WO2015115926A1 - Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии - Google Patents

Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии Download PDF

Info

Publication number
WO2015115926A1
WO2015115926A1 PCT/RU2014/000074 RU2014000074W WO2015115926A1 WO 2015115926 A1 WO2015115926 A1 WO 2015115926A1 RU 2014000074 W RU2014000074 W RU 2014000074W WO 2015115926 A1 WO2015115926 A1 WO 2015115926A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibiotic
biological fluid
sample
sensitivity
gram
Prior art date
Application number
PCT/RU2014/000074
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Агзамджан Ахтамович НИЯЗМАТОВ
Алла Николаевна ЯКОВЛЕВА
Мария Алексеевна РЯБИКОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственная Фирма "Рохат" (Ооо Нпф "Рохат")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственная Фирма "Рохат" (Ооо Нпф "Рохат") filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственная Фирма "Рохат" (Ооо Нпф "Рохат")
Priority to PCT/RU2014/000074 priority Critical patent/WO2015115926A1/ru
Publication of WO2015115926A1 publication Critical patent/WO2015115926A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/50—Lipopolysaccharides; LPS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Definitions

  • the invention relates to medicine, namely for clinical and laboratory diagnostics, and may be applicable, for example, for an express analysis of the sensitivity of pathogenic microflora to prescribed antibacterial therapy for purulent-inflammatory diseases of various localization.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • endotoxin is an essential structural element of all gram-negative bacteria. Destruction of the bacterial cell of gram-negative bacteria leads to an increase in the content of endotoxin, which can be used for early determination of the sensitivity of bacterial microflora to the planned antibacterial therapy in vitro before it begins in the clinic.
  • the bactericidal effect of antibacterial drugs on a bacterial cell which is a violation of protein synthesis in the ribosomes and, as a result, destruction of the cytoplasmic membrane and cell wall, can lead to an increase in the level of LPS in the blood.
  • a kit for determining the presence of gram-negative bacteria in the biological material, the total LPS of gram-negative bacteria, as well as the total LPS for the genus and type of gram-negative bacteria producing endotoxins, containing a diagnosticum and consisting of
  • a container in which a diagnosticum containing a carrier sensitized by mono- or polyclonal antibodies is placed in particular, a subclass of IgG2a, IgG2b, IgG3, IgGl and IgG2a-k to different types of gram-negative bacteria,
  • Serratia in particular, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter.
  • a carrier in the form of polystyrene latex with mono- or polyclonal antibodies sensitized on it and the polystyrene latex carrier is represented by core-shell latex particles, where the core is polystyrene latex and the shell is styrene-zinc methacrylate latex with a mass ratio of units of about 1 : 0.8 - 1: 0.4
  • ⁇ -Endotox spp mono- or polyclonal antibodies of a subclass, in particular IgG2a and IgG2b or IgG3 and IgG2a or IgGl and IgG2a-k or IgGl and IgG2a, with which latex particles are sensitized.
  • the first aspect of the invention is a method for rapid analysis of in vitro sensitivity to gram-negative bacteria antibiotics in a patient, comprising the following steps:
  • Blood, urine, cerebrospinal fluid, bile, sputum, exudate and pus can be used as a biological fluid.
  • bile, sputum, exudate or pus can be cleaned if necessary by centrifugation (3 min at 1700g) and diluted, for example, with a sterile 0.9% NaCl solution in the ratio sample: NaC solution 1 1: 100.
  • any antibiotics to which gram-negative bacteria are susceptible can be used, in particular meropenem, imepene, dorupenem, gentamicin, amikacin, ampicillin / sulbactam, cefaperazone / sulbactam, ceftriaxone, cefepime, pefloxacin, ciproflexacin, levoflacacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, lemoflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, leflexacin, le
  • Another aspect of the invention is a method for monitoring in vitro the effectiveness of antibiotic therapy before and after the first administration of a selected antibiotic, said method comprising determining the level of total lipopolysaccharide.
  • the specified control is carried out according to the level of lipopolysaccharide in a sample of biological fluid taken directly from the infection site or from the supernatant of a pre-diluted sample of biological fluid selected from the group consisting of blood, urine, cerebrospinal fluid, bile, supernatant pre-diluted with sputum, exudate or pus.
  • a criterion for clinical effectiveness is an increase in the level of total lipopolysaccharide 2 times or more from the initial level in the test sample.
  • sample is urine
  • a reanalysis is performed 4 hours after the first administration of the antibiotic.
  • sample is sputum, cerebrospinal fluid, bile, exudate or pus
  • a second examination is carried out no earlier than 24 hours after the first administration of the antibacterial drug.
  • Another aspect of the invention is the use of the Endotox spp MAP diagnosticum in a method for rapid in vitro analysis of the sensitivity of gram-negative bacteria in a patient.
  • Another aspect of the invention is the use of the Endotox spp diagnostic MAP in an in vitro method for monitoring the effectiveness of antibiotic therapy before and after the first administration of a selected antibiotic.
  • the aim of the invention is to accelerate and simplify the method of determining the sensitivity of gram-negative infections to antibacterial drugs, and therefore increase the effectiveness of the control of antibiotic therapy in a patient.
  • the goal is achieved by determining the total endotoxin (LPS) in the test sample of biological fluid.
  • the MAH-Endotox spp diagnostic kit is used, using disposable perforated 6-well cardboard plates, including wells for positive (K +) and negative (K-) controls.
  • the result of the reaction was evaluated taking into account the degree of dilution of the test material (blood, cerebrospinal fluid, urine without dilution, pus, cavity contents, sputum diluted with sterile saline to 100 ml, followed by centrifugation for 3 minutes) during the test.
  • the sensitivity of the method was multiplied (7.5 pg / ml) by the number of wells in which the positive reaction of endotoxin and antibodies contained in the diagnostic kit was determined.
  • the invention is as follows. At the first stage, 1 ml of the test material is taken (pus, cavity contents, sputum), diluted with sterile saline to 100 ml, followed by centrifugation for about 3 minutes. In the case of blood, cerebrospinal fluid and urine tests, dilution with saline is not carried out, since the number of bacteria in them during sepsis, meningoencephalitis and urinary tract infection is much lower than in other infectious foci.
  • Total endotoxin is determined gram-negative bacteria using the MAH-Endotox spp activated particles method in blood, cerebrospinal fluid, urine or in the supernatant (in the case of pus, cavity contents, sputum) after centrifugation.
  • test material blood, cerebrospinal fluid, urine, bile
  • the supernatant obtained after centrifugation diluted in a ratio of 1: 100 exudate, sputum, pus
  • Re-determination of the total endotoxin of gram-negative bacteria in the test material is carried out 30 minutes after adding the antibiotic to the test material.
  • the criterion of the sensitivity of microflora in the test material to in vitro antibacterial drugs is considered to be an increase in the level of LPS by 2 times or more from the initial level.
  • the choice of an antibacterial drug for use in a clinic in a particular patient is made taking into account the maximum increase in LPS from the initial values in the test material.
  • contraindications to the prescription of the drug associated with individual intolerance or an allergic history are taken into account.
  • the antibacterial drug is administered taking into account the most pronounced cross-sensitivity to one type of antibacterial drug or a combination of several antibacterial drugs is formed taking into account the activity of the pathological process, as well as contraindications to the appointment of the drug, individual non-transfer property or allergic history.
  • a method of monitoring the effectiveness of inhaled antibacterial therapy of nosocomial pneumonia caused by gram-negative flora is especially effective.
  • the effectiveness of the antibiotic therapy used is determined based on the growth of lipopolysaccharidemia in arterial blood 1 hour after the antibiotic is inhaled (it is concluded that it is advisable to carry out inhaled antibiotic therapy).
  • an increase in arterial lipopolysaccharidemia is noted in the absence of its increase in venous blood.
  • Example 1 Patient 3. 29 years. Diagnosis: condition after urgent delivery, acute appendicitis, diffuse fecal peritonitis, subphrenic abscess, bilateral pleuropneumonia, septic shock, multiple organ failure. Operation: hemicolectomy, debridement and drainage of the abdominal cavity. Puncture of a subphrenic abscess.
  • the patient received a combination of antibacterial drugs corresponding to the de-escalation tactics of managing patients with sepsis complicated by septic shock, and consisting of cefepime, moxifloxacin and metrogil.
  • antibacterial drugs corresponding to the de-escalation tactics of managing patients with sepsis complicated by septic shock, and consisting of cefepime, moxifloxacin and metrogil.
  • cefepime cefepime, moxifloxacin and metrogil.
  • the peritoneal exudate is diluted with sterile saline in a ratio of 1: 100 and centrifuged.
  • Example 2 Patient B., 31 years old. Diagnosis: Acute myeloid leukemia, first attack. Severe nosocomial pneumonia complicated by acute respiratory failure.
  • Cefepime was replaced by a combination of thienes and amikacin. A rapid regression of symptoms of a systemic inflammatory reaction (hyperthermia, leukocytosis), a gradual regression of clinical and laboratory manifestations of pneumonia and acute respiratory failure were noted. After 5 days, inoculation of lavage fluid (Pseudomonas aeruginosae) was obtained with high sensitivity to selected antibiotics and moderate sensitivity to previous therapy with cefepime and other cephalosporins. The patient's condition gradually stabilized. 8 months after pneumonia, he underwent a bone marrow transplant with a good result.
  • lavage fluid Pseudomonas aeruginosae
  • Example 3 Patient G., 10 years old. Diagnosis: hypertrophic obstructive cardiomyopathy, relative mitral valve insufficiency 3 degrees. Operation: myectomy of the interventricular septum from the right ventricle with plastic of the excretory section of the right ventricle with a xenopericardial patch, removal of fibrous tissue from the excretory section of the left ventricle under cardiopulmonary bypass (IR), hypothermia, pharmacological cold cardioplegia. IR time - 174 minutes, aortic clamping time - 73 minutes.
  • IR cardiopulmonary bypass
  • the patient was extubated on the 4th day, later transferred to the ward, however, the postoperative period was complicated by bleeding into the pericardial cavity and the development of acute cardiac tamponade.
  • the patient was re-taken to the operating room, a retoracotomy was performed with stopping the bleeding.
  • the patient's condition was complicated by the onset of multiple organ failure syndrome (SPON) (acute cardiac, respiratory, renal failure).
  • SPON multiple organ failure syndrome
  • Conducted complex syndromic therapy including hemodiafiltration sessions against the background of acute renal failure, anuria.
  • the patient was on antibiotic therapy with ciprofloxacin.
  • the level of endotoxemia did not change when ciprofloxacin and meropenem were added to the blood. This determined a change in the antibacterial drug. 12 hours after the change of antibacterial therapy to cefepime and polymyxin, a regression of fever, a gradual normalization of leukocyte counts and sepsis markers were noted. In the future, there was a positive dynamics in the patient's condition, regression of SPON. The level of endotoxin determined by the MACH test decreased after 3 days to 120 pg / ml, procalcitonin to 3 ng / ml. Subsequently, the values of the studied indicators did not exceed the level of due values. 3 days after changing the antibiotic, positive bacterial cultures were obtained: in sputum, the growth of Klebsiella pneumoniae
  • venous catheter culture showed the presence of Acinetobacter baumann 10.
  • the isolated microflora was highly sensitive to selected antibiotics and low to meropenem and ciprofloxacin.
  • the patient was extubated, transferred from the intensive care unit to the ward, where he received a long course of rehabilitation and rehabilitation treatment. Discharged from the hospital on the 71st day after the operation.
  • Example 4 Patient C., 48 years old. Diagnosis: obstructive pyelonephritis of a single kidney, condition after nephrostomy. Retroperitoneal phlegmon. Peritonitis. Pneumonia. Sepsis. Septic shock. Hemorrhagic shock. Multiple organ failure. The patient was transferred from the district hospital. Operation: Opening and drainage of retroperitoneal phlegmon. Suturing erosion of the inferior vena cava. Sanitation and drainage of the abdominal cavity. After transferring the patient to the intensive care unit and intensive care unit, a study was made of the sensitivity of the bacterial flora of blood, sputum, urine and effusion from the abdominal cavity to antibacterial drugs.
  • the results of bacterial culture showed a low sensitivity of microorganisms (Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter alpha) to amikacin and doripenem used earlier in the district hospital. Positive dynamics after a change in antibacterial drugs, relief of septic shock and systemic inflammatory reaction. In a subsequent patient, the selection of antibacterial drugs was performed twice using the developed method for determining antibiotic sensitivity. Relief of multiple organ failure through respiratory, inotropic and renal replacement therapy. At 53 days the patient was discharged to continue treatment at the place of residence.
  • Example 5 Patient F., 84 g. Diagnosis: Bilateral purulent sinusitis, purulent meningoencephalitis. Operation: bilateral sinusotomy. Pus was taken from the maxillary sinuses for sowing and antibiotic sensitivity. After transferring the patient to the intensive care unit and intensive care unit, a lumbar puncture was performed, cerebrospinal fluid was taken for inoculation, and antibiotic sensitivity testing was performed.
  • Levofloxacin therapy started.
  • the measurements of the level of lipopolysaccharide in the test material during repeated lumbar puncture and washing of the maxillary sinus performed at the third stage of the study showed a high increase in the endotoxin content relative to the initial values due to the bactericidal action of the selected antibiotic.
  • the obtained bacterial culture data obtained on the fifth day after the operation showed the presence of Enterobacter in high titer and high sensitivity only to fluoroquinolones.
  • Example 6 Patient U. December 2012 contacted an advisory clinic. Diagnosis: exacerbation of chronic pyelonephritis. Sick for 8 years, exacerbation of the disease about 2 times a year. Notes an increase in the timing of exacerbations and their frequency in the last 2 years. In 2011, during an exacerbation of pyelonephritis, a nephrostomy was applied. At the same time as urine culture urine was tested according to the method for determining antibiotic sensitivity.
  • Amoxiclav therapy started.
  • the measurements of the level of lipopolysaccharide in the urine carried out at the third stage of the study during repeated analysis showed an increase in the endotoxin content relative to the initial values due to the bactericidal action of the selected antibiotic.
  • the obtained bacterial culture data obtained on the fifth day after the start of therapy showed low sensitivity to fluoroquinolones.
  • Example 7 Patient I. In March 2013, he turned to an advisory clinic. Diagnosis: Acute purulent tracheobronchitis. Sick for 5 days. During the examination, the therapist carried out sputum sampling on the sensitivity of microflora to the antibiotics being studied. High sensitivity to ciprofloxacin was obtained — the level of endotoxin in sputum increased by 8 times. After the end of the doctor's appointment, after 30 minutes, the patient began the recommended antibiotic oral chemotherapy with ciprofloxacin determined using the antibiotic sensitivity test. A good clinical effect was obtained. On the next day, when coughing up sputum, the concentration of endotoxin was 4 times higher compared to the day of the first consultation. 10 days after the start of therapy, the patient was discharged from outpatient treatment.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, микробиологии, лабораторной диагностике и обеспечивает точность и простоту экспресс-определения in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и эффективности последних у пациента с помощью диагностикума «ΜΑΡ-Endotox spp.». Экспресс-анализ чувствительности бактерий включает стадии: а) отбор образца биологической жидкости (БЖ), б) определение минимальной концентрации (МК) общего эндотоксина (ЛПС) методом активированных частиц (MAP) путем внесения в лунку планшета 100 мкл (1%) буферного раствора, 100 мкл БЖ и 20 мкл диагностикума, титрование методом двукратного разведения, в) инкубацию смеси 5 мин при 37°С, г) добавление к 100 мкл БЖ 100 мкл тестируемого антибиотика или антибиотиков в количестве 1/5000 от его/их разовой расчетной дозы на 1 мл БЖ и 20 мкл диагностикума, инкубацию 30 мин смеси, полученной на стадии в), сравнение результатов реакций на стадиях б) и в), определение чувствительности к антибиотику исходя из 2-3 кратного увеличения ЛПС в смеси по сравнению с МК на стадии б). Контроль эффективности антибактериальной терапии до и после первого назначения антибиотика включает определение уровня ЛПС в образце БЖ непосредственно из очага инфекции, в крови, моче, ликворе, желчи, или в супернатанте разведенного образца БЖ - мокроты, экссудата, гноя. При повышении ЛПС в 2 раза и более от исходного уровня терапию считают эффективной.

Description

СПОСОБ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА IN VITRO ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно касается клинико- лабораторной диагностики, и может быть применимо, например, для экспресс-анализа чувствительности патогенной микрофлоры к назначаемой антибактериальной терапии при гнойно-воспалительных заболеваниях различной локализации.
Уровень техники
В настоящее время стартовая антибактериальная терапия является эмпирической, учитывающей локализацию поражения, характер вероятных возбудителей заболевания, а также ретроспективный анализ микробной флоры и ее чувствительности к антибиотикам для каждого конкретного лечебного учреждения или отделения. Определение возбудителя и изучение его чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам являются важнейшим этапом лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, так как именно использование соответствующих антибиотиков является при прочих равных условиях залогом окончательного излечения больного. До сих пор оценка эффективности антибактериальной терапии основана на клинических признаках (температура тела, лейкоцитоз, соматический статус пациента, динамика раневого процесса), доступных анализу и оценке не ранее чем через 48-72 часа от момента начала антибактериальной терапии (1).
К сожалению возможности бактериологической службы, не всегда позволяют получить эти сведения в короткое время. Это особо актуально в связи с применением эмпирического подхода к назначению стартовой и последующей антибактериальной терапии в условиях широкого распространения антибиотикорезистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (дискодиффузионный метод и метод серийных разведений), были разработаны в середине 60-х - начале 70-х годов и с тех пор не претерпели существенных изменений (2,3,4,5). Среди методов ускоренного определения возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний наибольшее распространение получили усовершенствованная прямая бактериоскопия, серологические реакции, газовая хроматография, полимеразная цепная реакция. Однако эти методы ранней идентификации возбудителя с определением его чувствительности к антибиотикам имеют ряд ограничений, в частности, относительно высокую стоимость анализаторов и используемых материалов/реагентов. Кроме того, в клинической практике инфекция чаще протекает с участием ассоциации различных видов микробов, поэтому этиологически достоверно указать все виды микроорганизмов на этапе экспресс- диагностики и определить экспресс-анализ их антибиотикочувствительности часто затруднительно .
Липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий . является главным патогенетическим фактором при развитии грамотрицательной инфекции, а также при развитии синдрома эндогенной интоксикации. ЛПС (эндотоксин) является обязательным структурным элементом всех грамотрицательных бактерий. Разрушение бактериальной клетки грамотрицательных бактерий приводит к повышению содержания эндотоксина, что можно использовать для раннего определения чувствительности бактериальной микрофлоры к планируемой антибактериальной терапии in vitro до ее начала в клинике. Бактерицидное действие антибактериальных препаратов на бактериальную клетку, заключающееся в нарушении синтеза белка в рибосомах и, как следствие, разрушении цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, может приводить к повышению уровня ЛПС в крови.
Из WO 2009/048350 А1 известен набор для определения наличия в биологическом материале грамотрицательных бактерий, общего LPS грамотрицательных бактерий, а также общего LPS для рода и вида грамотрицательных бактерий, продуцирующих эндотоксины, содержащий диагностикум и состоящий из
а) емкости, в которую помещен диагностикум, содержащий носитель, сенсибилизированный моно- или поликлональными антителами, в частности, подкласса IgG2a и IgG2b, для определения наличия LPS общего для всех грамотрицательных бактерий;
б) емкости, в которую помещен диагностикум, содержащий носитель, сенсибилизированный моно- или поликлональными антителами подкласса IgG3 и IgG2a для определения LPS, общего для рода бактерии, в частности, для рода Serratia;
в) емкости, в которую помещен диагностикум, содержащий носитель, сенсибилизированный моно- или поликлональными антителами подкласса IgGl и IgG2a-k для определения LPS, общего для рода ,бактерии, в частности, для рода Klebsiella; г) емкости, в которую помещен диагностикум, содержащий носитель, сенсибилизированный моно- или поликлональными антителами подкласса IgGl и IgG2a для определения LPS, общего для рода бактерии, в частности, рода Pseudomonas;
д) емкости, в которую помещен диагностикум, содержащий носитель, сенсибилизированный моно- или поликлональными антителами подкласса IgGl и IgG2a для определения LPS, общего рода бактерии, в частности, рода Enterobacter;
е) емкости, в которую помещен диагностикум, содержащий носитель, сенсибилизированный моно- или поликлональными антителами, в частности, подкласса IgG2a, IgG2b, IgG3, IgGl и IgG2a-k к разным видам грамотрицательных бактерий,
, в частности, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter.
ж) упаковки и инструкции к применению.
Там же описан и способ получения диагностикума для определения наличия в биологическом материале грамотрицательных бактерий, общего LPS грамотрицательных бактерий, а также общего LPS для рода и вида грамотрицательных бактерий, продуцирующих эндотоксины, имеющий чувствительность 4 пг/мл и состоящий из
а) носителя в виде полистирольного латекса с сенсибилизированными на нем моно- или поликлональными антителами, причем полистирольный латексный носитель представлен латексными частицами типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев около 1 :0,8 - 1 :0,4
б) моно- или поликлональных антител подкласса, в частности, IgG2a и IgG2b или IgG3 и IgG2a или IgGl и IgG2a-k или IgGl и IgG2a, которыми сенсибилизированы латексные частицы. («ΜΑΡ-Endotox spp»)
Эти набор и диагностикум предлагаются для нового использования.
Сущность изобретения
Первым аспектом изобретения является способ экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам грамотрицательных бактерий у пациента, включающий следующие этапы:
а) отбор образца биологической жидкости, содержащей грамотрицательные бактерии;
б) определение минимальной концентрации общего эндотоксина (общего LPS) методом активированных частиц путем внесения в лунку планшета 100 мкл (1%) буферного раствора, 100 мкл биологической жидкости и 20 мкл диагностикума МАЧ - Endotox spp., с последующим титрованием методом двукратного разведения и инкубацией полученной смеси при 37°С в течение 5 мин;
г) добавление к 100 мкл образца биологической жидкости 100 мкл тестируемого (ых) антибиотика (ов) в количестве 1/5000 частей от его/их разовой расчетной дозы на 1 мл образца биологической жидкости и 20 мкл диагностикума МАЧ -Endotox spp. и инкубацию смеси, полученной на стадии в) в течение 30 минут,
д) сравнение результатов реакций на стадиях б) и в) с последующим определением чувствительности бактерий к антибиотику исходя из максимального (2-3 кратного) увеличения уровня липополисахаридов в исследуемой смеси по сравнению с минимальной концентрацией общего эндотоксина, определенной на стадии б).
В качестве биологической жидкости могут быть использованы кровь, моча, ликвор, желчь, мокрота, экссудат и гной. Причем желчь, мокрота, экссудат или гной перед исследованием могут быть при необходимости очищены центрифугированием (3 мин при 1700g) и разведены, например, стерильным 0,9% раствором NaCl в соотношении образец: раствор NaC 1 1 : 100.
В качестве антибиотиков могут быть использованы любые антибиотики, к которым чувствительны грамотрицательные бактерии, в частности меропенем, имепенем, дорипенем, гентамицин, амикацин, ампициллин/сульбактам, цефаперазон/сульбактам, цефтриаксон, цефепим, пефлоксацин, ципрофлаксацин, моксифлоксацин, офлоксацин, левофлаксацин, полимиксин В, амоксициллин/клавунат, линкомицин, цефуроксим, рифампицин, тобрамицин и другие антибактериальные препараты, обладающие бактерицидным действием на грамотрицательные бактерии.
Другим аспектом изобретения является способ контроля in vitro эффективности антибактериальной терапии до и после первого назначения выбранного антибиотика, причем указанный способ включает определение уровня общего липополисахарида. Указанный контроль осуществляют по уровню липополисахарида в изъятом непосредственного из очага инфекции образце биологической жидкости или из супернатанта предварительно разведенного образца биологической жидкости, выбранного из группы, состоящей из образцов крови, мочи, ликвора, желчи, супернатанта предварительно разведенных мокротой, эксудата или гноя. Критерием клинической эффективности является повышение уровня общего липополисахарида в 2 раза и более от исходного уровня в исследуемом образце.
В этом способе, если образцом является кровь, экспресс-анализ на содержание липополисахаридов проводят через 1 час после внутреннего введения антибактериального препарата.
Если образцом является моча, повторный анализ проводится через 4 часа после первого введения антибиотика.
Если образцом является мокрота, ликвор, желчь, экксудат или гной повторное исследование проводится не ранее 24 часов после первого введения антибактериального препарата.
Другим аспектом изобретения является применение диагностикума MAP Endotox spp в способе экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий у пациента.
Еще одним аспектом изобретения является применение диагностикума MAP Endotox spp в способе контроля in vitro эффективности антибактериальной терапии до и после первого назначения выбранного антибиотика.
Целью изобретения является ускорение и упрощение способа определения чувствительности грамотрицательной инфекции к антибактериальным препаратам, а следовательно и повышение эффективности контроля антибактериальной терапии у больного.
Цель достигается путем определения общего эндотоксина (ЛПС) в исследуемом образце биологической жидкости. Для определения содержания общего эндотоксина используется диагностический набор «МАЧ-Endotox spp», с использованием одноразовых перфорированных 6-луночных картонных планшеток, включая лунки для положительных (К+) и отрицательных (К-) контролей. (6). Результат реакции оценивался с учетом степени разведения исследуемого материала (кровь, ликвор, моча без разведения, гной, содержимое полостей, мокрота разводятся стерильным физиологическим раствором до 100 мл с последующим центрифугированием в течение 3 минут) при проведении теста. Проводилось умножение чувствительности метода (7,5 пг/мл) на количество лунок в которых определена положительная реакция эндотоксина и антител, содержащихся в диагностическом наборе.
Изобретение осуществляется следующим образом. На первом этапе проводят забор 1 мл исследуемого материала (гной, содержимое полостей, мокрота), разводят его стерильным физиологическим раствором до 100 мл с последующим центрифугированием, примерно, 3 минут. В случае исследования крови, ликвора и мочи разведение физиологическим раствором не проводится, так как количество бактерий в них при сепсисе, менингоэнцефалитах и инфекции мочевыводящих путей значительно ниже, чем в других инфекционных очагах. Определяют общий эндотоксин (ЛПС) грамотрицательных бактерий методом активированных частиц «МАЧ-Endotox spp» в крови, ликворе, моче или в надосадочной жидкости (в случае исследования гноя, содержимого полостей, мокроты) после центрифугирования.
Затем в 1 мл исследуемого материала (кровь, ликвор, моча, желчь) или надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования разведенного в соотношении 1 : 100 экссудата, мокроты, гноя, добавляют 1/5000 доли от разовой дозы антибактериальных препаратов, планируемых к применению у данного больного. Повторное определение общего эндотоксина грамотрицательных бактерий в исследуемом материале проводят через 30 минут после добавления антибиотика в исследуемый материал.
Критерием чувствительности микрофлоры в исследуемом материале к антибактериальным препаратам in vitro считают повышение уровня ЛПС в 2 раза и более от исходного уровня. Выбор антибактериального препарата для применения в клинике у конкретного больного делается с учетом максимального повышения ЛПС от исходных величин в исследуемом материале. Дополнительно учитываются противопоказания к назначению препарата, связанные с индивидуальной непереносимостью или аллергологическим анамнезом. При исследовании нескольких видов биологического материала или одного вида биологического материала, взятого из разных очагов инфекции (например, экссудат из брюшной и грудной полостей), назначение антибактериального препарата проводится с учетом максимально выраженной перекрестной чувствительности к одному виду антибактериального препарата или формируется комбинация из нескольких антибактериальных препаратов с учетом активности патологического процесса, а также противопоказаний к назначению препарата, индивидуальной непереносимости или аллергологического анамнеза.
При контроле за эффективностью перименяемой терапии антибиотиками осуществляют повторный забор биологического материала после введения антибиотика, в котором повторно определяют уровень липополисахарида методом "МАЧ-Endotox spp". При исследовании крови исследование проводится через 1 час после внутривенного введения антибактериального препарата. Антибиотикотерапия сепсиса считается эффективной при росте липополисахаридемии в 2 раза и более. При исследовании мокроты повторное исследование проводится не ранее 24 часов после первого введения антибактериального препарата. Столь длительный срок между этапами исследования обусловлен как технической сложностью повторного проведения бронхоальвеолярного лаважа во время бронхоскопии, так и замедленным клиренсом мокроты по трахеобронхиальному дереву в условиях искусственной вентиляции легких. При исследовании экссудата или гноя клиническая эффективность определяется также через 24 часа после первого введения антибактериального препарата, что связано с его замедленным проникновением в очаг инфекции в условиях выраженного интерстициального отека в очаге и в перифокальной области. При исследовании мочи повторный анализ проводится через 4 часа после первого введения антибиотика или уросептика. При острой и хронической почечной недостаточности определение эффективности назначенной антибактериальной терапии затруднено из-за нарушений процессов фильтрации. При исследовании желчи повторный анализ проводится через 24 часа в связи с затруднениями процессов желчеобразования и желчевыделения в условиях инфекции желчевыводящих путей и холангита. При исследовании ликвора повторный анализ проводится также через 24 часа в связи с нарушением ликвородинамики и проницаемости гематоэнцефалического барьера при бактериальных менингоэнцефалитах. Полученные результаты сравнивали с результатами антибиотикочувствительности микрофлоры, полученных стандартным дискодиффузионным методом через несколько суток после начала терапии.
Особенно эффективен способ контроля за эффективностью ингаляционной антибактериальной терапии нозокомиальной пневмонии, вызванной грамотрицательной флорой. В ближайшем аналоге (7), эффективность применяемой терапии антибиотиками определяют на основании роста липополисахаридемии в артериальной крови через 1 час после ингаляции антибиотика (делается вывод о целесообразности проведения ингаляционной антибиотикотерапии). В этом аналоге после ингаляции антибиотика отмечается рост артериальной липополисахаридемии при отсутствии ее повышения в венозной крови.
Примеры клинических испытаний
Пример 1. Больная 3. 29 лет. Диагноз: состояние после срочных родов, острый аппендицит, разлитой каловый перитонит, поддиафрагмальный абсцесс, двусторонняя плевропневмония, септический шок, полиорганная недостаточность. Операция: гемиколэктомия, санация и дренирование брюшной полости. Пункция поддиафрагмального абсцесса.
Больная получала в течение суток после операции комбинацию антибактериальных препаратов, соответствующую деэскалационной тактике ведения больных с сепсисом, осложненным септическим шоком, и состоящую из цефепима, моксифлоксацина и метрогила. Проведено исследование чувствительности микрофлоры перитонеального экссудата, мокроты и крови к планируемой антибактериальной терапии. Перитонеальный экссудат разведен стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 100 и отцентрифугирован. После добавления к полученной после центрифугирования надосадочной жидкости антибактериальных препаратов повышение уровня липополисахарида с исходных 240 пг/мл до 7680 пг/мл получено при добавлении меропенема и амикацина. В мокроте рост содержания липополисахарида в надосадочной жидкости после добавления антибиотика увеличилось с исходных 240 пг/мл до 7680 пг/мл при добавлении in vitro меропенема и до 3840 пкг/мл при добавлении амикацина. В крови при добавлении этих антибактериальных препаратов содержание эндотоксина увеличилось с 480 пкг/мл до 15360 пг/мл и 7680 пг/мл соответственно (таблица 1).
Таблица 1
Динамика липополисахарида у больной 3. при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии сепсиса
Figure imgf000011_0001
С учетом высокой перекрестной чувствительности микрофлоры, содержащейся в различных очагах инфекции, проведена смена антибактериальной деэскалационной терапии на меропенем и амикацин. В таблице 1 и последующих таблицах выбранные для терапии антибактериальные препараты выделены жирным шрифтом. Повторное исследования липополисахарида после применения новой схемы антибактериальной терапии определило его рост через 1 час в крови-до 1920 пг/мл, в мокроте и экссудате через 24 часа-до 7680 пг/мл и 30720 пг/мл соответственно. Это расценено как положительный бактерицидный эффект применяемых антибиотиков. Через 5 суток после операции из лаборатории получен положительный посев содержимого брюшной полости и крови (Enterobacter agglomerans) с высокой чувствительностью только к карбапенемам и амикацину из группы аминогликозидов. Чувствительность микрофлоры к цефалоспоринам и большинству фторхинолонов отсутствовала. Назначенная антибактериальная терапия была успешной, сепсис по клинико- лабораторным данным был купирован к 3-м суткам после начала интенсивной терапии.
На 12-е сутки после санации брюшной полости у больной отмечено повышение температуры тела до 39,5°С, озноб. Компьютерная томография органов грудной клетки и брюшной полости выявили двустороннюю нижнедолевую плевропневмонию и наличие поддиафрагмального абсцесса. Лабораторные критерии сепсиса были отрицательными. Под контролем УЗИ проведена пункция и дренирование абсцесса, удалено 45 мл сливкообразного гноя, полость абсцесса промыта 50 мл антисептика. Проведено исследование уровня ЛПС в мокроте и гное после их разведения физиологическим раствором и центрифугирования. После добавления к надосадочной жидкости растворов антибиотиков выявлена потеря чувствительности микроорганизмов к бактерицидному действию применяемых антибиотиков (меропенема и амикацина) и наивысшее повышение липополисахарида при добавлении фторхинолонов к надосадочной жидкости, полученной при разведении мокроты и гноя стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 100 с последующим центрифугированием. Наивысшее бактерицидное действие зарегистрировано при добавлении левофлоксацина к надосадочной жидкости in vitro (с 960 пкг/мл до 15360 пкг/мл в содержимом плевральной полости и со 960 до 7680 пкг/мл в мокроте). Учитывая выявленную перекрестную чувствительность к левофлоксацину, начата антибактериальная терапия выбранным препаратом. Через 24 часа в мокроте и экссудате, выделяемом через дренаж в области поддиафрагмального абсцесса, уровень липополисахарида вырос до 7680 пг/мл и 3840 пк/мл соответственно. Результаты исследования представлены в таблице 2. Таблица 2
Динамика липополисахарида у больной 3. при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии плевропневмонии и поддиафрагмального абсцесса
Figure imgf000013_0001
Отмечено быстрое купирование системной воспалительной реакции после смены антибактериальной химиотерапии. Через 4 суток из баклаборатории получен посев мокроты (Enterobacter cloacae и Klebsiella pneumoniae) и гноя из поддиафрагмального абсцесса (Enterobacter cloacae и Enterobacter agglomerans). Микрофлора имела высокую чувствительность к назначенному левофлоксацину.
Проведенное через 8 суток повторное рентгенологическое и ультразвуковое инструментальное исследование выявило регресс пневмонии и отсутствие других инфекционных очагов в брюшной полости. Больная переведена в хирургическое отделение, в последующем выписана в удовлетворительном состоянии.
Пример 2. Больной Б., 31 год. Диагноз: Острый миелобластный лейкоз, первая атака. Тяжелая нозокомиальная пневмония осложненная острой дыхательной недостаточностью.
В связи с тяжелой пневмонией больной получал в течение 2 суток антибактериальную терапию цефепимом и метрогилом. При проведении санационной бронхоскопии было проведено исследование лаважной бронхоальвеолярной жидкости. 1 мл лаважной жидкости был разведен 100 мл физиологического раствора, отцентрифугирован. Исходно в надосадочной жидкости содержание эндотоксина составило 240 пкг/мл. Выявлено максимальное увеличение ЛПС в надосадочной жидкости при добавлении в нее меропенема, тиенама, амикацина, пефлоксацина, офлоксацина и левофлоксацина (таблица 3).
Таблица 3
Динамика липополисахарида у больного Б. при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии пневмонии
Figure imgf000015_0001
Проведена замена цефепима на комбинацию тиенам и амикацин. Отмечен быстрый регресс симптомов системной воспалительной реакции (гипертермия, лейкоцитоз), постепенный регресс клинико-лабораторных проявлений пневмонии и острой дыхательной недостаточности. Через 5 суток получен посев лаважной жидкости (Pseudomonas aeruginosae) с высокой чувствительностью к выбранным антибиотикам и умеренной чувствительностью к проводимой ранее терапии цефепимом и другим цефалоспоринам. Состояние пациента постепенно стабилизировалось. Через 8 месяцев после пневмонии, ему была проведена трансплантация костного мозга с хорошим результатом.
Пример 3. Больной Г., 10 лет. Диагноз: гипертрофическая обструктивная кардиомиопатия, относительная недостаточность митрального клапана 3 степени. Операция: миэктомия межжелудочковой перегородки из правого желудочка с пластикой выводного отдела правого желудочка ксеноперикардиальной заплатой, удаление фиброзной ткани из выводного отдела левого желудочка в условиях искусственного кровообращения (ИК), гипотермии, фармакохолодовой кардиоплегии. Время ИК - 174 мин, время пережатия аорты - 73 мин. После операции больной экстубирован на 4-е сутки, в последующем переведен в палату, однако послеоперационный период осложнился кровотечением в полость перикарда и развитием острой тампонады сердца. На 7-е сутки после операции пациент повторно взят в операционную, выполнена реторакотомия с остановкой кровотечения. В ближайший послеоперационный период состояние больного осложнилось присоединением синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) (острая сердечная, дыхательная, почечная недостаточность). Проводилась комплексная посиндромная терапия, включая сеансы гемодиафильтрации на фоне ОПН, анурии. В это время больной находился на антибактериальной терапии ципрофлоксацином. На 7-е сутки после повторной операции отмечено присоединение инфекционного процесса, синдрома системного воспалительного ответа. В клиническом анализе крови нарастание лейкоцитоза до 22-24x109, со сдвигом влево (юных форм 6- 10%), лимфопенией (9-10%). Отмечалось нарастание уровня прокальцитонина (РСТ) до 100 нг/мл, а через 5 суток до 293 нг/мл. Проведена смена антибактериального препарата на меропенем, без значительного эффекта в течение 24 часов.
Проведено исследование микрофлоры крови разработанным способом. Уровень эндотоксина методом МАЧ составил 960 пг/мл. При добавлении в кровь антибиотиков наибольшее увеличение содержания эндотоксина получено при использовании цефепима и полимиксина (до 7680 пкг/мл) (таблица 4). Таблица 4
Динамика липополисахарида у больного Г,, при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии сепсиса
Figure imgf000017_0001
Уровень эндотоксемии не изменялся при добавлении в кровь ципрофлоксацина и меропенема. Это определило смену антибактериального препарата. Через 12 часов после смены антибактериальной терапии на цефепим и полимиксин отмечен регресс лихорадки, постепенная нормализация лейкоцитарных показателей и маркеров сепсиса. В дальнейшем отмечалась положительная динамика в состоянии больного, регресс СПОН. Уровень эндотоксина, определяемого МАЧ-тестом, снизился через 3 суток до 120 пг/мл, прокальцитонин до 3 нг/мл. В последующем значения исследуемых показателей не превышали уровень должных величин. Через 3 суток после смены антибиотика получены положительные бактериальные посевы: в мокроте рост Klebsiella pneumoniae в
· * 3 титре 10 , посев венозного катетера показал наличие Acinetobacter baumann 10 . Выделенная микрофлора имела высокую чувствительность к выбранным антибиотикам и низкую к меропенему и ципрофлоксацину. На 22-е сутки после операции пациент экстубирован, переведен из отделения интенсивной терапии в палату, где получал длительный курс реабилитации и восстановительного лечения. Выписан из стационара на 71-е сутки после операции.
Пример 4. Больной В., 48 лет. Диагноз: обструктивный пиелонефрит единственной почки, состояние после нефростомии. Забрюшинная флегмона. Перитонит. Пневмония. Сепсис. Септический шок. Геморрагический шок. Полиорганная недостаточность. Больной переведен из районной больницы. Операция: Вскрытие и дренирование забрюшинной флегмоны. Ушивание эрозии нижней полой вены. Санация и дренирование брюшной полости. После перевода больного в отделение реанимации и интенсивной терапии проведено исследование чувствительности бактериальной флоры крови, мокроты, мочи и выпота из брюшной полости к антибактериальным препаратам.
Результаты исследования представлены в таблице 5. Определен максимальный рост эндотоксина в изучаемых средах при добавлении к ним цефоперазона/сульбактама и ципрофлоксацина (в крови в 8 и 16 раз соответственно, в моче - в 4 раза, в надосад очной жидкости после разведения 1 :100 мокроты в 8 и 16 раз соответственно, экссудата брюшной полости - в 8 раз).
Проведена смена антибактериальных препаратов на цефоперазон/сульбактам и ципрофлоксацин. Проведенные на третьем этапе исследования замеры уровня липополисахарида в исследуемом материале показали высокий рост содержания эндотоксина относительно исходных значений вследствие бактерицидного действия новой схемы антибиотикотерапии. Таблица 5
Динамика липополисахарида у больного В. при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии уросепсиса и пневмонии
Figure imgf000019_0001
Полученные результаты бактериальных посевов показали низкую чувствительность микрорганизмов (Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter alpha) к применяемым ранее в районной больнице амикацину и дорипенему. Положительная динамика после смены антибактериальных препаратов, купирование септического шока и системной воспалительной реакции. В последующем пациенту дважды проводился подбор антибактериальных препаратов с помощью разработанного способа определения антибиотикочувствительности. Купирование полиорганной недостаточности посредством респираторной, инотропной и заместительной почечной терапии. На 53 сутки больной выписан для продолжения лечения по месту жительства.
Пример 5. Больной Ф., 84 г. Диагноз: Двусторонний гнойный гайморит, гнойный менингоэнцефалит. Операция: Двусторонняя гайморотомия. Проведен забор гноя из гайморовых пазух на посев и антибиотикочувствительность. После перевода больного в отделение реанимации и интенсивной терапии проведена люмбальная пункция, взятие ликвора на посев и исследование на антибиотикочувствительность.
Результаты исследования представлены в таблице 6. Определен максимальный рост эндотоксина в гное и в ликворе при добавлении к нему фторхинолонов (от 4 до 8 раз). При этом определилась низкая чувствительность к планируемым для назначения карбапенемам и цефалоспоринам III и IV поколений.
Таблица 6
Динамика липополисахарида у больного Ф. при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии уросепсиса и пневмонии
Figure imgf000021_0001
Начата терапия левофлоксацином. Проведенные на третьем этапе исследования замеры уровня липополисахарида в исследуемом материале при повторной люмбальной пункции и промывании гайморовой пазухи показали высокий рост содержания эндотоксина относительно исходных значений вследствие бактерицидного действия выбранного антибиотика. Полученные данные бактериальных посевов, полученные на пятые сутки после операции показали наличие Enterobacter в высоком титре и высокой чувствительностью только к фторхинолонам.
Пример 6. Больная У. декабре 2012 года обратилась в консультативную поликлинику. Диагноз: обострение хронического пиелонефрита. Больна в течение 8 лет, обострения заболевания примерно 2 раза в год. Отмечает увеличение сроков обострений и их частоту в последние 2 года. В 2011 году - во время обострения пиелонефрита наложена нефростома. Одновременно с посевом мочи проведено исследование мочи по методике определения антибиотикочувствительности.
Результаты исследования представлены в таблице 7. Определен максимальный рост эндотоксина в моче при добавлении к ней амоксицилина/клавуната и цефалоспоринов (от 4 до 8 раз). При этом определилась низкая чувствительность к планируемым для назначения фторхинолонам.
Начата терапия амоксиклавом. Проведенные на третьем этапе исследования замеры уровня липополисахарида в моче при повторном анализе показали рост содержания эндотоксина относительно исходных значений вследствие бактерицидного действия выбранного антибиотика. Полученные данные бактериальных посевов, полученные на пятые сутки после начала терапии показали низкую чувствительность к фторхинолонам.
Таблица 7
Динамика липополисахарида у больной У. при исследовании антибиотикочувствительности и эффективности применяемой антибиотикотерапии пиелонефрита
Figure imgf000023_0001
Явления обострения хронического пиелонефрита купированы в течение 7 дней адекватной пероральной антибиотикотерапии.
Пример 7. Больной И. В марте 2013 года обратился в консультативную поликлинику. Диагноз: Острый гнойный трахеобронхит. Болен в течение 5 дней. Во время осмотра терапевтом проведен забор мокроты на чувствительность микрофлоры к исследуемым антибиотикам. Получена высокая чувствительность к ципрофлоксацину— уровень эндотоксина в мокроте увеличился в 8 раз. После окончания врачебного приема через 30 минут больной начал рекомендованную, определенную с помощью теста на антибиотикочувствительность антибактериальную пероральную химиотерапию ципрофлоксацином. Получен хороший клинический эффект. На следующие сутки при откашливании мокрота имела в 4 раза больше концентрация эндотоксина по сравнению с днем первой консультации. Через 10 суток после начала терапии больной выписан с амбулаторного лечения.
Источники информации:
1. Стратегия и тактика применения антимикробных средств в лечебных учреждениях России. Российские национальные рекомендации / под ред. B.C. Савельева, Б.Р. Гельфанда, СВ. Яковлева. - М: ООО «Компания БОРГЕС», 2012 г., - 92 с. Процитирована с.51
2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
Методические указания МУК 4.2.1890-04). Утверждены и введены в действие Главным государственным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 04.03.2004. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2004, т.6, JV° 4, с. 306-359
3. Стратегия и тактика применения антимикробных средств в лечебных учреждениях России. Российские национальные рекомендации / под ред. B.C. Савельева, Б.Р. Гельфанда, СВ. Яковлева. - М.: ООО «Компания БОРГЕС», 2012 г., - 92 с. Процитирована с.75-81
4. CLSI. Performance Standarts for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standart - Tenth Edition M02-A10. - Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standarts Institute; 2009
5. CLSI: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically Approved Standart - Eighth Edition M07-A8. - Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standarts Institute; 2009
Diagnosticum for determining the presence of total endotoxin (lipopolysaccharide-LPS) of gram-negative bacteria producing endotoxin, method for producing said diagnosticum and seUnternational application PCT WO 2009/048350 Al, 16.04.2009, paragraph: [0013] and [0024]
Яковлев А.Ю., Зайцев P.M., Гущина Н.Н. Способ определения эффективности ингаляционной антибактериальной терапии нозокомиальной пневмонии, вызванной грамотрицательной флорой. Патент RU 2456614, опубликован 20.07.2012, бюл. 20.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам грамотрицательных бактерий у пациента, включающий следующие этапы:
а) отбор образца биологической жидкости, содержащей грамотрицательные бактерии;
б) определение минимальной концентрации общего эндотоксина (общего LPS) методом активированных частиц путем внесения в лунку планшета 100 мкл (1%) буферного раствора, 100 мкл биологической жидкости и 20 мкл диагностикума МАЧ - Endotox spp., с последующим титрованием методом двукратного разведения и
инкубацией полученной смеси при 37°С в течение 5 мин;
г) добавление к 100 мкл образца биологической жидкости 100 мкл тестируемого (ых) антибиотика (ов) в количестве 1/5000 частей от его/их разовой расчетной дозы на 1 мл образца биологической жидкости и 20 мкл диагностикума МАЧ -Endotox spp. и инкубацию смеси, полученной на стадии в) в течение 30 минут
д) сравнение результатов реакций на стадиях б) и в) с последующим
определением чувствительности бактерий к антибиотику исходя из максимального (2-3 кратного) увеличения уровня липополисахарида в исследуемой смеси по сравнению с минимальной концентрации общего эндотоксина, определенной на стадии б).
2. Способ по п.1, в котором биологическая жидкость выбрана из группы, состоящей из крови, мочи, ликвора и желчь, мокроты, экссудата и гноя.
3. Способ по п.2, в котором, желчь мокрота, экссудат или гной перед исследованием подвергают подвергаются разведению.
4. Способ по п.З, в котором, образец разводят стерильным 0,9% раствором NaCl в соотношении образец: раствор NaCl 1 :100.
5. Способ по любому из п.п. 3 или 4, в котором центрифугирование проводят в течение 3 минут при 1700 g.
6 .Способ по любому из п.п. 1-5, где антибиотик выбирают из группы состоящей из меропенема, имепенема, дорипенема, гентамицина, амикацина, ампициллин/сульбактама, цефаперазон/сульбактама, цефтриаксона, цефепима, амоксиклава, пефлоксацина, ципрофлаксацина, моксифлоксацина, офлоксацина, левофлаксацина, полимиксина В, амоксициллина/клавуната, линкомицина, цефуроксима, рифампицина, тобрамицина и других антибактериальных препаратов, обладающих бактерицидным действием на грам отрицательные бактерии.
7. Способ контроля in vitro эффективности антибактериальной терапии до и после первого назначения выбранного антибиотика, включающий определение уровня липополисахарида? причем указанный контроль осуществляют по уровню липополисахарида изъятом непосредственного из очага инфекции образце биологической жидкости или из супернатанта предварительно разведенного образца биологической жидкости, выбранного из группы, состоящей из образцов крови, мочи, ликвора, желчи, супернатанта, предварительно разведенных мокротой, эксудата или гноя), и причем критерием клинической эффективности является повышение уровня липополисахарида в 2 раза и более от исходного уровня в исследуемом образце.
9. Способ по п. 8, в котором, если образцом является кровь, экспресс-анализ на содержание липополисахаридов проводят через 1 час после внутреннего введения антибактериального препарата.
10. Способ по п.8, в котором, если образцом является моча, повторный анализ проводится через 4 часа после первого введения антибиотика.
11. Способ по п.8, в котором, если образцом является мокрота, ликвор, желчь, экксудат или гной повторное исследование проводится не ранее 24 часов после первого введения антибактериального препарата.
12. Применение диагностикума MAP Endotox spp в способе экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий у пациента.
13. Применение диагностикума MAP Endotox spp в способе контроля in vitro эффективности антибактериальной терапии до и после первого назначения выбранного антибиотика.
PCT/RU2014/000074 2014-01-31 2014-01-31 Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии WO2015115926A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2014/000074 WO2015115926A1 (ru) 2014-01-31 2014-01-31 Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2014/000074 WO2015115926A1 (ru) 2014-01-31 2014-01-31 Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015115926A1 true WO2015115926A1 (ru) 2015-08-06

Family

ID=53757397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2014/000074 WO2015115926A1 (ru) 2014-01-31 2014-01-31 Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2015115926A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107684570A (zh) * 2017-09-07 2018-02-13 张万军 一种用于治疗阑尾炎的药物配方
CN111077307A (zh) * 2018-10-21 2020-04-28 厦门鲎试剂生物科技股份有限公司 一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法
RU2735983C1 (ru) * 2020-03-27 2020-11-11 Яковлев Алексей Юрьевич Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам бактерий и грибов у пациента

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009048350A1 (fr) * 2007-10-12 2009-04-16 Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchny Tsentr Serdechno-Sosudistoi Khirurgii Im. A.N. Bakuleva Rossiiskoi Academii Meditsinskikh Nauk Agent de diagnostic pour déterminer la présence d'une endotoxine générale (lipolysaccharide lps) de bactéries gram négatif et du genre et type de bactéries gram négatif produisant des endotoxines, procédé de fabrication de cet agent de diagnostic et kit correspondant
RU2456614C1 (ru) * 2011-02-07 2012-07-20 Алексей Юрьевич Яковлев Способ оценки эффективности ингаляционной антибактериальной терапии нозокомиальной пневмонии, вызванной грамотрицательной флорой

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009048350A1 (fr) * 2007-10-12 2009-04-16 Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchny Tsentr Serdechno-Sosudistoi Khirurgii Im. A.N. Bakuleva Rossiiskoi Academii Meditsinskikh Nauk Agent de diagnostic pour déterminer la présence d'une endotoxine générale (lipolysaccharide lps) de bactéries gram négatif et du genre et type de bactéries gram négatif produisant des endotoxines, procédé de fabrication de cet agent de diagnostic et kit correspondant
RU2456614C1 (ru) * 2011-02-07 2012-07-20 Алексей Юрьевич Яковлев Способ оценки эффективности ингаляционной антибактериальной терапии нозокомиальной пневмонии, вызванной грамотрицательной флорой

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LABINSKAYA A. S.: "Mikrobiologiya s tekhnikoi mikrobiologicheskikh issledovany. Tretie izdanie, pererabotannoe i dopolnennoe", M. ''MEDITSINA, vol. 84, 1972 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107684570A (zh) * 2017-09-07 2018-02-13 张万军 一种用于治疗阑尾炎的药物配方
CN111077307A (zh) * 2018-10-21 2020-04-28 厦门鲎试剂生物科技股份有限公司 一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法
CN111077307B (zh) * 2018-10-21 2022-08-23 厦门鲎试剂生物科技股份有限公司 一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法
RU2735983C1 (ru) * 2020-03-27 2020-11-11 Яковлев Алексей Юрьевич Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам бактерий и грибов у пациента
WO2021194391A1 (ru) * 2020-03-27 2021-09-30 Алексей Юрьевич ЯКОВЛЕВ Способ анализа in vitro антибиотикочувствительности бактерий и грибов

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jolley et al. Pyelonephritis in pregnancy: an update on treatment options for optimal outcomes
Ward et al. Acidosis of synovial fluid correlates with synovial fluid leukocytosis
Skedros et al. Subperiosteal orbital abscess in children: diagnosis, microbiology, and management
Lo et al. Yokenella regensburgei in an immunocompromised host: a case report and review of the literature
WO2015115926A1 (ru) Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам и его применение для контроля эффективности антибактериальной терапии
Straub et al. Evaluation of advanced platelet-rich fibrin (PRF) as a bio-carrier for ampicillin/sulbactam
Satvaldieva et al. Pediatric surgical sepsis: diagnostics and intensive therapy
Satake et al. Three cases of PR3-ANCA positive subacute endocarditis caused by attenuated bacteria (Propionibacterium, Gemella, and Bartonella) complicated with kidney injury
Kobilov et al. Current treatment of acute bacterial destructive pneumonia in children
Peña-López et al. Infection in ECMO patients: changes in epidemiology, diagnosis and prevention
Grupper et al. Septic arthritis due to Staphylococcus lugdunensis in a native joint
Erdogan et al. Brucella melitensis infection in total knee arthroplasty: a case report
Risbaevich et al. Estimated of effectiveness of using of enterosorbtion in complex treatment of acute intestinal obstruction
Potier et al. Antimicrobial susceptibility of bacterial isolates from ambulatory practice and from a referral hospital
RU2319150C1 (ru) Способ диагностики инфицированного панкреонекроза
Jayarajah et al. Burkholderia pseudomallei peri-prosthetic infection following medial malleolar internal fixation: a case report
Ostaszewska et al. Reoperation in early kidney post-transplant period as a strong risk factor of surgical site infection occurrence
Sohrabi et al. A challenging case of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae-related pyogenic liver abscess with capsular polysaccharide hyperproduction: a case report
Audard et al. Fatal septic shock caused by Corynebacterium D2
RU2664681C1 (ru) Способ лечения инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи, вызванной возбудителем или возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью
Doughty et al. Treatment of hospital-acquired infections with amikacin
Tian et al. Management of life-threatening staphylococcal septic shock in a breastfeeding woman with breast abscess: a case report
Bandy et al. Spontaneous bacterial peritonitis
Davis et al. Brain abscess
RU2705385C1 (ru) Способ диагностики стрептококковой абдоминальной хирургической инфекции

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14880717

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10201600001311

Country of ref document: CH

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14880717

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1