WO2015108246A1 - 루테리알 및 그 분리·배양 방법 - Google Patents

루테리알 및 그 분리·배양 방법 Download PDF

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권영아
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최원철
권영아
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Definitions

  • Figure 19 is a photograph that can observe the difference between the ruterial and exosomes, the distinction between the membrane of 20 ⁇ 120nm size is not clear and the inner color is relatively light exosome and the distinction of the distinction of the membrane of 50 ⁇ 800nm or inside Is ruterial.
  • FIG. 21 is an electron microscope (TEM) image of the ruterial library constructed in one embodiment of the present invention.
  • TEM electron microscope
  • Figure 23 is a photograph showing the shape and size changes according to the culture of ruterial.
  • Luterial is present in blood, saliva, lymphatic vessels, semen and vaginal fluids, breast milk (especially colostrum), cord blood, brain cells, spinal cord and bone marrow in animals including humans.
  • horned animals have luterials within their horns.
  • the average size of the ruterial is 200-800 nm, smaller than mitochondria (400-1,000 nm) and larger than exosomes (20-120 nm), while the exosomes are not distinct in membrane and relatively light in color. Is a distinct or inner form of the membrane (Fig. 19). In addition, luterial is completely different in form from exosomes and microvesicles (FIG. 20).
  • the ruterial is different in size (diameter), area, shape, and nano-tracking speed depending on the disease of the individual, it is possible to predict the diagnosis or prognosis of the disease through one or more of the above characteristics. This can be seen through the difference in the size, shape, nano-tracking speed, etc. of the luterial derived from a healthy person without disease and the diseased person.
  • a disease especially cancer
  • the simultaneous expression of Streptopyta gene and Eukaorte gene can be used as predictive marker for cancer diagnosis.
  • ruterials having a size of about 50 to 400 nm were confocal laser scanning microscopes (Confocal Laser Scanning Microscopes, Zeiss), Transmission Electron Microscopes, and Scanning Electron Microscopes. Photographed with Atomic Force Microscope and Confocal Scanner (Leica TCS-SP8) .Luterial is a double-membrane membrane similar to the mitochondria, which does not complete the internal cristae structure. It was confirmed that it had a structure and was observed in the same laser wavelength range as that of mitochondria. In addition, it could be observed that the shape is round to elliptical (Fig. 1, Fig. (E), Fig. 2 (h), Fig. 13 and Fig. 14).
  • the supernatant was carefully picked at about 600 ⁇ l into a SPIN filter, centrifuged at 14000 g for 1 min, the supernatant was discarded, and 500 ⁇ l of SEWS-M was added to the pellet and suspending. After centrifugation for 1 min, the supernatant was discarded and centrifugation was repeated so that no buffer remained. 50 ⁇ l of DES (DNase / Pyrogen-Free Water) was added and centrifuged at 14000 g for 1 min. Then, genomic DNA was obtained.
  • DES DNase / Pyrogen-Free Water

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Abstract

본 발명은 혈액유래 루테리알 및 그 분리·배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 루테리알은 (1) 혈액, 정액, 장액, 타액 세포액 등의 체액에 존재하며; (2) 면역형광시험에서 야누스 그린 B(Janus green B), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 로다민123(Rhodamine123)에 양성의 발색반응을 나타내고; (3) 최적상태(pH 7.2~7.4)에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자의 발현특성을 나타내고, 30~800nm의 크기를 가지고; (4) 산성화 상태에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자뿐만 아니라, 진핵세포 유래 유전자의 발현특성을 나타내는데, 주로 Sterptophyta 유전자를 발현하고, 400nm 이상부터 2000nm 이상까지 크기가 커지며; (5) 정상조건에서 ATP생성에 관여하고; 및 (6) 미토콘드리아와는 상이하고, 엑조좀과는 전혀 다르며, 원핵세포와 진핵세포의 중간단계 융합특성을 지닌 세포 또는 세포유사체이다.

Description

루테리알 및 그 분리·배양 방법
본 발명은 체액 유래 미토콘드리아 유사 미세물질인 루테리알 및 그 분리·배양방법에 관한 것이다.
혈액 내 미소포 등의 미세물질은 예전에는 특별한 기능을 가지지 않는 물질로 인식되어 왔다. 그러나, 미소포(microvesicle)도 다양한 생물활성을 가진다는 사실이 여러 실험 데이터를 통하여 알려지고 있다. 예를 들면, 혈소판 유래의 미소포는 소포상의 표면 단백질을 통하여 특정 세포를 자극하는 기능을 한다는 사실이 밝혀진바 있으며 (CD154, RANTES and/or PF-4; Thromb.Haemost.(1999) 82:794; J.Boil.Chem. (1999) 274:7545), 혈소판 미소포에 있어서의 생리활성 지질(예를 들어, HTET, 또는 아라키돈산)이 특정의 표적 세포에 대하여 특정 효과가 있음이 보고된 바 있다 (J.Biol.Chem.(2001) 276;19672; Cardiovasc.Res.(2001) 49(5):88). 이와 같이, 생물학적 시료 안에 존재하는 소낭 등의 물질의 특징 (가령, 크기, 표면 항원들, 기원 세포의 결정, 페이로드)은 질병의 진단, 예후 또는 치료진단 정보를 제공할 수 있으므로 질환을 탐지하고 치료하는데 이용될 수 있는 생물학적 지표를 확인할 필요가 대두되고 있다. 이에, 소낭과 연관된 RNA 및 다른 생물학적 지표들과 소낭의 특징을 진단, 예후, 또는 치료진단에 제공하고자 하는 시도도 있다(WO 2011/127219 참조).
한편, 암(cancer)은 세포가 무한히 증식해 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 폐암, 위암(gastric cancer, GC), 유방암(breast cancer, BRC), 대장암(colorectal cancer, CRC) 등이 대표적이나, 실질적으로는 어느 조직에서나 발생할 수 있다. 초창기 암 진단은 암 세포의 성장에 따른 생체 조직의 외적 변화에 근거하였으나, 근래에 들어 혈액, 당쇄(glyco chain), 디엔에이(DNA) 등 생물의 조직 또는 세포에 존재하는 미량의 생체 분자를 이용한 진단 및 검출이 시도되고 있다. 그러나 가장 보편적으로 사용되는 암 진단 방법은 생체 조직 검사를 통해 얻어진 조직 샘플을 이용하거나, 영상을 이용한 진단이다. 그 중 생체 조직 검사는 환자에게 큰 고통을 야기하며, 고비용이 들 뿐만 아니라, 진단까지 긴 시간이 소요되는 단점이 있다. 또한 환자가 실제 암에 걸린 경우, 생체 조직 검사 과정 중 암의 전이가 유발될 수 있는 위험이 있으며, 생체 조직 검사를 통해 조직 샘플을 얻을 수 없는 부위의 경우, 외과적인 수술을 통해 의심되는 조직의 적출이 이루어지기 전에는 질병의 진단이 불가능한 단점이 있다. 또한, 영상을 이용한 진단에서는 엑스레이(X-ray) 영상, 질병 표적 물질이 부착된 조영제를 사용하여 획득한 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR) 영상 등을 기반으로 암을 판정하고 있으나, 이러한 영상 진단은 임상의 또는 판독의의 숙련도에 따라 오진의 가능성이 있으며, 영상을 얻는 기기의 정밀도에 크게 의존하는 단점이 있다. 더 나아가, 가장 정밀한 기기조차도 수 mm 이하의 종양은 검출이 불가능하여, 발병 초기 단계에서는 검출이 어려운 단점이 있다. 또한, 영상을 얻기 위해 환자 또는 질병 보유 가능자가 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있는 고에너지의 전자기파에 노출되므로, 또 다른 질병을 야기할 수 있을 뿐만 아니라, 영상을 통한 진단 횟수에 제한이 있는 단점이 있다.
즉, 암의 진단을 위한 생체 조직 검사는 많은 시간, 비용, 불편, 고통 등을 수반하므로, 불필요한 생체 조직 검사의 대상자 수를 획기적으로 줄일 수 있는 방법, 조기에 암을 진단할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자는 환자에서 기 배출된 체액 내에 존재하는 미세물질의 특성을 관찰함으로써 질병을 진단 및 예측할 수 있음을 발견하고 이에 대한 내용을 2013년 7월 12일자로 특허출원을 한 바 있다 (대한민국 출원번호 제10-2013-0082060호). 본 발명자는 상기 미세물질을 "루테리알 (luterial)"으로 명명하였다.
그러나, 상기 미세물질을 임상에 적용할 수 있도록 효율적으로 루테리알을 분리 및 배양하는 기술은 아직까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 환자 또는 정상인에서 기 배출된 체액 내에 존재하는 미세물질인 루테리알을 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 개발하고, 이러한 방법에 의해 분리된 루테리알의 특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 환자 또는 정상인에서 기 배출된 체액 내에 존재하는 루테리알의 분리·배양방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 원핵세포(prokaryote)와 진핵세포(eukaryte)의 중간단계 융합특성을 지니고, Immunoflurorescence 시험에서 Janus Green B, Mitoteracker Red, Rhodamine123에 양성의 면역화학형광염색 반응을 나타내며, 운동성을 가지고, ATP 생산 등의 특징을 가지는 루테리알을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈액에서 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리하는 제1분리단계; 상기 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리시킨 혈액을 원심분리하는 제2분리단계; 상기 원심분리에 의해 수득한 상등액으로부터 루테리알을 분리하는 제3분리단계; 및 상기 분리된 루테리알을 세정하는 단계를 포함하는 루테리알의 분리방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 체액을 1차 원심분리한 다음, 상등액을 2-5 μm 필터로 필터링하는 단계; 및 상기 필터링된 용액을 2차 원심분리한 다음, 상등액을 0.5~2 μm 필터로 필터링하는 단계를 포함하는 루테리알의 분리방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 특성 중 하나 이상을 가지는 체액 유래 루테리알을 제공한다:
(a) 면역형광시험에서 야누스 그린 B(Janus green B), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 로다민123(Rhodamine123)에 양성의 발색반응을 나타냄;
(b) 최적상태(pH 7.2~7.4)에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자의 발현특성을 나타내고, 30~800nm의 크기를 가짐;
(c) 산성화 상태에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자뿐만 아니라, 진핵세포인 Sterptophyta 유전자를 발현하고, 400nm 이상부터 2000nm 이상까지 크기가 커짐;
(d) 정상조건에서 ATP생성에 관여함;
(e) 미토콘드리아 및 엑조좀과는 전혀 다른 세포 또는 세포 유사체임;
(f) 정상상태에서는 원형 내지 타원형이고, 환자 유래의 경우 정상상태보다 크기(장직경 800nm 이상)가 크고, 형태가 불균일한 변이 루테리알 발생;
(g) 이중막 구조를 가지고, 부착성이 있음;
(h) 세포 안 또는 밖에서 모두 존재 가능함;
(i) 운동성이 있고, 퓨전(fusion) 및/또는 피전(fission) 생태양식을 나타냄;
(j) 특정 조건에서 변이 루테리알은 bursting되고, bursting 이후에는 stemness를 가짐; 및
(k) p53 유전자 및 텔로미어 조절기능을 가짐.
본 발명은 또한, 상기 분리된 체액 유래 루테리알에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 루테리알의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 루테리알을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물을 제공한다.
도 1은 혈액 유래 미세물질인 루테리알을 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, Zeiss), 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope), 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope), 원자힘현미경 (Atomic Force Microscope) 및 공초점 스캐너 (Leica TCS-SP8)으로 촬영한 사진이다.
도 2는 루테리알의 크기별 모양이나 형태를 나타낸 사진이다((a): 39.6~49.0 nm, 미토트랙커 레드(Mito-tracker Red)로 염색한 후의 초고해상도 현미경(SR-GSD) 사진; (b): 50.1~85.1 nm, 미토트랙커 레드(Mito-tracker Red)로 염색한 후의 초고해상도 현미경(SR-GSD) 사진; (c): 76.5 nm, 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope) 사진; (d): 160 nm, 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope) 사진; (e): 170~230 nm, 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope) 사진, 이중막 구조; (f): 234 nm, 야누스 그린B(Janus green B)로 염색한 후의 사진; (g): 250 nm, 원자힘현미경 (Atomic Force Microscope) 사진; (h): 361 nm, 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope) 사진; (i): 650.1 nm, 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope) 사진; (j): 5 μm 이상 크기의 루테리알을 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)으로 염색한 뒤의 레이저 현미경(Laser Scanning Microscope)사진).
도 3은 루테리알을 로다민123(Rhodamine123)으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 루테리알을 미토트랙커(Mito-tracker)으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 관찰한 사진이다.
도 5는 루테리알을 아크리딘 오렌지(Acridine Orange)로 염색한 다음, 그 발색 유무를 관찰한 사진이다.
도 6은 루테리알을 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 관찰한 사진이다.
도 7은 나노트랙커를 이용하여 루테리알의 운동성을 측정한 사진이다((a) 측정전; (b) 1초후; (c) 3초후).
도 8은 정상적인 루테리알의 life cycling A와 돌연변이된 루테리알의 life cycling B를 나타낸 것이다.
도 9는 돌연변이 루테리알의 life cycling과 특성을 나타낸 것이다.
도 10은 암환자 체액에서 분리한 루테리알을 나타낸 것으로, (a)는 길다란 가지를 뻗으며 형태가 변한 암환자 유래 루테리알, (b)는 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 미토트랙커(Mito-tracker) 및 로다민123(Rhodamine123)으로 염색한 암환자 유래 루테리알을 나타낸 것이다.
도 11은 루테리알의 life cycle을 나타낸 것이다.
도 12는 루테리알, 변이 루테리알의 크기를 확인한 사진이다.
도 13은 루테리알의 원자현미경 프로브를 이용하여 스크래칭하고, 막을 제거한 사진이다.
도 14 (a), (b)는 변이되어 퓨전상태인 루테리알을 원자힘현미경(Atomic Force Microscope)으로 촬영한 것이고 (c), (d)는 변이된 루테리알의 막을 캔티레버로 벗긴 후 원자힘현미경(Atomic Force Microscope)으로 촬영한 것이다.
도 15는 루테리알의 원자현미경 프로브를 이용하여 스크래칭한 다음, DAPI 염색사진을 통해 DNA를 확인한 사진이다.
도 16 (a)는 루테리알 내부에 DNA가 함유되어 있는지 여부를 분석한 바이오 아날라이저 결과이다.
도 16 (b)는 루테리알 크기에 따라 DNA의 GAPDH 유전자 발현 차이가 나타나는 것은 qRT-PCR로 나타낸 것이다.
도 17은 루테리알 내부에 RNA가 함유되어 있는지 여부를 분석한 바이오 아날라이저 결과이다.
도 18은 루테리알 첨가를 달리한 배양액에서 루시페린-루시퍼라아제(luciferin-luciferase) 반응과 루미노피터(luminometer)를 이용하여 ATP 함량을 측정한 것이다(SSH: 삼성환, SSF: 피세틴, 12h: 실험 전에 미리 12시간 동안 37℃에서 활성화).
도 19는 루테리알과 엑소좀의 차이를 관찰할 수 있는 사진으로, 20~120nm 크기 중 막의 구분이 뚜렷하지 않고 내부 색깔이 비교적 연한 것이 엑소좀이고 50~800nm 중 막의 구분이 뚜렷하거나 안이 차있는 것이 루테리알이다.
도 20은 루테리알(luterial), 엑소좀(exosome) 및 미세소포(microvesicle)의 형태를 비교할 수 있게 나타낸 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 구축된 루테리알 라이브러리에 대한 전자현미경(TEM) 사진이다.
도 22는 루테리알의 배양에 따른 크기 변화를 공초점 레이저 주사현미경 사진이다.
도 23은 루테리알의 배양에 따른 형태 및 사이즈 변화를 나타낸 사진이다.
도 24는 건강인(기준 pH 7.2~7.4) 혈액 유래 루테리알의 크기별 16S rRNA 염기서열을 분석하여 상동성을 나타내는 유사 박테리아 구성을 나타낸 것이다 ((a): 100nm 이하; (b): 100~200nm; (c): 200~400nm; (d): 400~800nm).
도 25는 피로?질병상태(pH 7.0 이하)에서 혈액 및 정액 유래 루테리알의 크기별 16S rRNA 염기서열을 분석하여 상동성을 나타내는 유사 박테리아 구성을 나타낸 것이다 ((a): 100nm 이하; (b): 100~200nm; (c): 200~400nm; (d): 400~800nm).
도 26 (a), (b) 및 (c)는 혈액 유래 루테리알의 16S rRNA 염기서열에 기초한 계통발생도를 나타낸 것이다.
도 27은 난소암세포주인 SKOV3 및 A2780 세포주에 100~800nm 크기의 루테리알과 시판중인 항암제 cisplatin을 농도별로 처리한 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “루테리알(luterial)”은 동물에 존재하는 생명인자 (living organism)로서, 바이러스와 유사한 정도부터 약 800nm까지 (정상 피션단계 50~800nm/ 비정상 퓨전단계 800nm이상)의 크기를 가지는 미세물질을 본 발명자가 명명한 것이다. 루테리알은 (1) 원핵세포와 진핵세포의 중간단계 융합특성을 지닌 세포 또는 세포유사체로서; (2) 혈액, 정액, 장액, 타액 세포액 등의 체액에 존재하며; (3) 면역형광시험에서 야누스 그린 B(Janus green B), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 로다민123(Rhodamine123)에 양성의 발색반응을 나타내고; (4) 최적상태(pH 7.2~7.4)에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자의 발현특성을 나타내고, 30~800nm의 크기를 가지고; (5) 산성화 상태에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자뿐만 아니라, 진핵세포 유래 유전자의 발현특성을 나타내는데, 주로 Sterptophyta 유전자를 발현하고, 400nm 이상부터 2000nm 이상까지 크기가 커지며; (6) 정상조건에서 ATP생성에 관여하고; 및 (7) 미토콘드리아와는 상이하고, 엑조좀과는 전혀 다른 세포 또는 세포 유사체이다. 루테리알은 인간을 포함한 동물의 경우에는 혈액, 타액, 림프관, 정액?질액, 모유(특히, 초유), 제대혈, 뇌세포, 척수, 골수에 존재한다. 그 외, 뿔이 있는 동물의 경우에는 뿔 내에도 루테리알이 존재한다.
정상적인 루테리알의 크기는 50~800nm이고, 변이체 루테리알은 융합하여 변이체를 형성하여 수십 마이크로미터 크기를 가진다. 루테리알은 mRNA와 miRNA뿐만 아니라, DNA도 포함하는 미성숙 미토콘드리아 단계를 지칭하는 것일 수 있다. 루테리알은 소화액에서 녹지 않고 혈액에 유입되는 특징이 있다.
루테리알은 시그널링, 세포 분화, 세포 사멸뿐 아니라 세포 사이클 및 세포 성장의 조절과도 관련이 있을 것으로 예상되는데, 본 발명자는 그 중에서도 루테리알이 암의 진단에 밀접한 관련이 있음을 발견하였다.
정상적인 루테리알 (normal luterial)은 암세포의 성장을 막고, 세포를 건강한 면역체계로 되돌리는 역할을 하는 것으로 예상되는데, 그 역할은 유전자를 정상화시키는 가능성을 지닌 RNAi(RNA interference; RNA 간섭)에 의해 수행된다. 이와 같이, 건강한 사람이나 동물의 혈액 내에서는 루테리알이 RNA 내에 있는 정보체계가 정상궤도에서 벗어나 이상 질환을 유발하는 단백질을 생산하도록 지시할 경우 이를 인위적으로 간섭하여 암 등의 질병 발생을 억제하도록 작용하며, 크기가 200-500 nm 이상으로 성숙하였을 때에는 에너지 대사에도 관여하며, 특정한 파장을 조사(照射)하였을 때, 반응발현으로 빛 에너지 증폭 기능을 하며, 엽록체처럼 반응하는 것으로 확인된다. 이에, 이러한 루테리알이 정상적인 역할을 수행하지 못할 경우에는 항상성 및 ATP 생산에 결정적인 장애를 유발하여, 호흡 및 에너지 대사 모두에 질병을 야기시킬 수 있다.
이와 같이, 정상적인 역할을 수행하지 못하는 돌연변이 루테리알은, 정상적인 루테리알과는 생태 및 특성이 상이하여 그 크기나 형태가 다양하다. 구체적으로, 정상적인 루테리알의 경우는 이중포자 (double-spore)를 형성한 후 더 이상 증식하지는 않으나, 암 환자나 만성 질병을 가지는 환자의 혈액 내에서 발견되는 돌연변이 루테리알의 경우에는 줄기세포와 유사하게 무한히 증식하는 특성을 가져 600~800 nm 이상부터, 어떤 것은 200 μm(200,000nm) 이상의 크기를 가진다. 또한, 바이러스와 유사하게 적혈구, 백혈구, 혈소판 등에 침입하여 생장하거나, 다른 루테리알과 응집하는 특성을 보인다.
따라서, 루테리알의 형태학적 특성 또는 생화학적 특성을 관찰함으로써 질병의 진단이나 치료가 가능하여 그 용도가 무궁무진할 것으로 예상되나, 인간을 포함한 동물에서 기 배출된 체액으로부터 분리된 루테리알은 생체 외에서는 빠른 시간 내에 용해되어 소멸되거나 형태가 변하는 특성이 있어 관찰 자체가 어려우며, 비정상적인 환경 하에 두는 경우에는 24시간 이내에 정상적인 루테리알도 돌연변이 루테리알로 변이되어 질병의 정확한 진단이나 치료가 어렵다는 문제점이 있다.
본 발명에서는 환자 또는 정상인에게서 기 배출된 체액 내에 존재하는 미세물질인 루테리알을 2가지 방법으로 분리하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 체액으로부터 루테리알을 분리하는 방법에 관한 것이다.
제1방법은 혈액으로부터 루테리알을 분리하는 방법으로, 혈액에서 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리하는 제1분리단계; 상기 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리시킨 혈액을 원심분리하는 제2분리단계; 상기 원심분리에 의해 수득한 상등액으로부터 루테리알을 분리하는 제3분리단계; 및 상기 분리된 루테리알을 세정하는 단계를 포함한다.
상기 제1분리단계는 혈액을 0.8~1.2 μm의 공극을 가지는 필터를 통과시켜 여과되지 않은 물질은 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2분리단계는, 1200~5000rpm에서 5~10min 반복적으로 원심분리하여 엑소좀(exosome)과 같은 일반 마이크로 베지클을 제거하여 상등액을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제3분리단계는, 원심분리를 통해 수득한 상등액에 가시광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제1단계에서 사용된 혈액은 포유동물 중 인간 유래인 것을 특징으로 한다. 루테리알은 자가형광 및 운동성의 특성을 가지므로 상기와 같이 가시광선을 조사시 상등액으로부터 루테리알 입자를 확인할 수 있다. 이때, 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 움직이는 루테리알 입자를 확인하면서 피펫을 사용하여 분리할 수 있다. 상기 제3단계에서 분리된 루테리알을 50 nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 PBS로 세척하여 루테리알을 수득할 수 있다. 루테리알은 장직경 50 nm 이상의 크기를 가지므로 상기 과정을 통하여 루테리알 이외의 혈액 유래 미세물질은 제거할 수 있다.
제2방법은 혈액이나 정액 등 체액으로부터 루테리알을 분리하는 방법으로, 체액을 1차 원심분리한 다음, 상등액을 2~5 μm 필터로 필터링하는 단계; 및 상기 필터링된 용액을 2차 원심분리한 다음, 상등액을 0.5~2 μm 필터로 필터링하는 단계를 포함한다.
즉, 체액을 2000~4000 rpm에서 5~30min 1차 원심분리 한 다음, 상등액을 2~5 μm 필터로 필터링하고 필터링된 용액을 3000~7000rpm에서 5~20min 2차 원심분리 한 다음, 0.5~2 μm 필터로 필터링하는 단계를 포함할 수 있다.
필터링으로 수득한 용액에 가시광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 루테리알은 자가형광 및 운동성의 특성을 가지므로 상기와 같이 가시광선을 조사시 상등액으로부터 루테리알 입자를 확인할 수 있다. 이때, 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 움직이는 루테리알 입자를 확인하면서 피펫을 사용하여 분리할 수 있다. 분리된 루테리알을 50nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 PBS로 세척하여 루테리알을 수득할 수 있다. 루테리알은 장직경 50nm 이상의 크기를 가지므로 상기 과정을 통하여 루테리알 이외의 혈액 유래 미세물질은 제거할 수 있다.
이러한 2가지 방법에 의해 분리된 루테리알은 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰이 가능하며, 각각 200nm, 400nm, 600nm, 800nm 및 1000nm 필터를 순차적으로 이용하여 크기에 따라 50-200nm (발생기)/ 200-400nm (성숙기)/ 400-600nm (분열기)/ 600-800nm (과분열기)로 구별할 수 있다.
본 발명에서는 상기 분리된 루테리알의 특성을 규명하였다.
(1) Morphology
정상적인 루테리알의 크기는 50~800nm이고(도 2 및 도 12), 퓨전이 없을 경우 800nm까지 성숙하며, 환자 유래 루테리알의 경우, 정상 유래보다 크기(장직경 800nm 이상)가 크고, 형태가 불균일한 변이 루테리알이 발생하며 퓨전이 발생할 경우 루테리알의 크기는 수천nm까지 커지는 것을 확인하였다.
아울러, 루테리알은 원형 내지 타원형으로 SEM 또는 TEM 전자현미경사진상에서 미토콘드리아와 유사한 이중막 구조를 나타내지만 내부 크리스테(cristae) 구조를 가지지 않았다(도 1).
(2) 면역화학형광염색
미토콘드리아는 야누스 그린 B(Janus green B) 및 형광염색인 로다민123(Rhodamine123), 미토트랙커(Mitotracker), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 DAPI에 의해 발색이 되는 것으로 알려져 있는데, 루테리알도 미토콘드리아와 동일한 염색약에 의해 발색이 확인되었다. 상기 루테리알이 미토콘드리아와 유사한 면역화학형광염색 반응을 보인 것에 반해 엑소좀(exsome)과는 상반된 반응을 나타내었으며 자가형광(authfluorescence)을 나타내는 특징을 형광사진을 통해 확인하였다(도 2 (a), 도 2 (b), 도 2 (f), 도 2 (j), 도 3 내지 도 6 ).
(3) 생태양식
루테리알은 엑소좀(exosome) 및 마이크로베지클(microvesicle)과는 달리 부착성과 운동성을 가지며 퓨전(fusion) 또는 피전(fission) 생태양식을 나타내었다. 특정 조건에서 변이 루테리알은 bursting되고, bursting 이후에는 stemness를 가지는 것을 확인하였으며 세포 안 또는 세포 밖에서 존재 가능함을 확인하였다(도 8, 도 9, 도 11).
(4) ATP 생산
200~400nm 크기의 루테리알에서 ATP가 생산되는 것을 루시페린(luciferin)-루시퍼라아제(luciferase) 반응과 루미노미터(luminometer)를 이용하여 입증하였다. 루테리알이 첨가된 군은 루테리알이 첨가되지 않은 군에 비해 ATP 농도가 증가하였고, 이는 루테리알은 ATP 생산 능력이 있는 것으로 결론을 도출할 수 있다. SSH 및 SSF 첨가의 차이점을 살펴보면, SSF 첨가군이 SSH 첨가군에 비해 ATP 농도가 높은 것으로 나타났으며, 이에 따라 ATP 함량을 효율적으로 증가시킬 수 있는 배양액을 확인하였다(도 18).
(5) 핵산함유
DAPI 및 아크리딘 오렌지(AO) 염색법에 의하여 루테리알 내에 RNA뿐 아니라 DNA도 함유되어 있음을 확인하였다. 구체적으로, RNA는 아크리딘 오렌지 염색약에 의하여 여기 460nm, 방출이 650nm인 level에서 오렌지로 염색되고, DNA는 여기 502nm, 방출이 525nm인 level에서 녹색으로 염색되며, DAPI 염색법에 의하면 DNA가 함유되어 있음을 확인할 수 있다. 본 발명의 루테리알은 상기 염색법을 이용하여 그 내부에 RNA와 DNA가 함유되어 있음을 확인하였다(도 5 및 도 6). 또한 루테리알의 RNA 및 DNA를 kit로 분리 및 정제한 후 아가로즈(agarose) 겔 전기영동을 통해 밴드를 확인하였으며 qRT-PCR 기법으로 GAPDH 발현 정도를 확인함으로써 루테리알 크기에 따라 유전자 발현에 차이가 있음을 확인하였다. (도 2 (h), 도 16 및 도 17)
(6) 16S rRNA 서열분석
FastDNA SPIN Kit(MP Biomedicals, Cat 6560-200)를 이용하여 루테리알의 gDNA를 추출한 다음, 표 1 및 표 2의 특정 primer를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다.
아울러, 상기 증폭된 1461개의 단편 유전자를 대상으로 GeneBank database(NCBI database)를 통해 상동성을 분석한 결과, 혈액 및 정액 유래 루테리알의 16S rRNA 염기서열은 베타 프로티오박테리아(β-Proteobacteria), 감마 프로티오박테리아(γ-Proteobacteria), 아키도박테리아(Acidobacteria), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 피르미쿠테스 (Firmicutes) 및 유캐리오트(Eukaryote) 유래 유전자와 상동성을 나타내며, 원핵세포와 진핵세포의 중간단계 융합 특성을 지닌다(도 24 내지 25).
최적상태(혈액의 pH: 7.2~7.4)에서, 혈액 유래 루테리알은 베타 프로티오박테리아(β-Proteobacteria) 와 감마 프로티오박테리아(γ-Proteobacteria) 및 Bacteroidetes 유래 유전자와 상동성을 나타내고(도 24), 50~800nm의 크기로 관찰된다.
정상상태에서 정액 유래 루테리알은 베타 프로티오박테리아, 감마 프로티오박테리아, Bacteroidetes 및 Chordata 유래 유전자와 상동성을 나타낸다.
반면, 산성화 상태에서는 정상상태와 동일하게 베타 프로티오박테리아 (β-proteobacteria) 및 감마 프로티오박테리아(γ-Proteobacteria) 유래 유전자뿐만 아니라, 박테리아 유래 유전자가 더 다양하게 발현되고, 진핵세포(Eukaryote) 유래 유전자도 발현된다. 주로 스트렙토파이타(Streptophyta)와 planctomy의 16S rRNA 특성을 발현하며(도 25), 크기는 400~2000nm까지 성장한다.
표 1 Forward Primer
Taxon Name Sequence(Adaptor-key-linker-target sequence) 서열번호
Bacteria B16S-F 5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1
Bifidobacterium Bif16S-F 5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-GGGTTCGATTCTGGCTCAG-3’ 2
표 2 Reverse Primer
Taxon Name Sequence(Adaptor-key-linker-target sequence) 서열번호
Bacteria B16-7-4 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGAGCTG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 3
Bacteria B16-7-7 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCAGATG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 4
Bacteria B16-7-8 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CGATGAG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 5
Bacteria B16-7-12 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCTGCAG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 6
Bacteria B16-7-13 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGCGATG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 7
Bacteria B16-8-3 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ATGCTGAG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 8
Bacteria B16-8-4 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TACAGCAG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 9
Bacteria B16-8-18 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ATCGTGTG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 10
Bacteria B16-8-21 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CTACACAG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 11
Bacteria B16-9-4 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CGTGTACTG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 12
Bacteria B16-9-5 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CTGTCTACG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 13
Bacteria B16-9-8 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGTCACTAG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 14
Bacteria B16-9-12 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGCTCACTG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 15
Bacteria B16-10-6 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ATCACGTGCG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 16
Bacteria B16-10-7 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ATAGCTCTCG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 17
Bacteria B16-10-8 5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGTGAGCTCG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 18
Bacteria B16-10-9 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGTCTGACTG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 19
Bacteria B16-11-1 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCATATACGCG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 20
Bacteria B16-11-2 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TAGATAGTGCG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 21
Bacteria B16-11-3 5’―CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ACGTCTCTACG-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 22
Bacteria B16-11-4 5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CTAGAGACACT-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 23
(7) 엑소좀 및 미토콘드리아와의 차이
표 3은 엑소좀 및 미토콘드리아와 루테리알의 차이점을 정리한 것이다.
표 3
No. Category Exosomes Luterials Mitochondria
1 Size 20~120nm 50~800nm 400~1,000nm
2 Fluorescence (CD63antibody)GFP+ (CD63antibody)GFP- (CD63antibody)GFP-
3 Mitotracker Red - Mitotracker Red+ Mitotracker Red+
4 Janus Green B - Janus Green B+ Janus Green B+
5 Rhodamine 123 - Rhodamine 123+ Rhodamine 123+
6 Mobility － 13~25 μm/sec －
7 Growth in Culture － ＋ －
8 Natural Growth － ＋ －
9 ATP Synthesis － ＋ ＋
10 Auto-fluorescence － ＋ N/A
11 Fusion ＋ ＋ ＋
12 Kiss-and-run (Fission and Fusion) － ＋ ＋
13 Sequencing 18SrRNA28S rRNA 16SrRNA(GammaProtebacteria Beta ProteobacteriaBacteroidetes 16srRNAAlpha Proteobacteria
14 Habitat Out of cell In-and-out of Cell In cell
루테리알의 평균 크기는 200~800nm로 미토콘드리아(400~1,000nm)보다는 작고 엑소좀(20~120nm)보다는 큰 편이며, 엑소좀은 막의 구분이 뚜렷하지 않고 내부 색이 비교적 연한 편인 반면, 루테리알은 막의 구분이 뚜렷하거나 안이 차있는 형태이다 (도 19). 아울러, 루테리알은 엑소좀 및 마이크로비지클(microvesicles)과는 그 형태가 완전히 상이하다(도 20).
면역화학형광염색시 루테리알은 미토콘드리아와 유사한 반응을 보인 반면, 엑소좀과는 상반된 반응을 나타낸다. 세포 내외에 모두 존재하는 루테리알과 세포외 존재하는 엑소좀은 식품을 섭취함으로써 얻어지는 물질이기도 한 반면, 미토콘드리아는 식품 섭취로는 얻을 수 없는 세포 내에만 존재한다는 차이점이 있다.
그리고 엑소좀 및 미토콘드리아와 달리 루테리알은 운동성이 있고, 자연 성장이 가능하며 배양을 통해 성장을 유지할 수 있고 자가형광의 특징을 나타낸다. 또한, 루테리알, 엑소좀 및 미토콘드리아 모두 퓨전의 생태양식을 지니지만 엑소좀에서는 kiss-and-run 퓨전이 일어나지 않고 ATP 생산도 일어나지 않는다. 또한, 엑소좀은 세포 밖에서 존재하고 미토콘드리아는 세포 내에 존재하는 반면, 루테리알은 세포 밖 또는 안에서 모두 존재가 가능하다(도 11).
또한, 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 미토콘드리아는 α-Proteobacteria와 상동성을 나타내는 반면, 루테리알은 감마 프로티오박테리아(γ-Proteobacteria), 베타 프로티오박테리아(β-Proteobacteria), Bacteroidetes, 피르미쿠테스(Firmicutes) 및 유캐리오트(Eukaryote)와 상동성을 나타낸다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음 특성 중 하나 이상을 가지는 체액 유래 루테리알에 관한 것이다:
(a) 면역형광시험에서 야누스 그린 B(Janus green B), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 로다민123(Rhodamine123)에 양성의 발색반응을 나타냄;
(b) 최적상태(pH 7.2~7.4)에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자의 발현특성을 나타내고, 30~800nm의 크기를 가짐;
(c) 산성화 상태에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자뿐만 아니라, 진핵세포인 Sterptophyta 유전자를 발현하고, 400nm 이상부터 2000nm 이상까지 크기가 커짐;
(d) 정상조건에서 ATP생성에 관여함;
(e) 미토콘드리아 및 엑조좀과는 전혀 다른 세포 또는 세포 유사체임;
(f) 정상상태에서는 원형 내지 타원형이고, 환자 유래의 경우 정상상태보다 크기(장직경 800nm 이상)가 크고, 형태가 불균일한 변이 루테리알 발생;
(g) 이중막 구조를 가지고, 부착성이 있음;
(h) 세포 안 또는 밖에서 모두 존재 가능함;
(i) 운동성이 있고, 퓨전(fusion) 및/또는 피전(fission) 생태양식을 나타냄;
(j) 특정 조건에서 변이 루테리알은 bursting되고, bursting 이후에는 stemness를 가짐; 및
(k) p53 유전자 및 텔로미어 조절기능을 가짐.
한편, 루테리알은 개체의 질병 유무에 따라 크기(직경), 면적, 형태 및 나노 트랙킹 속도가 상이하여, 상기 특성 중 한 가지 이상의 특성을 통하여 질병의 진단이나 예후를 예측할 수 있다. 이는, 질병이 없는 건강한 사람으로부터 유래한 루테리알과 질병이 있는 사람으로부터 유래한 루테리알의 크기, 형태, 나노 트랙킹 속도 등이 상이함을 통해 알 수 있다.
건강한 사람 내의 정상적인 루테리알의 경우에는 단순히 이중포자(double-spore)를 형성(fission)할 뿐이지만, 만성질병이나 암 환자 내의 루테리알(돌연변이 루테리알)의 경우에는 루테리알끼리 융합(fussion) 또는 응집(coagulation)하거나 폭발(bursting)하여 적혈구나 암세포 등의 세포에도 부착하여 그 형태 및 크기가 정상적인 루테리알과는 달리 비정상적으로 거대해지는 특징이 있다(도 8 내지 도 10). 돌연변이 루테리알은 부착성이 높아, 상기와 같은 cycle에 의하여 융합(fusion)은 더욱 가속화되어 그 크기가 약 600~800nm 이상으로 커지며, 그 중에서 어떤 것들은 200μm(200,000 nm) 이상의 크기를 가지기도 한다. 본 발명자는 암의 종류나 진행정도에 따라 돌연변이된 루테리알의 형태에 일관성이 있음을 확인하여, 이에 대한 내용을 특허출원한 바 있다(특허출원 제10-2013-0082060호).
따라서, 루테리알의 형태학적 특성 또는 생화학적 특성을 관찰함으로써 질병의 진단이나 예후를 예측할 수 있어 그 용도가 무궁무진하다.
루테리알의 형태는 정상형, 편모형, 매스(Mass)형, 로드(Rod)형, 또는 복합형을 나타내는데, 정상형이란 별도의 융합, 버스팅(Bursting) 등 변형을 일으키지 않고 장지름:단지름의 비를 1:1~3:1로 하는 형태일 수 있다. 원형에 가까운 형상을 나타낼 수 있다. 현미경 관찰 시 작은 점으로 나타난다.
편모형이란 루테리알이 변형 또는 융합을 일으켜 외부에 편모가 구비된 형태일 수 있다. 본 발명자들은 말기암으로 갈수록 편모형 관찰 비율이 급격히 증가하며, 4 기암에서는 99.1％로 거의 대부분의 4기암 진단받은 환자에게서 편모형의 루테리알이 관찰되는 것을 확인한 바 있다(한국특허출원 2013-0082060). 루테리알의 형태가 편모형의 형태와 80~100％ 일치할 경우 말기 종양 의심 표식인자(Tumor Marker)로 표시할 수 있다. 상기 말기 종양으로 진단받은 환자의 생존기간은 대략 1~4개월이고, 특히 편모형의 경우 장기생존이 불가능하다.
매스형(M형)이란 루테리알이 버스팅(Bursting) 또는 융합을 일으켜 크기 및 형태가 정상형에서 변형된 것으로, 장지름 및 단지름의 차이가 크지 않은 불규칙적인 부피 형태이다. 바람직하게는 장지름:단지름의 비가 3:1~5:1일 수 있다. 다양한 형태의 매스형이 관찰된다.
로드형(R형)은 루테리알이 버스팅(Bursting), 변형, 또는 융합을 일으켜 막대(Rod) 형태를 이룬 것을 말한다. 단지름과 장지름의 길이 차이가 매스형보다 크다. 바람직하게는 장지름:단지름의 비가 5:1~12:1일 수 있다. 원형 또는 타원형의 단일 사슬로 이루어지는 로드 1형; 및 단일 사슬이 2개 이상 결합하여 이루어지는 로드 2형을 포함한다. 상기 로드 1형은 단일의 루테리알이 막대 형태가 된 것을 말한다. 이는 버스팅(Bursting) 및/또는 변형에 의한 것일 수 있다. 상기 로드2형은 2 이상의 루테리알이 결합하여 막대 형태가 된 것을 말한다. 이는 버스팅(Bursting), 변형, 및 융합 중 1 이상에 의한 것일 수 있다. 한편 편모형은 형상에 있어서 큰 범주에서 로드형에 포함될 수 있으나, 편모가 뻗어 나왔다는 점에서 일부 차이를 가질 수 있다. 따라서 로드형인지 먼저 판단한 다음 편모형인지를 판단할 수 있다.
상기 복합형은 로드형과 매스형의 융합형태일 수 있다. 일체로 형성된 미세물질의 일부는 로드형이나 일부는 매스형인 형태를 일컬을 수 있다.
상기 로드(Rod) 형은 원형 또는 타원형의 단일 사슬로 이루어지는 로드 1형;및 단일 사슬이 2개 이상 결합하여 이루어지는 로드 2형을 포함하는 군 중 하나일수 있다. 상기 복합형은 로드형과 매스형의 융합형태일 수 있다.
상기와 같이, 질병의 발병과 진행에 따라, 생체 내의 루테리알의 형태가 변하므로, 루테리알의 형태학적 특성을 관찰함으로써 질병의 진단이나 예후를 예측할 수 있다. 또한, 상기 루테리알의 형태 변화는 루테리알이 함유하고 있는 핵산의 양과 서열변화와도 관련성이 있는바, 루테리알의 핵산 발현 패턴(16S rRNA)서열을 분석하여 질병의 진단이 가능할 수 있다.
예컨대, 정상 루테리알의 16S rRNA 서열과 환자 루테리알의 16S rRNA 서열을 비교함으로써 질병(특히, 암)을 진단하는 것이 가능한다. 특히 Streptopyta 유전자 발현과 유캐어트(Eukaorte) 유전자 동시 발현은 암화 진단 예측 마커로 활용 가능하다.
다만, 환자 또는 정상인에게서 기 배출된 체액으로부터 분리된 루테리알은 생체 외에서는 빠른 시간 내에 용해되어 소멸되거나 형태가 변하는 특징이 있어 관찰 자체가 어려우며, 비정상적인 환경 하에 두는 경우에는 24시간 이내에 정상적인 루테리알도 돌연변이 루테리알로 변이되어 질병의 정확한 진단이나 치료가 어려우나, 본 발명의 배양방법에 의하면 특정한 크기(500nm) 이상이 되지 않도록 루테리알을 배양할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 루테리알에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃(바람직하게는 20~25℃)에서 배양하는 것을 특징으로 하는 루테리알의 배양방법에 관한 것이다.
상기 배양시 첨가되는 수분은 식염수 또는 PBS 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양 전의 체액 유래 루테리알은 본 발명의 분리방법에 따라 수득할 수 있으며, 그 크기가 50~200nm인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 혈액유래 루테리알의 배양 후 크기는 300~800nm일 수 있다. 이때, 현미경으로 관찰하면서 루테리알의 크기가 500nm을 넘지 않도록 할 수 있으며, 배양이 끝나면 크기별로 분류하여 영하 80℃로 냉각하여 보관하거나 질소로 충진하여 보관 또는 영상에서 보관할 수 있으며 보관시 보존제를 첨가할 수 있다.
상기와 같이 배양된 루테리알은 그 특성의 변화 없이 일정기간 보관이 가능하여 루테리알을 이용한 질병의 진단 및 예후 예측에 효과적으로 활용될 수 있다. 본 발명에서 “루테리알의 특성의 변화 없이”는 루테리알의 형태(morphology)나 크기(size)가 배지에서 배양하기 전의 상태와 거의 유사하게 그 형태를 유지하는 것을 의미하는 것이다. 또한, 나노트랙킹 속도와 같은 루테리알의 운동성 등의 활성이, 배양하기 전의 상태와 유사한 값을 유지하는 것을 의미하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 루테리알은 다음 목적을 위하여 사용할 수 있다. 변이된 돌연변이 루테리알은 융합(fussion) 또는 응집하여 그 형태 및 크기가 정상적인 루테리알과는 달리 비정상적으로 거대하여진 것으로(도 8 내지 도 10), 분리된 돌연변이 루테리알의 배양시 루테리알의 융합 또는 응집을 억제할 수 있는 후보물질이나 수단을 처리하여 루테리알의 융합 또는 응집의 억제 여부를 관찰함으로써 루테리알이 변이되는 것을 억제하거나 예방할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있다.
또한, 분리된 루테리알의 배양시, fission을 촉진하는 후보물질이나 수단을 처리함으로써, 돌연변이 루테리알의 fission을 촉진하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 루테리알은 융합 또는 응집하는 생태양식을 가지지만(도 8, 도 9 및 도 11), fission 생태양식으로 전환되거나 돌연변이된 루테리알이 fission되어 정상적인 루테리알의 크기를 갖도록 fission을 촉진하는 후보물질을 처리하여, 루테리알이 변이되는 것을 억제하거나 변이된 루테리알이 정상적인 루테리알의 생태양식을 가지도록 전환하는 물질, 궁극적으로는 변이된 루테리알에 의하여 유발될 수 있는 질병의 예방물질을 스크리닝할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 혈액 유래 루테리알의 분리
비소세포성 폐암 말기 환자에게서 혈액을 50cc 채취하여 0.8μm 이상의 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 물질은 분리하였다. 필터링된 혈액을 1200~5000rpm에서 5~10min 반복적으로 원심분리를 수행하여 엑소좀(exosome)과 같은 일반 마이크로 베지클을 제거하여 상등액을 획득하였다. 상기 상등액에 가시광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하였다. 루테리알은 자가형광 및 운동성의 특성을 가지므로 상기와 같이 가시광선을 조사시 루테리알 입자를 확인할 수 있다. 이때, 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 움직이는 루테리알 입자를 확인하면서 피펫을 사용하여 분리하였다. 분리된 루테리알을 50nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 PBS로 세척하여 루테리알을 수득하였다. 상기 과정에 의해 장직경 50-800nm인 루테리알을 수득할 수 있으며, 이는 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰 확인이 가능하였다. 상기 수득한 루테리알은 크기에 따라 50-200nm (발생기)/ 200-400nm (성숙기)/ 400-600nm (분열기)/ 600-800nm (과분열기)로 구분하였다. 유사한 방법으로, 도 21과 같은 루테리알 사이즈별 라이브러리를 구축하였으며 루테리알의 사이즈별 morphology를 도 2에 나타내었다.
실시예 2: 정액 유래 루테리알의 분리
정액을 2000~4000rpm에서 5~30min 1차 원심분리를 한 다음, 상등액을 2~5 μm 필터로 필터링하고 필터링된 용액을 3000~7000rpm에서 5~20min 2차 원심분리 한 다음, 0.5~2 μm 필터로 필터링하였다. 루테리알은 자가형광 및 운동성의 특성을 가지므로 필터링한 용액에 가시광선을 조사시 루테리알 입자를 확인할 수 있다. 이때, 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 움직이는 루테리알 입자를 확인하면서 피펫을 사용하여 분리하였다. 분리된 루테리알을 50 nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 PBS로 세척하여 루테리알을 수득하였고 이는 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰 확인이 가능하였다.
실시예 3: 루테리알의 특성
(1) 구조
실시예 1에서 수득된 루테리알 중 약 50~400nm의 크기를 가지는 루테리알을 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, Zeiss), 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope), 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope), 원자힘현미경 (Atomic Force Microscope) 및 공초점 스캐너 (Leica TCS-SP8)으로 촬영한 결과, 루테리알도 미토콘드리아와 유사하게 이중막을 가진 막구조로서 내부 크리스테(cristae) 구조를 완성하지 않은 상태의 구조를 가지며, 미토콘드리아와 동일한 레이저 파장 범위에서 관찰됨을 확인하였다. 또한, 그 형태는 원형 내지 타원형임을 관찰할 수 있었다 (도 1, 도 (e), 도 2 (h), 도 13 및 도 14).
(2) 염색 특성
실시예 1에서 수득된 루테리알 중 약 50~800nm의 크기를 가지는 루테리알을 미토트랙커(Mito-tracker), 로다민123(Rhodamine123), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 야누스 그린B(Janus green B)으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 관찰하였다. 그 결과, 식물유래 루테리알도 미토트랙커, 로다민 123, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 야누스 그린 B에 의해 발색이 확인됨을 확인하였다(도 2 (a), 도 2 (b), 도 2 (f), 도 2 (j), 도 3 내지 도 6).
(3) 자가형광
실시예 1에서 수득된 루테리알 중 약 50-800nm의 크기를 가지는 루테리알은 빛반응을 나타냄을 형광 사진을 통해 확인하였다(도 5).
(4) 운동성
실시예 1에서 수득된 루테리알의 운동성을 미국 3i 사의 나노 트랙킹으로 측정하였다. 구체적으로, 루테리알을 명시야 현미경으로 관찰한 후 루테리알 중심에 트랙킹을 설정하고 나노 트랙킹을 작동하면, 루테리알의 이동과 함께 실시간 이동궤적을 표기하여 초당 속도를 계산하였다(도 7).
그 결과, 본 실시예에 따른 루테리알의 나노 트랙킹 속도는 약 13~25 μm/sec로 측정되었다.
(5) 루테리알에 RNA 및 DNA 함유 여부 분석
실시예 1에서 분리된 200~400nm 루테리알의 원자현미경 촬영결과, 도 2 (h), 도 15, 도 16 및 도 17에 나타난 바와 같이, 루테리알에 RNA나 DNA와 같은 핵산이 함유되어 있는 것으로 추정할 수 있다.
실시예 1에서 분리된 200~400nm 루테리알로부터 총 RNA와 DNA를 분리하기 위하여, QIAGEN 킷트(RNeasy Micro Kit: Cat 74004)를 사용하여 분리한 다음, Experion RNA(DNA) StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다.
루테리알을 원심분리(8000g, 1h 30min)하여 회수한 후 키트 내 분해 완충액 RLT plus (Guanidine isothiocycanate, detergents) 50㎕에 베타 멀캅토에탄올 3.5㎕를 첨가하여 20 게이지 바늘이 부착된 주사기를 이용하여 5-10회 통과시켜 루테리알을 용해시켰다. 샘플 분해 완충액을 AllPrep DNA spin 컬럼에 옮긴 후 원심분리(≥8000g 15초)하여 컬럼에 걸려 있는 DNA와 컬럼을 통과한 RNA가 포함된 버퍼에서 각각 분리하였다.
우선 컬럼을 통과한 버퍼에 동일한 부피의 350㎕ 70％ 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 700㎕의 혼합액을 RNease MinElute spin 컬럼에 옮겨 원심분리(≥8000g 15초)하고 컬럼을 통과한 버퍼는 제거하였다. 각각의 350㎕의 RW1, 500㎕의 RPE 버퍼와 500㎕의 80% 에탄올을 이용하여 단계적으로 컬럼 세척을 진행하였다. 위에 사용된 모든 원심분리(≥8000g 15sec)는 동일 조건으로 진행하였다. RNA를 얻기 위하여 14㎕ RNeasy-free 용액을 컬럼에 넣은 후 원심분리((≥8000g 60 sec)하여 루테리알 RNA를 분리하였다.
지노믹 DNA 분리를 위하여 FastDNA SPIN Kit(MP Biomedical)를 사용하였다. 튜브에 분리된 루테리알을 넣은 후 978㎕의 sodium phosphate buffer, 122㎕의 MT버퍼를 첨가하였다. 40sec 균질화시킨 다음, 14,000g에서 10min 원심분리하여 상층액을 얻은 다음, 250㎕의 PPS(Protein Precipitation Solution)를 넣고 10min 섞어주었다. 14000g에서 5min 원심분리한 다음, 15ml 튜브에 상층액을 옮기는 과정을 2번 반복하고 DNA binding을 위해 rotor에 2min 올려둔 후 실리카 매트릭스 받침대에 3min 넣어두었다. 상층액을 대략 600㎕ 정도 조심히 따서 SPIN Filter에 넣고 14000g에서 1min 원심분리 한 후, 상층액을 버리고 pellet에 SEWS-M을 500㎕넣고 suspending 하였다. 1min 원심분리 한 후 상층액을 버리고 어떠한 버퍼도 남아있지 않게끔 원심분리를 반복하였다. 50㎕의 DES(DNase/Pyrogen-Free Water)를 넣고 14000g에서 1min 원심분리한 다음, 지노믹 DNA를 얻었다.
Experion RNA(DNA) StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량한 결과, 도 16 및 17에 나타난 바와 같이, 루테리알에 각각 RNA 및 DNA가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
(6) 16S rRNA 서열 분석
16S rRNA(ribosomal Ribonucleic acid)는 다양한 단백질들과 상호작용하여 리보솜(Ribosome)을 구성하는 RNA로서, 염기서열 변화율이 대부분의 게놈에 있는 다른 유전자 염기서열보다 월등히 적기 때문에 16S rRNA 염기서열 유사도의 정도가 생물간의 계통학적 거리를 반영하는 것으로 인식되고 있다.
① 혈액 유래 루테리알
실시예 1에서 얻은 혈액 유래 루테리알을 FastDNA SPIN Kit(MP Biomedicals, Cat 6560-200)를 이용하여 gDNA를 추출한 후 PCR-premix(iNtRON Biotechnology, Korea) 서열번호 1 내지 23의 primer를 이용하여 루테리알의 16S rRNA를 증폭하였다.
증폭된 PCR 산물은 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(applied Biosystems, USA)와 automated DNA analyzer system(PRISM 3730XL DNA analyzer, Applied Biosystems)을 통하여 염기서열을 분석하였다. 증폭된 PCR 산물은 총 1461개의 절편으로, 이중 1407개의 절편은 프로티오박테리아(proteobacteria) 유래 유전자와 상동성을 나타냈고, 20개의 절편은 아키도박테리아(Acidobacteria) 유래 유전자와 상동성을 나타냈으며, 11개의 절편은 악티노박테리아(Actinobacteria) 유래 유전자와 상동성을 나타내었다(표 4).
분석한 염기서열의 절편을 SeqMan software(DNASTAR)로 조합하여 16S rRNA의 염기서열을 얻었다.
도 24는 건강인(혈액의 pH: 7.2~7.4) 혈액 유래 루테리알의 16S rRNA를 염기서열 분석하여 상동성을 나타내는 유사 박테리아 구성을 나타낸 것으로 루테리알 크기별로 분석하였다 ((a): 100nm 이하, (b): 100~200nm, (c) 200~400nm, (d) 400~800nm). 크기별로 별다른 차이가 없었으며, 모두 Proteobacteria, Firmicutes 및 Bacteroidetes 유래 유전자와 상동성을 나타냈다
도 25 (c)는 피로·질병상태(혈액의 pH: 7.0 이하)인 혈액 유래 200~400nm 크기의 루테리알 16S rRNA를 염기서열 분석하여 상동성을 나타내는 유사 박테리아 구성을 나타낸 것이다. 정상상태와는 달리, Streptophyta 유래 유전자와 상동성을 나타내는 유전자가 추가로 발현되었다.
도 26 (a), (b) 및 (c)는 혈액 유래 루테리알의 16S rRNA 염기서열에 기초한 계통발생도를 도시한 것이다.
표 4
Rank Taxonomy Name LKL-B SUM(Ratio) LKL-B Sum (Number)
Phylum Bacteria;;;Proteobacteria Proteobacteria 96.3039 96.3039 1407 1407
Phylum Bacteria;;;Acidobacteria Acidobacteria 1.36893 1.36893 20 20
Phylum Bacteria;;;Actinobacteria Actinobacteria 0.75291 0.75291 11 11
Phylum Bacteria;;;Bacteroidetes Bacteroidetes 0.54757 0.54757 8 8
Phylum Bacteria;;;Cyanobacteria Cyanobacteria 0.41068 0.41068 6 6
Phylum Eukarya;Viridiplantae;;Streptophyta Streptophyta 0.27379 0.27379 4 4
Phylum Bacteria;;;Firmicutes Firmicutes 0.20534 0.20534 3 3
Phylum Bacteria;;;TM6 TM6 0.06845 0.06845 1 1
Phylum Bacteria;;;Planctomycetes Planctomycetes 0.06845 0.06845 1 1
혈액 유래 루테리알의 16S rRNA 단편은 베타 프로티오박테리아, 감마 프로티오박테리아, Bacteroidetes, Firmicutes 및 Streptophyta 등의 다양한 박테리아와 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다.
일반적으로 미생물 분류 체계상 gDNA relatedness가 70％ 미만이면 서로 독립적인 균주로 인정된다. 또한 16S rRNA 염기서열의 상동성이 97％ 미만 이면 gDNA relatedness가 70％ 미만이라는 것이 통계학적인 분석에 의해 증명되었다. 따라서 루테리알의 16S rRNA 단편과 상동성이 97.0％ 이상으로 나타나는 서열을 가지는 세포를 분석한 결과, 표 5 내지 표 7에 나타낸 바와 같이, 혈액 유래 루테리알은 감마 프로티오박테리아와 100%의 상동성을 나타내었으며, Firmicutes와는 97.53%, Bacteroidetes와는 97% 이상의 상동성을 나타내었다.
한편, 비정상상태인 산성조건의 루테리알은 표 8에 나타낸 바와 같이, Streptophyta와 99％ 이상의 상동성을 나타내었다.
표 5 Characteristics of Luterial by 16S rRNA Seq
Raw data Seq Name Sequence Hit accession Similarity Taxonomic assignment
IOFBYRO01DTJ3I ATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTCCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01DUOG5 ATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01BHYT4 TTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01CYAL1 ATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01DRDH1 ATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAACACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01BWKSQ ATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01BWKSO ATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGATGAGGTGCTTGCACCTTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AM410704 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter junii;;LMG 998-AM410704(T)
IOFBYRO01A8KAW TATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATCCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTAGTATTAATACTACTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG AKIQ01000085 100 Bacteria;;;Proteobacteria;;Gammaproteobacteria;;Pseudomonadales;;Moraxellaceae;;Acinetobacter;Acinetobacter venetianus;;RAG-1-AKIQ01000085(T)
표 6 Firmicutes
Raw data Seq Name Sequence Hit accession Similarity Taxonomic assignment
IOFBYRO01ANZSO GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGCTTGGTGCTTGCACCGAGCGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTCTTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACAGCATAAAAGTCGATATCGCATGATATTGATTTGAAAGGTGCAATTGCATCACTAAGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAACTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTG ADVN01000004 97.53 Bacteria;;;Firmicutes;;Bacilli;;Lactobacillales;;Streptococcaceae;;Streptococcus;Streptococcus parasanguinis;;ATCC 15912-ADVN01000004(T)
표 7 Bacteroidetes
Raw data Seq Name Sequence Hit accession Similarity Taxonomic assignment
IOFBYRO01BUV34 TGAACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGTGGGGCAGCACAGAATAGCAATATTTGGGTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACACAACCTTCCGATAAGTGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCGTAACATATAGAGATGGCATCGTCTTTATATTATAGCTTCGGTGCTTATTGATGGGTGTGCGTCTGATTAGGTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCTACGATCAGTAGCTGATGTGAGAGCATGATCAGCCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAAGGATGAATGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATTTGGGACGAAAAAGAGCATTCTTGCTCACTTGACGGTACCAAGTGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTG 4P004046 99.79 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Sphingobacteria;;Sphingobacteriales;;Chitinophagaceae;;4P004046_g;4P004046_s;;4P004046
IOFBYRO01AEZDS GATGAACGCTAGCGATAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCACATGAAGTAGCAATACTGATGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATGCAACCTACCTTCAACAGGAGAATAACCCGTCGAAAGACGGACTAATACTCCATAACACAGGGATCCCACATGGGAATATTTGTTAAAGATTTATCGGTTGAAGATGGGCATGCGCTCCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTTTTGTAAGGGAATAAAGTTAGTTACGTGTAACTATTTGCATGTACCTTACGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTG FJ672469 97.34 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Bacteroidia;;Bacteroidales;;Porphyromonadaceae;;AB243818_g;FJ672469_s;;FJ672469
IOFBYRO01BP52Z GATGAACGCTAGCGATAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCACATGAAGTAGCAATACTGATGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATGCAACCTACCTTCAACAGGAGAATAACCCGTCGAAAGACGGACTAATACTCCATAACACAGGGATCCCACATGGGAATATTTGTTAAAGATTTATCGGTTGAAGATGGGCATGCGCTCCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTTTTGTAAGGGAATAAAGTTAGTTACGTGTAACTATTTGCATGTACCTTACGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTG FJ672469 97.34 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Bacteroidia;;Bacteroidales;;Porphyromonadaceae;;AB243818_g;FJ672469_s;;FJ672469
IOFBYRO01BBMIP TGAACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGTGGGGCAGCACAGAATAGCAATATTTGGGTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACACAACCTTCCGATAAGTGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCGTAACATATAGAGATGGCATCGTCTTTATATTATAGCTTCGGTGCTTATTGATGGGTGTGCGTCTGATTAGGTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCTACGATCAGTAGCTGATGTGAGAGCATGATCAGCCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAAGGATGAATGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATTTGGGACGAAAAAAGAGCATTCTTGCTCACTTGACGGTACCAAGTGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTG 4P004046 99.79 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Sphingobacteria;;Sphingobacteriales;;Chitinophagaceae;;4P004046_g;4P004046_s;;4P004046
IOFBYRO01BBHTW ATGGACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGTGGGGCAGCACAGAATAGCAATATTGGGTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACACAACCTTCCGATAAGTGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCGTAACATATAGAGATGGCATCGTCTTTATATTATAGCTTCGGCGCTTATTGATGGGTGTGCGTCTAATTAGGTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCTACGATCAGTAGCTGATGTGAGAGCATGATCAGCCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAAGGATGAATGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATTTGGGACGAAAAAAGAGCATTCTTGCTCACTTGACGGTACCAAGTGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTG 4P004046 99.58 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Sphingobacteria;;Sphingobacteriales;;Chitinophagaceae;;4P004046_g;4P004046_s;;4P004046
IOFBYRO01BQCEI GATGAACGCTAGCGATAGGCCTAACACATGCAAGTCGAAGGGGCAGCACATGAAGTAGCAATACTGATGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATGCAACCTACCTTCAACAGGAGAATAACCCGTCGAAAGACGGACTAATACTCCATAACACAGGGATCCCACATGGGAATATTTGTTAAAGAGTTTATCGGTTGAAGATGGGCATGCGCTCCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTTTTGTAAGGGAATAAAGTTAGTTACGTGTAACTATTTGCATGTACCTTACGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTG FJ672469 97.34 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Bacteroidia;;Bacteroidales;;Porphyromonadaceae;;AB243818_g;FJ672469_s;;FJ672469
IOFBYRO01CGIIX ATGAACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGAGGGGCAGCACGGTATAGCAATATATGGGTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACACAACCTTCCGGTGAGCGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCATACTATAATGATCAGGCATCTGGTTATTATCAAAGGCTTCGGCCGCTTATTGATGGGTGTGCGTCTGATTAGGTAGTTGGCGGGGTAGAGGCCCACCAAGCCTACGATCAGTAGCTGATGTGAGAGCATGATCAGCCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGACAATGGACGCAAGTCTGATCCAGCCATGCTGCGTGAAGGATGAATGCCCTCTGGGTTGTAAACTTCTTTTACAGGGGAAGAAAGTTATCTTTTTTAGGATATTTGACGGTACCCTATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTG FN665659 97.8 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Sphingobacteria;;Sphingobacteriales;;Chitinophagaceae;;Hydrotalea;Hydrotalea flava;;CCUG 51397-FN665659(T)
IOFBYRO01BUV35 TGAACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGTGGGGCAGCACAGAATAGCAATATTTGGGTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACACAACCTTCCGATAAGTGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCGTAACATATAGAGATGGCATCGTCTTTATATTATAGCTTCGGTGCTTATTGATGGGTGTGCGTCTGATTAGGTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCTACGATCAGTAGCTGATGTGAGAGCATGATCAGCCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAAGGATGAATGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATTTGGGACGAAAAAGAGCATTCTTGCTCACTTGACGGTACCAAGTGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTG 4P004047 99.24906689 Bacteria;;;Bacteroidetes;;Sphingobacteria;;Sphingobacteriales;;Chitinophagaceae;;4P004046_g;4P004046_s;;4P004047
표 8 Streptophyta
Raw data Seq Name Sequence Hit accession Similarity Taxonomic assignment
IOFBYRO01BVMU5 GATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGGACGGGAAGTGGTGTTTCCAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAACCTGCCCTTGGGAGGGGAACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCCCGTAGGCTGAGGAGCAAAAGGAGGAATCCGCCCGAGGAGGGGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGCAATAGCTTACCAAGGCGATGATCAGTAGCTGGTCCGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATGCCGCGTGGAGGTAGAAGGCCCACGGGTCGTGAACTTCTTTTCCCGGAGAAGAAGCAATGACGGTATCTGGGGAATAAGCATCGGCTAACTCTGTG CAAP02016081 100 Eukarya;Viridiplantae;;Streptophyta;;eudicotyledons;;core eudicotyledons;;Vitaceae;;Vitis;Vitis vinifera;;CAAP02016081
IOFBYRO01DG9Y3 GATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGGACGGGAAGTGGTGTTTCCAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAACCTGCCCTTGGGAGGGGAACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCCCGTAGGCTGAGGAGCAAAAGGAGGAATCCGCCCGAGGAGGGGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGCAATAGCTTACCAAGGCGATGATCAGTAGCTGGTCCGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATGCCGCGTGGAGGTAGAAGGCCCACGGGTCGTGAACTTCTTTTCCCGGAGAAGAAGCAATGACGGTATCTGGGGAATAAGCATCGGCTAACTCTGTG CAAP02016081 100 Eukarya;Viridiplantae;;Streptophyta;;eudicotyledons;;core eudicotyledons;;Vitaceae;;Vitis;Vitis vinifera;;CAAP02016081
IOFBYRO01BVXH2 GATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGGACGGGAAGTGGTGTTTCCAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAACCTGCCCTTGGGAGGGGAACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCCCGTAGGCTGAGGAGCAAAAGGAGGAATCCGCCCGAGGAGGGGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGCAATAGCTTACCAAGGCGATGATCAGTAGCTGGTCCGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATGCCGCGTGGAGGTAGAAGGCCCACGGGTCGTGAACTTCTTTTCCCGGAGAAGAAGCAATGACGGTATCTGGGGAATAAGCATCGGCTAACTCTGTG CAAP02016081 100 Eukarya;Viridiplantae;;Streptophyta;;eudicotyledons;;core eudicotyledons;;Vitaceae;;Vitis;Vitis vinifera;;CAAP02016081
IOFBYRO01CVD3E GATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGGACGGGAAGTGGTGTTTCCAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAACCTGCCCTTGGGAGGGGAACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCCCGTAGGCTGAGGAGCAAAAGGAGGAATCCGCCCGAGGAGGGGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGCAATAGCTTACCAAGGCGATGATCAGTAGCTGGTCCGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATGCCGCGTGGAGGTAGAAGGCCCACGGGTCGTGAACTTCTTTTCCCGGAGAAGAAGCAATGACGGTATCTGGGGAATAAGCATCGGCTAACTCTGTG CAAP02016081 99.77 Eukarya;Viridiplantae;;Streptophyta;;eudicotyledons;;core eudicotyledons;;Vitaceae;;Vitis;Vitis vinifera;;CAAP02016081
② 정액 유래 루테리알
실시예 2에서 얻은 정액 유래 루테리알을 위와 같은 방법으로 gDNA 추출, PCR 증폭 및 염기서열 분석을 진행하였다. 도 25는 피로·질병상태(정액의 pH: 7.0 이하)인 정액 유래 루테리알의 16S rRNA를 염기서열 분석하여 상동성을 나타내는 유사 박테리아 구성을 나타낸 것으로 루테리알 크기별로 분석하였다((a): 100nm 이하, (b): 100~200nm, (d) 400~800nm).
정상상태의 정액 유래 루테리알은 혈액유래 루테리알과 마찬가지로 Proteobacteria, Firmicutes 및 Bacteroidetes 유래 유전자와 상동성을 나타냈으며, 특이하게 Chordata 유래 유전자와 상동성이 있는 것으로 나타났다.
아울러, 비정상상태인 산성조건에서는 Streptophyta 유래 유전자와 상동성을 가지는 유전자가 발현되었다.
(7) ATP 함량 측정
대조군, 루테리알, 루테리알(SSH 12h) 및 루테리알(SSF 12h)으로 구성된 4종 배양액 10 mL를 각각 튜브에 넣고 Glucose(100mg/mL) 및 ADP(1mM) 기질을 넣어 37℃ 수욕상에서 배양하였다. 배양 시작 후 30min 간격으로 시료 100μl를 채취하여 튜브에 넣고 900μl의 증류수를 넣어 10배 희석한 후 10μl의 시료를 새로운 튜브에 옮기고 ATP kit에 포함되어 있는 luciferase 시약을 100μl 첨가하고 즉시 luminometer로 5회 반복하여 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 루테리알이 첨가된 군에서 루테리알이 첨가되지 않은 군에 비해 ATP 농도가 증가한 것으로 나타났다. 이 결과로부터 루테리알은 ATP 생산 능력이 있다는 것을 확인할 수 있었다. SSH 및 SSF 첨가의 차이점을 살펴보면, SSF 첨가군이 SSH 첨가군에 비해 ATP 농도가 높았다(도 18).
실시예 4: 루테리알의 배양
(1) 실시예 1에서 수득된 루테리알 중 크기가 약 50~200 nm인 루테리알에 PBS를 첨가하고 IR 광선을 조사한 뒤, 약 3시간 동안 18~30℃에서 배양하였다. IR 광선을 조사한 직후부터 약 1시간 간격으로 루테리알의 크기를 현미경으로 확인하였다. 약 1~6시간 뒤, 배양 전 그 크기가 약 200 nm인 루테리알이 약 500 nm으로 성장하였음을 확인할 수 있었다. 이로써, 혈액유래 루테리알에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃에서 배양하는 경우, 그 크기를 500 nm정도까지 성장시킬 수 있었다. 물론, 추가 배양시 수백 μm까지 배양되는 것을 확인할 수 있었고, 이 상태에서 추가 배양시 bursting되는 것도 확인하였다(도 22).
(2) 실시예 1에서 수득된 루테리알 중 크기가 약 400~800 nm인 루테리알에 PBS를 첨가하고 IR광선 조사한 뒤, 약 3시간 동안 18~30℃에서 배양하였다. IR 광선을 조사한 직후부터 약 1시간 간격으로 루테리알의 크기와 상태를 현미경으로 확인하였다. 약 1~6시간 뒤, 배양 전 그 크기가 약 400~800 nm인 루테리알이 성장하지는 않고 피션(fission)되는 것을 확인하였다.
아울러, 800 nm 이상의 변이 루테리알을 추가로 배양할 경우, 암환자의 혈액에서 나타난 변이 루테리알의 형태로 변하는 것이 관찰되었다 (도 23).
실시예 5: 루테리알의 항암효과
난소암세포주 SKOV3 및 A2780 2종의 증식억제 효과를 측정하기 위하여 황색 테트라졸륨 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석법을 실시하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 생육을 측정하는 방법으로써, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 보라색 포마잔(formazan)을 생성하는 원리를 이용한다. 보라색 포마잔(formazan)의 생산량은 대사적으로 활성이 있는 살아있는 세포수와 거의 비례하는 것으로 알려져 세포의 생육과 분화를 측정하는데 아주 효과적으로 사용될 수 있다.
배양된 각각의 암세포를 96 well plate에 5×104 개/ml가 되도록 well당 100μl씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 습윤한 인큐베이터에서 배양한 후, 100~800 nm 크기의 루테리알을 농도별로 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후, 각 well에 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 녹인 MTT(5 mg/ml) 용액을 15μl씩 첨가하여 다시 4시간 동안 배양시켰다. 포마잔(formazan) 형성을 확인한 후 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 포마잔을 녹이기 위해 100μl의 디메틸 설포시드(DMSO)를 첨가하였다. 그런 후, 마이크로 플레이트리더(GEMINI, Stratec biomedical)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포 증식 억제율을 산출하였다.
그 결과, SKOV3 및 A2780 세포주의 루테리알 IC50는 각각 30 μg/ml 및 60 μg/ml 이었고, 시판중인 항암제 cisplatin의 IC50는 100 μM 이었다(도 27). 루테리알은 난소암세포주 2종에 대하여 양성대조약물군 보다 강력한 세포독성을 나타내었고 난소정상세포에 대해서는 양성대조 약물군과 비슷한 세포독성을 나타내었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따르면, 환자 또는 정상인의 체액 내에 존재하는 미세물질인 루테리알을 효과적으로 분리할 수 있고, 상기 분리된 루테리알을 일정 크기로 성장하도록 배양할 수 있어 질병의 진단 및 치료에 유용하다. 특히 루테리알은 암세포주에 대하여 강력한 항암효과를 나타내므로 항암제로 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (20)

  1. 다음 단계를 포함하는 루테리알의 분리방법:
    (a) 혈액에서 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리하는 단계;
    (b) 상기 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리시킨 혈액을 원심분리하는 단계;
    (c) 상기 원심분리에 의해 수득한 상등액으로부터 루테리알을 분리하는 제3분리단계; 및
    (d) 상기 분리된 루테리알을 세정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액은 포유동물 유래인 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혈액은 인간유래인 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1분리단계는 0.8~1.2 μm 의 공극을 가지는 필터로 필터링한 다음, 필터에 걸린 부위를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  5. 제4항에 있어서, 200 μm, 400 μm, 600 μm, 800 μm 및 1000 μm 필터를 순차적으로 이용하여, 각각 50~200 μm, 200~400 μm, 400~600 μm, 600~800 μm 및 800~1000 μm 크기의 루테리알로 분류하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2분리단계는 1200~5000rpm에서 5~10min 반복적으로 원심분리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제2분리단계에 의해 엑소좀(exosome)이 제거되는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제3분리단계는 원심분리를 통해 수득한 상등액에 가시광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세정단계는 상기 제3분리단계에 의해 수득되는 루테리알을 50nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 세척하여 루테리알을 수득하여 수행되는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  10. 다음의 특성 중 하나 이상을 가지는 체액 유래 루테리알:
    (a) 면역형광시험에서 야누스 그린 B(Janus green B), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 로다민123(Rhodamine123)에 양성의 발색반응을 나타냄;
    (b) 최적상태(pH 7.2~7.4)에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자의 발현특성을 나타내고, 30~800 nm의 크기를 가짐;
    (c) 산성화 상태에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자뿐만 아니라, 진핵세포인 Sterptophyta 유전자를 발현하고, 400 nm 이상부터 2000 nm 이상까지 크기가 커짐;
    (d) 정상조건에서 ATP생성에 관여함;
    (e) 미토콘드리아 및 엑조좀과는 전혀 다른 세포 또는 세포 유사체임;
    (f) 정상상태에서는 원형 내지 타원형이고, 환자 유래의 경우 정상상태보다 크기(장직경 800nm 이상)가 크고, 형태가 불균일한 변이 루테리알 발생;
    (g) 이중막 구조를 가지고, 부착성이 있음;
    (h) 세포 안 또는 밖에서 모두 존재 가능함;
    (i) 운동성이 있고, 퓨전(fusion) 및/또는 피전(fission) 생태양식을 나타냄;
    (j) 특정 조건에서 변이 루테리알은 bursting되고, bursting 이후에는 stemness를 가짐; 및
    (k) p53 유전자 및 텔로미어 조절기능을 가짐.
  11. 제10항에 있어서, 상기 체액은 포유동물 유래 혈액, 정액, 장액, 타액 또는 세포액인 것을 특징으로 하는 루테리알.
  12. 제10항의 루테리알에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 루테리알의 배양방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 배양 전 및 후 루테리알의 크기는 각각 50~200 nm 및 300~800 nm인 것을 특징으로 하는 루테리알의 배양방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 수분은 식염수 또는 PBS 용액인 것을 특징으로 하는 루테리알의 배양방법.
  15. 다음 단계를 포함하는 루테리알의 분리방법:
    (a) 체액을 1차 원심분리한 다음, 상등액을 2~5 μm 필터로 필터링하는 단계; 및
    (b) 상기 필터링된 용액을 2차 원심분리한 다음, 상등액을 0.5~2 μm 필터로 필터링하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, (c) 상기 (b)단계에서 필터링된 용액에 가시광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 체액은 포유동물 유래 혈액, 정액, 장액, 타액 또는 세포액인 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 1차 원심분리는 2000~4000rpm에서 5~30min 수행되는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 2차 원심분리는 3000~7000rpm에서 5~20min 수행되는 것을 특징으로 하는 루테리알의 분리방법.
  20. 제10항의 루테리알을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물.
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