WO2015094017A1 - Method for isolating separate types of micro-rna from biological fluids containing exosomes - Google Patents

Method for isolating separate types of micro-rna from biological fluids containing exosomes Download PDF

Info

Publication number
WO2015094017A1
WO2015094017A1 PCT/RU2014/000941 RU2014000941W WO2015094017A1 WO 2015094017 A1 WO2015094017 A1 WO 2015094017A1 RU 2014000941 W RU2014000941 W RU 2014000941W WO 2015094017 A1 WO2015094017 A1 WO 2015094017A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mir
exosomes
centrifuge
column
centrifugation
Prior art date
Application number
PCT/RU2014/000941
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Вадим Игоревич ПОСПЕЛОВ
Александр Андреевич АБРАМОВ
Дмитрий Александрович МУРАШКО
Original Assignee
МАМОНТОВА, Марина Васильевна
Вадим Игоревич ПОСПЕЛОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МАМОНТОВА, Марина Васильевна, Вадим Игоревич ПОСПЕЛОВ filed Critical МАМОНТОВА, Марина Васильевна
Priority to SG11201604889UA priority Critical patent/SG11201604889UA/en
Priority to CH00123/16A priority patent/CH710195B1/en
Publication of WO2015094017A1 publication Critical patent/WO2015094017A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the invention relates to molecular biology, in particular, to methods for the isolation of miRNAs from biological fluids and is intended to isolate various types of miRNAs from various exosome-containing biological materials for evaluating individual fractions of exosomes.
  • Exosomes are small, 20-100 nm, spherical vesicles formed by a cell for intercellular interactions. Exosomes contain complexes of proteins and microRNAs, which are valuable as diagnostic markers, and can also be used to form an immune response in oncology. However, for the effective use of exosomes, it is necessary to obtain a pure fraction.
  • Exosomes are stable in body fluids, blood, urine, saliva, ascites, or culture fluid if cultured. This makes available a non-invasive diagnosis of tumor-causing exosomes in plasma and urine.
  • Exosomes are actively secreted by the cells of the immune system — dendritic cells and B lymphocytes, cells of the nervous tissue, secretory tissues and especially tumor cells [K.Denzer et al. 2000, Huber et al.al.005, P.Wwearsch 2009].
  • dendritic cells exosomes containing small (8-12 amino acids) presented polypeptides in the complex with the MHC I antigen are attached, connecting to the corresponding receptors on CD8 cytotoxic T-lymphocytes,, cells, and also in complex with MHC II, containing large (12- 16 amino acids) presented polypeptides to the corresponding receptors on CD4 cytotoxic T-lymphocytes.
  • Exosomes secreted by tumor cells can interfere with the formation of the antitumor response of cytotoxic T cells due to competition with exosomes of dendritic cells or macrophages, given that the concentration of exosomes in plasma / serum increases by about 50 times with advanced cancer [Taylor et al 2008, Iero 2008].
  • Exosomes contain antigens of MHC I and MHC II histocompatibility complex, Rab proteins of a number of integrins, as well as antigens and miRNA sets, determined by tissue affiliation and individual characteristics of the cell type. So in the exosomes from human urine, the presence of 295 proteins was detected [Pisitkun et al. 2004]. About 50 proteins are found regularly in all exosomes [Gonzales et.al, 2009]. In the case of tumors, a tissue-specific set of proteins and a tumor-specific set of microRNAs can be used for early diagnosis or justification of the treatment regimen [Baj-Krzyworzeka et a1.2007]. To study specific tumor exosomes, it is necessary to differentiate them. The concentration of specific miRNAs is then a criterion for the selection of exosomes from specific cells.
  • the supernatant is collected in a separate tube and examined by laser correlation spectroscopy (LCS) to check removal of exosomal particles from it, the precipitate is dissolved in the maximum volume of phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again under the same conditions. The resulting precipitate was dissolved in 100 ⁇ l of water (MiliQ) or PBS, and aliquoted, which were frozen at -80 ° C for further proteomic studies.
  • LCS laser correlation spectroscopy
  • the known method does not allow to divide exosomes into different fractions related to different tissues, and, therefore, to assess the level of microRNA in the selected samples.
  • FIG. 1 is a table showing the distribution of microRNA isolated from 500 ml of urine from a healthy donor in wells. The concentration is presented as log with a base of 2 copies of miRNA in a microliter.
  • FIG. Figure 2 shows the distribution table of microRNA isolated from 500 ml of urine of a patient with lung adenocarcinoma in the wells. The concentration is presented as log with a base of 2 copies of miRNA in a microliter.
  • the technical effect of the claimed method is the ability to isolate certain types of miRNAs from biological fluids containing exosomes, in particular, the ability to isolate certain types, for example, tissue-specific and tumor-specific miRNAs, will subsequently create vaccines based on exosomes from tumor cells.
  • a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection on a 7500 Applied Biosystems device using spramers for individual types, for example, tissue-specific and tumor-specific miRNAs, namely miR-141, miR-200a, miR-200c, miR -203, miR-205, miR-214, miR-17- ⁇ whatsoever, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331- ⁇ counter , miR-432, miR-438, miR-574-Sp, miR-625 *, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c.
  • tissue-specific and tumor-specific miRNAs namely miR-141, miR
  • the precipitate is dissolved in the maximum volume of phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again under the same conditions.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the resulting precipitate was dissolved in 100 ⁇ l of water (MiliQ) or PBS, then the test sample was subjected to free-flow electrophoresis in special buffers on an FFE system (FFE Service GmbH) under the following conditions: total electrophoresis time 5 min, supplied voltage 900 V and current 34 mA Sample and marker were introduced at a flow rate of 2.5 ml / h and 280 ml / h respectively.
  • the run was carried out in the cyclic interval mode FF-ZE at 85 ml / h and the fractionated sample was eluted at 320 ml / h.
  • the following buffer is used for anodic stabilization: 1.5 M thiourea + 6 M urea + 100 mM H 2 S0 4 +25 mM 2-pyridine-propanol + 300 mM 2-pyridine-ethanol;
  • the separation medium has the following composition: 1.8 M thiourea + 6 M urea + 55 mM MOPS + 55 mM 2-pyridine-propanol;
  • the following buffer is used: 1.8 M thiourea + 76 M urea + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, followed by collecting individual fractions, concentrating samples from individual wells using ultracentrifugation in a centrifuge Avanti 301 (rotor JA-30.50) in the regime of 100,000 g for
  • microRNAs are isolated according to the following procedure: 5 ⁇ M proteinase K is added to the sample, incubated at 56 ° C for 1 hour, then Exiqon columns are used for purification miRNA - the sample is applied to a column, after which the wire It is centrifuged at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each washing centrifugation is carried out at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then 20 ⁇ l of non-nucleus water is applied to the column.
  • the column is left for 10 min at room temperature, and then centrifuged at 3000 g on an eppendorf 5104 centrifuge, after which a reverse transcription reaction is performed using reverse transcriptase (Exiqon), for this, to 8 ⁇ l of sample add 8 ⁇ l of reagent and incubate for 1 h at a temperature of 60 ° C, after which the reaction is stopped by heating to 95 ° C for 5 minutes.
  • a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection on a 7500 Applied Biosystems instrument, with primers for the following miRNAs: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17- Sp, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3p, miR-432, miR-438, miR-574-Sp, miR-625 *,
  • the precipitate is dissolved in the maximum volume of phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again under the same conditions.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the resulting precipitate was dissolved in 100 ⁇ l of water (MiliQ) or PBS, then the test sample was subjected to free-flow electrophoresis in special buffers on an FFE system (FFE Service GmbH) under the following conditions: total electrophoresis time 5 min, supplied voltage 900 V and current 34 mA
  • the sample and marker were introduced at a flow rate of 2.5 ml / h and 280 ml / h, respectively.
  • the run was carried out in the cyclic interval mode FF-ZE at 85 ml / h and the fractionated sample was eluted at 320 ml / h.
  • the following buffer is used for anodic stabilization: 1.5 M thiourea + 6 M urea + 100 mM H 2 SO 4 + 25 mM 2-pyridine-propanol + 300 mM 2-pyridine-ethanol;
  • the separation medium has the following composition: 1.8 M thiourea + 6 M urea + 55 mM MOPS + 55 mM 2-pyridine-propanol;
  • the following buffer is used: 1.8 M thiourea + 76 M urea + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, followed by collecting individual fractions, concentrating samples from individual wells using ultracentrifugation in a centrifuge Avanti 301 (rotor JA-30.50) in the regime of 100,000 g for 2
  • microRNAs are isolated according to the following procedure: 5 ⁇ M proteinase K is added to the sample, incubated at 56 ° C for 1 hour, then Exiqon columns are used for purification miRNA - the sample is applied to a column, after which the wire it is centrifuged at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then the column is washed 3 times with Exiqon washing buffer, after each washing, centrifugation is carried out at 2000 g on an eppendorf 5104 centrifuge, then 20 ⁇ l of non-nucleated water is applied to the column.
  • miRNAs are observed only in patients with pulmonary adenocarcinoma and are not detected in a healthy donor, which indicates that these only exosomes from tumor cells of lung adenocarcinoma get into the wells, therefore, by the claimed method it is possible to isolate pure fractions of certain types of miRNAs, including tissue-specific and tumor-specific miRNAs, from biological fluids containing exosomes.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to biotechnology, and specifically to a method for isolating microRNA from biological fluids which contain exosomes. The method involves subsequent centrifugation, ultrafiltration and ultracentrifugation of a condensed culture medium, dissolving the produced precipitate in a phosphate salt buffer and further centrifugation. The produced precipitate is dissolved in water, and the solution is subjected to free flow electrophoresis using an FFE system apparatus. Each produced fraction then undergoes ultracentrifugation. Each fraction is cleaned of cell walls of exosomes by means of filtration and centrifugation, and a reverse transcription reaction is carried out using reverse transcriptase. The reaction is stopped by heating to 95°С over a period of 5 minutes.

Description

Название изобретения.  The name of the invention.
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ТИПОВ МИКРОРНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ЭКЗОСОМЫ. Область техники.  METHOD FOR ISOLATING SEPARATE MICRORNA TYPES FROM BIOLOGICAL LIQUIDS CONTAINING EXOSOMES. The field of technology.
Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности, к способам выделения микроРНК из биологических жидкостей и предназначено для выделения различных типов микроРНК из различных экзосомосодержащих биологических материалов для оценки отдельных фракций экзосом.  The invention relates to molecular biology, in particular, to methods for the isolation of miRNAs from biological fluids and is intended to isolate various types of miRNAs from various exosome-containing biological materials for evaluating individual fractions of exosomes.
Предшествующий уровень техники. The prior art.
Экзосомы - маленькие, 20-100 нм, сферические пузырьки, формируемые клеткой для межклеточных взаимодействий. В экзосомах содержатся комплексы белков и микроРНК, которые представляют ценность как диагностические маркеры, а также могут использоваться для формирования иммунного ответа в онкологии. Однако, для эффективного использования экзосом необходимо получение чистой фракции.  Exosomes are small, 20-100 nm, spherical vesicles formed by a cell for intercellular interactions. Exosomes contain complexes of proteins and microRNAs, which are valuable as diagnostic markers, and can also be used to form an immune response in oncology. However, for the effective use of exosomes, it is necessary to obtain a pure fraction.
Экзосомы стабильны в биологических жидкостях, крови, моче, слюне, асците или культуральной жидкости в случае культивирования. Это делает доступной не инвазивную диагностику экзосом опухолевого происхождения в плазме крови и моче.  Exosomes are stable in body fluids, blood, urine, saliva, ascites, or culture fluid if cultured. This makes available a non-invasive diagnosis of tumor-causing exosomes in plasma and urine.
Экзосомы активно выделяются клетками иммунной системы— дендритные клетки и В -лимфоциты, клетками нервной ткани, секреторных тканей и особенно опухолевыми клетками [K.Denzer et al. 2000,Huber et al.al.005, P.Wwearsch 2009]. В случае дендритных клеток выделяются экзосомы содержащие маленькие (8-12 аминокислот) презентованные полипептиды в комплексе антигеном МНС I, присоединяющиеся к соответствующим рецепторам на CD8 цитотоксических Т-лимфоцитах, Κ-клетках, а также в комплексе с МНС II, содержащие большие (12-16 аминокислот) презентированные полипептиды, к соответствующим рецепторам на CD4 цитотоксических Т-лимфоцитах. Экзосомы, выделяющиеся опухолевыми клетками, могут нарушать формирование противоопухолевого ответа цитотоксических Т-клеток за счет конкуренции с экзосомами дендритных клеток или макрофагов, учитывая, что концентрация экзосом увеличивается в плазме/сыворотке крови примерно в 50 раз при развитом раке [Taylor et al 2008, Iero 2008]. Exosomes are actively secreted by the cells of the immune system — dendritic cells and B lymphocytes, cells of the nervous tissue, secretory tissues and especially tumor cells [K.Denzer et al. 2000, Huber et al.al.005, P.Wwearsch 2009]. In the case of dendritic cells, exosomes containing small (8-12 amino acids) presented polypeptides in the complex with the MHC I antigen are attached, connecting to the corresponding receptors on CD8 cytotoxic T-lymphocytes,, cells, and also in complex with MHC II, containing large (12- 16 amino acids) presented polypeptides to the corresponding receptors on CD4 cytotoxic T-lymphocytes. Exosomes secreted by tumor cells can interfere with the formation of the antitumor response of cytotoxic T cells due to competition with exosomes of dendritic cells or macrophages, given that the concentration of exosomes in plasma / serum increases by about 50 times with advanced cancer [Taylor et al 2008, Iero 2008].
Экзосомы содержат антигены МНС I и МНС II комплекса гистосовместимости, Rab-белки ряд интегринов, а также антигены и наборы микроРНК, определяемые тканевой принадлежностью и индивидуальными особенностями типа клеток. Так в экзосомах из мочи человека обнаружено присутствие 295 белков [Pisitkun et al. 2004]. Около 50 белков встречаются регулярно во всех экзосомах [Gonzales et.al, 2009]. В случае опухолей тканеспецифический набор белков и опухолевоспецифический набор микроРНК может использоваться для ранней диагностики или обоснования схемы лечения [Baj-Krzyworzeka et а1.2007]. Для изучения специфических опухолевых экзосом необходимо их дифференцировать. Концентрация конкретных микроРНК является в таком случае критерием отбора экзосом из конкретных клеток. Exosomes contain antigens of MHC I and MHC II histocompatibility complex, Rab proteins of a number of integrins, as well as antigens and miRNA sets, determined by tissue affiliation and individual characteristics of the cell type. So in the exosomes from human urine, the presence of 295 proteins was detected [Pisitkun et al. 2004]. About 50 proteins are found regularly in all exosomes [Gonzales et.al, 2009]. In the case of tumors, a tissue-specific set of proteins and a tumor-specific set of microRNAs can be used for early diagnosis or justification of the treatment regimen [Baj-Krzyworzeka et a1.2007]. To study specific tumor exosomes, it is necessary to differentiate them. The concentration of specific miRNAs is then a criterion for the selection of exosomes from specific cells.
Известен способ выделения экзосом из биологических жидкостей (см. ссылку из сети Интернет http://tsitologiya.cytspb.rssi.ru/54_5/shtam ms.pdf), где собирают культуральную конденсированную среду (КС), проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, далее полученную КС объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом из полученных препаратов концентрированной КС применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA- 30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, разбивают на аликвоты, которые замораживают при -80°С для дальнейших протеомных исследований.  There is a method of isolating exosomes from biological fluids (see the link from the Internet http://tsitologiya.cytspb.rssi.ru/54_5/shtam ms.pdf), where the culture condensed medium (CS) is collected, sequential centrifugation in the 2000 mode is carried out, and 10000 g, then the resulting 500 ml CS was concentrated by ultrafiltration (Centricon Plus-70, 100 kDa, Millipore) to a final volume of 10 ml. Further, to isolate exosomes from the obtained preparations of concentrated CS, ultracentrifugation using an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) for 2 hours is used. After centrifugation, the supernatant is collected in a separate tube and examined by laser correlation spectroscopy (LCS) to check removal of exosomal particles from it, the precipitate is dissolved in the maximum volume of phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again under the same conditions. The resulting precipitate was dissolved in 100 μl of water (MiliQ) or PBS, and aliquoted, which were frozen at -80 ° C for further proteomic studies.
Известный метод не позволяет разделить экзосомы на различные фракции, относящиеся к различным тканям, а, следовательно, и осуществить оценку уровня микроРНК в выделенных образцах. The known method does not allow to divide exosomes into different fractions related to different tissues, and, therefore, to assess the level of microRNA in the selected samples.
Сущность изобретения. SUMMARY OF THE INVENTION
Краткое описание чертежей.  A brief description of the drawings.
На Фиг. 1 представлена таблица распределения микроРНК, выделенной из 500 мл мочи здорового донора по лункам. Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микроРНК в микролитре.  In FIG. 1 is a table showing the distribution of microRNA isolated from 500 ml of urine from a healthy donor in wells. The concentration is presented as log with a base of 2 copies of miRNA in a microliter.
На Фиг. 2 представлена таблица распределения микроРНК, выделенной из 500 мл мочи пациента с аденокарциномой легких по лункам. Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микроРНК в микролитре.  In FIG. Figure 2 shows the distribution table of microRNA isolated from 500 ml of urine of a patient with lung adenocarcinoma in the wells. The concentration is presented as log with a base of 2 copies of miRNA in a microliter.
Осуществление изобретения. The implementation of the invention.
Техническим эффектом заявленного способа является возможность выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, в частности, возможность выделения отдельных типов, например, тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК в дальнейшем позволит создавать вакцины, основанные на экзосомах из опухолевых клеток.  The technical effect of the claimed method is the ability to isolate certain types of miRNAs from biological fluids containing exosomes, in particular, the ability to isolate certain types, for example, tissue-specific and tumor-specific miRNAs, will subsequently create vaccines based on exosomes from tumor cells.
Вышеприведенный технический результат достигается тем, что в способе выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, включающем последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, ультрафильтрацию полученной надосадочной жидкости на цетрифужном концентраторе Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore до конечного объема 10 мл, ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч, растворение полученного осадока в фосфатно-солевом буфере, повторное центрифугирование при тех же условиях, и растворение полученного осадка в 100 мкл воды, согласно настоящему изобретению, далее полученный раствор подвергают электрофорезу в свободном потоке в бункерах для анодной и катодной стабилизации на приборе FFE System с последующим сбором отдельных фракций при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА, образец и маркер вводят при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно, пробег проводят в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч, для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5М тиомочевины + 6 М мочевины + 100 мМ H2SO4 + 25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол; Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 М тиомочевины + 6 М мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 М тиомочевины + 76 М мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, далее отдельные фракции повторно ультрацентрифугируют на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч, затем проводят выделение микроРНК из каждой отдельной фракции, а именно, в каждую из отдельных фракций добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), а именно, к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. The above technical result is achieved by the fact that in the method of isolation of certain types of microRNA from biological fluids containing exosomes, including sequential centrifugation in the 2000 and 10000 g mode, ultrafiltration of the obtained supernatant in a centricon plus-70 centrifuge concentrator, 100 kDa, Millipore to a final volume of 10 ml, ultracentrifugation in an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) in the mode 100,000 g for 2 hours, dissolving the precipitate obtained in phosphate-buffered saline, re-centrifuging under the same conditions, and dissolving the precipitate obtained in 100 μl of water according to the present invention, the resulting solution was further exposed t free-flow electrophoresis in bins for anodic and cathodic stabilization on an FFE System instrument with subsequent collection of individual fractions under the following conditions: total electrophoresis time 5 min, applied voltage 900 V and current 34 mA, sample and marker are introduced at a flow rate of 2, 5 ml / h and 280 ml / h, respectively, the run is carried out in the FF-ZE cyclic interval mode at 85 ml / h and the fractionated sample is eluted at 320 ml / h, the following buffer is used for anodic stabilization: 1.5 M thiourea + 6 M urea + 100 mm H 2 SO 4 + 25 mm 2-pyridine-prop nol + 300 mM 2-pyridine-ethanol; The separation medium has the following composition: 1.8 M thiourea + 6 M urea + 55 mM MOPS + 55 mM 2-pyridine-propanol; the following buffer is used for cathodic stabilization: 1.8 M thiourea + 76 M urea + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, then separate fractions again ultracentrifuged on an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) at 100,000 g for 2 hours, then microRNAs are isolated from each separate fraction, namely, 5 μM proteinase K is added to each of the separate fractions, incubated at 56 ° C for 1 h, then applied to an Exiqon column, after which centrifugation is carried out at 2000 g, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each washing, centrifugation is carried out at 2000 g with an eppendorf 5104 centrifuge, then 20 μl of nucleic acid-free water is applied to the column, then the column is left for 10 min at room temperature, and then centrifuged at 3000 g, after which the reverse transcription reaction is carried out using reverse transcriptase (Exiqon), namely, 8 μl of the reagent is added to 8 μl of the sample and incubated for 1 h at a temperature of 60 ° С, after which the reaction is stopped by heating to 95 ° C for 5 minutes
Далее, с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems спраймерами на отдельные типы, например, тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК, а именно: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-Зр, miR-106a, miR- 146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр, miR-432, miR-438, miR-574-Зр, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR- 517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR- 151, miR- 19b, miR-29c. Затем при помощи программы GenEx qPCR software, вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, после чего полученные данные сводят в таблицу для сравнения профилей экспрессии микроРНК в образцах из разных тканей. Further, in order to identify certain types of miRNAs, a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection on a 7500 Applied Biosystems device using spramers for individual types, for example, tissue-specific and tumor-specific miRNAs, namely miR-141, miR-200a, miR-200c, miR -203, miR-205, miR-214, miR-17-Зр, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр , miR-432, miR-438, miR-574-Sp, miR-625 *, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c. Then, using the GenEx qPCR software program, the amount of each of the studied miRNAs extracted from each fraction is calculated, after which the obtained data is tabulated for comparison of miRNA expression profiles in samples from different tissues.
Пример исследования:  Study Example:
600 мл мочи, взятой у здорового донора подвергают последовательному центрифугированию в режиме 2000 и 10000 g, далее полученную надосадочную жидкость объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, далее исследуемый образец подвергают электрофорезу в свободном потоке в специальных буферах на приборе FFE system (FFE Service GmbH) при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА. Образец и маркер были введены при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно. Пробег проводили в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч. Для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5М тиомочевины + 6 М мочевины + 100 мМ H2S04 +25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол; Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 М тиомочевины + 6 М мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 М тиомочевины + 76 М мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, с последующим сбором отдельных фракций, концентрированием образцов из отдельных лунок при помощи повторного ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч. Затем проводят выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, затем используют колонки Exiqon, для очистки микроРНК— образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems, с праймерами на следующие микроРНК: miR-141, miR- 200а, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-Зр, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331- 3p, miR-432, miR-438, miR-574-Зр, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR- 29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c результаты анализируют при помощи программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы (см. Фиг.1). 600 ml of urine taken from a healthy donor are subjected to sequential centrifugation in the 2000 and 10000 g regimen, then the resulting 500 ml supernatant is concentrated by ultrafiltration (Centricon plus-70, 100 kDa, Millipore) to a final volume of 10 ml. Subsequently, to isolate exosomes, ultracentrifugation using an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) in a mode of 100,000 g for 2 hours is used. After centrifugation, the supernatant is collected in a separate tube and examined by laser correlation spectroscopy (LSC) to verify the removal of exosomal particles from it. size, the precipitate is dissolved in the maximum volume of phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again under the same conditions. The resulting precipitate was dissolved in 100 μl of water (MiliQ) or PBS, then the test sample was subjected to free-flow electrophoresis in special buffers on an FFE system (FFE Service GmbH) under the following conditions: total electrophoresis time 5 min, supplied voltage 900 V and current 34 mA Sample and marker were introduced at a flow rate of 2.5 ml / h and 280 ml / h respectively. The run was carried out in the cyclic interval mode FF-ZE at 85 ml / h and the fractionated sample was eluted at 320 ml / h. The following buffer is used for anodic stabilization: 1.5 M thiourea + 6 M urea + 100 mM H 2 S0 4 +25 mM 2-pyridine-propanol + 300 mM 2-pyridine-ethanol; The separation medium has the following composition: 1.8 M thiourea + 6 M urea + 55 mM MOPS + 55 mM 2-pyridine-propanol; For cathodic stabilization, the following buffer is used: 1.8 M thiourea + 76 M urea + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, followed by collecting individual fractions, concentrating samples from individual wells using ultracentrifugation in a centrifuge Avanti 301 (rotor JA-30.50) in the regime of 100,000 g for 2 hours. Then, microRNAs are isolated according to the following procedure: 5 μM proteinase K is added to the sample, incubated at 56 ° C for 1 hour, then Exiqon columns are used for purification miRNA - the sample is applied to a column, after which the wire It is centrifuged at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each washing centrifugation is carried out at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then 20 μl of non-nucleus water is applied to the column. The column is left for 10 min at room temperature, and then centrifuged at 3000 g on an eppendorf 5104 centrifuge, after which a reverse transcription reaction is performed using reverse transcriptase (Exiqon), for this, to 8 μl of sample add 8 μl of reagent and incubate for 1 h at a temperature of 60 ° C, after which the reaction is stopped by heating to 95 ° C for 5 minutes Then a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection on a 7500 Applied Biosystems instrument, with primers for the following miRNAs: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17- Sp, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3p, miR-432, miR-438, miR-574-Sp, miR-625 *, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151 , miR-19b, miR-29c, the results are analyzed using the GenEx qPCR software and formatted as a table (see Figure 1).
Затем, 600 мл мочи, взятой у пациента с раком молочной железы подвергают последовательному центрифугированию в режиме 2000 и 10000 g, далее полученную надосадочную жидкость объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA- 30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЖС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, далее исследуемый образец подвергают электрофорезу в свободном потоке в специальных буферах на приборе FFE system (FFE Service GmbH) при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА. Образец и маркер были введены при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно. Пробег проводили в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч. Для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5М тиомочевины + 6 М мочевины + 100 мМ H2SO4 +25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол; Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 М тиомочевины + 6 М мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 М тиомочевины + 76 М мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, с последующим сбором отдельных фракций, концентрированием образцов из отдельных лунок при помощи повторного ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч. Затем проводят выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, затем используют колонки Exiqon, для очистки микроРНК— образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером фирмы Exiqon, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 °С в течение 5 мин. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosy stems, с праймерами на следующие микроРНК: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR- 205, miR-214, miR-17-Зр, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр, miR-432, miR-438, miR- 574-3p, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-4 1, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR- 19b, miR-29c, результаты анализируют при помощи компьютерной программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы (см. Фиг.2). Как видно из таблиц, представленных на Фиг. 1 и 2, в лунках 61Then, 600 ml of urine taken from a patient with breast cancer is subjected to sequential centrifugation in the regime of 2000 and 10000 g, then the resulting supernatant with a volume of 500 ml is concentrated by ultrafiltration (Centricon plus-70, 100 kDa, Millipore) to a final volume of 10 ml . Subsequently, ultracentrifugation using an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) for 2 hours is used to isolate exosomes. After centrifugation, the supernatant is collected in a separate tube and examined by laser correlation spectroscopy (LC) to verify removal of exosomal particles from it. size, the precipitate is dissolved in the maximum volume of phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged again under the same conditions. The resulting precipitate was dissolved in 100 μl of water (MiliQ) or PBS, then the test sample was subjected to free-flow electrophoresis in special buffers on an FFE system (FFE Service GmbH) under the following conditions: total electrophoresis time 5 min, supplied voltage 900 V and current 34 mA The sample and marker were introduced at a flow rate of 2.5 ml / h and 280 ml / h, respectively. The run was carried out in the cyclic interval mode FF-ZE at 85 ml / h and the fractionated sample was eluted at 320 ml / h. The following buffer is used for anodic stabilization: 1.5 M thiourea + 6 M urea + 100 mM H 2 SO 4 + 25 mM 2-pyridine-propanol + 300 mM 2-pyridine-ethanol; The separation medium has the following composition: 1.8 M thiourea + 6 M urea + 55 mM MOPS + 55 mM 2-pyridine-propanol; For cathodic stabilization, the following buffer is used: 1.8 M thiourea + 76 M urea + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, followed by collecting individual fractions, concentrating samples from individual wells using ultracentrifugation in a centrifuge Avanti 301 (rotor JA-30.50) in the regime of 100,000 g for 2 hours. Then, microRNAs are isolated according to the following procedure: 5 μM proteinase K is added to the sample, incubated at 56 ° C for 1 hour, then Exiqon columns are used for purification miRNA - the sample is applied to a column, after which the wire it is centrifuged at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then the column is washed 3 times with Exiqon washing buffer, after each washing, centrifugation is carried out at 2000 g on an eppendorf 5104 centrifuge, then 20 μl of non-nucleated water is applied to the column. The column was left for 10 min at room temperature, and then centrifuged at 3000 g on an eppendorf 5104 centrifuge, after which a reverse transcription reaction was performed using reverse transcriptase (Exiqon), for this, 8 μl of reagent was added and incubated for 1 h at a temperature of 60 ° C, after which the reaction is stopped by heating to 95 ° C for 5 minutes Then a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection on a 7500 Applied Biosystems instrument, with primers for the following miRNAs: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17 -Sp, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Sp, miR-432, miR-438, miR-574-3p , miR-625 *, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-4 1, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR -151, miR-19b, miR-29c, the results are analyzed using the computer program GenEx qPCR software and formatted as a table (see Figure 2). As can be seen from the tables shown in FIG. 1 and 2, in holes 61
- 66 микроРНК miR-17-Зр, miR- 106а, miR-146, miR-155, miR-191, miR- 192 наблюдаются только у пациента с аденокарциномой легких и не выявляется у здорового донора, что указывает на то, что в эти лунки попадают только экзосомы из опухолевых клеток аденокарциномы легких, следовательно, заявленным способом возможно выделять чистые фракции отдельных типов микроРНК, в том числе тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК, из биологических жидкостей, содержащих экзосомы. - 66 miR-17-Sp, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192 miRNAs are observed only in patients with pulmonary adenocarcinoma and are not detected in a healthy donor, which indicates that these only exosomes from tumor cells of lung adenocarcinoma get into the wells, therefore, by the claimed method it is possible to isolate pure fractions of certain types of miRNAs, including tissue-specific and tumor-specific miRNAs, from biological fluids containing exosomes.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
Способ выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, включающий последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, ультрафильтрацию полученной надосадочной жидкости на цетрифужном концентраторе Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore до конечного объема 10 мл и ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч, далее полученный осадок растворяют в фосфатно-солевом буфере и повторно центрифугируют при тех же условиях, затем полученный осадок растворяют в 100 мкл воды, отличающийся тем, что далее полученный раствор подвергают электрофорезу в свободном потоке в бункерах для анодной и катодной стабилизации на приборе FFE System с последующим сбором отдельных фракций при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА, образец и маркер вводят при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно, пробег проводят в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч, для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 М мочевины + 100 мМ H2SO4 + 25 мМ 2- пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол; среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 М тиомочевины + 6 М мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 М тиомочевины + 76 М мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, далее отдельные фракции повторно ультрацентрифугируют на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2 ч, затем проводят выделение микроРНК из каждой отдельной фракции, а именно, в каждую из отдельных фракций добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), а именно, к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. A method for isolating certain types of microRNAs from biological fluids containing exosomes, including sequential centrifugation in the 2000 and 10000 g mode, ultrafiltration of the obtained supernatant in a centricon plus-70, 100 kDa centrifuge concentrator, Millipore to a final volume of 10 ml and ultracentrifugation in an Avanti 301 centrifuge ( rotor JA-30.50) in the regime of 100,000 g for 2 h, then the resulting precipitate was dissolved in phosphate-buffered saline and re-centrifuged under the same conditions, then the resulting precipitate was dissolved in 100 μl of water, excellent In that case, the resulting solution is then subjected to free flow electrophoresis in hoppers for anodic and cathodic stabilization on an FFE System instrument with subsequent collection of individual fractions under the following conditions: total electrophoresis time 5 min, supplied voltage 900 V and current 34 mA, sample and the marker is introduced at a flow rate of 2.5 ml / h and 280 ml / h, respectively, the run is carried out in the cyclic interval FF-ZE mode at 85 ml / h and the fractionated sample is eluted at 320 ml / h, the following buffer is used for anodic stabilization: 1 , 5 M thiome Chevin + 6M Urea + 100mM H 2 SO 4 + 25mM pyridin-2- propanol + 300 mM 2-pyridine-ethanol; The separation medium has the following composition: 1.8 M thiourea + 6 M urea + 55 mM MOPS + 55 mM 2-pyridine-propanol; for The following buffer is used for cathodic stabilization: 1.8 M thiourea + 76 M urea + 180 mm NaOH + 25 mm Tris + 35 mm MOPS + 280 mm EPPS, then the individual fractions are re-ultracentrifuged on an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) in 100000 mode g for 2 hours, then microRNA is isolated from each individual fraction, namely, 5 μM proteinase K is added to each of the separate fractions, incubated at 56 ° C for 1 hour, then applied to an Exiqon column, followed by centrifugation at 2000 g, then the column is washed 3 times with wash buffer, after each the washes centrifuged at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge, then 20 μl of non-nucleated water was applied to the column, then the column was left for 10 min at room temperature, and then centrifuged at 3000 g, after which the reverse transcription reaction was performed using reverse transcriptase (Exiqon) namely, 8 μl of the reagent is added to 8 μl of the sample and incubated for 1 h at a temperature of 60 ° C, after which the reaction is stopped by heating to 95 ° C for 5 min.
PCT/RU2014/000941 2013-12-16 2014-12-12 Method for isolating separate types of micro-rna from biological fluids containing exosomes WO2015094017A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG11201604889UA SG11201604889UA (en) 2013-12-16 2014-12-12 Method for isolating separate types of micro-rna from biological fluids containing exosomes
CH00123/16A CH710195B1 (en) 2013-12-16 2014-12-12 Methods for isolating specific miRNA types of exosome-containing biological fluids.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013155716/10A RU2548816C1 (en) 2013-12-16 2013-12-16 Method of extraction of microrna from biological fluids
RU2013155716 2013-12-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015094017A1 true WO2015094017A1 (en) 2015-06-25

Family

ID=53289500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2014/000941 WO2015094017A1 (en) 2013-12-16 2014-12-12 Method for isolating separate types of micro-rna from biological fluids containing exosomes

Country Status (3)

Country Link
RU (1) RU2548816C1 (en)
SG (1) SG11201604889UA (en)
WO (1) WO2015094017A1 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2710368C2 (en) * 2018-05-29 2019-12-26 Станислав Евгеньевич Волчков METHOD OF PRODUCING AND CONCENTRATING microRNA-CONTAINING EXOSOMES OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS FOR USE IN COSMETIC AND MEDICINAL AGENTS FOR STIMULATING REGENERATIVE PROCESSES AND SLOWING DOWN AGING PROCESSES
RU2729423C2 (en) * 2018-12-19 2020-08-06 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Method of extracting free and exosomal micro-rna from saliva
RU2748767C1 (en) * 2020-08-27 2021-05-31 Гордейчук Владимир Евгеньевич Method for loading exosomes with small non-coding rnas

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2301260C2 (en) * 2000-09-22 2007-06-20 Вирэкссис Корпорейшн Viral vectors with condition-dependent replication and their using
WO2011029903A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Flemming Velin Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application
US20120164648A1 (en) * 2010-12-28 2012-06-28 Bexmart Integrated Versatile and Systems Preparation of Specimens

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2301260C2 (en) * 2000-09-22 2007-06-20 Вирэкссис Корпорейшн Viral vectors with condition-dependent replication and their using
WO2011029903A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Flemming Velin Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application
US20120164648A1 (en) * 2010-12-28 2012-06-28 Bexmart Integrated Versatile and Systems Preparation of Specimens

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAJ-KRZYWORZEKA M. ET AL.: "Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes", IMMUNOL LETT, vol. 113, no. 2, 2007, pages 76 - 82, XP022299577, DOI: doi:10.1016/j.imlet.2007.07.014 *
SHTAM T. A. ET AL.: "«Poluchenie i analiz ekzosom, sekretiruemykh zlokachestvenno transformirovannymi kletkami cheloveka v sistemakh in vitro».", TSITOLOGIIA, vol. 54, no. 5, 2012, pages 430 - 438 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201604889UA (en) 2016-07-28
RU2548816C1 (en) 2015-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. Current progresses of exosomes as cancer diagnostic and prognostic biomarkers
McBride et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutics in dermatology: a focus on exosomes
Masaoutis et al. Exosomes in lung cancer diagnosis and treatment. From the translating research into future clinical practice
CN105026911B (en) Method for separating microcapsule bubble
CN107002075A (en) Microvesicle and the method for extracting nucleic acid are separated from biological sample
US9868988B2 (en) Method to assess human allograft status from microrna expression levels
Xu et al. Exosome: an emerging source of biomarkers for human diseases
CN109642229A (en) Extracellular vesica is separated from biofluid and isolates the automatically and manually method of Cell-free DNA
Xu et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology
JP2014522993A5 (en)
Salmond et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles for clinical applications in cancer–time for standardization?
Nachmany et al. Two potential biomarkers identified in mesenchymal stem cells and leukocytes of patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis
RU2548816C1 (en) Method of extraction of microrna from biological fluids
CN110945145B (en) Microvesicle nucleic acids and/or proteins and their use as markers for renal transplant rejection
CN104120185A (en) Method and kit for diagnosing liver cancer by use of the ratio of change in serum miRNA quantity
ES2908932T3 (en) Nucleic acid microvesicle profiling and uses thereof as hallmarks in kidney transplant rejection diagnosis
JP6531987B2 (en) Exosome recovery method for renal disease diagnosis
Théry et al. ISEV2018 abstract book
Tastan et al. Role of exosomal microRNAs in cell-to-cell communication
US20230183809A1 (en) Extracellular vesicles for treatment and diagnosis
CN109055312A (en) AIM2 breaks up CD4 in induction+T cell is converted into the application in Tfh cell
Campos et al. Analytical technologies for liquid biopsy of subcellular materials
CN102021169A (en) Serum/plasma miRNA composition and use thereof
CH710195B1 (en) Methods for isolating specific miRNA types of exosome-containing biological fluids.
Raihan et al. Method of Microglial DNA-RNA Purification from a Single Brain of an Adult Mouse. Methods Protoc. 2021, 4, 86

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14871190

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10201500000123

Country of ref document: CH

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14871190

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1