WO2015105294A1 - 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물 - Google Patents

5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2015105294A1
WO2015105294A1 PCT/KR2014/013005 KR2014013005W WO2015105294A1 WO 2015105294 A1 WO2015105294 A1 WO 2015105294A1 KR 2014013005 W KR2014013005 W KR 2014013005W WO 2015105294 A1 WO2015105294 A1 WO 2015105294A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
xylitol
oral
composition
ribose
pentose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2014/013005
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
홍수형
이헌진
도애진
박상빈
오태준
이범기
이현호
이민찬
이소희
한세영
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Original Assignee
Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020140191320A external-priority patent/KR101735895B1/ko
Application filed by Industry Academic Cooperation Foundation of KNU filed Critical Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Publication of WO2015105294A1 publication Critical patent/WO2015105294A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7004—Monosaccharides having only carbon, hydrogen and oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting biofilm formation by inhibiting oral bacterial adhesion and oral product comprising pentose sugar and xylitol as active ingredients.
  • Bacteria in the oral cavity are believed to be the cause of various oral diseases, including dental caries and periodontal disease. They are not simply suspended in the oral cavity, but are present as biofilms attached to intraoral tissues (especially teeth). Oral biofilms themselves have a protective effect on the outside, as well as host immunity and resistance to antibiotics. Oral biofilms are particularly important for initial attachment by Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus , which are well known as caries, and then Gram-negative bacteria in addition to other Gram-positive bacteria It forms a complete biofilm. Therefore, it is assumed that the prevention of streptococci early adhesion is very important for the prevention of oral disease.
  • the present inventors have made efforts to develop biofilm inhibitors capable of inhibiting oral bacterial adhesion.
  • pentose sugar and xylitol are synergistically affected by Streptococcus mutans or Streptococcus sobriners.
  • the present invention was completed by confirming the fact that Streptococcus sobrinus effectively inhibits biofilm formation.
  • an object of the present invention is to provide a composition for inhibiting oral bacterial adhesion, comprising pentose sugar and xylitol as an active ingredient, and a method for preventing or treating oral diseases using the same.
  • Another object of the present invention is to provide a product for oral cavity containing pentose sugar and xylitol as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for inhibiting oral bacteria adhesion and oral products comprising pentose sugar and xylitol as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of inhibiting the adhesion of oral bacteria by treating a subject with a composition comprising pentose sugar and xylitol as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for inhibiting oral bacterial adhesion of the composition comprising pentose sugar and xylitol as an active ingredient.
  • the pentose sugar is D-arabinose (D-arabinose), L-arabinose (L-arabinose), D-ribose (D-ribose), L-ribose (L- ribose) and D-xylose.
  • the oral bacteria may be Streptococcus mutans or Streptococcus sobrinus .
  • the oral bacteria may be xylitol resistant bacteria.
  • the pentose sugar and xylitol may be contained in a weight ratio of 0.1 to 10: 1 to 100.
  • the composition may inhibit the expression of gbpC (glucan binding protein C) and dblB (dextran-binding lectin B) gene.
  • the composition may prevent or treat periodontal disease, gingivitis, periodontitis or dental caries.
  • the oral product is selected from the group consisting of toothpaste, gargle products, gum, candy, caramel, jelly, oral spray, oral ointment, mouthwash, mouthwash and tooth whitening agent.
  • toothpaste gargle products, gum, candy, caramel, jelly
  • oral spray oral ointment, mouthwash, mouthwash and tooth whitening agent.
  • Oral composition according to the present invention can inhibit the influx of bacteria of AI-2 (autoinducer-2) associated with the formation of bacterial plaque, thereby effectively suppressing plaque formation by reducing the expression of gbpC, dblB, which promotes bacterial adhesion It can work.
  • AI-2 autoinducer-2
  • the pentose and xylitol of the present invention can be useful as a food additive because it is inexpensive and harmless to the human body and can add taste.
  • FIG. 2 shows the effects of D-arabinose, L-arabinose, L-ribose, and D-xylose on the formation of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus biofilms at 5 mM concentration, respectively.
  • D-arabinose L-arabinose
  • L-ribose L-ribose
  • D-xylose D-xylose
  • Figure 5 shows the effect of ribose and reserpin on the expression of the dblB gene of gbpC, Streptococcus sobrinus of Streptococcus mutans ( Streptococcus mutans ).
  • Figure 6 shows the synergistic effect on the inhibition of biofilm formation of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus when treated with xylitol and ribose simultaneously.
  • Figure 9 is a photograph showing the result of staining the teeth with a plaque staining agent in order to determine the effect on the oral plaque formation in vivo when using a toothpaste containing xylitol, ribose alone or together.
  • the present invention is characterized by providing a composition for inhibiting oral bacterial adhesion, comprising pentose sugar and xylitol as an active ingredient.
  • Pentasaccharide refers to a monosaccharide composed of five carbon atoms, commonly called pentose.
  • the chemical formula is C 5 H 10 O 5
  • aldopentose having an aldehyde group includes ribose, arabinose and xylose
  • ketopentose includes xylose and ribose. It is known that D-ribose, D, L-arabinose and D-xylose are widely distributed in the flora and fauna in nature.
  • Oral plaque or bacterial biofilm, is the earliest that the Streptococci species adheres to the tooth surface and then the other oral flora continues to adhere to the Streptococci upper layer, resulting in a thickening of the layer. Formation can be inhibited, resulting in oral disease prevention.
  • xylitol is absorbed by oral bacteria but cannot be used as an energy source, it is known to inhibit the growth of plaque bacteria. However, as the generation of bacteria increases after exposure to xylitol, resistance to xylitol becomes more frequent. . In addition, xylitol can be expected to suppress tooth decay only when a continuous supply of 10 to 25 g (about 7 in general xylitol gum) per day.
  • the present inventors examined the effect of oral bacterium suppression mechanism on the plaque formation when the oral bacterium suppression mechanism is treated with totally different xylitol.
  • the biofilm-forming ability of caries was significantly decreased than that with each treatment.
  • xylitol resistance was significantly reduced.
  • the present invention provides a composition for inhibiting oral bacterial adhesion, comprising pentose sugar and xylitol as an active ingredient.
  • composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating periodontal disease, gingivitis, periodontitis and / or dental caries.
  • compositions according to the invention may comprise pharmaceutically effective amounts of pentose alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the disease. This may vary according to the degree of symptoms of the disease, the age, weight, health status, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition which is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like when administered to a human.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the composition according to the invention can be administered via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, the dosage of the active ingredient being determined by several factors such as the route of administration, the age, sex, weight and severity of the patient. It may be appropriately selected depending on.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with known compounds having the effect of preventing, ameliorating or treating oral diseases such as periodontal disease, gingivitis, periodontitis or dental caries.
  • composition according to the present invention may provide an effect of alleviating oral diseases such as periodontal disease and dental caries through the effect of reducing biofilm formation of Streptococcus mutans or Streptococcus sobrinus .
  • oral diseases such as periodontal disease and dental caries
  • Streptococcus mutans or Streptococcus sobrinus .
  • the composition of the present invention can be added to foods for the purpose of preventing or treating oral diseases and suppressing bad breath, and thus can be used as a food composition for preventing and improving symptoms of oral disease and suppressing bad breath.
  • it can be easily used as a food, such as the main raw material, secondary ingredients, food additives, functional foods or beverages that are effective in preventing and improving symptoms of oral disease.
  • the food means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, and preferably means a state in which it can be directly eaten through a certain processing step, and as a conventional meaning, It includes all foods, food additives, functional foods and beverages.
  • Foods to which the composition according to the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, functional foods, and the like.
  • food includes special nutritional products (e.g., formulated milk, young, infant food, etc.), processed meat products, fish products, tofu, jelly, noodles (e.g. ramen, noodles, etc.), bread, health supplements, seasonings.
  • Foods e.g., soy sauce, miso, red pepper paste, mixed soy sauce
  • sauces e.g. snacks
  • candy chocolates, gum, candy, ice cream
  • dairy products e.g.
  • fermented milk, cheese, etc. other processed foods
  • Kimchi, pickled foods variant kimchi, pickles, etc.
  • beverages e.g., fruit drinks, vegetable drinks, soy milk, fermented beverages, etc.
  • natural seasonings e.g., ramen soup, etc.
  • the food, beverage or food additives may be prepared by a conventional manufacturing method.
  • the functional food is a biological defense rhythm control, disease prevention and recovery of a food group or a food composition that has added value to the food by using physical, biochemical, biotechnological techniques, etc. to function and express the function of the food for a specific purpose. It means a food that is designed and processed to fully express the body regulatory function related to the living body, specifically, it may be a health functional food.
  • the functional food may include food acceptable food additives, and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
  • the beverage refers to a generic term for drinking to quench thirst or enjoy a taste and includes a functional beverage.
  • the beverage is an essential ingredient in the indicated proportions, including the composition for treating or preventing oral disease such as periodontal disease, gingivitis or dental caries, according to the present invention is not particularly limited to other ingredients and various flavors, such as ordinary drinks Agent or natural carbohydrate and the like may be included as additional components.
  • foods containing the composition of the present invention include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavoring agents, colorants and fillers (such as cheese and chocolate), and pectic acid. And salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like, which components may be independently or in combination Can be used.
  • the amount of the composition according to the present invention may comprise from 0.001% to 90% by weight of the total food weight, preferably from 0.1% to 40% by weight.
  • the amount of the composition according to the present invention may comprise from 0.001% to 90% by weight of the total food weight, preferably from 0.1% to 40% by weight.
  • it may be included in a ratio of 0.001g to 2g, preferably 0.01g to 0.1g based on 100ml, in the case of long-term intake for health and hygiene purposes or health control purposes It may be less than the range, the active ingredient is not limited to the above range because it may be used in an amount above the range because there is no problem in terms of safety.
  • the present invention can provide a health functional food for the improvement, prevention or treatment of oral diseases, such as periodontal disease, gingivitis or dental caries, containing pentose sugar and xylitol according to the present invention as an active ingredient
  • the form of the food May be in the form of powder, granules, tablets, capsules or beverages, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a product for oral cavity containing the composition.
  • Compositions according to the present invention containing the pentasaccharide is an oral composition that can be included in all products manufactured and marketed for oral health in general, there is no limitation on the oral product to be applied.
  • the oral product may include, but is not limited to, toothpaste, oral spray, oral cleaner, oral ointment, oral cleanser, gargle product, gum, and the like.
  • Oral products of the present invention may be in the form of liquid, solid, suspension, gel, aerosol, but is not limited thereto.
  • Appropriate additives, carriers, and the like may be further included in the antimicrobial composition for application to the oral products of the present invention, and the additives and carriers may be appropriately selected and combined by those skilled in the art. .
  • bacterial adhesion that is, the degree of biofilm formation was commonly measured as follows.
  • a pellicle composed of glycoproteins and mucous substances among saliva components plays an important role. Therefore, in this experiment, artificial saliva (Taliba, Hallym Pharm) was evenly sprayed on the plate bottom to simulate the oral environment, and then used after coating for 1 hour at 37 °C.
  • S. mutans were incubated overnight in a BHI liquid medium, and again used a mid-log phase of 0.3 OD after 1% inoculation in the same medium.
  • the bacteria were inoculated 1% in 1 mL of BHI medium dispensed into each well of a 12-well polystyrene plate (Corning, NY. USA).
  • various pentose sugars D-ribose, L-ribose, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose
  • xylitol D-xylitol
  • reserpine various pentose sugars (D-ribose, L-ribose, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose), xylitol, and reserpine are treated by concentration, and the effect of sucrose is confirmed.
  • Sucrose was also added to the medium in various ways.
  • Reserpin an ABC membrane transport inhibitor
  • DMSO was added at a concentration of 1/1000 (v / v) to a reserpine control well.
  • ⁇ ribose '' D-ribose
  • the present inventors have identified oral bacteria Streptococcus mutans and Streptococcus sobrie.
  • both bacteria showed that the degree of biofilm formation decreased significantly as the concentration of ribose increased. 1).
  • Example 1 The present inventors confirmed that the ribose in Example 1 is capable of inhibiting the formation of oral bacteria biofilm, and to examine whether such an effect is also applied to other types of pentose, pentose other than ribose tested in Example 1 ( D-arabinose, L-arabinose, L-ribose, D-xylose) 5 mM each was added to 0.3% sucrose-BHI medium and the degree of bacterial biofilm formation was examined.
  • the present inventors confirmed whether the mechanism by which ribose inhibits bacterial biofilm formation is due to competition between AI-2 and ribose when AI-2, a signaling material that regulates bacterial biofilm formation, is introduced into cells.
  • AI-2 a signaling material that regulates bacterial biofilm formation
  • biofilm formation was increased as reserpine concentration increased to 1, 5, and 10 ⁇ M compared to the control group DMSO. It can be seen that the degree is significantly reduced (see Fig. 3).
  • Biofilm formation can also be affected by the degree of bacterial growth and the medium pH. Therefore, the present inventors conducted the experiment as follows to determine whether the effect of pentose sugar and reserpin on biofilm formation is due to bacterial growth or medium pH change.
  • sucrose medium inoculated with various concentrations of ribose and reserpin was inoculated with bacteria and cultured for 24 hours, and then the pH of the medium was measured with a pH meter. Thereafter, the medium was sonicated twice for 30 seconds to completely separate bacteria aggregated with each other, and then absorbance was measured at 600 nM by a spectrophotometer. In addition, when the xylitol and ribose were simultaneously treated, the pH change of the growth medium of the bacteria was measured by the same method. These experiments were repeated three times independently and statistically processed.
  • OD600 and medium pH were measured after 24 hours of incubation of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in 0.3% -BHI medium supplemented with various concentrations of ribose and reserpin. , Ribose and reserpin did not significantly affect the growth of bacteria and medium pH at all concentrations (see Figure 4).
  • GbpC glucan binding protein C plays an important role in the attachment process from each bacterium to identify the mechanisms by which ribose and reserpin inhibit the adhesion of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus And expression of the dblB (dextran-binding lectin B) gene.
  • gbpC forward primer 5'-AATTCTGATACTGTTGCA-3 '
  • gbpc-reverse primer 5'-TTCTGTTGCAGCCGGTTCT-3 '
  • dblB forward primer 5'-GGTGCGGCTTCTGTCTTACTTG-3 '
  • dblb reverse primer 5'-CGCGGAATTACCTGCTGTTT-3 '
  • 16S-forward primer 5'-ATCACTAGTAGATGGA-3 '
  • 16S-reverse primer 5'-TGTATCGTCGCCTTGGTAAG-3 '
  • Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus were passaged once every two days to 15 generations in BHI medium containing 1% xylitol. At this time, the control group was subcultured in the same manner without adding xylitol. Subsequently, bacterial biofilm formation was quantified in the same manner as in Example 1 when each generation of bacteria was added with 10 mM ribose with BHI containing 0.3% sucrose and 1% xylitol as a base medium. .
  • the present inventors conducted the experiment in the same manner as in Example 4 to confirm the growth of bacteria and the change of medium pH when xylitol and ribose were treated simultaneously.
  • xylitol-containing medium Bacteria growing on xylitol-containing medium are known to be resistant to xylitol as the number of generations increases.In this experiment, we subcultured up to 15 generations of Streptococcus mutans in BHI medium containing 1% xylitol. (xylitol-resistant) Each generation of bacteria was cultured in a medium containing xylitol and ribose to measure the degree of biofilm formation. In this case, as a control, the result of comparing bacteria using xylitol-sensitive passaged to 15 generations in a medium not containing xylitol was shown as shown in FIG. 8.
  • xylitol-resistant Streptococcus mutans which were resistant to xylitol, significantly decreased biofilm formation with the number of generations, and then increased again until generations 8-10 (## P ⁇ 0.0005). It remained almost constant at about%. Even xylitol-sensitive Streptococcus mutans , which have not been exposed to xylitol for a long time, continue to decrease until 6th generation and then increase to 10th generation (* P ⁇ 0.05). Was maintained.
  • the degree of biofilm formation of first-generation xylitol-resistant bacteria was statistically increased, but similar results were found in the medium containing ribose.
  • the effect of ribose on xylitol-resistant and xylitol-sensitive bacterial biofilm formation was found to be reduced across all generations in both groups. In the first generation, the difference in the degree of biofilm formation between the two groups was 30%, but in the 15th generation, it was less than 5%.
  • the plaque area was measured by photographic image analysis and quantified by the relative value when the plaque area of the control group was 1.000. The average value was calculated.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물 및 구강용 제품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 구강 조성물은 세균 치태형성과 관련된 AI-2(autoinducer-2)의 세균 내 유입을 억제할 수 있으며, 이를 통해 세균 부착 촉진 유전자인 gbpC, dblB의 발현을 감소시킴으로써 치태형성을 효과적으로 억제할 수 있는 효과가 있다. 또한, 5탄당은 기존에 충치억제를 위해 널리 사용되고 있는 자일리톨의 효과를 상승시킬 뿐 아니라 자일리톨 내성에 의한 반작용을 억제시키는 효과도 있는 것으로 확인되었다. 본 발명의 5탄당 및 자일리톨은 가격이 저렴하며 인체에 무해할 뿐 아니라 맛을 더할 수 있어 식품첨가물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물
본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는, 구강 세균 부착 억제에 의한 바이오필름 형성 저해용 조성물 및 구강용 제품에 관한 것이다.
구강 내 세균들은 치아 우식 및 치주질환을 비롯한 여러 구강질환의 원인으로 여겨진다. 이들은 단순히 구강 내에 부유하는 것이 아닌 구강내 조직(특히 치아)에 붙어있는 바이오필름(biofilm)으로 존재한다. 구강 바이오필름은 그 자체가 외부에 대한 방어막 효과를 가지며, 숙주면역, 항생제에 대한 저항성도 가진다. 구강 바이오필름은 특히 충치균으로 잘 알려져 있는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)에 의한 초기 부착이 중요하며 그 후 기타 그람 양성세균 외에 그람 음성세균들도 서로 응집하여 완전한 바이오필름을 이룬다. 따라서 구강질환의 예방을 위해서는 streptococci의 초기 부착을 어떻게 억제하느냐가 매우 중요한 것으로 추정되고 있다.
그러나 많은 연구팀들이 바이오필름을 제거할 수 있는 항미생물제(antimicrobial agent)와 살충제(biocides)를 개발하였지만 이런 물질들은 대부분 비특이적으로 세균의 증식을 억제함으로 정상구강세균총의 균형을 파괴할 뿐 아니라 환경에도 유해한 영향을 미칠 수 있으므로 친환경적인 바이오필름 억제제를 개발할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 구강 세균 부착을 억제할 수 있는 바이오필름 억제제를 개발하기 위하여 노력해온 결과, 5탄당 및 자일리톨이 상승작용에 의하여 단독 물질에 비하여 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 또는 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)의 바이오필름 형성을 효과적으로 억제한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물, 및 이를 이용한 구강질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강용 제품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는, 구강 세균 부착 억제용 조성물 및 구강용 제품을 제공한다.
또한, 본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 처리함으로써 구강 세균의 부착을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 조성물의 구강 세균 부착 억제 용도를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 5탄당은 D-아라비노즈(D-arabinose), L-아라비노즈(L-arabinose), D-라이보스(D-ribose), L-라이보스(L-ribose) 및 D-자일로스(D-xylose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 구강 세균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 또는 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 구강 세균은 자일리톨 내성균일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 5탄당과 자일리톨은 0.1∼10 : 1∼100의 중량비로 함유될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 gbpC (glucan binding protein C) 및 dblB(dextran-binding lectin B) 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 치주질환, 치은염, 치주염 또는 치아우식을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 구강용 제품은 치약, 가글링 제품, 껌, 사탕류, 캬라멜류, 젤리류, 구강 스프레이, 구강용 연고, 구강세정제, 구강 청정제 및 치아미백제로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 구강 조성물은 세균치태 형성과 관련된 AI-2(autoinducer-2)의 세균 내 유입을 억제할 수 있으며, 이를 통해 세균 부착 촉진 유전자인 gbpC, dblB의 발현을 감소시킴으로써 치태형성을 효과적으로 억제할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 5탄당 및 자일리톨은 가격이 저렴하며 인체에 무해할 뿐 아니라 맛을 더할 수 있어 식품첨가물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 라이보스(D-ribose)가 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 바이오필름 형성에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 바이오필름 형성은 바이오필름 내의 전체 세균과 죽은 세균을 특이적인 형광항체로 각각 염색 후 죽은 세균을 제외시키고 살아있는 세균만을 세어서 나타내었다.
도 2는 D-arabinose, L-arabinose, L-ribose, D-xylose가 각각 5 mM 농도에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 바이오필름 형성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 3은 ABC 트랜스포터 억제제인 레세르핀이 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 바이오필름 형성에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 4는 라이보스 및 레세르핀이 Streptococci 증식 및 배지 pH에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.(A) 라이보스(D-ribose), (B) 레세르핀
도 5는 라이보스 및 레세르핀이 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 gbpC, 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)의 dblB 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 6은 자일리톨과 라이보스를 동시에 처리하였을 때 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)의 바이오필름 형성 억제에 대한 상승효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 자일리톨, 라이보스를 각각, 또는 동시에 처리하였을 때 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 증식 및 배지 pH에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.(A) 세균의 증식, (B) 배지 pH
도 8은 라이보스가 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 자일리톨에 대한 내성을 억제함으로 자일리톨에 오래 노출된 세균에서 바이오필름 형성이 증가되는 현상을 완하시키는 효과를 분석한 결과이다.
도 9는 자일리톨, 라이보스를 단독, 또는 함께 포함하는 치약을 사용하였을 때 in vivo에서 구강의 치태 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 치태염색제로 치아를 염색한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 자일리톨, 라이보스를 단독, 또는 함께 포함하는 치약을 사용하였을 때 in vivo에서 구강의 치태 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 치태염색제로 치아를 염색한 후, 각각의 치태 면적을 대조군에 대한 상대적인 값으로 나타낸 그래프이다(p=0.004).
본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는, 구강 세균 부착 억제용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
5탄당은 탄소원자 5개로 이루어진 단당류를 의미하는 것으로서, 흔히 펜토스라고 부른다. 화학식은 C5H10O5이고, 알데하이드기를 가진 알도펜토스로서는 리보스, 아라비노스, 자일로스가 있고, 케토펜토스에는 자일로스, 리블로스 등이 있다. 천연으로 동식물계에 널리 분포하는 것은 D-리보스·D,L-아라비노스·D-자일로스 등이 있다고 알려져 있다.
한편, 치아에 구강세균이 계속적으로 부착되어 치태가 형성되면 이 세균층에 대해 숙주는 계속적으로 면역반응을 일으키게 되고 또한 치태세균이 설탕을 대사한 결과 생성되는 산이 치아를 부식시켜 다양한 치주질환이 발발하게 된다. 구강 치태, 즉 세균 바이오필름은 가장 초기에 Streptococci 균종이 치아표면에 부착되고 그 후 다른 구강세균총이 계속적으로 Streptococci 상부층에 부착되면서 점점 층이 두꺼워지는데 결국 초기에 Streptococci의 치아부착을 억제할 수 있다면 치태형성이 억제되어 결과적으로 구강질환을 예방할 수 있다.
지금까지 자일리톨은 구강세균에 흡수는 되지만 에너지원으로 사용될 수 없어 결국 치태세균의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있지만 자일리톨에 노출된 후 세균의 세대수가 늘어갈수록 자일리톨에 대한 내성이 빈번하게 생겨 그 효과가 떨어진다. 또한, 자일리톨은 1일 10~25 g(일반적인 자일리톨껌 7통 정도)을 계속적으로 공급할 때만 충치 억제 효능을 기대할 수 있다.
5탄당이 구강세균의 치태형성을 억제한다는 보고는 2007년 미국 플로리다 치과대학에서 발표된 이 후 많이 연구되어 왔는데 그 분자기전에 대해서는 autoinducer-2가 세포 내로 유입되는 과정에 관여한다는 정도로만 알려져 왔다. 세균은 환경에 대처하기 위해 서로 신호를 주고 받는데 특정한 물질을 합성하여 세포 외부로 분비하는 방법, 즉 일종의 퀘럼센싱 방법이 그 것이다. 세균 치태형성에서도 퀘럼센싱에 의한 신호전달이 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 autoinducer-2(AI-2)를 세포 내부로 받아들인 후 이 물질에 의해 세균 부착을 촉진하는 유전자(gbpC, dblB 등)의 발현이 유도된다. 따라서 만약 AI-2의 세포내로의 유입을 줄일 수 있다면 치태형성을 효과적으로 억제할 수 있다. AI-2는 ABC 트랜스포터라는 특수한 수용체에 의해 세균 내로 유입되는데 이러한 특성을 고려하여 5탄당이 세균 부착성을 억제하는 기전을 연구한 결과 기본적인 분자구조가 AI-2와 유사한 5탄당이 세균 내로 유입되는 과정에서 AI-2와 서로 경쟁하는 것을 확인하였다.
즉 본 발명의 일실시예를 통해 확인한 결과, 5탄당을 처리한 세균은 고체표면 부착성이 감소하며 AI-2 퀘럼센싱 결과 유도되는 gbpC, dblB 유전자의 발현이 감소되었음을 알 수 있었다.
또한 ABC 트랜스포터 억제제인 레세르핀을 처리하였을 때도 동일한 결과를 얻었다.
나아가 본 발명자들은 5탄당의 이러한 특성을 고려할 때 5탄당을 구강세균 억제기전이 전혀 다른 자일리톨과 함께 처리하였을 때 치태형성에 어떤 영향을 미칠지 조사하였는데 그 결과, 대표적 5탄당인 라이보스 10mM을 1% 자일리톨과 함께 충치균에 처리하였을 때 충치균의 바이오필름 형성 능력이 각각을 처리하였을 때보다 통계적으로 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다. 또한, 세균 세대수가 증가할수록 나타나는 자일리톨 내성 현상이 현저히 감소하였음을 알 수 있었다.
이러한 효과는 in vivo에서도 확인할 수 있었는데, 라이보스와 자일리톨이 함께 첨가된 치약을 사용할 경우, 단독 사용시보다 치태 형성이 현저히 저하됨을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는, 구강 세균 부착 억제용 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 조성물은 치주질환, 치은염, 치주염 및/또는 치아우식을 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 5탄당을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 상기 질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 이는 질환의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 치주질환, 치은염, 치주염 또는 치아우식등의 구강질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 조성물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 또는 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)의 바이오필름 형성을 감소시키는 효과를 통해 치주질환 및 치아 우식 등 구강 질환을 완화시키는 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 대한 별다른 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 조성물은 구강질환의 예방 또는 치료, 구취 억제를 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 구강질환 증상의 예방 및 개선, 구취 억제를 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다. 또한 구강질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 치주질환, 치은염 또는 치아우식 등의 구강질환 치료 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 함유하는 치주질환, 치은염 또는 치아우식 등의 구강질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 구강용 제품을 제공한다. 5탄당을 유효성분으로 하는 본 발명에 따른 조성물은 일반적으로 구강 건강을 위해 제조, 시판되는 제품들에 모두 포함될 수 있는 구강 조성물로서, 적용되는 구강용 제품에는 제한이 없다. 예를들어, 상기 구강용 제품으로는 치약, 구강 스프레이, 구강 세정제, 구강용 연고, 구강 청정제, 가글링 제품, 껌 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구강용 제품은 액상, 고상, 현탁액, 겔상, 에어로졸 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구강용 제품에 적용하기 위해서 적절한 첨가제, 담체 등을 상기 항균 조성물에 추가로 포함시킬 수 있으며, 상기 첨가제 및 담체 등을 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택 및 조합할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 세균 부착, 즉 바이오필름 형성 정도는 공통적으로 다음과 같이 측정되었다. 구강세균의 초기 부착과정에서는 타액 성분 중 당단백질과 점액성 물질로 이루어지는 피막 (pellicle)이 중요한 역할을 한다. 따라서 본 실험에서도 구강환경을 흉내내기 위해 인공타액 (Taliba, 한림제약)을 플레이트 바닥에 골고루 뿌린 후 37℃에서 1시간동안 코팅한 후 사용하였다.
접종용 종균(S.mutans)은 BHI 액체배지에서 밤새 배양하였고, 다시 동일한 배지에 1% 접종 후 OD 0.3정도의 mid-log phase 것을 사용했다. 이 균을 12-웰 폴리스틸렌 플레이트(well polystyrene plate; Corning, NY. USA) 각 웰에 분주되어 있는 BHI 배지 1 mL에 1%씩 접종하였다. 여기에 여러 오탄당 (D-ribose, L-ribose, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose) 및 자일리톨(xylitol), 그리고 레세르핀(reserpine)을 농도별로 처리하고 이 때 sucrose의 영향을 확인하기 위해 sucrose도 다양하게 배지에 첨가하였다. ABC 막 수송 억제제인 레세르핀은 DMSO에 1000 배 농도로 녹여 사용했으므로 레세르핀 대조군 웰(reserpine control well)에는 DMSO를 1/1000 (v/v) 농도로 첨가하였다. 37℃ 호기성 배양기에서 24시간 배양한 후 유세포 분석기에 의해 플레이트 바닥에 형성된 바이오필름 세균을 다음과 같이 정량하였다. 먼저 플레이트에서 배양된 세균 부유액을 제거한 후 멸균된 식염수로 3회 씻은 후 다시 1 mL의 식염수를 넣고 30초식 3회 초음파 처리를 하여 부착된 세균을 떼어낸다. 그 후 죽은 세균만 붉은 색으로 염색하는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide), 모든 세균을 녹색으로 염색하는 Cyto 9으로 동시에 염색한 후 유세포 분석기에 의해 붉은색을 띠지 않는 녹색만 측정함으로 바이오필름 내의 생균수만을 정량한다. 각 실험은 3회 독립적으로 반복하여 통계처리 한다.
<실시예 1>
D-라이보스가 구강세균 바이오필름 형성에 미치는 영향
본 발명자들은 D-라이보스(ribose)(이하 '라이보스'라 명명함)가 구강세균 바이오필름 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 구강세균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 각각에 라이보스를 농도별로 처리한 뒤 바이오필름 형성 정도를 확인한 결과, 두 세균 모두 라이보스 농도가 증가할수록 바이오필름(biofilm) 형성 정도가 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다(도 1 참조).
또한, 라이보스에 의한 바이오필름 형성 억제효과는 sucrose가 첨가되지 않은 배지에서 보다 sucrose가 각각 0.3%, 1% 첨가된 배지에서 통계적으로 유의하게 증가하였는데 (P<0.05~0.0001), 이러한 현상은 sucrose가 충치를 촉진한다는 점을 고려할 때 충치예방에 더욱 효과적일 수 있음을 의미한다. 0.3% sucrose가 첨가된 배지에서 라이보스 10 mM 농도를 처리하면 두 세균 모두에서 바이오필름 형성 정도가 20% 이하로 감소하였는데 앞으로의 실험은 이 조건에서 행하였다.
<실시예 2>
다른 종류의 5탄당이 구강세균 바이오필름 형성에 미치는 영향
본 발명자들은 실시예 1에서 라이보스가 구강세균 바이오필름의 형성을 억제가능함을 확인하였으며, 다른 종류의 5탄당에도 그러한 효과가 있는지를 알아보기 위하여 실시예 1에서 실험한 라이보스 이외의 5탄당(D-arabinose, L-arabinose, L-ribose, D-xylose) 각 5 mM를 0.3% sucrose-BHI 배지에 첨가한 후 세균 바이오필름 형성 정도를 조사하였다.
그 결과, 본 실험에 사용된 모든 5탄당에 대해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)의 바이오필름 형성이 통계적으로 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다(도 2 참조).
<실시예 3>
ABC 수송 억제제인 레세르핀이 세균 바이오필름 형성에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 라이보스가 세균 바이오필름 형성을 억제하는 기전이 세균 바이오필름 형성을 조절하는 신호전달 물질인 AI-2가 세포 내로 유입될 때 AI-2와 라이보스(ribose)의 경쟁 때문인지를 확인하기 위해 ABC 수송억제제(transporter inhibitor)를 처리한 후 동일한 조건에서 바이오필름 형성 정도를 측정한 결과, 대조군인 DMSO에 비하여 레세르핀(reserpine) 농도가 1, 5, 10 μM로 증가할수록 바이오필름 형성 정도가 유의하게 감소하는 양상을 보임을 알 수 있었다(도 3 참조).
<실시예 4>
라이보스 및 레세르핀이 세균의 증식 및 배지 pH에 미치는 영향 분석
바이오필름 형성은 세균의 증식 정도와 배지 pH에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 따라서 본 발명자들은 5탄당 및 레세르핀이 바이오필름 형성에 미치는 영향이 세균 증식 또는 배지 pH 변화에 의한 것인지를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 진행하였다.
여러 농도의 라이보스와 레세르핀이 첨가된 BHI-0.3% sucrose 배지에 세균을 접종하여 24시간 배양 후 배지 pH를 pH meter로 측정하였다. 그 후 30초 동안 2회 배지를 초음파 처리(sonication)하여 서로 응집된 세균을 완전히 분리한 후 분광 광도계(spectrophotometer)에 의해 600 nM에서 흡광도를 측정하였다. 또한 자일리톨과 라이보스를 동시에 처리했을 때도 동일한 방법으로 세균의 증식 배지 pH 변화를 측정하였다. 이러한 실험을 3회 독립적으로 반복하여 통계처리 하였다.
다양한 농도의 라이보스 및 레세르핀이 첨가된 0.3%-BHI 배지에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)를 24시간 배양한 후 OD600과 배지 pH를 측정한 결과, 라이보스 및 레세르핀은 모든 농도에서 세균의 증식 및 배지 pH에 큰 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다(도 4 참조).
따라서 라이보스에 의한 바이오필름 형성 억제효과는 세균의 증식 억제 때문이 아니라 세균의 부착성이 저하됨으로 초래된 결과임을 확인하였다.
<실시예 5>
gbpC & dblB 유전자 발현
라이보스 및 레세르핀이 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 부착 억제기전을 확인하기 위해 각각의 세균으로부터 부착과정에서 중요한 역할을 하는 gbpC (glucan binding protein C) 및 dblB (dextran-binding lectin B)유전자의 발현을 분석하였다.
먼저, 라이보스 및 레세르핀이 첨가된 배지에서 8시간 배양된 두 세균 배양액으로부터 QIAzol solution (QIAGEN, CA, USA)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 그 후 분리된 RNA로 Omniscript RT kit 및 primers (QIAGEN, CA, USA)를 사용하여cDNA를 합성하였다. 마지막으로 gene-specific primer pairs with SYBR Premix Ex taq (TaKaRa, WI, USA)을 사용하여 quantitive real-time PCR을 수행하였다 (ABI Prism 7500, Applied Biosystems, CA, USA). 이 때 사용한 프라이머 세트 시퀀스(primer set sequence)는 다음과 같다.
gbpC forward primer: 5'-AATTCTGATACTGTTGCA-3'
gbpc-reverse primer: 5'-TTCTGTTGCAGCCGGTTCT-3'
dblB forward primer: 5'-GGTGCGGCTTCTGTCTTACTTG-3'
dblb reverse primer: 5'-CGCGGAATTACCTGCTGTTT-3'
16S-forward primer: 5'-ATCACTAGTAGATGGA-3'
16S-reverse primer: 5'-TGTATCGTCGCCTTGGTAAG-3'
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 라이보스가 첨가된 배지에서는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 두 세균 모두에서 각각 gbpC 및 dblb 유전자의 발현이 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
in vitro 에서 자일리톨과 라이보스의 바이오필름 억제 상승효과 확인
자일리톨에 오래 노출된 세균은 자일리톨에 대한 내성이 생기면서 바이오필름 형성정도에도 변화가 초래되는 것으로 알려져 있어 본 연구에서는 라이보스가 자일리톨 내성균의 바이오필름 형성 정도에도 영향을 미치는지 하기와 같이 실험하였다.
먼저 1% 자일리톨이 첨가된 BHI 배지에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)를 15세대까지 2일에 한번 계대배양 하였다. 이때 자일리톨이 첨가되지 않은 배지에도 동일하게 대조군을 계대배양 하였다. 그 후 각 세대의 세균을 0.3% sucrose, 1% 자일리톨이 포함된 BHI를 기본배지로 하여 10 mM 라이보스를 첨가하였을 때와 그렇지 않을 때 각각 실시예 1과 동일한 방법으로 세균 바이오필름 형성을 정량화 하였다.
그 결과, 0.3% sucrose-BHI 배지에서의 자일리톨 처리 군의 바이오필름 형성 정도를 확인한 결과, 41 ~ 52%정도 바이오필름 형성 정도가 감소한 반면, 라이보스 처리 군에서서 87 ~ 88% 바이오필름 형성이 감소하였음을 알 수 있었다. 또한, 자일리톨과 라이보스를 동시에 처리한 군에서는 라이보스만 처리한 경우보다 통계적으로 유의하게 바이오필름 형성이 감소하였음을 알 수 있었다(도 6 참조).
<실시예 7>
자일리톨과 라이보스 동시에 처리하였을 때의 세균의 증식 및 배지 pH 변화 확인
본 발명자들은 자일리톨과 라이보스를 동시에 처리하였을 때의 세균의 증식 및 배지 pH 변화를 확인하기 위하여 실시예 4의 방법과 동일하게 실험을 진행하였다.
그 결과, 1% 자일리톨을 24시간 처리하였을 때 세균의 증식이 다소 감소하였으나 통계적으로 유의성은 없었다. 또한, 자일리톨과 라이보스를 동시에 처리하였을 때에도 세균의 증식에 큰 영향은 없었으며, 배지 pH도 모든 경우에서 큰 차이를 보이지 않았음을 알 수 있었다(도 7 참조).
<실시예 8>
라이보스가 자일리톨 저항성 세균의 바이오필름 형성에 미치는 영향
자일리톨이 포함된 배지에서 자라는 세균은 세대수가 증가할수록 자일리톨에 대한 내성이 생기는 것으로 알려져 있는데 본 실험에서는 1% 자일리톨이 포함된 BHI 배지에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 15세대까지 계대배양한 후 (xylitol-resistant) 각 세대의 세균을 자일리톨 및 라이보스가 포함된 배지에 배양하면서 바이오필름 형성 정도를 측정하였다. 이 때 대조군으로는 자일리톨이 포함되지 않은 배지에서 15세대까지 계대배양한 세균 (xylitol-sensitive)을 사용하여 비교한 결과 도 8과 같은 결과가 나타났다.
먼저 자일리톨에 내성이 생긴 스트렙토코커스 뮤탄스(xylitol-resistant Streptococcus mutans)는 세대 수에 따라 바이오필름 형성이 현저하게 감소하다가 8-10 세대 까지는 다시 증가하였으며 (##P<0.0005), 그 이후에는 80% 정도로 거의 일정하게 유지되었다. 자일리톨에 장시간 노출되지 않은 스트렙토코커스 뮤탄스(xylitol-sensitive Streptococcus mutans) 경우에도 6세대까지는 계속적으로 감소하였으며 다시 10세대까지는 증가하는 추세를 보이고 (*P<0.05), 그 이후에는 60% 정도로 거의 일정하게 유지되었다. 또한, 자일리톨에 내성이 생기지 않은 Xylitol-sensitive 군, 자일리톨에 내성이 생긴 xylitol-resistant 그룹 간의 바이오필름 형성 정도를 비교하면 전체적으로 자일리톨에 내성이 생기지 않은 Xylitol-sensitive 군에서 낮게 나타났음을 알 수 있었다.
1세대 xylitol-resistant 세균의 바이오필름 형성 정도가 통계적으로 유의하게 증가하였는데 라이보스가 포함된 배지에서도 비슷한 양상을 보였다. 라이보스가 xylitol-resistant, xylitol-sensitive 세균 바이오필름 형성에 미치는 영향을 보았을 때 두 그룹 모두에서 전 세대를 통틀어 감소시키는 것을 알 수 있었다. 그리고 1세대에서는 두 그룹간의 바이오필름 형성정도의 차이가 30% 였지만 15세대에서는 5% 미만이었다.
따라서, 이러한 결과는 라이보스가 세균의 바이오필름 형성 정도 측면에서는 자일리톨 저항성을 완화시켜 줄 수 있음을 의미한다.
<실시예 9>
in vivo 에서 자일리톨과 라이보스의 바이오필름 억제 상승효과 확인
상기 실시예 6 내지 8을 통하여, in vitro에서 자일리톨과 라이보스를 동시 처리하였을때 각각 처리한 군에 비하여 바이오필름 형성억제 효과가 더욱 상승되는 것을 확인하였기 때문에, 이러한 상승효과를 in vivo에서 더욱 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
우선, 5명의 실험대상에 대해 각각 8개의 치아를 선택(total n=40)하고, 치간청결물리요법(PMTC; Professional Mechanical Tooth Cleaning)으로 치태를 제거한 후 치태염색제로 염색하여 사진 촬영해두었다. 이후, 각 실험대상에 대하여 무첨가 치약(대조군), 자일리톨(1중량%)만 첨가된 치약, 라이보스(0.15중량%)만 첨가된 치약, 자일리톨(1중량%)과 라이보스(0.15중량%)가 모두 첨가된 치약을 1주일간 사용하게 한 후 치태염색제로 염색하고 사진 촬영하였다(도 9 참조).
이러한 과정을 1주일 term을 두고 총 4회 반복한 후, 사진 이미지 분석에 의해 치태 면적을 측정하였으며, 대조군의 치태 면적을 1.000로 하였을 때의 상대적인 값으로 정량화하고, 각 실험대상에서 8개의 치아에 대해 평균값을 구하였다.
그 결과, 하기 표 1 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 자일리톨과 라이보스가 모두 첨가된 치약을 사용할 경우, 자일리톨 또는 라이보스만 단독 첨가된 치약 사용시에 비하여, 치태 형성이 대략 2배 이상 저하되었음을 확인하였는 바, 이로써 in vivo에서도 구강 바이오필름 형성이 단독 사용군에 비하여 현저히 억제됨을 알 수 있었다.
표 1 치태 면적
대조군 자일리톨 첨가 치약 라이보스 첨가 치약 자일리톨 + 라이보스 첨가 치약
실험대상 1 1.000 1.471 1.228 0.700
실험대상 2 1.000 1.489 1.059 0.525
실험대상 3 1.000 1.704 1.108 0.558
실험대상 4 1.000 1.350 0.912 0.717
실험대상 5 1.000 0.706 1.144 0.820
평균값 1.000 1.344 1.090 0.664
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는, 구강 세균 부착 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 5탄당은 D-아라비노즈(D-arabinose), L-아라비노즈(L-arabinose), D-라이보스(D-ribose), L-라이보스(L-ribose) 및 D-자일로스(D-xylose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 구강 세균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 또는 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 구강 세균은 자일리톨 내성균인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 5탄당과 자일리톨은 0.1∼10 : 1∼100의 중량비로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 gbpC (glucan binding protein C) 및 dblB(dextran-binding lectin B) 유전자의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 치주질환, 치은염, 치주염 또는 치아우식을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 구강용 제품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 구강용 제품은 치약, 가글링 제품, 껌, 사탕류, 캬라멜류, 젤리류, 구강 스프레이, 구강용 연고, 구강세정제, 구강 청정제 및 치아미백제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 구강용 제품.
  10. 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 구강 세균 부착 억제방법.
  11. 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 조성물의 구강 세균 부착 억제 용도.
PCT/KR2014/013005 2014-01-07 2014-12-30 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물 Ceased WO2015105294A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0001924 2014-01-07
KR20140001924 2014-01-07
KR10-2014-0191320 2014-12-29
KR1020140191320A KR101735895B1 (ko) 2014-01-07 2014-12-29 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015105294A1 true WO2015105294A1 (ko) 2015-07-16

Family

ID=53524089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/013005 Ceased WO2015105294A1 (ko) 2014-01-07 2014-12-30 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2015105294A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116173218A (zh) * 2023-04-28 2023-05-30 北京大学口腔医学院 蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途
CN116440077A (zh) * 2023-03-15 2023-07-18 山东大学 一种预防及快速诊断和治疗龋病的口腔喷剂及其制备方法
WO2025207472A1 (en) * 2024-03-26 2025-10-02 Hill's Pet Nutrition, Inc. Pet food compositions

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4291045A (en) * 1976-05-04 1981-09-22 Life Savers, Inc. Method of reducing dental caries

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4291045A (en) * 1976-05-04 1981-09-22 Life Savers, Inc. Method of reducing dental caries

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BISWAS, I. ET AL.: "Regulation of gbpC expression in Streptococcus mutans", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 189, no. 18, 2007, pages 6521 - 6531 *
JANG, Y. J. ET AL.: "Autoinducer 2 of Fusobacterium nucleatum as a target molecule to inhibit biofilm formation of periodontopathogens", ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY, vol. 58, no. 1, 2013, pages 17 - 27 *
LEE, H. J. ET AL.: "Synergistic inhibition of Streptococcal biofilm by ribose and xylitol", ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY, vol. 60, no. 2, 15 November 2014 (2014-11-15), pages 304 - 312 *
LEE, S. H. ET AL.: "The cariogenic characters of xylitol-resistant and xylitol-sensitive Streptococcus mutans in biofilm formation with salivary bacteria", ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY, vol. 57, no. 6, 2012, pages 697 - 703 *
LEE, Y. J. ET AL.: "Inhibitory Effect of Pentose on Biofilm Formation by Oral Bacteria", INTERNATIONAL JOURNAL OF ORAL BIOLOGY, vol. 35, no. 4, 2010, pages 203 - 207 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116440077A (zh) * 2023-03-15 2023-07-18 山东大学 一种预防及快速诊断和治疗龋病的口腔喷剂及其制备方法
CN116440077B (zh) * 2023-03-15 2024-12-03 山东大学 一种预防及快速诊断和治疗龋病的口腔喷剂及其制备方法
CN116173218A (zh) * 2023-04-28 2023-05-30 北京大学口腔医学院 蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途
CN116173218B (zh) * 2023-04-28 2023-08-04 北京大学口腔医学院 蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途
WO2025207472A1 (en) * 2024-03-26 2025-10-02 Hill's Pet Nutrition, Inc. Pet food compositions

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12226519B2 (en) Oral compositions
EP2420580A1 (en) Probiotic composition for oral health
JP7737690B2 (ja) 歯周病における歯槽骨吸収の予防又は改善用食品組成物、飼料組成物、歯周病における歯槽骨吸収の予防又は治療剤、破骨細胞分化抑制食品組成物、飼料組成物、破骨細胞分化抑制剤
KR101921309B1 (ko) 바이셀라 사이베리아 균주를 포함하는 충치 예방 또는 개선용 조성물
JPS61171423A (ja) 抗う蝕乃至抗歯周症剤
WO2015105294A1 (ko) 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물
WO2024090747A1 (ko) 칸나비디올 및 타우린을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 조성물
KR101735895B1 (ko) 5탄당 및 자일리톨을 유효성분으로 포함하는 구강 세균 부착 억제용 조성물
JP5946608B2 (ja) オートインデューサー−２阻害剤
KR20200027663A (ko) 해조류로부터 분리된 황산 다당류를 유효성분으로 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물
JP7725198B2 (ja) 歯周病の予防又は改善剤
KR102329670B1 (ko) 열처리 가공염을 포함하는 구강내 균총 개선용 조성물
KR102892032B1 (ko) 근감소증 예방 및 개선 기능성을 가지는 유산균주 락토바실러스 가세리 cbt lga2
CN121057586A (zh) 益生菌组合物及其在预防和/或治疗口腔病理状况和/或病症中的用途
KR102750523B1 (ko) 바이오필름 형성 억제 및 구강질환 예방 또는 치료용 조성물
CN112194588B (zh) 一种萘环类化合物在制备防治口腔细菌的产品中的用途
JPH0288518A (ja) 口腔用組成物
WO2026054011A1 (ja) 細菌によるバイオフィルム形成を抑制する組成物
JP2026074308A (ja) 口腔内ナイセリア・ムコサ増加剤
WO2020032651A1 (ko) Lpar2 저해제를 포함하는 상아질-치수질환 또는 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20160118851A (ko) 실리비닌을 유효성분으로 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물
Lee et al. INHIBITORY EFFECT OF LACTOCOCCUS LACTIS 1370 ON THE FORMATION OF DENTAL PLAQUE IN CHILDREN

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14878092

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14878092

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1