WO2015088107A1 - Mri/fi 조영제 및 이의 제조방법 - Google Patents

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WO2015088107A1
WO2015088107A1 PCT/KR2014/002845 KR2014002845W WO2015088107A1 WO 2015088107 A1 WO2015088107 A1 WO 2015088107A1 KR 2014002845 W KR2014002845 W KR 2014002845W WO 2015088107 A1 WO2015088107 A1 WO 2015088107A1
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contrast agent
mri
nanoparticles
contrast
formula
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PCT/KR2014/002845
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이강호
장용민
김태정
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경북대학교 산학협력단
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    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
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    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction

Definitions

  • the present invention relates to a MRI / FI contrast agent and a method for manufacturing the same, more specifically, can be used simultaneously as MRI contrast agent and FI contrast agent, small average particle diameter is suitable as contrast medium and high T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ) MRI MRI / FI contrast agent suitable as a contrast agent and a method for preparing the same.
  • Disease test methods include blood tests, biopsies, and molecular imaging. Blood tests look for changes in the concentration of certain components in the blood, for example, in liver disease, bilirubin, aminotransferases, alkaline phosphatase (ALP) and albumin (albumin). ), A method for diagnosing liver disease by measuring serum ammonia such as globulin and drug clearance.
  • the disease diagnosis method through the blood as described above is not a method that can be measured directly, there is a problem that the disease marker is not detected in the early stage of the disease.
  • the biopsy is a method of directly removing a tissue and observing it directly under a microscope, but it is an essential step for accurate diagnosis, but there is a problem in that the examination is not easy.
  • Molecular imaging is a technique that analyzes and evaluates various molecular-level changes in a cell, such as gene expression, biochemical changes, and biological changes, by combining molecular biology and advanced imaging techniques. It is an integrated technology of biology, cytology, chemistry, pharmacy, physics, computer science, medical engineering, radiology and nuclear medicine.
  • the magnetic resonance imaging (MRI) technology is a method of obtaining anatomical, physiological and biochemical information images of a body using relaxation of spin of hydrogen atoms in a magnetic field. It is one of the excellent imaging tools for invasive and real time imaging.
  • MRI uses various methods to increase image contrast by injecting a substance from outside and is called a contrast agent. Contrast between tissues on an MRI image is a result of tissue-specific relaxation in which the nuclear spin of water molecules in the tissue returns to equilibrium, and contrast agents affect this relaxation. This results in a wider gap in relaxation between tissues and a change in the MRI signal, which sharpens the contrast between tissues.
  • Contrast-enhancing agents that increase the contrast of the image will vary in utility and precision, depending on features, functions, and targets. Augmented contrast with contrast agents raises or lowers the periphery and image signals of certain living organs and tissues for sharper imaging.
  • a contrast agent that makes the image signal of the body part that wants to obtain an MRI image relatively higher than the surroundings is called a positive contrast agent, and a contrast agent that makes the imaging signal relatively lower than the surroundings is called a negative contrast agent.
  • the contrast agent should be paramagnetic with magnetic properties.
  • Paramagnetic nanoparticles used in the preparation of contrast agents include Mn, Fe, Co, Ni, and Gd, and these paramagnetic nanoparticles have problems such as water solubility and toxicity. In order to solve this problem, there are attempts to coat paramagnetic nanoparticle surfaces with various materials.
  • Korean Patent Publication No. 10-2013-0121554 (published date: November 06, 2013) provides a nanophosphor containing a fluoride-based first compound co-doped with Ce 3+ and Tb 3+ .
  • the nanophosphor described in the above-described patent has a problem that the average particle size is 8 nm or more and the size of the nanoparticles is large, making it unsuitable for use as a systemic contrast agent.
  • the present invention has been made to solve the above problems, the nanoparticles of the present invention has a small average particle diameter is suitable for use as a systemic contrast agent, high T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ) is suitable as an MRI contrast agent To provide an MRI / FI contrast agent and a method of manufacturing the same, which can be used simultaneously as MRI contrast agent and FI contrast agent.
  • r 2 spin relaxation coefficient
  • the present invention provides a nanoparticle for MRI (magnetic resonance imaging) / FI (fluorescence imaging) contrast agent comprising a compound represented by the following formula (1).
  • the compound is Dy 1.4 ⁇ 1.6 Eu 0.4 ⁇ 0.6 O 3 , Ho 1.5 ⁇ 1.7 Eu 0.3 ⁇ 0.5 O 3 and Ho 1.0 ⁇ 1.2 Tb 0.8 ⁇ 1.0 O 3 It may be one or more.
  • the average particle diameter of the nanoparticles may be 1 to 3 nm.
  • the T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ) of the nanoparticles may be 40 ⁇ 80 mM -1 s -1 .
  • the present invention is an MRI / FI contrast agent nanoparticles as described above; And a biocompatible coating layer coating the surface of the nanoparticles for the MRI / FI contrast agent and including a biocompatible ligand. It provides an MRI / FI contrast medium.
  • the biocompatible coating layer may have an average thickness of 3 to 20 nm.
  • the biocompatible ligand is polylactide, polyglycolide, poly (lactide-glycolide) copolymer [poly (lactide-co-glycolide)] , Polycaprolactone, dextran, D-glucuronic acid, Lactibionic acid, polyethylene glycol acid and copolymers thereof It may be to include one or more of the group consisting of.
  • the MRI / FI contrast agent may be a contrast agent for cancer cells.
  • the present invention comprises the steps of preparing a mixture by mixing a polar organic solvent and a lanthanum precursor; Mixing the mixture, an alkaline solution, and an oxidizing agent to form nanoparticles including the compound represented by Chemical Formula 1; And preparing a contrast agent by coating the nanoparticles with a water-soluble biocompatible ligand, wherein the lanthanide precursor is Dy (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Ho (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Gd (NO 3 ) First lanthanum precursor and Eu (NO) containing at least one of the group consisting of 3 ⁇ 5H 2 O, Tb (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O and Er (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O 3 ) It provides a method for producing MRI / FI contrast agent comprising a second lanthanum precursor containing at least one of the group consisting of 3 ⁇ 5H 2 O and Tb (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O.
  • the polar organic solvent comprises at least one of the group consisting of triethylene glycol (diethylene glycol) and diethylene glycol (diethylene glycol),
  • the alkaline solution is an aqueous sodium hydroxide solution, hydroxide It may include one or more of the group consisting of methanol dissolved sodium, aqueous potassium hydroxide solution and methanol dissolved potassium hydroxide.
  • the mixture may be a mixture of 1 to 10 parts by weight of a lanthanum precursor based on 100 parts by weight of a polar organic solvent.
  • the mixing ratio of the mixture, the alkaline solution and the oxidizing agent may be mixed in a 1: 2.5 to 3.5: 2.5 to 3.5 molar ratio.
  • the oxidant comprises hydrogen peroxide (H 2 O 2)
  • the water-soluble biocompatible ligand is polylactide, polyglycolide, poly (lactide-glycolide) ) Copolymer [poly (lactide-co-glycolide)], polycaprolactone, dextran, D-glucuronic acid, Lactibionic Acid, polyethyleneglycol It may include one or more of the group consisting of lycolic acid (polyethylene glycol acid) and copolymers thereof.
  • the present invention has an effect of providing a contrast agent suitable as an MRI contrast medium having a small average particle diameter, suitable for use as a systemic contrast agent, and having a high T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ).
  • the contrast agent of the present invention has the effect of providing an MRI / FI contrast agent and a method for producing the same can be used simultaneously as MRI contrast agent and FI contrast agent.
  • Figure 2 is the result of observing the nanoparticles of the present invention measured in Experimental Example 1-2 with HRTEM and HVEM.
  • thermogravimetric analyzer 9 is a gravimetric analysis result using the thermogravimetric analyzer measured in Experimental Example 1-5.
  • FIG. 10 is an M-H curve measured in Experimental Example 2.
  • FIG. 11 is a ZEC M-T curve measured in Experimental Example 2.
  • FIG. 12 is a pure magnetization history at 5 K or 300 K measured in Experimental Example 2.
  • FIG. 13 is a 1 / T 1 and 1 / T 2 graph according to the concentration of Dy or Ho measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 13 is a 1 / T 1 and 1 / T 2 graph according to the concentration of Dy or Ho measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 15 is an R 1 map image and an R 2 map image measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 15 is an R 1 map image and an R 2 map image measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 16 is a graph of r 1 and r 2 measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 16 is a graph of r 1 and r 2 measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 17 shows r 1 and r 2 measurement results measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 21 is a T 2 MR image measured in Experimental Example 5.
  • FIG. 22 is a T 2 MR image measured in Experimental Example 5.
  • paramagnetic nanoparticles conventionally used have problems such as water insolubility and toxicity, and in order to solve this problem, an attempt has been made to coat paramagnetic nanoparticle surfaces with various materials.
  • it is not suitable as a contrast agent, and at the same time, the role of FI contrast agent as well as MRI could be performed simultaneously, so it was urgent to provide a contrast agent with improved accuracy of imaging information.
  • the present invention has been sought to solve the above-mentioned problems by providing nanoparticles for MRI (magnetic resonance imaging) / FI (fluorescence imaging) contrast agents containing a compound of Formula 1 below.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • FI fluorescence imaging
  • the average particle size is smaller than that of the conventional contrast medium, and thus, it is suitable to be used as a clinical contrast medium, and the role of the FI contrast medium as well as the MRI can be simultaneously performed, thereby providing a contrast agent with improved accuracy of imaging information.
  • the present invention provides nanoparticles for MRI / FI contrast agent comprising the compound of formula (1).
  • the nanoparticles have a T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ) of 40 to 80 mM ⁇ 1 s ⁇ 1, which is suitable for use as an MRI contrast agent, and is suitable for use as a fluorescence imaging (FI) contrast agent by developing fluorescence in the body. .
  • Example 3 and Figures 13 to 17 dysprosium (Dy), holmium (Ho), manganese oxide, iron oxide (Fe 3 O 4 ) or gadolinium oxide (Gd 2 O 3 ) of the present invention It was confirmed that the T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ) of the nanoparticles was significantly higher. Through this, the nanoparticles of the present invention was found to be suitable for use as MRI contrast agent.
  • A may be dysprosium (Dy), holmium (Ho), gadolinium (Gd), terbium (Tb) or erbium (Er), and B may be europium (Eu) or terbium (Tb). More preferably, Dy 1.4 ⁇ 1.6 Eu 0.4 ⁇ 0.6 O 3 , Ho 1.5 ⁇ 1.7 Eu 0.3 ⁇ 0.5 O 3 And Ho 1.0 ⁇ 1.2 Tb It may be one or more of the group consisting of 0.8 ⁇ 1.0 O 3 .
  • the average particle diameter of the nanoparticles is not particularly limited as long as it is usually used as a contrast agent, preferably an average particle diameter of 1 to 3 nm.
  • the average particle diameter exceeds 3 nm, it may be difficult to use as a clinical contrast agent because it is not discharged to the body after the contrast.
  • the present invention is an MRI / FI contrast agent nanoparticles as described above; And a biocompatible coating layer coating the surface of the nanoparticles for the MRI / FI contrast agent and comprising a biocompatible ligand.
  • the biocompatible coating layer is not particularly limited as long as it is a coating thickness of a biocompatible ligand coated on a conventionally used contrast agent, and preferably may have an average thickness of 3 to 20 nm.
  • the biothickness coating layer having an average thickness of more than 20 nm in average thickness is included, the size of the prepared MRI / FI contrast medium is increased, and thus, it may be difficult to be used as a clinical contrast agent because it is not discharged to the body after in vivo contrast.
  • the biocompatible ligand is not particularly limited as long as it is a water-soluble biocompatible ligand that is usually coated on a contrast agent.
  • the MRI / FI contrast agent is very useful for imaging the internal region of the human body.
  • the imaging process is accomplished by administering a diagnostically effective amount of contrast medium to a human and then scanning the human body using FI imaging and MRI imaging to obtain a visible image of the internal parts (tissue) of the human body.
  • the MRI / FI contrast agent of the present invention is useful as a contrast agent for cancer cells.
  • the MRI / FI contrast agent of the present invention can be administered with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are those conventionally used in the formulation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, poly Vinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the contrast agent of the present invention is preferably administered parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, intramuscular injection, intra-articular injection, intra-synovial injection, intramural injection, intrahepatic injection, intralesional injection or It may be administered by intracranial infusion or the like.
  • Suitable dosages of the contrast agent of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. It may be prescribed as appropriate for a diagnostically effective amount.
  • the "diagnostic effective amount” means an amount sufficient to obtain MRI and FI images of the human body.
  • the present invention comprises the steps of preparing a mixture by mixing a polar organic solvent and a lanthanum precursor; Mixing the mixture, an alkaline solution, and an oxidizing agent to form nanoparticles including the compound represented by Chemical Formula 1; And preparing a contrast agent by coating the nanoparticles with a water-soluble biocompatible ligand, wherein the lanthanide precursor is Dy (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Ho (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Gd (NO 3 ) First lanthanum precursor and Eu (NO) containing at least one of the group consisting of 3 ⁇ 5H 2 O, Tb (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O and Er (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O 3 ) It provides a method for producing MRI / FI contrast agent comprising a second lanthanum precursor containing at least one of the group consisting of 3 ⁇ 5H 2 O and Tb (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O.
  • a mixture is prepared by mixing a polar organic solvent and a lanthanum precursor.
  • the polar organic solvent is not particularly limited as long as it is commonly used in the preparation of contrast medium, preferably may include one or more of the group consisting of triethylene glycol and diethylene glycol, more Preferably it may be triethylene glycol (triethylene glycol).
  • the lanthanide precursor is Dy (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Ho (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Gd (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Eu (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Er (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O and Tb (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O It may be two or more of the group consisting of, preferably Dy (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Ho (NO 3 ) 3 ⁇ 5H 2 O, Gd (NO 3) 3 ⁇ 5H 2 O, Tb (NO 3) 3 ⁇ 5H 2 O and Er (NO 3) 3 ⁇ first lanthanum containing at least one of the group consisting of 5H 2 O System precursors; And a second lanthanum precursor including one or more of the group consisting of Eu (NO 3 ) 3 .5H 2 O and Tb (NO 3 ) 3 .5H 2 O.
  • the mixing ratio of the polar organic solvent and the lanthanum precursor is not particularly limited as long as it is a condition generally used in the preparation of a contrast agent.
  • 1 to 10 parts by weight of the lanthanum precursor may be mixed with respect to 100 parts by weight of the polar organic solvent. More preferably, 2 to 5 parts by weight of the lanthanum precursor may be mixed with respect to 100 parts by weight of the polar organic solvent.
  • the amount of the lanthanum precursor may be too small to generate nanoparticles.
  • the amount of the lanthanum precursor may be too large to produce nanoparticles having a large average diameter of the produced nanoparticles.
  • the mixing is not particularly limited as long as it is usually used in the preparation of contrast medium, preferably, it may be performed at 30 to 50 ° C. for 0.5 to 5 hours.
  • the mixture, the alkaline solution and the oxidant are mixed to form nanoparticles containing the compound represented by the formula (1).
  • the alkaline solution is not particularly limited as long as it is typically used in the preparation of contrast medium, but may preferably include one or more of the group consisting of sodium hydroxide aqueous solution, methanol dissolved sodium hydroxide, aqueous potassium hydroxide solution and methanol dissolved potassium hydroxide. More preferably, it may be methanol dissolved sodium hydroxide.
  • the concentration of methanol in which sodium hydroxide is dissolved is not particularly limited, but preferably 10 to 20 mmol of sodium hydroxide may be dissolved in 3 to 10 ml of methanol.
  • the oxidizing agent is not particularly limited as long as it is typically used in the preparation of a contrast agent, and may preferably include hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).
  • the mixing ratio of the mixture, the alkaline solution and the oxidant is not particularly limited as long as it is a condition normally used in the preparation of the contrast agent, preferably the mixing ratio of the mixture, the alkaline solution and the oxidant may be 1: 2.5 to 3.5: 2.5 to 3.5 molar ratio. have.
  • the mixing ratio of the mixture and the alkaline solution is less than 1: 2.5 molar ratio, the amount of the mixture is small may cause a problem that the production of nanoparticles is difficult.
  • the mixture when the mixture, the alkaline solution and the oxidant are mixed at once, the mixture may not be dissolved in the alkaline solution so that the generation of nanoparticles may be difficult.
  • a primary mixture by mixing the mixture and the alkaline solution; And mixing the primary mixture and the oxidant to form nanoparticles. For this reason, there was no problem that it was difficult to produce nanoparticles, which occurred when the mixture, the alkaline solution and the oxidant were mixed at one time.
  • the mixture and the alkaline solution are mixed to prepare a primary mixture.
  • Mixing of the mixture and the alkaline solution is not particularly limited as long as it is a condition used in preparing a contrast agent, preferably, it may be performed at 70 to 85 ° C. for 1 to 3 hours.
  • the mixture may not be dissolved in an alkaline solution, and if the mixture is mixed at a temperature exceeding 85 °C, the diameter of the prepared nanoparticles increases to increase the average diameter Problems with the production of nanoparticles can occur.
  • the primary mixture and the oxidant are mixed to form nanoparticles.
  • Mixing of the primary mixture and the oxidizing agent is not particularly limited as long as it is a condition used in the preparation of the contrast agent, it may be preferably carried out for 1 to 3 hours at 70 ⁇ 85 °C.
  • the generation of nanoparticles may be difficult to produce a problem, when mixing at a temperature exceeding 85 °C, may cause a problem that the nanoparticles having a large average diameter is generated.
  • a contrast agent is prepared by coating a water-soluble biocompatible ligand on the nanoparticles.
  • the water-soluble biocompatible ligand is not particularly limited as long as it is a water-soluble biocompatible ligand that is usually coated on a contrast agent.
  • the mixing ratio of the nanoparticles and the water-soluble biocompatible ligand is not particularly limited as long as it is a condition generally used in preparing a contrast agent.
  • the mixing ratio of the nanoparticles and the water-soluble biocompatible ligand may be mixed in a 1: 0.5 to 2 molar ratio.
  • the mixing ratio of the nanoparticles and the water-soluble biocompatible ligand is less than 1: 0.5 molar ratio, the coating of the water-soluble biocompatible ligand on the nanoparticles may be difficult.
  • Mixing of the nanoparticles and the water-soluble biocompatible ligand is not particularly limited as long as the conditions are applied to coat the ligand on the nanoparticles that are commonly used as a contrast agent, but may be mixed at 70 to 85 ° C. for 20 to 30 hours. have.
  • Dy (NO 3) used in Example of the invention 3 ⁇ xH 2 O (99.9% ), Ho (NO 3) 3 ⁇ 5H 2 O (99.9%), Eu (NO 3) 3 ⁇ 5H 2 O (99.9% ), Tb (NO 3 ) 3 .5H 2 O (99.9%), NaOH (99.9%), 50% H 2 O 2 aqueous solution, triethylene glycol (99%), CH 3 OH (99.9%) and D-glucuronic acid (99.99%) was purchased from Sigma-Aldrich. In addition, C 2 H 5 OH (99%) was purchased from Deoksan, South Korea.
  • a hydroxide solution was prepared by dissolving 15 mmol of NaOH in 5 ml of methanol. The hydroxide solution was slowly added to the precursor solution using a syringe, and stirred at 240 ° C. for 24 hours. After cooling to 80 °C to produce a nanoparticle. 7.5 mL of 50% H 2 O 2 aqueous solution was added to the synthesized nanoparticles, and stirred for 2 hours to synthesize Dy / Eu nanoparticles.
  • Ho / Eu nanoparticles were synthesized in the same manner as in Example 1 except that Ho (NO 3 ) 3 .5H 2 O was used instead of Dy (NO 3 ) 3 .5H 2 O.
  • a Ho / Eu contrast agent and a Ho / Eu contrast agent solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that the Ho / Eu nanoparticles prepared in Example 2 were used.
  • a Ho / Tb contrast agent and a Ho / Tb contrast agent solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that the Ho / Tb nanoparticles prepared in Example 2 were used.
  • the concentration of lanthanum-based elements (Dy, Ho, Eu, and Tb) in the nanoparticles prepared in Examples 1 to 3 was measured using an inductively coupled plasma atomic emission spectrometer (ICPAES; Thermo Jarrell Ash Co., IRIS / AP ) was measured.
  • ICPAES inductively coupled plasma atomic emission spectrometer
  • X of the Dy X Eu Y O 3 nanoparticles of Dy / Eu nanoparticles prepared in Example 1 was 1.5 ⁇ 0.1, Y was measured to 0.5 ⁇ 0.1, Ho / Eu nano prepared in Example 2
  • the particle size of the particle of HO X Eu Y O 3 nanoparticles X was 1.6 ⁇ 0.1, Y was measured to 0.4 ⁇ 0.1.
  • the HO X Tb Y O 3 nanoparticles of Ho / Tb nanoparticles prepared in Example 3 X was 1.1 ⁇ 0.1, Y was measured to 0.9 ⁇ 0.1.
  • the particle diameters of the nanoparticles prepared in Examples 1 to 3 are high resolution transmission electron microscopes (HRTEM; JEOL, JEM 2100F, 200 kV acceleration voltage) and ultra high voltage electron microscopes (electron microscope). electron microscope; HVEM; JEOL JEM-ARM 1300 S, 1.2 MeV acceleration voltage).
  • micropipette PELCO No. 160, TED PELLA, INC.
  • micropipette Eppendorf, 2-20 ⁇ l
  • HRTEM and HVEM HRTEM and HVEM.
  • Observation results are shown in Figures 1 to 3, the distribution of the particle size of the nanoparticles observed in Figures 1 to 3 was analyzed by a log-normal function, the analysis results are shown in Figures 4 to 6, wherein Ntotal Is the number of nanoparticles used for lognormal function analysis.
  • the average particle diameter of Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 , the core particle of the biocompatible ligand-coated Dy / Eu nanoparticles prepared in Preparation Example 1, is 2.3 ⁇ 0.1 nm. there was.
  • the average particle diameter of the nanoparticles of the present invention was confirmed to be suitable for use as a clinical contrast agent of less than 3 nm.
  • the hydrodynamic deameter of the contrast agents prepared in Preparation Examples 1 to 3 was measured by a dynamic light scattering analyzer.
  • the contrast agent solution prepared in Preparation Examples 1 to 3 is a solution containing 0.1 mM of Dy, Ho, Eu or Tb, which is a dynamic light scattering (DLS) particle size analyzer (UPA-150, Microtrac) Observation results and photographs of the contrast agent mixture are shown in FIG. 7.
  • DLS dynamic light scattering
  • (I) of Figure 7 is a contrast agent of Preparation Example 1, which is Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 coated with D-glucuronic acid, (II) is Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 coated with D-glucuronic acid
  • the contrast agent of Preparation Example 2 (III) shows the results of DLS analysis of the contrast agent of Preparation Example 3, which is Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 coated with D-glucuronic acid.
  • the average particle diameter of the contrast agent of Preparation Example 1 was 6.7 ⁇ 0.1 nm
  • the average particle diameter of the contrast agent of Preparation Example 2 was 6.4 ⁇ 0.1 nm
  • the average particle diameter of the contrast agent of Preparation Example 3 was 7.6 ⁇ 0.1. It was confirmed that it was nm.
  • FIG. 7 could confirm the well-dispersed solution of the contrast agent prepared in Preparation Examples 1 to 3.
  • thermogravimetric analyzer was used to measure the amount of D-glucuronic acid coated on the contrast agent powders prepared in Preparation Examples 1 to 3.
  • thermogravimetric analysis curve was measured at a temperature of 25 ⁇ 900 °C, the measurement results are shown in Figure 9.
  • the surface coating weight% was found to be 46.0% in Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 , 46.0% in Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 and 59.0% in Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 , 25 ⁇ Moisture desorption between 110 ° C. was found to be 5.0%.
  • the magnetic properties of the contrast agents prepared in Preparation Examples 1 to 3 were measured using a superconducting quantum interference device (SQUID) magnetometer (Quantum Design, MPMS-7).
  • SQUID superconducting quantum interference device
  • M-H curve magnetization (M) versus applied field (H) curve; -5 ⁇ H ⁇ 5 tesla
  • ZEC M-T curves zerofield-cooled magnetization-Temperature curves; 5 ⁇ T ⁇ 300 K
  • 0 Oe Oersted
  • 100 Oe Oersted
  • the pure magnetization of the nanoparticles in the contrast agent prepared in Preparation Examples 1 to 3 at 300 K was high due to incomplete magnetization at 25 ° C.
  • the pure magnetization of nanoparticles at 5 K is greater than at 300 K because of the stable magnetization at low temperatures.
  • the magnetization of the contrast agent prepared in Preparation Examples 1 to 3 was increased than Dy 3+ ( 6 H 15/2 ), Ho 3+ ( 5 I 8 ) and Tb 3+ ( 7 F 6 ). You can see that.
  • the magnetizations of Dy 3+ ( 6 H 15/2 ), Ho 3+ ( 5 I 8 ) and Tb 3+ ( 7 F 6 ) are listed in Table 1 below.
  • the relaxation times of T1 and T2 were measured using a 1.5 Tesla MRI (GE 1.5 T Signa Advantage, GE medical system).
  • 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM or 0.0625 mM of Dy or Ho was added to tertiary distilled water to prepare a sample aqueous solution, and 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM or 0.0625 mM of Dy 1.5 Eu 0.5 O Contrast aqueous solution was prepared by adding 3 , Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 or Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 to tertiary distilled water.
  • the relaxation time of the sample aqueous solution and the contrast agent aqueous solution, map images of R 1 and R 2 were measured.
  • the field of view (FOV) 16 cm
  • the phase FOV 1 cm
  • the matrix size 512 ⁇ 512
  • the slide thickness 5 mm
  • the pixel bandwidth is 61.0547
  • the repetition time (TR) is 2009 ms
  • echo time (TE) were performed at 9 ms.
  • FIG. 15 Graphs of the measured r 1 and r 2 values are shown in FIG. 15, and the R 1 map image and the R 2 map image are shown in FIG. 16.
  • (I) in FIG. 16 is Dy 1.5 Eu 0.5 O 3
  • (II) is Ho 1.6 Eu 0.4 O 3
  • (III) is Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 .
  • the r 1 value was insufficient in the lanthanide-based elements Dy or Ho alone and in combination, but the r 2 value depending on the total magnetic moment of the contrast agent was found to be significant.
  • the r 2 value of the contrast agents Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 , Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 or Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 prepared in Preparation Examples 1 to 3 was high, depending on the concentration of the contrast agent solution. Due to the increase and decrease of contrast in the R2 map image, it was confirmed that the contrast agent of the present invention is suitable for use as a T 2 MRI contrast agent.
  • Fe3O4 nanoparticles coated with dibasic acid PEG (PEG-diacid) and MnO nanoparticles coated with D-glucuronic acid were the next largest r after Gd 2 O 3 nanoparticles coated with D-glucuronic acid. 1 value was shown. However, the r 1 values of Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 , Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 and Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 were insufficient.
  • the r 2 values of Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 , Ho 1.6 Eu 0.4 O 3, and Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 were significantly higher than those of other nanoparticles, and were found to be suitable for use as T 2 MRI contrast agents.
  • a luminometer (luminometer; Victor 3, Perkin-Elmer) was used to measure the amount of adenosine triphosphate (ATP) in the cells, the cells used for measuring cytotoxicity, human prostate cancer cells (DU145 ) And normal mouse hepatocytes (NCTC1469).
  • the cancer cells and hepatocytes were cultured using Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) and RPMI1640.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the culture was performed by dispensing cancer cells or hepatocytes in a 24-well cell culture plate at 5 ⁇ 10 4 units / well and incubating at 5% CO 2 and 37 ° C. for 24 hours.
  • 2 ml of contrast agent sample solution at various concentrations (10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 200 ⁇ M, 400 ⁇ M or 500 ⁇ M) was added and incubated for 48 hours.
  • the number of viable cells was then measured twice per cell and the average value was used for cell viability.
  • the cell viability was normalized compared to the control without the contrast sample solution.
  • Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 of Preparation Example 1 is shown in FIG. 18, Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 of Preparation Example 2 is shown in FIG. 19, and Ho 1.1 Tb 0.9 O of Preparation Example 3 is shown in FIG. 20.
  • the contrast agent sample solution was prepared by adding sterile phosphate buffered saline (sterile PBS) to the contrast agent solution prepared in Preparation Examples 1 to 3 of 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 200 ⁇ M, 400 ⁇ M or 500 ⁇ M. Dilute to concentration.
  • sterile PBS sterile phosphate buffered saline
  • the contrast agents prepared in Preparation Examples 1 to 3 did not affect cell viability even when used at a concentration of 10 to 500 ⁇ M, and there was no cytotoxicity.
  • T 2 spin echocardiography T 2 spin
  • SE 3 Tesla MRI equipment
  • mice used in this experimental example were 30 g of ICR female rats, and each mouse was anesthetized with oxygen containing 1.5% isoflurane. Thereafter, 30 ml of an aqueous solution containing 0.05 mmol of Ho 1.6 Eu 0.4 O 3 , a contrast agent prepared in Preparation Example 2, was injected into the tail vein of the mice, and the mice awakened from anesthesia were kept at 37 ° C. with feed and water. was placed in us (cage) after 1 hour was measured T 2 spin echocardiography of mice. The measurement result was shown to FIGS. 21-22.
  • the temperature is 37 °C
  • NEX 3 ⁇ 4
  • field of view (FOV) 60 mm
  • phase FOV 60 mm
  • matrix size 256 ⁇ 256
  • spacing gap 0.1 mm
  • axial view (axial view) 3 tesla
  • NEX 3-4
  • field of view (FOV) 60 mm
  • phase FOV 30 mm
  • matrix size 128 ⁇ 256, slide thickness 1 mm
  • Spacing gap 0.1 mm
  • repetition time (TR) was performed at 2690 ms and echo time (TE) at 37 ms.
  • the nanoparticles coated with the biocompatible ligand of the present invention is suitable for use as a T 2 MRI contrast agent.
  • cancer cells were divided into three 35 mm cell culture dishes at 2.5 ⁇ 10 5 / containers and incubated at 5% CO 2 and 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, the two containers were incubated for 48 hours by adding 50 ml of an aqueous solution of contrast medium containing 0.2 mM of Dy 1.5 Eu 0.5 O 3 of Preparation Example 1 or Ho 1.1 Tb 0.9 O 3 of Preparation Example 3, and the other container was contrast medium. Incubate for 48 hours without adding aqueous solution.
  • the cells of two containers cultured with the addition of an aqueous solution of contrast medium were washed twice with PBS, and the cells of one container that had been cultured without the addition of an aqueous solution of contrast medium were used as controls.
  • Cells in three vessels were then fixed with PBS solution containing 4% paraformaldehyde (PFA) at 25 ° C. for 10 minutes, and the fixed cells were washed three times with PBS.
  • PFA paraformaldehyde
  • the nuclei of the fixed cells were stained with 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) and then washed three times with PBS.
  • the fixed cells were placed in Prolong Gold (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) for imaging, and the laser intensity was 8 watts (W) for lifting.
  • the contrast agent of the present invention has a high sensitivity as a fluorescent image (FI) contrast agent to show that it is suitable to utilize as a FI contrast agent.
  • FI fluorescent image
  • the nanoparticles of the present invention has a small average particle diameter, which is suitable for use as a systemic contrast agent, and has a high T 2 spin relaxation coefficient (r 2 ), which makes it suitable as an MRI contrast agent.
  • r 2 T 2 spin relaxation coefficient
  • the contrast agent of the present invention was confirmed that the MRI / FI contrast agent that can be used simultaneously as MRI contrast agent and FI contrast agent.

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Abstract

본 발명은 MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 MRI 조영제 및 FI 조영제로 동시에 사용될 수 있고, 평균 입경이 작아 조영제로서 적합하며 T2 스핀 이완 계수(r2)가 높아 MRI 조영제로서 적합한 MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법
본 발명은 MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 MRI 조영제 및 FI 조영제로 동시에 사용될 수 있고, 평균 입경이 작아 조영제로서 적합하며 T2 스핀 이완 계수(r2)가 높아 MRI 조영제로서 적합한 MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체내에서 발생하는 질병은 조기 진단하는 것이 질환 치료에 있어서 매우 중요한 요소로 알려져 있다. 질환 검사방법에는 대표적으로 혈액검사, 생체검사, 분자영상법 등이 있다. 혈액 검사는 혈액 속에 특정 성분의 농도가 변경되는 것을 살펴보는 것인데, 예컨대, 간 질환의 경우, 빌리루빈(bilirubin), 아미노전이효소(Aminotransferases), 알칼라인 인산 분해효소(ALP,Alkaline phosphatase), 알부민(albumin), 글로부린(globulin)등의 혈청 암모니아(ammonia), 약물 청소율(drug clearance) 등을 측정하여 간 질환을 진단하는 방법이 있다. 그러나, 위와 같이 혈액을 통한 질병 진단방법은 직접적으로 측정할 수 있는 방법이 아니기에 질환 초기에는 질환 표지물질이 검출되지 않는 문제가 있다. 다음으로 생체검사는 직접 조직을 떼어내어 현미경 등으로 직접 관찰하는 방법으로 정확한 진단을 위해 필수적인 단계이긴 하지만 검사가 용이하지 않는 문제가 있다.
분자영상법은 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화, 즉 유전자의 발현, 생화학적 변화, 생물학적 변화를 영상으로 분석 평가하는 기법으로, 분자생물학과 첨단 영상기술이 접목하여 가능하게 되었으며 의학, 유전학, 분자생물학, 세포학, 화학, 약학, 물리학, 전산학, 의공학, 영상의학, 핵의학의 기술들이 집약되어 있는 기술이다.
최근 들어 분자영상 기술의 빠른 발전으로 질병의 진단 및 병변의 검출이 가능해지고 있다. 특히, 핵의학 영상과 자기공명영상 기술은 질환의 진단에 매우 유용한 검사 시스템으로 주목받고 있다.
상기 자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging) 기술은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보 영상을 얻는 방법으로서, 인간이나 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간 영상화할 수 있는 뛰어난 영상 진단 장비중의 하나이다.
생명과학이나 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해서 외부에서 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가하는 방법을 사용하는데, 이러한 물질을 조영제라고 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상인데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고 MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다.
영상 대조도를 증가시키는 조영제는 특징과 기능, 주입하는 대상에 따라 활용도와 정밀도의 차이가 생긴다. 조영제를 이용하여 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 주변과 영상신호를 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해 준다. MRI 영상을 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 주위보다 상대적으로 높게 만드는 조영제를 양성(positive) 조영제라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 음성(negative) 조영제라고 한다.
음성 조영제로는 현재 산화철 나노입자 한 가지밖에 없는데, 산화철 나노입자 조영제는 나노입자 사이즈가 너무 커서 간조영제로만 사용된다. 그러나, 다양한 질환의 진단을 위해서는 조영제로 사용할 물질의 입자 크기가 나노 사이즈로 매우 작아야, 생체 내 모든 기관에 적용이 가능하다.
또한, 조영제는 자성을 띄는 상자성이 있어야 하는데, 조영제의 제조에 사용되는 상자성 나노입자로는 Mn, Fe, Co, Ni, Gd 등이 있으며, 이들 상자성 나노입자는 비수용성 및 독성 등과 같은 문제를 가지고 있어서, 이를 해결하기 위하여 상자성 나노입자 표면을 다양한 물질로 코팅하려는 시도가 있다.
이에 대해, 공개특허 10-2013-0121554(공개일자: 2013년11월06일)에는 Ce3+과 Tb3+이 공부활된(codoped) 불화물계 제1화합물을 포함하는 나노형광체를 제공한다. 그러나, 상기 공개특허에 기재되어 있는 나노형광체는 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 평균 입경이 8 ㎚ 이상으로 나노입자의 사이즈가 커서 전신 조영제로 사용하기에 적합하지 않은 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 나노입자는 평균 입경이 작아 전신 조영제로 사용하기에 적합하고, T2 스핀 이완 계수(r2)가 높아 MRI 조영제로서 적합하며, MRI 조영제 및 FI 조영제로 동시에 사용될 수 있는 MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 MRI(자기공명영상; magnetic resonance imaging)/FI(형광영상; fluorescent imaging) 조영제용 나노입자를 제공한다.
[화학식 1]
AXBYO3
상기 화학식 1에 있어서, A는 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb) 또는 에르븀(Er)이고, B는 유로퓸(Eu) 또는 테르븀(Tb)이며, X 및 Y는 0.8 ≤ X ≤ 1.9, 0.1 ≤ Y ≤ 1.2 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 X 및 Y는 1 ≤ X ≤ 1.7, 0.3 ≤ Y ≤ 1 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 Dy1.4 ~ 1.6Eu0.4 ~ 0.6O3, Ho1.5 ~ 1.7Eu0.3 ~ 0.5O3 및 Ho1.0 ~ 1.2Tb0.8 ~ 1.0O3으로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 나노입자의 평균 입경은 1 ~ 3 ㎚일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 나노입자의 T2 스핀 이완 계수(r2)는 40 ~ 80 mM-1s-1일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 MRI/FI 조영제용 나노입자; 및 상기 MRI/FI 조영제용 나노입자 표면을 코팅하고 생체적합성 리간드를 포함하는 생체적합 코팅층; 를 포함하는 MRI/FI 조영제를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 생체적합 코팅층은 평균 두께 3 ~ 20 ㎚일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 생체적합성 리간드는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 덱스트란(dextran), D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid), 락토바이오닉산(Lactibionic Acid), 폴리에틸렌글라이콜산 (polyethylene glycol acid) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 MRI/FI 조영제는 암세포용 조영제일 수 있다.
나아가, 본 발명은 극성 유기용매 및 란탄계 전구체를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제를 혼합하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 나노입자를 형성하는 단계; 및 상기 나노입자에 수용성 생체적합성 리간드를 코팅하여 조영제를 제조하는 단계;를 포함하고, 상기 란탄계 전구체는 Dy(NO3)3·5H2O, Ho(NO3)3·5H2O, Gd(NO3)3·5H2O, Tb(NO3)3·5H2O 및 Er(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제1 란탄계 전구체 및 Eu(NO3)3·5H2O 및 Tb(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제2 란탄계 전구체를 포함하는 MRI/FI 조영제 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 극성 유기용매는 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol) 및 다이에틸렌 글리콜 (diethylene glycol)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 알칼리 용액은 수산화 나트륨 수용액, 수산화 나트륨을 용해한 메탄올, 수산화 포타슘 수용액 및 수산화 포타슘을 용해한 메탄올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 혼합물은 극성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 ~ 10 중량부 란탄계 전구체를 혼합한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제의 혼합비는 1 : 2.5 ~ 3.5 : 2.5 ~ 3.5 몰비로 혼합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 산화제는 과산화수소(H2O2)를 포함하고, 상기 수용성 생체적합성 리간드는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 덱스트란(dextran), D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid), 락토바이오닉산(Lactibionic Acid), 폴리에틸렌글라이콜산 (polyethylene glycol acid) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 평균 입경이 작아 전신 조영제로 사용하기에 적합하고, T2 스핀 이완 계수(r2)가 높아 MRI 조영제로서 적합한 조영제를 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 조영제는 MRI 조영제 및 FI 조영제로 동시에 사용될 수 있는 MRI/FI 조영제 및 이의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 실험예 1-2에서 측정한 본 발명의 나노입자를 HRTEM 및 HVEM로 관찰한 결과이다.
도 2는 실험예 1-2에서 측정한 본 발명의 나노입자를 HRTEM 및 HVEM로 관찰한 결과이다.
도 3은 실험예 1-2에서 측정한 본 발명의 나노입자를 HRTEM 및 HVEM로 관찰한 결과이다.
도 4는 실험예 1-2에서 측정한 본 발명의 나노입자의 입경의 분포를 로그정규 함수(log-normal function)로 분석한 결과이다.
도 5는 실험예 1-2에서 측정한 본 발명의 나노입자의 입경의 분포를 로그정규 함수(log-normal function)로 분석한 결과이다.
도 6은 실험예 1-2에서 측정한 본 발명의 나노입자의 입경의 분포를 로그정규 함수(log-normal function)로 분석한 결과이다.
도 7은 실험예 1-3에서 측정한 본 발명의 조영제의 입경 분포도이다.
도 8은 실험예 1-4에서 측정한 FT-IR 결과이다.
도 9는 실험예 1-5에서 측정한 열 중량분석기를 이용한 중량분석 결과이다.
도 10은 실험예 2에서 측정한 M-H 커브이다.
도 11은 실험예 2에서 측정한 ZEC M-T 커브이다.
도 12는 실험예 2에서 측정한 5 K 또는 300 K에서의 순수 자화 이력이다.
도 13은 실험예 3에서 측정한 Dy 또는 Ho의 농도에 따른 1/T1 및 1/T2 그래프이다.
도 14는 실험예 3에서 측정한 본 발명의 조영제 농도에 따른 1/T1 및 1/T2 그래프이다.
도 15는 실험예 3에서 측정한 R1 지도 이미지 및 R2 지도 이미지이다.
도 16은 실험예 3에서 측정한 r1 및 r2 그래프이다.
도 17은 실험예 3에서 측정한 r1 및 r2 측정 결과이다.
도 18은 실험예 4에서 측정한 Dy1.5Eu0.5O3의 세포 독성 실험 결과이다.
도 19은 실험예 4에서 측정한 Ho1.6Eu0.4O3의 세포 독성 실험 결과이다.
도 20은 실험예 4에서 측정한 Ho1.1Tb0.9O3의 세포 독성 실험 결과이다.
도 21는 실험예 5에서 측정한 T2 MR 이미지이다.
도 22은 실험예 5에서 측정한 T2 MR 이미지이다.
도 23는 실험예 6에서 측정한 λex = 405 ㎚일 때 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지이다.
도 24는 실험예 6에서 측정한 λex = 405 ㎚일 때 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지이다.
도 25은 실험예 6에서 측정한 λex = 405 ㎚일 때 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지이다.
도 26은 실험예 6에서 측정한 λex = 488 ㎚일 때 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지이다.
도 27은 실험예 6에서 측정한 λex = 488 ㎚일 때 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지이다.
도 28는 실험예 6에서 측정한 λex = 488 ㎚일 때 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 통상적으로 사용되던 상자성 나노입자는 비수용성 및 독성 등과 같은 문제가 있어, 이를 해결하기 위하여 상자성 나노입자 표면을 다양한 물질로 코팅하려는 시도가 있으나, 코팅에 의해 나노입자의 입경이 증가하여 조영제로 적합하지 않으며, MRI 뿐 아니라 FI 조영제의 역할도 동시에 수행할 수 있어 이미징(imaging) 정보의 정확도를 높인 조영제의 제공이 시급한 실정이었다.
이에 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 MRI(자기공명영상; magnetic resonance imaging)/FI(형광영상; fluorescent imaging) 조영제용 나노입자를 제공함으로써, 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래 조영제에 비해 평균 입경이 작아 임상 조영제로 사용하게 적합하며, MRI 뿐 아니라 FI 조영제의 역할도 동시에 수행할 수 있어 이미징(imaging) 정보의 정확도를 높인 조영제를 제공하는 효과가 있다.
[화학식 1]
AXBYO3
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 MRI/FI 조영제용 나노입자를 제공한다.
상기 나노입자는 T2 스핀 이완 계수(r2)는 40 ~ 80 mM-1s-1로 MRI 조영제로 사용하기 적합하며, 체내에서 형광을 발색하여 형광영상(FI) 조영제로 사용하기에도 적합하다.
구체적으로, 실시예 3 및 도면 13 내지 17에서 확인되는 바와 같이, 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 산화망간, 산화철(Fe3O4) 또는 산화 가돌리늄(Gd2O3)보다 본 발명의 나노입자의 T2 스핀 이완 계수(r2)가 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 나노입자는 MRI 조영제로 사용하기 적합하다는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 화학식 1에 있어서, A는 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb) 또는 에르븀(Er)이고, B는 유로퓸(Eu) 또는 테르븀(Tb)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Dy1.4 ~ 1.6Eu0.4 ~ 0.6O3, Ho1.5 ~ 1.7Eu0.3 ~ 0.5O3 및 Ho1.0 ~ 1.2Tb0.8 ~ 1.0O3으로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.
나아가, 상기 화학식 1의 X 및 Y는 바람직하게는 0.8 ≤ X ≤ 1.9, 0.1 ≤ Y ≤ 1.2 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 X 및 Y는 1 ≤ X ≤ 1.7, 0.3 ≤ Y ≤ 1 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수일 수 있다.
더불어, 상기 나노입자의 평균 입경은 통상적으로 조영제로 사용되는 정도라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 평균 입경 1 ~ 3 ㎚일 수 있다.
만약, 평균 입경이 3 ㎚를 초과할 경우, 체내 조영 이후 체외로 배출되지 않아 임상 조영제로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.
게다가, 본 발명은 상술한 바와 같은 MRI/FI 조영제용 나노입자; 및 상기 MRI/FI 조영제용 나노입자 표면을 코팅하고 생체적합성 리간드를 포함하는 생체적합 코팅층;를 포함하는 MRI/FI 조영제를 제공한다.
상기 생체적합 코팅층은 통상적으로 사용되는 조영제에 코팅되는 생체적합성 리간드의 코팅 두께라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 평균 두께 3 ~ 20 ㎚일 수 있다.
만약, 평균 두께 20 ㎚를 초과하는 평균 두께의 생체적합 코팅층을 포함할 경우, 제조한 MRI/FI 조영제의 크기가 커져서 체내 조영 이후 체외로 배출되지 않아 임상 조영제로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.
상기 생체적합성 리간드는 통상적으로 조영제에 코팅되는 수용성 생체적합성 리간드라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 덱스트란(dextran), D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid), 락토바이오닉산(Lactibionic Acid), 폴리에틸렌글라이콜산 (polyethylene glycol acid) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid)일 수 있다.
또한, 상기 MRI/FI 조영제는 인체의 내부 부위(internal region)에 대한 이미징에 매우 유용하다. 이미징 과정은 사람에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 인체의 내부 부위(조직)의 가시적 이미지를 얻기 위하여 FI 이미징 및 MRI 이미징을 이용하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다. 특히, 본 발명의 MRI/FI 조영제는 암세포용 조영제로 유용하다.
나아가, 본 발명의 MRI/FI 조영제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조영제는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두 개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있으며, 진단학적 유효량에 적합하게 처방될 수 있다.
상기 "진단학적 유효량"은 인체의 MRI 및 FI 이미지를 얻는데 충분한 양을 의미한다.
더불어, 본 발명은 극성 유기용매 및 란탄계 전구체를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제를 혼합하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 나노입자를 형성하는 단계; 및 상기 나노입자에 수용성 생체적합성 리간드를 코팅하여 조영제를 제조하는 단계;를 포함하고, 상기 란탄계 전구체는 Dy(NO3)3·5H2O, Ho(NO3)3·5H2O, Gd(NO3)3·5H2O, Tb(NO3)3·5H2O 및 Er(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제1 란탄계 전구체 및 Eu(NO3)3·5H2O 및 Tb(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제2 란탄계 전구체를 포함하는 MRI/FI 조영제 제조방법을 제공한다.
먼저, 극성 유기용매 및 란탄계 전구체를 혼합하여 혼합물을 제조한다.
상기 극성 유기용매는 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol) 및 다이에틸렌 글리콜 (diethylene glycol)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol)일 수 있다.
상기 란탄계 전구체는 Dy(NO3)3·5H2O, Ho(NO3)3·5H2O, Gd(NO3)3·5H2O, Eu(NO3)3·5H2O, Er(NO3)3·5H2O 및 Tb(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 2종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 Dy(NO3)3·5H2O, Ho(NO3)3·5H2O, Gd(NO3)3·5H2O, Tb(NO3)3·5H2O 및 Er(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제1 란탄계 전구체; 및 Eu(NO3)3·5H2O 및 Tb(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제2 란탄계 전구체;를 포함할 수 있다.
상기 극성 유기용매 및 란탄계 전구체의 혼합비는 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 극성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 ~ 10 중량부 란탄계 전구체를 혼합한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 극성 유기용매 100 중량부에 대하여 2 ~ 5 중량부 란탄계 전구체를 혼합한 것일 수 있다.
만약, 극성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 중량부 미만의 란탄계 전구체를 혼합할 경우, 란탄계 전구체의 양이 너무 적어 나노입자가 생성되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 극성 유기용매 100 중량부에 대하여 10 중량부를 초과하는 중량의 란탄계 전구체를 혼합할 경우, 란탄계 전구체의 양이 너무 많아 생성된 나노입자의 평균 직경이 큰 나노입자가 생성되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 혼합은 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 30 ~ 50 ℃에서 0.5 ~ 5 시간 동안 수행할 수 있다.
만약, 30 ℃ 미만의 온도에서 혼합할 경우, 란탄계 전구체가 극성 유기용매에 용해되지 않는 문제가 발생할 수 있다.
다음, 상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제를 혼합하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 나노입자를 형성한다.
상기 알칼리 용액은 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수산화 나트륨 수용액, 수산화 나트륨을 용해한 메탄올, 수산화 포타슘 수용액 및 수산화 포타슘을 용해한 메탄올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수산화 나트륨을 용해한 메탄올일 수 있다.
또한, 상기 수산화 나트륨을 용해한 메탄올의 농도는 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수산화 나트륨 10 ~ 20 mmol을 메탄올 3 ~ 10 ㎖에 용해한 것일 수 있다.
상기 산화제는 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 과산화수소(H2O2)를 포함할 수 있다.
나아가, 상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제의 혼합비는 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제의 혼합비가 1 : 2.5 ~ 3.5 : 2.5 ~ 3.5 몰비일 수 있다.
만약, 혼합물과 알칼리 용액의 혼합비가 1 : 2.5 몰비 미만일 경우, 혼합물의 양이 적어 나노입자의 생성이 힘든 문제가 발생할 수 있다.
한편, 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제를 한꺼번에 혼합할 경우, 혼합물이 알칼리 용액에 잘 용해되지 않아 나노입자의 생성이 힘든 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일구현예에서는 혼합물 및 알칼리 용액을 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 1차 혼합물 및 산화제를 혼합하여 나노입자를 형성하는 단계;를 포함하여 수행하였다. 이로 인해, 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제를 한꺼번에 혼합한 경우 발생하였던 나노입자 생성이 어려웠던 문제점이 발생하지 않았다.
먼저, 혼합물 및 알칼리 용액을 혼합하여 1차 혼합물을 제조한다.
상기 혼합물 및 알칼리 용액의 혼합은 조영제 제조시 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 70 ~ 85 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 수행할 수 있다.
만약, 70 ℃ 미만의 온도에서 혼합할 경우, 혼합물이 알칼리 용액에 용해되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 85 ℃를 초과하는 온도에서 혼합할 경우, 제조한 나노입자의 직경이 증가하여 평균 직경이 큰 나노입자가 생성되는 문제가 발생할 수 있다.
다음, 상기 1차 혼합물 및 산화제를 혼합하여 나노입자를 형성한다.
상기 1차 혼합물 및 산화제의 혼합은 조영제 제조시 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 70 ~ 85 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 수행할 수 있다.
만약, 70 ℃ 미만의 온도에서 혼합할 경우, 나노입자의 생성이 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 85 ℃를 초과하는 온도에서 혼합할 경우, 평균 직경이 큰 나노입자가 생성되는 문제가 발생할 수 있다.
다음으로, 상기 나노입자에 수용성 생체적합성 리간드를 코팅하여 조영제를 제조한다.
상기 수용성 생체적합성 리간드는 통상적으로 조영제에 코팅되는 수용성 생체적합성 리간드라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 덱스트란(dextran), D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid), 락토바이오닉산(Lactibionic Acid), 폴리에틸렌글라이콜산 (polyethylene glycol acid) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid)일 수 있다.
상기 나노입자 및 수용성 생체적합성 리간드의 혼합비는 통상적으로 조영제 제조시 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 나노입자와 수용성 생체적합성 리간드의 혼합비는 1 : 0.5 ~ 2 몰비로 혼합할 수 있다.
만약, 나노입자와 수용성 생체적합성 리간드의 혼합비가 1 : 0.5 몰비 미만으로 혼합할 경우, 나노입자에 수용성 생체적합성 리간드의 코팅이 힘든 문제가 발생할 수 있다.
상기 나노입자 및 수용성 생체적합성 리간드의 혼합은 통상적으로 조영제로 사용되는 나노입자에 리간드를 코팅하기 위하여 적용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 70 ~ 85 ℃에서 20 ~ 30 시간 동안 혼합할 수 있다.
만약, 70 ℃ 미만의 온도에서 혼합할 경우, 나노입자에 수용성 생체적합성 리간드의 코팅이 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 85 ℃를 초과하는 온도에서 혼합할 경우, 수용성 생체적합성 리간드가 분해되는 문제가 발생할 수 있다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
준비예.
본 발명의 실시예에서 사용한 Dy(NO3)3·xH2O (99.9%), Ho(NO3)3·5H2O (99.9%), Eu(NO3)3·5H2O(99.9%), Tb(NO3)3·5H2O(99.9%), NaOH (99.9%), 50% H2O2 수용액, 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol, 99%), CH3OH (99.9%) 및 D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid, 99.99%)은 Sigma-Aldrich사 제품을 구매하여 사용하였다. 또한, C2H5OH(99%)는 한국 소재 덕산 기업에서 구매하여 사용하였다.
실시예 1. Dy/Eu 나노입자 합성
4 mmol의 Dy(NO3)3·xH2O 및 1 mmol의 Eu(NO3)3·5H2O을 40 ㎖의 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol)을 포함하는 100 ㎖의 삼구 플라스크(three neck flask)에 첨가하였다. 이후 40 ℃, 대기압(atmospheric condition) 하에서 전구체가 트리에틸렌 글리콜에 완전히 용해될 때까지 교반하여 전구체 용액을 제조하였다.
5 ㎖의 메탄올에 15 mmol의 NaOH를 용해시켜 수산화용액을 제조하였다. 상기 수산화용액을 실린지(syringe)를 이용하여 전구체 용액에 천천히 첨가하고, 240 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 이후 80 ℃로 냉각하여 나노입자를 제조하였다. 합성한 나노입자에 7.5 ㎖의 50% H2O2 수용액을 첨가하고, 2시간 동안 교반하여 Dy/Eu 나노입자를 합성하였다.
실시예 2. Ho/Eu 나노입자 합성
Dy(NO3)3·5H2O 대신 Ho(NO3)3·5H2O을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 Ho/Eu 나노입자를 합성하였다.
실시예 3. Ho/Tb 나노입자 합성
2.5 mmol의 Ho(NO3)3·5H2O 및 2.5 mmol의 Tb(NO3)3·5H2O을 40 ㎖의 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol)에 첨가하고, 트리에틸렌 글리콜에 전구체가 완전히 용해될 때까지 교반하여 전구체 용액을 제조하였다. 이후, 상기 전구체 용액에 실시예 1에서 제조한 수산화용액 5 ㎖을 첨가하고, 80 ℃에서 2시간 동안 교반하여 Ho/Tb 나노입자를 합성하였다.
제조예 1. Dy/Eu 조영제 합성
실시예 1에서 제조한 Dy/Eu 나노입자에 5 mmol의 D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid)을 첨가하고, 80 ℃ 및 대기압 하에서 24 시간 동안 교반하였다. 이후 25 ℃로 냉각하여 1 ℓ 비커로 옮긴 후 500 ㎖의 삼차 증류수(triply distilled water)를 첨가하고 세척하여 생체적합성 리간드가 코팅된 Dy/Eu 나노입자를 제조하여 Dy/Eu 조영제가 침전될 때까지 정치한다. 상기 Dy/Eu 조영제가 침전된 용액의 상층액을 제거하고, Dy/Eu 조영제를 삼차 증류수로 3번 세척하였다.
이후 세척한 Dy/Eu 조영제 전체 중 절반을 삼차 증류수에 첨가하여 Dy/Eu 조영제 용액을 제조하고, 나머지 절반은 공기 중에서 건조시켜 나노 크기의 분말형태를 갖는 Dy/Eu 조영제를 제조하였다.
제조예 2. Ho/Eu 조영제 합성
실시예 2에서 제조한 Ho/Eu 나노입자를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 Ho/Eu 조영제 및 Ho/Eu 조영제 용액을 제조하였다.
제조예 3. Ho/Tb 조영제 합성
실시예 2에서 제조한 Ho/Tb 나노입자를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 Ho/Tb 조영제 및 Ho/Tb 조영제 용액을 제조하였다.
실험예 1. 나노입자의 조성 및 표면 분석
1-1: 란탄계 원소 농도 측정
실시예 1 내지 3에서 제조한 나노입자 중 란탄계 원소(Dy, Ho, Eu 및 Tb)의 농도는 유도결합 플라즈마 방출 분광법(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer; ICPAES; Thermo Jarrell Ash Co., IRIS/AP)을 이용하여 측정하였다.
측정 결과, 실시예 1에서 제조한 Dy/Eu 나노입자인 DyXEuYO3 나노입자의 X는 1.5 ± 0.1이고, Y는 0.5 ± 0.1로 측정되었으며, 실시예 2에서 제조한 Ho/Eu 나노입자인 HOXEuYO3 나노입자의 X는 1.6 ± 0.1이고, Y는 0.4 ± 0.1로 측정되었다. 또한, 실시예 3에서 제조한 Ho/Tb 나노입자인 HOXTbYO3 나노입자의 X는 1.1 ± 0.1이고, Y는 0.9 ± 0.1로 측정되었다.
1-2: 나노입자 입경 측정
실시예 1 내지 3에서 제조한 나노입자의 입경은 전자현미경(electron microscope)인 고분해능 투과형 전자 현미경(High Resolution Transmission Electron Microscope; HRTEM; JEOL, JEM 2100F, 200 kV acceleration voltage) 및초고압 전자 현미경(high voltage electron microscope ; HVEM; JEOL JEM-ARM 1300 S, 1.2 MeV acceleration voltage)으로 측정하였다.
구체적으로, 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 용액을 필터 페이퍼(filter paper)에 놓인 비정질 탄소 막의 상부에 얹어놓은 구리 그리드(copper grid; PELCO No.160, TED PELLA, INC.)에 마이크로 피펫(micropipette; Eppendorf, 2 ~ 20 ㎕)으로 떨어뜨리고, 이를 HRTEM 및 HVEM로 관찰하였다. 관찰 결과는 도면 1 내지 3에 나타냈고, 도면 1 내지 3에서 관찰한 나노입자 입경의 분포를 로그정규 함수(log-normal function)로 분석하였으며, 분석 결과는 도면 4 내지 6에 나타냈으며, 이때 Ntotal는 로그정규 함수 분석에 사용한 나노입자의 개수이다.
도 1 및 도 4에서 확인되는 바와 같이, 제조예 1에서 제조한 생체적합성 리간드가 코팅된 Dy/Eu 나노입자의 코어 입자인 Dy1.5Eu0.5O3의 평균 입경은 2.3 ± 0.1 ㎚인 것을 알 수 있었다.
도 2 및 도 5에서 확인되는 바와 같이, 제조예 2에서 제조한 생체적합성 리간드가 코팅된 Ho/Eu 나노입자의 코어 입자인 Ho1.6Eu0.4O3의 평균 입경은 2.1 ± 0.1 ㎚인 것을 알 수 있었다.
도 3 및 도 6에서 확인되는 바와 같이, 제조예 3에서 제조한 생체적합성 리간드가 코팅된 Ho/Tb 나노입자의 코어 입자인 Ho1.1Tb0.9O3의 평균 입경은 2.5 ± 0.1 ㎚인 것을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이, 도 1 내지 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 나노입자의 평균 입경은 3 ㎚ 미만으로 임상 조영제로 사용하기에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
1-3: 조영제의 평균 입경 측정
제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제의 유체역학의 입경(hydrodynamic deameter)을 동적 광산란 분석기로 측정하였다.
구체적으로, 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 용액은 0.1 mM의 Dy, Ho, Eu 또는 Tb을 포함하는 용액이고, 이를 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 입자 사이즈 분석기(UPA-150, Microtrac)로 관찰하였고, 관찰 결과 및 상기 조영제 혼합물의 사진을 도면 7에 나타냈다.
도면 7의 (Ⅰ)은 D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Dy1.5Eu0.5O3인 제조예 1의 조영제이고, (Ⅱ)은 D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Ho1.6Eu0.4O3인 제조예 2의 조영제이며, (Ⅲ)은 D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Ho1.1Tb0.9O3인 제조예 3의 조영제의 DLS 분석 결과를 나타냈다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, 제조예 1의 조영제의 평균 입경은 6.7 ± 0.1 ㎚이고, 제조예 2의 조영제의 평균 입경은 6.4 ± 0.1 ㎚이고, 제조예 3의 조영제의 평균 입경은 7.6 ± 0.1 ㎚인 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7은 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제가 잘 분산된 용액을 확인할 수 있었다.
1-4: FT-IR 분석
제조예 1 내지 3에서 제조한 수용성 생체적합성 리간드로 코팅된 나노입자의 표면 코팅을 분석하였다.
구체적으로, 펠렛(pallet)에 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 가루 1 ㎎에 KBr 1 ㎎ 및 D-글루쿠로닉산 1 ㎎을 첨가하고, FT-IR 흡광 분석기(Mattson Instruments, Inc., Galaxy 7020A)를 이용하여 400 ~ 4000 ㎝-1의 흡광도에서 흡광도를 분석하였다. 분석 결과는 도면 8에 나타냈다.
도 8에서 확인되는 바와 같이, D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Dy1.5Eu0.5O3, D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Ho1.6Eu0.4O3 및 D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Ho1.1Tb0.9O3의 FT-IR 스펙트라 모두에서, 2910 ㎝-1에서 C-H의 스트레칭 프리퀀시(frequency) 특성이, 1610 ㎝-1에서 C=O의 스트레칭 프리퀀시 특성이, 1070 ㎝-1에서 C-O의 스트레칭 프리퀀시 특성이 확인할 수 있었다. 이로 인해, 제조예 1 내지 3에서 제조한 생체적합성 리간드가 코팅된 조영제는 생체적합성 리간드가 잘 코팅된 것을 알 수 있었다.
또한, D-글루쿠로닉산의 FT-IR 스펙트라 1710 ㎝-1에서 C=O의 스트레칭 프리퀀시 특성이 조영제에서는 약 100 ㎝-1 만큼 적색 이동(red shift)한 것을 확인할 수 있는다. 이는 D-글루쿠로닉산의 -COOH 그룹이 나노입자에 결합하여 발생하는 것으로, 상기 적색 이동은 -COOH 그룹을 가지는 리간드로 코팅된 금속 산화 나노입자에서 확인되는 것이다.
1-5: 열 중량분석기를 이용한 중량분석
제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 가루에 코팅된 D-글루쿠로닉산의 양을 측정하기 위해 열 중량분석기를 이용하였다.
구체적으로, 열 중량분석기(thermogravimetric analyzer; TGA; TA Instruments, SDT-Q 600)을 이용하여 측정한 열 중량분석 커브에서 질량 감소로부터 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 가루에 코팅된 D-글루쿠로닉산의 양을 측정하였다.
상기 열 중량분석 커브는 25 ~ 900 ℃의 온도에서 측정하였으며, 측정 결과는 도면 9에 나타냈다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 표면 코팅 중량%는 Dy1.5Eu0.5O3에서 46.0 %, Ho1.6Eu0.4O3에서 46.0 % 및 Ho1.1Tb0.9O3에서 59.0 %인 것을 알 수 있었으며, 25 ~ 110 ℃ 사이의 수분 탈착(desorption)은 5.0 %로 나타났다.
실험예 2. 자성 측정
제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제의 자성은 초전도 양자간섭소자(superconducting quantum interference device; SQUID) 자력계(magnetometer)(Quantum Design, MPMS-7)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, M-H 커브(magnetization(M) versus applied field(H) curve; -5 ≤ H ≤5 테슬라(tesla))는 5 ~ 300 K에서 측정하였으며, 측정 결과는 도면 10에 나타냈다. 또한, ZEC M-T 커브(zerofield-cooled magnetization-Temperature curves; 5 ≤ T ≤ 300 K)는 H가 0 Oe(oersted) 또는 100 Oe(oersted)에서 측정하였으며, 측정 결과는 도면 11에 나타냈다.
M-H 커브 및 ZEC M-T 커브를 측정하기 위해, 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 13 ㎎을 5 ㎜ × 15 ㎜ 크기의 비자성 젤라틴 캡슐에 첨가하였다. 또한, 조영제에 나노입자의 순수 자화(magnetization)를 측정하기 위해, 측정한 자화는 실험예 1-5에서 측정한 TGA 커브로부터 측정된 조영제 가루 내 나노입자의 중량%와 조영제 가루를 이용하여 질량-정정(mass-correct)을 수행하였다. 측정한 H = 5 테슬라 및 5 K 또는 300 K에서의 순수 자화 이력은 도면 12에 나타냈다.
도 10 및 도 12에서 확인되는 바와 같이, 300 K에서 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 중 나노입자의 순수 자화는 높은데, 이는 25 ℃에서 불완전한 자화때문이다. 반면, 5 K에서 나노입자의 순수 자화는 300 K에서 보다 크며, 이는 낮은 온도에서의 안정적 자화때문이다.
도 11에서 확인되는 바와 같이, 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제의 자화는 Dy3+(6H15/2), Ho3+(5I8) 및 Tb3+(7F6)보다 증가한 것을 확인할 수 있다. Dy3+(6H15/2), Ho3+(5I8) 및 Tb3+(7F6)의 자화는 하기 표 1에 기재하였다.
표 1
Figure PCTKR2014002845-appb-T000001
실험예 3. T2 이완율 측정
종파(longitudinal; 1/T1) 및 횡파(transverse; 1/T2)의 이완 시간은 1.5 테슬라 및 22 ℃에서 측정하였으며, 이를 란탄계 원소인 Dy 또는 Ho의 농도 함수 그래프로 도면 13에 나타냈고, 이를 Ln1와 Ln2(Ln1 = Dy 또는 Ho, Ln2 = Eu 또는 Tb)의 혼합물의 농도 함수 그래프로 도면 14에 나타냈다.
도 14의 (I)는 Dy1.5Eu0.5O3, (II)는 Ho1.6Eu0.4O3 및 (III)은 Ho1.1Tb0.9O3이다.
구체적으로, 1.5 테슬라(tesla) MRI(GE 1.5 T Signa Advantage, GE medical system)를 이용하여 T1 및 T2의 이완 시간을 측정하였다. 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM 또는 0.0625 mM의 Dy 또는 Ho을 삼차증류수에 첨가하여 샘플 수용액으로 제조하고, 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM 또는 0.0625 mM의 Dy1.5Eu0.5O3, Ho1.6Eu0.4O3 또는 Ho1.1Tb0.9O3을 삼차증류수에 첨가하여 조영제 수용액을 제조하였다. 이후 상기 샘플 수용액 및 조영제 수용액의 이완 시간, R1 및 R2의 지도 이미지를 측정하였다. 이때, FOV(field of view) = 16 ㎝, 상(phase) FOV = 1 ㎝, 매트릭스 사이즈 = 512 × 512, 슬라이드 두께는 5 ㎜, 픽셀 대역폭(pixel bandwidth)은 61.0547, 반복 시간(TR)은 2009 ms 및 에코 시간(TE)은 9 ms로 수행하였다.
측정한 r1 및 r2 값의 그래프는 도면 15에 나타냈고, R1 지도 이미지 및 R2 지도 이미지는 도면 16에 나타냈다.
도 16의 (I)는 Dy1.5Eu0.5O3, (II)는 Ho1.6Eu0.4O3 및 (III)은 Ho1.1Tb0.9O3이다.
도 15에서 확인되는 바와 같이, 란탄계 원소 Dy 또는 Ho 단독 및 복합 사용으로는 r1 값이 미비하였으나, 조영제의 총 마그네틱 모먼트에 의존하는 r2 값은 유의미한 것을 확인할 수 있었다.
도 16에서 확인되는 바와 같이, 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제인 Dy1.5Eu0.5O3, Ho1.6Eu0.4O3 또는 Ho1.1Tb0.9O3의 r2 값이 높고, 조영제 수용액 농도에 따른 R2 지도 이미지에서의 조영의 증감으로 인해, 본 발명의 조영제가 T2 MRI 조영제로서 사용하기 적합한 것을 확인할 수 있었다.
나아가, D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Gd2O3 나노입자(평균 입경 = 1.0 ㎚), 2염기산 PEG(PEG-diacid)로 코팅된 Fe3O4 나노입자(평균 입경 = 1.7 ㎚), D-글루쿠로닉산으로 코팅된 MnO 나노입자(평균 입경 = 2.5 ㎚), Dy1.5Eu0.5O3, Ho1.6Eu0.4O3 또는 Ho1.1Tb0.9O3의 r1 및 r2를 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였고, 측정 결과는 도면 17에 나타냈다.
도 17에서 확인되는 바와 같이, D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Gd2O3 나노입자는 가장 큰 r1 값 가졌는데, 이는 가돌리늄(Gd)의 높은 전자 스핀 마그네틱 모먼트(S = 7/2)에 기인한 것으로 판단된다. 또한, 2염기산 PEG(PEG-diacid)로 코팅된 Fe3O4 나노입자 및 D-글루쿠로닉산으로 코팅된 MnO 나노입자는 D-글루쿠로닉산으로 코팅된 Gd2O3 나노입자 다음으로 큰 r1 값을 나타냈다. 그러나, Dy1.5Eu0.5O3, Ho1.6Eu0.4O3 및 Ho1.1Tb0.9O3의 r1 값은 미비하였다.
반면, Dy1.5Eu0.5O3, Ho1.6Eu0.4O3 및 Ho1.1Tb0.9O3의 r2 값은 다른 나노입자들보다 월등히 높아 T2 MRI 조영제로서 사용하기 적합한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 세포독성 실험
제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제의 세포 독성을 측정하기 위해, 셀 타이터-글로 루머네슨스 셀 바이어빌리티 어세이(Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay; Promega, WI, USA)를 이용하였다.
구체적으로, 루미노미터(luminometer; Victor 3, Perkin-Elmer)는 세포 내 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)의 양을 측정하기 위해 사용하였으며, 세포 독성 측정에 사용된 세포로 인간 전립선암 세포(DU145)와 정상 마우스 간세포(NCTC1469)를 사용하였다. 상기 암세포 및 간세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)와 RPMI1640를 사용하여 배양하였다.
상기 배양은 암세포 또는 간세포를 24-웰 셀 컬처 플레이트(24-well cell culture plate)에 5 × 104 unit/웰로 분주한 후 5% CO2 및 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 암세포에 여러 농도(10 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM 또는 500 μM)의 조영제 샘플 용액 2 ㎖를 첨가하고 48 시간 동안 배양하였다. 이후 살아있는 세포 수를 각 세포당 2번 측정하여 그 평균값을 세포 생존력에 사용하였으며, 상기 세포 생존력은 조영제 샘플 용액을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 정규화(normalize)하였다. 측정한 세포 생존력 중 제조예 1의 Dy1.5Eu0.5O3는 도면 18에, 제조예 2의 Ho1.6Eu0.4O3는 도면 19에, 제조예 3의 Ho1.1Tb0.9O는 도면 20에 나타냈다.
상기 조영제 샘플 용액은 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제 용액에 무균 인산완충식염수(sterile phosphate buffered saline; sterile PBS)를 첨가하여 10 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM 또는 500 μM의 농도로 희석한 것이다.
도 18 내지 20에서 확인되는 바와 같이, 제조예 1 내지 3에서 제조한 조영제는 10 ~ 500 μM의 농도로 사용하여도 세포 생존력에 영향을 주지 않아 세포 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 동물을 이용한 T2 MR 이미지 측정
제조예 2에서 제조한 조영제의 MRI 조영제로서의 평가를 위해, 3 테슬라 MRI 장비(SIEMENS 3.0 T MAGNETOMTrio a Tim)를 이용하여 실험쥐에 조영제 샘플 용액의 주입 전 및 후의 T2 스핀 심장초음파(T2 spin echo; SE)를 측정하였다.
구체적으로, 본 실험예에서 사용한 실험쥐는 30 g의 ICR 암컷 흰쥐를 사용하였으며, 각각의 실험쥐는 1.5 % 아이소플루렌스(isoflurane)를 포함하는 산소로 마취하였다. 이후 제조예 2에서 제조한 조영제인 Ho1.6Eu0.4O3의 0.05 mmol을 포함하는 수용액 30 ㎖를 실험쥐의 꼬리 정맥에 주입한 후 마취에서 깨어난 실험쥐를 사료 및 물이 있고 37 ℃로 유지한 우리(cage)에 넣고 1시간 후 실험쥐의 T2 스핀 심장초음파를 측정하였다. 측정 결과는 도면 21 내지 22에 나타냈다.
이때, 두정 관찰(coronal view)은 H = 3 테슬라(tesla), 온도는 37 ℃, NEX = 3 ~ 4, FOV(field of view) = 60 ㎜, 상(phase) FOV = 60 ㎜, 매트릭스 사이즈 = 256 × 256, 슬라이드 두께는 1 ㎜, 스페이싱 갭(spacing gap) = 0.1 ㎜, 반복 시간(TR)은 1620 ms 및 에코 시간(TE)은 37 ms로 수행하였으며, 액시얼 관찰(axial view)은 H = 3 테슬라(tesla), 온도는 37 ℃, NEX = 3 ~ 4, FOV(field of view) = 60 ㎜, 상(phase) FOV = 30 ㎜, 매트릭스 사이즈 = 128 × 256, 슬라이드 두께는 1 ㎜, 스페이싱 갭(spacing gap) = 0.1 ㎜, 반복 시간(TR)은 2690 ms 및 에코 시간(TE)은 37 ms로 수행하였다.
도 21 내지 22에서 확인되는 바와 같이, 제조예 2에서 제조한 조영제인 Ho1.6Eu0.4O3은 간 및 신장(kidney) 모두에서 조영제로 사용하기 적합한 것을 알 수 있었으며, 주입 1시간 후 조영 효과가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이로 인해, 본 발명의 생체적합성 리간드로 코팅된 나노입자는 T2 MRI 조영제로 사용하기 적합한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 형광 공촛점(confocal) 세포 이미지 측정
제조예 1의 Dy1.5Eu0.5O3 또는 제조예 3의 Ho1.1Tb0.9O3을 처리한 인간 전립선암 세포(DU145)에서의 형광 공촛점 이미지 측정을 위해, 공촛점 레이저 스케닝 현미경(confocal laser scanning microscope; Carl Zeiss, LSM 700)를 이용하였다.
구체적으로, 암세포는 3개의 35 ㎜ 세포 컬처 용기(cell culture dishe)에 2.5 × 105 /용기로 분주하고, 5% CO2 및 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 2개의 용기는 제조예 1의 Dy1.5Eu0.5O3 또는 제조예 3의 Ho1.1Tb0.9O3을 0.2 mM 포함하는 조영제 수용액 50 ㎖를 첨가하여 48 시간 동안 배양하였고, 다른 1개의 용기는 조영제 수용액을 첨가하지 않고 48 시간 동안 배양하였다.
이후 조영제 수용액을 첨가하여 배양한 2개의 용기의 세포는 PBS로 2번 세척하고, 조영제 수용액을 첨가하지 않고 배양한 1개의 용기의 세포는 대조군으로 사용하였다. 이후 3개의 용기의 세포는 10 분 동안 25 ℃에서 4 % 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA)를 포함하는 PBS 용액으로 고정하고, 고정한 세포는 PBS로 3번 세척하였다. 상기 고정한 세포의 핵은 4',6 디아미디노-2-페닐인돌(4',6 diamidino-2-phenylindole; DAPI)로 착색하였고, 이후 PBS로 3번 세척하였다.
상기 고정한 세포는 이미지 촬영을 위해 프럴롱 골드(Prolong Gold; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 끼우고, 들뜸을 위해 레이저 세기는 8 와트(W)를 사용하였다.
DAPI 및 제조예 1의 Dy1.5Eu0.5O3 또는 제조예 3의 Ho1.1Tb0.9O3의 발현은 λex값이 405 ㎚ 및 488 ㎚에서 측정하였으며, 측정 결과 중 λex = 405 ㎚일 때, 대조군은 도면 23에, 제조예 1의 Dy1.5Eu0.5O3는 도면 24에, 제조예 3의 Ho1.1Tb0.9O3는 도면 25에 나타냈다. 또한, λex = 488 ㎚일 때, 대조군은 도면 26에, 제조예 1의 Dy1.5Eu0.5O3는 도면 27에, 제조예 3의 Ho1.1Tb0.9O3는 도면 28에 나타냈다.
도 23 내지 25에서 확인되는 바와 같이, λex = 405 ㎚일 때 세포 핵이 파랗게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
도 26에서 확인되는 바와 같이, λex = 488 ㎚일 때 조영제 수용액을 첨가하지 않은 대조군은 형광 발색이 없는 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 도 27 내지 28에서 확인되는 바와 같이, λex = 488 ㎚일 때 Dy1.5Eu0.5O3도 27)는 붉은 형광을, Ho1.1Tb0.9O3(도 28)는 초록 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 조영제는 형광 이미지(FI) 조영제로서 높은 감도를 가져 FI 조영제로 활용하기 적합한 것을 보여주는 것이다.
상기 실시예 및 실험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 평균 입경이 작아 전신 조영제로 사용하기에 적합하고, T2 스핀 이완 계수(r2)가 높아 MRI 조영제로서 적합한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 조영제는 MRI 조영제 및 FI 조영제로 동시에 사용될 수 있는 MRI/FI 조영제임을 확인할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 MRI(자기공명영상; magnetic resonance imaging)/FI(형광영상; fluorescent imaging) 조영제용 나노입자.
    [화학식 1]
    AXBYO3
    상기 화학식 1에 있어서, A는 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb) 또는 에르븀(Er)이고, B는 유로퓸(Eu) 또는 테르븀(Tb)이며, X 및 Y는 0.8 ≤ X ≤ 1.9, 0.1 ≤ Y ≤ 1.2 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 X 및 Y는 1 ≤ X ≤ 1.7, 0.3 ≤ Y ≤ 1 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제용 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 Dy1.4 ~ 1.6Eu0.4 ~ 0.6O3, Ho1.5 ~ 1.7Eu0.3 ~ 0.5O3 및 Ho1.0 ~ 1.2Tb0.8 ~ 1.0O3으로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제용 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 평균 입경 1 ~ 3 ㎚인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제용 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, T2 스핀 이완 계수(r2)는 40 ~ 80 mM-1s-1인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제용 나노입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 MRI/FI 조영제용 나노입자; 및
    상기 MRI/FI 조영제용 나노입자 표면을 코팅하고, 생체적합성 리간드를 포함하는 생체적합 코팅층;
    를 포함하는 MRI/FI 조영제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생체적합 코팅층은 평균 두께 3 ~ 20 ㎚인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생체적합성 리간드는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 덱스트란(dextran), D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid), 락토바이오닉산(Lactibionic Acid), 폴리에틸렌글라이콜산 (polyethylene glycol acid) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제.
  9. 제6항에 있어서, 상기 MRI/FI 조영제는 암세포용 조영제인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제.
  10. 극성 유기용매 및 란탄계 전구체를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제를 혼합하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 나노입자에 수용성 생체적합성 리간드를 코팅하여 조영제를 제조하는 단계;를 포함하고,
    상기 란탄계 전구체는 Dy(NO3)3·5H2O, Ho(NO3)3·5H2O, Gd(NO3)3·5H2O, Tb(NO3)3·5H2O 및 Er(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제1 란탄계 전구체 및 Eu(NO3)3·5H2O 및 Tb(NO3)3·5H2O로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 제2 란탄계 전구체를 포함하는 MRI/FI 조영제 제조방법.
    [화학식 1]
    AXBYO3
    상기 화학식 1에 있어서, A는 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb) 또는 에르븀(Er)이고, B는 유로퓸(Eu) 또는 테르븀(Tb)이며, X 및 Y는 0.8 ≤ X ≤ 1.9, 0.1 ≤ Y ≤ 1.2 및 X + Y = 2를 만족하는 유리수이다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 극성 유기용매는 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol) 및 다이에틸렌 글리콜 (diethylene glycol)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고,
    상기 알칼리 용액은 수산화 나트륨 수용액, 수산화 나트륨을 용해한 메탄올, 수산화 포타슘 수용액 및 수산화 포타슘을 용해한 메탄올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 혼합물은 극성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 ~ 10 중량부 란탄계 전구체를 혼합하는 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제 제조방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 혼합물, 알칼리 용액 및 산화제의 혼합비는 1 : 2.5 ~ 3.5 : 2.5 ~ 3.5 몰비인 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제 제조방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 산화제는 과산화수소(H2O2)를 포함하고,
    상기 수용성 생체적합성 리간드는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 덱스트란(dextran), D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid), 락토바이오닉산(Lactibionic Acid), 폴리에틸렌글라이콜산 (polyethylene glycol acid) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 MRI/FI 조영제 제조방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004026344A1 (en) * 2002-09-23 2004-04-01 General Electric Company Bifunctional contrast agent comprising a fluorescent dye and an mri contrast agent
KR101072666B1 (ko) * 2008-12-30 2011-10-11 경북대학교 산학협력단 산화가돌리늄 나노입자에 생체적합성 리간드가 코팅된 나노입자체 및 이의 제조방법
KR20130094875A (ko) * 2012-02-17 2013-08-27 경북대학교 산학협력단 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004026344A1 (en) * 2002-09-23 2004-04-01 General Electric Company Bifunctional contrast agent comprising a fluorescent dye and an mri contrast agent
KR101072666B1 (ko) * 2008-12-30 2011-10-11 경북대학교 산학협력단 산화가돌리늄 나노입자에 생체적합성 리간드가 코팅된 나노입자체 및 이의 제조방법
KR20130094875A (ko) * 2012-02-17 2013-08-27 경북대학교 산학협력단 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENLONG XU ET AL.: "D-Glucuronic Acid Coated DyEu03 and HoEu03 Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging (MRI) and Fluorescence Imaging (FI", ISMR M 21ST ANNUAL MEETING AND EXHIBITION, 20 April 2013 (2013-04-20) *
WENLONG XU ET AL.: "Mixed lanthanide oxide nanoparticles as dual imaging age nt in biomedicine", SCIENTIFIC REPORTS 3, 13 November 2013 (2013-11-13) *

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