the host.
  • the present invention also provides a method for preparing, ex vivo, this population of immunosuppressive cells.
  • the present invention relates in particular to a cell expressing CD33, CD11b, CD14, CD163, CD206, HLA-DR, CD44, CD31, CD105 and CCR5.
  • Applicants have been able to generate, ex vivo these cells, to characterize them by studying the expression of the molecules mentioned above. Applicants have also been able to show the usefulness of these cells in the context of the treatment of certain pathologies whose neutralization of the immune system of the patient to be treated is indicated.
  • the term "cell” refers to a natural or recombinant eukaryotic cell.
  • said cell is a human cell and even more preferably said cell is derived from a hematopoietic stem cell.
  • drift means that said cell is derived, directly or indirectly, from the division of a hematopoietic stem cell.
  • the various markers cited in the context of the present invention are well known to those skilled in the art. In a preferred manner, said markers designate any of the human isoforms of said markers.
  • the CD (for cluster of differentiation) nomenclature, used in this application, was proposed and established by the 1st International Working Group and Conference on Human Leukocyte Antigens, meeting in Paris in 1982. The nomenclature in This question is maintained by the HCDM and can be consulted on the association's website (www.hcdm.org).
  • the term “expresses” means that the cell according to the invention produces the proteins mentioned. More particularly, when said proteins are membrane proteins, the term “expresses” means that said protein is expressed at the cell membrane of said cell. When said protein is a soluble protein, the term “expresses” means that said protein is expressed to the extracellular domain.
  • the cell according to the invention expresses CD33, CD11b, CD14, CD163, CD206, HLA-DR, CD44, CD31, CD105 and CCR5. According to a preferred embodiment, the cell according to the invention does not express the following molecules: CDla, CD80, CD86, CD16, CD56, CD3, CD19, CD66b, CCR7 and PDL1.
  • the cell according to the invention expresses CCL2, and IL-6. According to a preferred embodiment, the cell according to the invention does not express the following IL-4, IL-5, IL-12p70, TNF-, IL- ⁇ , CCL20, IFN ⁇ , granzyme B, soluble FasL, TGF- ⁇ .
  • the present invention also relates to a cell according to the invention for use as a medicament.
  • the possible use as a medicament of the cell according to the invention has in particular been demonstrated in an experimental model of graft-versus-host disease and can be extended to all pathologies where a temporary neutralization of the immune system may be desired.
  • the present invention also relates to the use of the cell according to the invention for the treatment of graft-versus-host disease, auto-inflammatory diseases such as gigantocellular arteritis (Horton's disease), polyarthritis rheumatoid, autoimmune diseases and transplant rejection.
  • the present invention also relates to a composition comprising a cell according to the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • physiological saline PBS, glUCOSG 5% RPMI.
  • the present invention also relates to a cell according to the invention for inducing the increase of regulatory CD8 T lymphocytes.
  • the term “increase” refers to an increase in proliferation.
  • the present invention also relates to a cell according to the invention for inducing an inhibition of the proliferation of effector T lymphocytes.
  • composition according to the invention may further comprise any drugs necessary in the context of the treatment envisaged.
  • said composition comprises between 1 X 10 7 and 1 X 10 8 cells per injection and a number of injections of 1 to 20 injections depending on the tolerance and the response.
  • the cells according to the invention can be injected into the patient by any route known to those skilled in the art. Of these, the intravenous route is preferred.
  • the present invention also relates to a method for preparing a cell according to the invention comprising the steps of:
  • step (ii) may be omitted.
  • step (i) is carried out in the absence of any other chemokines, cytokines and human growth factors.
  • the monocytes are cultured in step (i) in the absence of IL-4.
  • the monocytes are cultured in step (i) in the absence of IL-1, IL-3, TNF, SCF, EPO and IFN-g.
  • the monocytes are cultured in step (i) in the absence of IFN ⁇ , IL-2 and a chemokine or a combination of chemokines chosen from CCL2, CCL3, CCL4, CCL8 and CXCL10.
  • the method according to the invention does not comprise additional steps.
  • the monocytes come preferentially from the peripheral blood of the patient to be treated, or from the blood of healthy allogeneic volunteers.
  • Monocytes can be obtained preferentially using 2 techniques, either after magnetic isolation of cells expressing CD14, or from CD34 + cells isolated from peripheral blood by magnetic sorting and then multiplied during a culture in the presence of "CD34 expansion medium” then differentiated into monocytes during culture in the presence of M-CSF.
  • the preparation method according to the invention is remarkable in that the step (ii) of isolating the cells expressing CD33 is carried out via a cell sorter.
  • the preparation method according to the invention is remarkable in that the step (ii) of isolating the cells expressing CD33 is carried out via magnetic beads.
  • Step (i) of culturing monocytes in the presence of IL-6 and GM-CSF can be carried out under the culture conditions usually used for this type of cells.
  • the cells are maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 in a suitable culture medium.
  • said culture medium is RPMI1640.
  • the preparation method according to the invention is remarkable in that the IL-6 present in the culture medium in step (i) is between 5 and 15 ng / ml and quite preferably between 8 and 12 ng / ml.
  • the preparation method according to the invention is remarkable in that the GM-CSF present in the culture medium in step (i) is between 5 and 15 ng / ml and quite preferably between 8 and 12 ng / ml.
  • the concentration of GM-CSF and IL-6 indicated is the initial concentration in the culture medium at the moment of its contact with the cells.
  • said culture medium is renewed regularly every 2 or 3 days.
  • the preparation process according to the invention is remarkable in that step (i) is carried out for a period of between 4 and 10 days and quite preferably of 7 days.
  • the preparation process according to the invention is remarkable in that step (i) is carried out at 37 ° C.
  • Mononuclear peripheral blood cells were isolated from healthy donors or from patients to be treated using 2 techniques.
  • the first technique consists in performing centrifugation of peripheral blood on a Ficoll gradient, recovering PBMCs (for peripheral blood mononuclear cells), and then isolating the monocytes by magnetic sorting using the anti- CD14 coupled to a magnetic ball.
  • the second is to isolate the peripheral blood cells expressing CD34 by magnetic sorting, then to grow these cells in the presence of medium promoting their multiplication (CD34 expansion medium), and differentiate by cultivating them in the presence of M-CSF.
  • the monocytes were then cultured at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml in RPMI1640, supplemented with 10% fetal calf serum, 10 ng / ml GM-CSF and 10 ng / ml IL-6 for 7 days. medium being renewed every 3 days.
  • the cells according to the invention were then purified, after labeling with a marker specific for CD33, via a cell sorter. - Cell proliferation test
  • T cells, CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 + T cells were labeled with the "Cell trace Violet cell proliferation kit” kit (Cell Trace, Carlsbad, CA).
  • the labeled cells are cultured in the presence of beads coated with anti CD3 / anti CD28 (Dynabeads, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) with or without the cells according to the invention.
  • the proliferation of T lymphocytes was detected by flow cytometry. - morphological analysis
  • the morphological analysis of the cells according to the invention was carried out after a Wright / Giemsa labeling.
  • the concentration of IFN- ⁇ , TNF-, IL-10, IL-6 and TGF- ⁇ was determined in the culture supernatant of the cells cultured by the ELISA technique. Animal model of graft disease against IFN- ⁇ , TNF-, IL-10, IL-6 and TGF- ⁇ was determined in the culture supernatant of the cells cultured by the ELISA technique. Animal model of graft disease against IFN- ⁇ , TNF-, IL-10, IL-6 and TGF- ⁇ was determined in the culture supernatant of the cells cultured by the ELISA technique. Animal model of graft disease against
  • NOD / SCID / IL2RYC - / - mice (Jackson Laboratory), aged 8 to 12 weeks, received intravenously peripheral blood mononuclear cells (20 ⁇ 10 6 cells per mouse) with or without cells according to the invention (5.10). cells per mouse). The mixing of the cells is done just before the injection. The detection of signs of graft-versus-host disease was performed every 3 days blind.
  • mice The organs removed from the treated mice were fixed in formaldehyde and embedded in paraffin. 5 ⁇ sections are made and stained with eosin and hematoxylin.
  • HuMoSC have the physical, phenotypic and functional characteristics as described below.
  • HuMoSC appear as a homogeneous population of large mononuclear cells with basophilic cytoplasm. Phenotype of the cells according to the invention
  • the cells according to the invention have a CD33 + CD11b + CD14 + CD163 + CD206 + HLA-DR + CD44 + CD31 + CD105 + CCR5 + phenotype, and weakly express CCR6.
  • the cells according to the invention do not express CD1, CD80, CD86, CD16, CD56, CD3, CD19 and CCR7. Effect of the cells according to the invention on the proliferation of T lymphocytes
  • Autologous stimulated T cells were co-cultured with the cells according to the invention with a ratio of 2 T lymphocytes / cells according to the invention. It has been found that the stimulated T lymphocytes co-cultured with the cells according to the invention proliferate less than the T cells cultured alone. Separate analysis of T lymphocytes showed that the proliferation of CD4 + T cells and CD8 + T cells was also inhibited by the cells according to the invention. Moreover, the antiproliferative effect of the cells according to the invention is also observed on autologous T cells and on allogeneic T cells. T cells co-cultured with the cells according to the invention do not express the CD25 + marker in contrast to T cells cultured alone.
  • the analysis of the culture supernatants of the different samples made it possible to demonstrate that the cells according to the invention block the production of pro-inflammatory cytokine (INF- ⁇ and TNF-) by the T lymphocytes.
  • the cells according to the invention is notable in that it blocks cell activation and cell proliferation of autologous and allogenic CD4 + and CD8 + T cells and their secretion of cytokines.
  • the suppressive effect of the cells according to the invention depends on STAT3
  • the suppressive effect of the cells according to the invention does not depend on direct contacts of cells to cells but of one or more soluble factors.
  • the pretreatment of the cells according to the invention with an inhibitor of the phosphorylated form of STAT3 leads to the loss of the suppressive effect, the decrease in the secretion of CCL2 and of IL-6 without interfering with the viability of the cells according to the invention .
  • the cells according to the invention protect against the appearance of graft disease against the host
  • mice that have received human peripheral blood cells develop clinical signs of graft-versus-host disease between 20 and 30 days after injection and die before the 50th day after injection.
  • mice that have co-injected human peripheral blood cells with the cells according to the invention show only weak signs of graft versus host disease and survive this injection.
  • the histological lesions of GvHD at the hepatic level are markedly diminished in the group which has received the cells according to the invention.
  • T-regulatory lymphocytes represent a population of suppressor cells capable of promoting the specific tolerance of alloantigens.
  • the mice which received the cells according to the invention have a larger amount of FoxP3-expressing CD8 + T cells compared to the control mice.
  • the same results were observed in vitro after co-culture of a total population of T lymphocytes with the cells according to the invention.

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Abstract

La présente invention concerne un médicament et plus particulièrement un médicament pour le traitement de la réponse inflammatoire et dysimmunitaire. La présente invention concerne également un médicament pour le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte. Ainsi la présente invention concerne notamment une cellule exprimant le CD33, le CD11b, le CD14, le CD163, le CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, le CCR5 et le CD105.

Description

TRAITEMENT DE LA REPONSE INFLAMMATOIRE ET DYS IMMUNITAIRE
Domaine technique
La présente invention concerne un médicament et plus particulièrement un médicament pour inhiber ou diminuer la réponse immunitaire et inflammatoire. La présente invention concerne également un médicament pour le traitement des maladies pour lesquelles la réponse immunitaire ou inflammatoire est délétère pour le patient comme la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies auto-immunes et les maladies auto-inflammatoires.
Technique antérieure
La régulation du système immunitaire et de l'inflammation est un des buts thérapeutiques à atteindre pour éviter la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) et traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. La GvHD est une complication de la greffe provoquée par la transplantation de cellules hématopoïétiques allogéniques . Actuellement, la stratégie principale pour lutter contre l'apparition de la GvHD ou pour traiter les maladies auto- immunes et auto-inflammatoires consiste à utiliser des immunosuppresseurs (corticoïdes, chimiothérapie) pour induire une immunosuppression générale chez le patient. Toutefois, ces traitements immunosuppresseurs exposent le patient à de possibles infections et à des rechutes de son hémopathie. De nouvelles stratégies sont actuellement à l'étude, notamment l'utilisation de cellules suppressives comme les lymphocytes T régulateurs (Treg) mais à ce jour l'efficacité de cette thérapie n'a pas été démontrée dans des essais cliniques de phase II/III. Un autre type cellulaire connu sous l'acronyme MDSC (pour "myeloid derived suppressor cells") intervient aussi pour réguler négativement le système immunitaire. Ce sous-type cellulaire est rare ou absent chez les individus en bonne santé et retrouvé en cas de pathologie et notamment en cas de cancer. L'injection de ces cellules a permis chez l'animal de promouvoir la tolérance des greffes après transplantation mais la rareté de ces cellules rend difficile leur utilisation en clinique. La présente invention, propose l'utilisation d'un nouveau sous-type cellulaire de cellules myéloïdes suppressives générées à partir des cellules circulantes isolées du sang des patients et utilisables pour traiter les maladies auto- immunes et auto-inflammatoires et la maladie du greffon contre l'hôte. La présente invention propose également un procédé de préparation, ex vivo, de cette population de cellules immunosuppressives .
Résumé de l'invention
Ainsi la présente invention, concerne notamment une cellule exprimant le CD33, le CDllb, le CD14, le CD163, le CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, le CD105 et le CCR5.
Les déposants ont pu générer, ex vivo ces cellules, les caractériser par l'étude de l'expression des molécules citées ci-dessus. Les déposants ont pu également montrer l'utilité de ces cellules dans le cadre du traitement de certaines pathologies dont la neutralisation du système immunitaire du patient à traiter est indiquée.
Dans le cadre de la présente invention, le terme «cellule» fait référence à une cellule eucaryote naturelle ou recombinante. Préférentiellement , ladite cellule est une cellule humaine et encore plus préférentiellement ladite cellule dérive d'une cellule souche hématopoïétique . Le terme «dérive» entend signifier que ladite cellule est issue, directement ou indirectement, de la division d'une cellule souche hématopoïétique . Les différents marqueurs cités dans le cadre de la présente invention sont bien connus de l'homme du métier. De manière préférée, lesdits marqueurs désignent l'un quelconque des isoformes humains desdits marqueurs. La nomenclature CD (pour cluster of differentiation) , notamment utilisée dans le cadre de cette demande, a été proposée et établie par le 1er groupe de travail et conférence internationale sur les antigènes des leucocytes humains, en réunion à Paris en 1982. La nomenclature en question est maintenue par le HCDM et notamment consultable sur le site de l'association (www . hcdm. org) .
Dans le cadre de la présente invention, le terme « exprime » entend indiquer que la cellule selon l'invention produit les protéines citées. Plus particulièrement, lorsque lesdites protéines sont des protéines membranaires , le terme « exprime » signifie que ladite protéine est exprimée à la membrane cellulaire de ladite cellule. Lorsque ladite protéine est une protéine soluble, le terme « exprime » entend signifier que ladite protéine est exprimée vers le domaine extracellulaire.
Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, la cellule selon l'invention exprime le CD33, le CDllb, le CD14, le CD163, le CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, CD105 et le CCR5. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule selon l'invention n'exprime pas les molécules suivantes le CDla, le CD80, le CD86, le CD16, le CD56, le CD3, le CD19, le CD66b, le CCR7et le PDL1.
Selon un mode de réalisation préféré, la cellule selon l'invention exprime le CCL2, et l'IL-6. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule selon l'invention ne n'exprime pas les suivantes l'IL-4, l'IL-5, l'IL-12p70, le TNF- , l'IL-Ιβ, le CCL20, l'IFNy, le granzyme B, le FasL soluble, le TGF-β.
La présente invention concerne également une cellule selon l'invention pour utilisation comme médicament. L'utilisation possible comme médicament de la cellule selon l'invention a été notamment démontrée dans un modèle expérimental de la maladie du greffon contre l'hôte et peut être étendue à toutes les pathologies où une neutralisation temporaire du système immunitaire peut être souhaitée. Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation de la cellule selon l'invention pour le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto-inflammatoires comme l'artérite giganto- cellulaire (Maladie de Horton) , la polyarthrite rhumatoïde, les maladies auto-immunes et le rejet de greffe. La présente invention concerne également une composition comprenant une cellule selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Parmi les vecteurs pharmaceutiquement acceptables on peut citer le sérum physiologique, le PBS, le glUCOSG 5% le RPMI.
La présente invention concerne également une cellule selon l'invention pour induire l'augmentation des lymphocytes T CD8 régulateurs.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « augmentation » fait référence à une augmentation de la prolifération.
La présente invention concerne également une cellule selon l'invention pour induire une inhibition de la prolifération des lymphocytes T effecteurs.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre toutes drogues nécessaires dans le cadre du traitement envisagé. Préférentiellement , ladite composition comprend entre 1 X 107 et 1 X 108 cellules par injection et un nombre d'injections de 1 à 20 injections en fonction de la tolérance et de la réponse.
Les cellules selon l'invention peuvent être injectées chez le patient par toutes les voies connues de l'homme du métier. Parmi celles-ci, la voie intraveineuse est préférée .
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention comprenant les étapes consistant à :
- (i) cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de
GM-CSF.
- (ii) isoler dans les cellules obtenues à l'issue de l'étape précédente, les cellules exprimant le CD33.
Selon un mode de réalisation alternatif de la présente invention, l'étape (ii) peut être omise.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'étape (i) est réalisé en l'absence de tout autre chemokines, cytokines et facteurs de croissance humain.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention les monocytes sont cultivés à l'étape (i) en l'absence d'IL-4.
Selon un autre mode de réalisation plus préféré de l'invention les monocytes sont cultivés à l'étape (i) en 1' absence d'IL-l, d'll-3, de TNF, de SCF, d'EPO et d'IFN-g.
Selon un autre mode de réalisation plus préféré de l'invention les monocytes sont cultivés à l'étape (i) en l'absence d' IFNy, d' IL-2 et d'une chemokine ou d'une combinaison de chemokines choisies parmi le CCL2, le CCL3, le CCL4, le CCL8 et le CXCL10.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé selon l'invention ne comprend pas d'étapes supplémentaires . Les monocytes proviennent préférentiellement du sang périphérique du patient à traiter, ou du sang de volontaires sains allogéniques .
Les monocytes peuvent être obtenus préférentiellement en utilisant 2 techniques, soit après isolation magnétique des cellules exprimant le CD14, soit à partir des cellules CD34+ isolées du sang périphérique par tri magnétique puis multipliées lors d'une culture en présence de « CD34 expansion médium » puis différentiées en monocytes lors d'une culture en présence de M-CSF.
(ii) après 7 jours de culture, isoler par tri magnétique à partir des cellules obtenues à l'issue de l'étape précédente, les cellules exprimant le CD33.
L'homme du métier connaît bien les techniques permettant d' isoler les cellules en fonction de leurs phénotypes. Lesdites techniques utilisent habituellement des anticorps, éventuellement marqués, spécifiques desdits phénotypes puis une technique permettant de séparer les cellules ayant fixé lesdits anticorps des autres cellules.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'étape (ii) consistant à isoler les cellules exprimant le CD33 est réalisée via un trieur de cellules.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'étape (ii) consistant à isoler les cellules exprimant le CD33 est réalisé via des billes magnétiques.
L'étape (i) consistant à cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de GM-CSF peut être mise en œuvre dans les conditions de culture habituellement utilisées pour ce type de cellules. Préférentiellement , les cellules sont maintenues à 37°C et 5% de CO2 dans un milieu de culture adéquat. Préférentiellement ledit milieu de culture est du RPMI1640. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'IL-6 présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15ng/ml et tout à fait préférentiellement entre 8 et 12ng/ml. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que le GM-CSF présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15ng/ml et tout à fait préférentiellement entre 8 et 12ng/ml. La concentration de GM-CSF et d'IL-6 indiquée est la concentration initiale dans le milieu de culture au moment de sa mise en contact avec les cellules. Avantageusement, ledit milieu de culture est renouvelé régulièrement tous les 2 ou 3 jours. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'étape (i) est effectuée pendant une période comprise entre 4 et 10 jours et tout à fait préférentiellement de 7 jours. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'étape (i) est effectuée à 37°C.
Description des modes de réalisation Matériel et méthodes
- Préparation des cellules selon l'invention
Les cellules mononucléaires du sang périphérique ont été isolées chez des donneurs sains ou chez les patients à traiter en utilisant 2 techniques. La première technique consiste à réaliser une centrifugation du sang périphérique sur gradient de Ficoll, récupérer les PBMC (pour cellules mononucléées du sang périphérique) , puis isoler les monocytes par tri magnétique en utilisant l'anticorps anti- CD14 couplé à une bille magnétique. La seconde consiste à isoler du sang périphérique les cellules exprimant le CD34 par tri magnétique, puis à cultiver ces cellules en présence de milieu favorisant leur multiplication (CD34 expansion médium) , puis à les différencier en les cultivant en présence de M-CSF.
Les monocytes ont été ensuite cultivés à une concentration de 5.106 cellules/ml dans du RPMI1640, supplémentés par 10% de Sérum de veau fœtal, 10ng/ml de GM- CSF et 10ng/ml d'IL-6 pendant 7 jours, le milieu étant renouvelé tous les 3 jours. Les cellules selon l'invention ont été ensuite purifiées, après marquage avec un marqueur spécifique du CD33, via un trieur de cellule. - Test de prolifération cellulaire
Des lymphocytes T, des lymphocytes T CD4+CD25- et des lymphocytes T CD4+CD25+ ont été marquées par le kit "Cell trace Violet cell prolifération kit" (Cell Trace, Carlsbad, CA) . Les cellules marquées sont cultivées en présence de billes recouvertes d' anti CD3/anti CD28 (Dynabeads, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) avec ou sans les cellules selon l'invention. La prolifération des lymphocytes T a été détectée par cytométrie en flux. - Analyse morphologique
L'analyse morphologique des cellules selon l'invention a été effectuée après un marquage Wright/Giemsa .
- Dosage des Cytokines
La concentration en IFN-γ, TNF- , IL-10, IL-6 et TGF- β a été déterminée dans le surnageant de culture des cellules cultivées par la technique ELISA. Modèle animal de la maladie du greffon contre
1' hôte
Des souris NOD/SCID/IL2RYC-/- (Jackson Laboratory) , âgées de 8 à 12 semaines, ont reçu en intraveineux des cellules mononucléées du sang périphérique (20.106 cellules par souris) avec ou sans cellules selon l'invention (5.106 cellules par souris) . Le mélange des cellules est fait juste avant l'injection. La détection des signes de maladie du greffon contre l'hôte a été réalisée tous les 3 jours en aveugle.
- Analyse histologique des lésions de la maladie du greffon contre l'hôte
Les organes prélevés sur les souris traitées ont été fixés dans du formaldéhyde et inclus dans de la paraffine. Des coupes de 5μη sont réalisées et colorées à l'éosine et à 1 ' hématoxyline .
Résultats
Les cellules ainsi obtenues appelées HuMoSC ont les caractéristiques physiques, phénotypiques et fonctionnelles comme décrit ci-dessous.
- Caractère physique des cellules selon l'invention Après coloration par le colorant Wright/Giemsa, les
HuMoSC apparaissent comme une population homogène de cellules mononucléées de grande taille à cytoplasme basophile . - Phénotype des cellules selon l'invention
Les cellules selon l'invention ont un phénotype CD33+CDllb+CD14+CD163+CD206+ HLA-DR+CD44+CD31+CD105+ CCR5+, et expriment faiblement le CCR6. Les cellules selon l'invention n'expriment pas le CDl , le CD80, le CD86, le CD16, le CD56, le CD3, le CD19 et le CCR7. - Effet des cellules selon l'invention sur la prolifération des lymphocytes T
Des lymphocytes T autologues stimulés ont été co- cultivés avec les cellules selon l'invention avec un ratio de 2 lymphocytes T/cellules selon l'invention. Il a été constaté que les lymphocytes T, stimulés co-cultivés avec les cellules selon l'invention, prolifèrent moins que les lymphocytes T cultivés seuls. Une analyse séparée des lymphocytes T a montré que la prolifération des lymphocytes T CD4+ et des lymphocytes T CD8+ était également inhibée par les cellules selon l'invention. Par ailleurs, l'effet antiprolifératif des cellules selon l'invention est également observé sur les Lymphocytes T autologues et sur les lymphocytes T allogéniques . Les lymphocytes T co- cultivés avec les cellules selon l'invention n'expriment pas le marqueur CD25+ contrairement aux lymphocytes T cultivés seuls. L'analyse des surnageants de culture des différents échantillons a permis de mettre en évidence que les cellules selon l'invention bloquent la production de cytokine pro-inflammatoire (INF-γ et TNF- ) par les lymphocytes T. Ainsi les cellules selon l'invention sont remarquables en ce sens qu'elles bloquent l'activation cellulaire et la prolifération cellulaire des lymphocytes T CD4+ et CD8+, autologues et allogéniques et leur sécrétion de cytokines.
- L'effet suppressif des cellules selon l'invention dépend de STAT3 L'effet suppressif des cellules selon l'invention ne dépend pas de contacts directs de cellules à cellules mais d'un ou plusieurs facteurs solubles. Le prétraitement des cellules selon l'invention par un inhibiteur de la forme phosphorylée de STAT3 entraine la perte de l'effet suppressif, la diminution de la sécrétion de CCL2 et d'IL-6 sans interférer avec la viabilité des cellules selon 1' invention .
Les cellules selon l'invention protègent de l'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte
Les souris ayant reçu des cellules du sang périphérique humain développent les signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte entre 20 et 30 jours après l'injection et meurent avant le 50ème jour après l'injection. Au contraire, les souris ayant reçu une co- injection de cellules du sang périphérique humain avec les cellules selon l'invention ne présentent que de faibles signes de la maladie du greffon contre l'hôte et survivent à cette injection. En particulier les lésions histologiques de GvHD au niveau hépatique sont nettement diminuées dans le groupe qui a reçu les cellules selon l'invention.
- Effet des cellules selon l'invention sur les lymphocytes T régulateurs.
Les lymphocytes T-régulateurs représentent une population de cellules suppressives capables de promouvoir la tolérance spécifique d' allo-antigènes . Les souris ayant reçus les cellules selon l'invention présentent une quantité plus importantes de lymphocytes T CD8+ exprimant FoxP3 comparativement aux souris contrôles. Les mêmes résultats ont été observés in vitro après co-culture d'une population totale de lymphocyte T avec les cellules selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Cellule caractérisée en ce qu'elle exprime le CD33, le CDllb, le CD14, le CD163, le CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, CD105, et le CCR5. 2 - Cellule selon la revendication précédente caractérisée en ce qu'elle n'exprime pas une ou plusieurs molécules choisies dans le groupe comprenant le CDla, le CD80, le CD86, le CD16, le CD56, le CD3, le CD19, le CCR7 et le PDL1.
3 - Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle exprime une ou plusieurs molécules choisies dans le groupe comprenant le CCL2 et l'IL-6.
4 - Cellule selon l'une des revendications précédentes pour utilisation comme médicament.
5 - Cellule selon l'une des revendications précédentes pour le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto-inflammatoires, de l'artérite giganto-cellulaire (Maladie de Horton) , de la polyarthrite rhumatoïde, des maladies auto-immunes et du rejet de greffe.
6 - Cellule selon l'une des revendications précédentes pour induire l'augmentation des lymphocytes T CD8 régulateurs. 7 - Cellule selon l'une des revendications précédentes pour induire une inhibition de la prolifération des lymphocytes T effecteurs. 8 - Composition comprenant une cellule selon l'une des revendications 1 à 7 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable .
9 - Procédé de préparation d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 7 comprenant l' étape consistant à :
- (i) cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de GM-CSF.
10 - Procédé de préparation d'une cellule selon la revendication 9 comprenant les étapes consistant à :
- (i) cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de GM-CSF.
- (ii) isoler dans les cellules obtenues à l'issue de l'étape précédente, les cellules exprimant CD33.
11 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 10 caractérisé en ce que les cellules dérivant d'au moins une cellule hématopoïétique sont des PBMC.
12 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 10 à 11 caractérisé en ce que l'étape consistant à isoler dans les cellules exprimant CD33 est un trieur de cellules.
13 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 10 à 11 caractérisé en ce que l'étape consistant à isoler dans les cellules exprimant le CD33 est réalisé via des billes magnétiques.
14 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 13 caractérisé en ce que l'IL-6 présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15 ng/ml .
15 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 14 caractérisé en ce que le GM-CSF présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15 ng/ml.
16 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 15 caractérisé en ce que l'étape (i) est effectuée pendant une période comprise entre 4 et 10 jours.
17 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 16 caractérisé en ce que l'étape (i) est effectuée à 37°C.
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