WO2015079180A1 - Procédé de fabrication d'un dispositif multi-modal comprenant un monolithe poreux confine dans un circuit micro-fluidique par photo-greffage - Google Patents

Procédé de fabrication d'un dispositif multi-modal comprenant un monolithe poreux confine dans un circuit micro-fluidique par photo-greffage Download PDF

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WO2015079180A1
WO2015079180A1 PCT/FR2014/053072 FR2014053072W WO2015079180A1 WO 2015079180 A1 WO2015079180 A1 WO 2015079180A1 FR 2014053072 W FR2014053072 W FR 2014053072W WO 2015079180 A1 WO2015079180 A1 WO 2015079180A1
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porous monolith
monolith
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Vincent Dugas
Claire DEMESMAY
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Universite Claude Bernard Lyon I
Ecole Normale Superieure De Lyon
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3847—Multimodal interactions

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of chromatography.
  • the invention relates to a process for the manufacture by photo-grafting of multimodal devices, of very small size, particularly suitable for liquid chromatography.
  • Chromatographic techniques include separative techniques based on the interaction of a solute with a stationary phase and a mobile phase.
  • the stationary phase may be disposed within different types of micro-ffuidique circuit, including: inside of a chromatographic column, which is in the form of a tube, or within open channels or Closed, arranged in a substrate
  • chromatographic column which is in the form of a tube
  • open channels or Closed arranged in a substrate
  • the limitation of volumes, compared to ⁇ ⁇ conventional 'tools of HPLC or UHPLC in particular, is important in His domains where the sample volume is limiting (biology-health, environment).
  • mass spectrometry detection systems become unavoidable.
  • the sensitivity of these detection systems is dependent on the liquid flow rates at the outlet of the chromatographic column.
  • the optimum flow rates for the columns of a few tens of microns in internal DIAMET (of the order of a hundred nanofltres / min) are well suited for the sources nano-spray of this type of detector.
  • chromatographic techniques must be adapted to the analysis of more and more complex matrices; the challenge is to be able to separate, in a single analysis, as many compounds as possible,
  • the publication by Chen et al, Journal of chroma ography A, 2012, 1233 91-99 describes the synthesis m situ in a capillary tube of two different monoliths, obtained by filling the capillary with two different mixtures and grafting the desired functions.
  • the first zone (segment A) is obtained by filling the capillary with a mixture of a silica monomer, a vinyl silane, an initiator and an aorylate functional monomer.
  • a second zone (segment B) is obtained by filling the capillary with a mixture of a silica monomer and a virsyl siiane.
  • the reaction mixtures are introduced into the capillary successively after synthesis, the capillary is filled by a segment of functionalized monolith (segment A) and chemically inactivated by the reaction between the vinyl functions and the acrylate monomer. Initiated by a thermal initiator and a "reactive" segment of monolith (segment 8) carrying vinyl functions on the surface. These are, in a second step, involved in a thermally initiated polymerization reaction following the introduction of a reaction mixture throughout the column! comprising a thiolated functional monomer and a thermal initiator (AIBB).
  • AIBB thermal initiator
  • No. 5,431,807 relates to the synthesis of monoliths, of organic type, prepared by free radical initiated polymerization and thus uses light to initiate the reaction. Then, an abstraction reaction on C-H groups of these organic monoliths is carried out, still by irradiation, in order to graft different organic functionalizations and thus create a muttimodal column. Now, it is known that the abstraction of hydrogen on C-H groups is not very specific in nature. As a result, the technique described does not make it possible to control the points of hanging of the functionalities and does not lead to a homogeneous functionalization,
  • the patent application US 2004/101442 describes a multimodal separation process, without describing a method for preparing the chromatographic medium to be used.
  • the proposed multimodal separation method is based on a single material, having multiple pore size domains, with each pore size domain containing surface groups of different functionality. No information is provided on the grafting mode within the pore size domains. pore, except that it is necessary to use methods for grafting, selectively, pores of a given size, which poses problems of practical implementation.
  • a solution consisting of the use of monolithic silica columns has been proposed to simultaneously meet the needs for miniaturization and increase of peak capacity.
  • silica monolith is prepared in a capillary tube. Silanization with an acrylate silane is then conducted, followed by operation with acrylate monomers using ether. methyl benzoin (BME) as a free radical initiator. The location of the photochemical reaction is demonstrated, but the implementation of the acrylate-acrylate pair is again difficult to implement in order not to alter the chromatographic properties.
  • BME methyl benzoin
  • the invention relates to a method of manufacturing a device comprising a porous monolith confined in a microfluidic circuit, said porous monolith having at least two distinct zones, including at least one zone (I) carrying a function R linked to the porous monolith by a covalent bond, and obtained by the following successive steps:
  • X is a function having a abstractible hydrogen selected from -SH functions, -OH, alkyl amine functions having a hydrogen atom carried by a carbon in the alpha position relative to the nitrogen atom, and ether functions having a hydrogen atom carried by a carbon alph position relative to the oxygen atom and Y has an unsaturated;
  • the method according to the invention allows the manufacture of a device comprising a porous monolith confined in a microfluidic circuit, said porous monolith having at least two zones (3 ⁇ 4 and Za)., Each zone being carrier of a different functionality ⁇ 3 ⁇ 4 and 3 ⁇ 4) related to the porous monolith by a covalent link, and comprises the following successive steps:
  • a second localized functionalization by contacting the porous monolith carrying reactive functions X with a reagent comprising a reactive function Ya and the desired functionality R3 ⁇ 4 on another determined zone Z 3 ⁇ 4 in the presence of a free radical initiator by abstraction hydrogen, followed by localized illumination of the targeted zone Z3 ⁇ 4 causing the reaction of the functions and Y3 ⁇ 4 so as to obtain a bridge coded, and
  • X is a function comprising an abstractive hydrogen selected from the -SH f -OH functions, the alkylamine functions having a hydrogen atom carried by a carbon in the alpha position with respect to the nitrogen atom, and the ether functional groups having a hydrogen atom carried by a carbon in alpha position with respect to the oxygen atom and Y * and: identical or different, comprise an unsaturation; or X has an unsaturation and ⁇ and Y 2 , which are identical or different, are a function comprising an abstract hydrogen selected from the functions -SH-OH, the alkylamine functions having a hydrogen atom carried by the carbon in the alpha position relative to to the nitrogen atom and ether functions ies having an atom of hydrogen carried by a carbon in the alpha position relative to the oxygen atom.
  • the method according to the invention consists in coupling the situ synthesis of porous monolith in microfluidic systems, in particular of the column or capillary tube, or micro-channel type, with functionalization of the localized monolith making it possible to develop devices presenting modes different natographic chr.
  • a porous monolith is prepared directly within the micro-fiukiic circuit.
  • the elaborate monoliths which are essentially inorganic in nature, carry organic functions giving them appropriate surface reactivity.
  • These X reactive functional groups can be inserted directly during the synthesis of the monolith by using a precursor carrying such functions, or made after synthesis of the monolith through suitable coupling agents.
  • a reagent comprising a reactive function generically called Y (and Yi in the case of the first functionalization, Y 3 ⁇ 4 in the case of a second ..,) and the desired functionality R. (and R % in the case of the first functionalization, 3 ⁇ 4 in the case of a second ...) on a given area is used under light irradiation , to obtain the desired functionailsation in a desired area of the monolith.
  • the choice of the functionality of the reagent and thus of the functionality ultimately grafted onto the monolith depends on the chromatographic mode envisaged.
  • the photochemical reactions carried out in the context of the invention are faster (a few minutes, or even ten minutes) than the thermally initiated reactions used in the prior art for the functionalization.
  • such a photochemical actlvatlon makes it possible to locate the modified area.
  • By performing at least two successive stages of focused irradiation with reagents comprising different functionalities it is possible to obtain in the same micro-circuit fluidic at least two zones each having a different functionality. It is thus possible to couple in the same microfluidic circuit different chromatographic modes.
  • a photo-chemical reaction is carried out at each functionalization between two different reactive functions called X or Y, one of the two reactive functions X or
  • the reaction between the functions and Y results in a simple covalent grafting without surface polymerization reaction. Also, compared to the previous method (methaerylate / acrylate), this method avoids surface photo-polymerization. It is therefore just a surface photo-grafting of functionalized molecules.
  • the functionalization used in the process according to the invention generally leads to a monomolecular layer.
  • the process according to the invention also makes it possible to avoid physical coupling, that is to say the coupling of columns by the union bias (connector) or coupling through injection valve that requires multiple pumping systems.
  • abtract hydrogen is meant a hydrogen atom capable of being removed under photoactivation, in the presence of a hydrogen-free radical initiator, to form a radical
  • functions carrying a hydrogen abstractly we will use a function -Sri, -OH, an alkylamine function having a hydrogen atom carried by a carbon in the alpha position relative to the nitrogen atom, or an ether function having a hydrogen atom carried by a carbon in the alpha position relative to the oxygen atom, which has at least one easily abstractîble hydrogen.
  • the Tiilois and the alkylamines having a hydrogen atom in position aipha with respect to the nitrogen atom, and in particular of the tertiary amines type are efficient hydrogen donors (allowing obtain efficient hydrogen transfers). These hydrogen donors therefore make it possible to target the reaction on these specific groups even in the presence of other molecules having hydrogens such as acrylates or methacrylates, for example.
  • the function which comprises an unsaturation is, for its part, chosen from among the groups comprising a double bond ⁇ OC ⁇ or triple bond -OC-, especially among the alkenyls such as the vinyl group, the alkynyls, its acryiates, the acrylamides, vinyl ethers, vinyl esters, norbornenes, N-vinyl amides, allyltriazines, N-amylenes, allylthers, alkylsocyanurates, unsaturated esters, M-substituted monimides, acrylonitrile, styrene and the like. conjugated dienes.
  • the alkenyls such as the vinyl group, the alkynyls, its acryiates, the acrylamides, vinyl ethers, vinyl esters, norbornenes, N-vinyl amides, allyltriazines, N-amylenes, allylthers, alkylsocyanurates, uns
  • the process according to the invention is not limited to particular inorganic monoliths.
  • the monolith is a continuous porous monoblock material formed of an inorganic skeleton delimiting an interconnected network of macropores on which organic functions are or will be grafted.
  • the material may be based on inorganic oxide, and in particular with silicon oxide, titanium oxide or zirconium oxide, or even with hafnium oxide.
  • the monolith can be prepared with a single precursor or with a mixture of several precursors, at least some of which are mono or multifunctional.
  • the porous monolith will have a porosity adapted to chromatography processes.
  • the icro-fluidic circuit may have a mixed porosity, with a macroporosis for the flow of a mobile phase and a meso- or microporosity to increase the
  • the in situ synthesis of the monolith within the icro-fluidic circuit is conventionally carried out by the implementation of a sol-gel process with at least one porogenic agent of the surfactant or polymer type, which confers the porosity to the monolith obtained and allows to obtain the desired porosity (Nakanishi et al., J SOL-GEL SCI TECH MOL (1997) 8: i, 547-552).
  • Conventional sol-gel synthesis techniques as described in J.
  • the reactive function X allowing the photo-grafting reaction can be inserted directly on the monolith during its synthesis in the micro-fioidic circuit or grafted after synthesis when the monolith is already positioned in the micro-fluldic circuit.
  • obtaining the porous monolith carrying reactive functions X can be achieved by functlonnalSsat on a porous inorganic monolith, preferably obtained by sol-gel process
  • Obtaining porous monolith carrying reactive functions X fear also be carried out in a single step, directly inside the mtcro-ftuidic circuit, by implementing a sol-gel process using a functionalized precursor.
  • Phosphonic acids and phosphonates also bind to the surface of monoliths based on ⁇ 2 or Zr € 3 ⁇ 4 in particular, and may be used to introduce the reactive functions M.
  • the molecules carrying a catechol pattern are also capable of producing adherent layers. strongly on titanium and can therefore be used to functionalize porous monoliths with low TK3 ⁇ 4.
  • ⁇ will carry reactive functions X to subsequently perform the photo-grafting functionalization step
  • the reactive group may be directly bonded to a silicon, titanium, zirconium or hafnlum atom of the monolith or bonded through a linker.
  • the reactive functions will be present on the porous monolith at 0.1 to 10 pmol / m 2 .
  • the monolith must be transparent to the irradiation wavelengths used.
  • the metal oxides mentioned above are perfectly adapted.
  • the monolith thus formed inside the micro-functional circuit carrying reactive functions X is then brought into contact with the carrier reagent.
  • a reactive function Y which will react with the X functions carried by the monolith and, at the other end, a functional group R making it possible to confer on the selected monolith zone the desired electron chromatographic properties.
  • the linking arm which can be used between the monolith and the M function and / or between the ⁇ and R functions can be, for example, a linear or branched alkylene chain (divalent alkyl) or a particular unit such as, for example, a pattern of ethylene oxide type. This pattern may be repetitive (polymeric) or not.
  • a ratio Y functions / X functions greater than or equal to i # will be used so as to optimize the functionalization density finally obtained on the monolith.
  • a solution containing the reagent with the reactive function ⁇ and the functionality H and the initiating agent will be used to impregnate the porous monolith.
  • a solution is prepared either directly in the reagent to be grafted, either in a solvent
  • the solvent may be an organic solvent, a mixture of organic solvents, an aqueous solvent or a hydro-organic mixture.
  • the solvent include THF, mayihanol, acetonitrile, water and mixtures thereof.
  • the initiator is preferably soluble in said solution, it is also conceivable to carry out photo-grafting reactions after adsorptioo the initiator agent to the porous monolith or to make you adsorption reagent and the initiator agent before irradiation,
  • concentration of reagent carrying the reactive function Y and the functionality R, in the solution used is, in general, from 0.2 to 1M
  • all of the reagents necessary to carry out the grafting of the functionality R of interest namely the reagent carrying the functionality il and the reactive function Y which will react with the reactive monolith and the initiating agent, It is introduced into the same reaction mixture with which the reactive monolith will be brought into contact and subjected to photo-irradiation.
  • the photo-irradiation being carried out in a localized manner, the whole of the porous monolith can be brought into contact with the reagent.
  • the initiating agent is preferably activatable under UV radiation, although activation under X-rays or gamma may also be envisaged, as examples of suitable initiating agents, mention may be made of benzophenone and its derivatives, thioxanthones, benzoin and its ethers; benzyl and its ketals; acetophenone and its derivatives, alkylphenones and their derivatives; alpha hydroxy ketones; acyiphosphine oxides; and titanocenes.
  • an initiator of the type Morrish type IL will be used.
  • the initiator is used in amounts sufficient to enable the hydrogen abstraction without ceremoniester (hide) the incident light.
  • the amount of initiator agent will be dependent on the initiator agent used and will be adapted by those skilled in the art. In general, the amount of initiating agent used will be from 0 to 10% by weight relative to the total mass of the solution. impregnation used. Localized illumination leading to photo-grafting is most often carried out at a wavelength in the range of 200 to 600 nm, in particular in the range of 240 to 380 nm.
  • the dirradiation energy is, in general, from 0.05 ⁇ m- 2 to 9 ⁇ m- 2 , and more particularly from 1 to 3 ⁇ m- 2 .
  • the irradiation time is, for example, from 1 to 20 minutes, preferably from 1 to 10 minutes. Irradiation is generally carried out under normal conditions of temperature (ambient temperature) and pressure (atmospheric pressure),
  • the irradiation is localized by using a mask or a focused irradiation, in order to obtain the desired functionalization by reaction of the X and ⁇ functions in the targeted zone.
  • the irradiation is said to be localized, since only the zone in which it is desired is irradiated. get functionalization.
  • FIG. 1 schematically illustrates an example of the method according to the invention , with irradiation localized by means of a mask, used in an example which follows.
  • polymeric chains for example of the polyethylene glycol type
  • the ionized and / or zwitterionic groups such as sulphates, sulphonates, quaternary ammonium groups, phosphates, phosphates, betaine and sfobetaine, - biological molecules such as aptamers, nucleic acids ,, phospho ipides f the sugars proteins, your antibody fragments!
  • cheelling agents such as nitrile triacetic acid, nithiodiacetic acid,
  • polar groups such as amides
  • At least two different functionalizations will be carried out with selected reagents to obtain:
  • the microfluidic circuit will, most often, be delimited by a chromatography column, or by one or more channels arranged in a substrate.
  • the distance traversed by the irradiation beam used in the photo-grafting step which corresponds to the depth or diameter of said circuit, is less than 500 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m. This makes it possible in particular to ensure that the light received will be relatively homogeneous within the porous monolith.
  • channels are, in most cases, of rectangular cross-section with the most Next to their cross-section, which belongs to the range of 10 to 200 microns, the channels will often have a closed cross-section, so that the light will have to pass through the substrate in order to carry out the photo-initiation. is the case with chromatographic columns.
  • the material defining the column or channels must be transparent to the irradiation used.
  • the material constituting the substrate or column will be transparent to light in a range of wavelengths from 200 to 500 nm, especially in an allan range of 240 to 380 nm, the irradiations generally being at a wavelength of 254 nm ; 365 nm or 380 nm.
  • the material constituting the substrate or the column is, for this type of chromatographic application, preferably chemically inert with respect to the main solvents used in liquid chromatography. It is possible to choose a constituent material of the substrate or of the column which will not react with the solvent used in the chromatographic application, in particular with acetonitrile, methanol, tetrahydrofuran, 1-prapanol, 2-propanol and / or As examples of such materials, mention may be made of glass, fused silica, quartz, COQ and for applications in biocharography (which require analysis conditions that respect biological molecules), it is possible to envisage use PDMS (polydimethylsiloxane), ⁇ (polymethylmethacrylate) or PS (polystyrene), depending on the wavelength chosen for the irradiation and solvents used in the mobile phase.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • ⁇ polymethylmethacrylate
  • PS polystyrene
  • the process makes it possible to manufacture chromatographic devices allowing the circulation of gaseous or liquid media.
  • the circulation will be ensured by pumping systems (HPLC pump, for example), use of electric fields (electrochromatography), or centrifugal force (Lab on CD, for example).
  • HPLC pump for example
  • electrochromatography electrochromatography
  • centrifugal force Lab on CD, for example
  • the devices obtained can be used in separative techniques, to carry out different successive steps of sample preparation (immunopreconeentration, purification, depletion, for example), sample treatment (anzymatic digestion, labeling) and chromatographic separation (reversed phase, HIUC, exchange of dlons).
  • the starting support is a monolithic silica column synthesized in a molten capillary tube of 75 ⁇ l internal diameter coated with a Teflon film transparent to UY.
  • the entire capillary column is in a first step functionalized with vinyl trimethoxysilane. .
  • the reaction mixture is obtained by mixing 50 ⁇ l of vinyl trimethoxysilane and 25 ⁇ l of triethylamine with 1 ml of a methanol / water mixture (95/5, v v).
  • the capillary is filled with the reaction mixture and placed in an oven at 80 ° C for 6 hours.
  • the monolithic column functionalized with the vinyl functions is then filled with a solution consisting of 0.573 g of 1-octadecanethiol (ODT) and 0.1 ml of a 0.0455 g solution.
  • ODT 1-octadecanethiol
  • mL of benzophenone in THF in 1 mL of THF.
  • the capillary is sealed at its ends by silicone plugs and placed in an illumination oven at a wavelength of 365 nm for 5 minutes f.
  • the column is then washed under THF flow for 20 minutes.
  • the column is characterized by inverted-phase chromatography.
  • the mobile phase is a methanol / water mixture (8G / 2G, v / v).
  • the analysis is carried out by injecting three solutes (thiourea, pentylbenzene and hexyibenzene).
  • the chromatogram obtained is shown in FIG. 2 and shows the separation of penzylbenzene and hexylbenzene (the thiourea is used to mark the dead time of the column).
  • the photo-grafted column with the ODT is characterized by inverted-phase chromatography.
  • the mobile phase is a methanol / water mixture (8G / 2G, v / v).
  • the analysis is carried out by injecting three solutes (thiourea, pentylbenzene and hexyibenzene).
  • the chromatogram obtained is shown in FIG. 2 and shows the separation of penzylbenzene and hexylbenzene
  • the retention factors for pentylbenzene and Itsexyl enzene are 2.5 and 3.6, respectively.
  • the inter-capillary variation coefficient obtained on 3 different columns obtained according to the operating procedure of Example 1 is 2%. It is shown that the photo-grafting process used does not alter the intrinsic effectiveness of the support. Indeed, after photografting, the efficiency of the columns is similar to the efficiencies of the columns before grafting (measurements made in HILIC mode on the silica),
  • the retention of the columns by the photo-grafting process is comparable to or even superior to monolithic columns functionalised by "conventional" route.
  • the particulate or monolithic chromatographic columns used in reverse phase mode are mainly obtained by grafting a highly reactive monofunctional silane such as (dimethylamino) dimethyl (oct3decyl) silane (C18-ODS).
  • This reagent makes it possible to obtain dense monomolecular layers.
  • the justification for the use of a monofunctional silane is based on the quality and reproducibility of the layers obtained.
  • These chromatographic supports are conventionally taken as a reference.
  • C18-ODS (dimethylamino) dimethyl (octadecyl) butane
  • a second chromatographic test is used to assess the nature of the layers obtained.
  • the selectivity values calculated with the photo-grafted column with ⁇ are of the order of 1.5 and are similar to what is obtained for C18-ODS layers. This test clearly shows that the functionalization obtained is closer to a monomolecular layer, like layer obtained by silanisatlon with the C18-ODS, as a poiymécher layer as is obtained by reacting acrylate or methacrylate on acrylate or methacrylate surfaces or by silanisatlon with silanes
  • a monolithic column functionalized with vinyie functions obtained in accordance with Example 1, is filled with a solution to achieve the photo-grafting composed of 0432 g of cysteine and 0436 ml of an aqueous solution at 224 mg / mL dihydrochloride 2,2 '-Aze> bi $ (2-methylpropionamide) (AIBA) in 0.864 ml of water.
  • the capillary is capped at its ends by silicone caps and placed in an illumination furnace at a wavelength of 365 nm for 5 minutes. The column is then washed under a stream with water for 30 minutes.
  • the column was characterized in HILIC mode for the separation of a mixture of urination, adenosine, cytosine, cytidine and naphthalene.
  • the mobile phase is an acetonitrile / water mixture (90/10 v / v).
  • the chromatogram shown in FIG. 3 is obtained by following the UV signal at 214 nm and shows the HILIC mode separation of ruradle, adenosine, cytosine and cytidine (naphthalene is used as a dead time marker). ) on the monolithic capillary column cystéine grafted.
  • the modification of the silica with a water-soluble monomer (cysteine in this case) in an aqueous medium is therefore feasible by using a photon
  • a monolithic column functionalized with the functions vinyie obtained, according to the example i f is filled with a solution to carry out the photo-grafting consisting of 0.0164 g of sodium 2-mercaptoéthanesulfonate (SHES) and 0 f 136 ml d an aqueous solution at 22.1 mg / mL dihydrochloride 2,2 'a ⁇ ODis ⁇ (2 ⁇ methyipropionamlde) (AIBA) in 0.864 mL of water.
  • the capillary is capped at its ends by silicone plugs and placed in an illumination furnace at a wavelength of 365 nm for 5 minutes. The column is then washed under flow with water for 30 minutes,
  • the tests on the cation exchange columns are carried out with a mixture of betablockers in a mobile phase acetonitrile / phosphate buffer (pH 2.5, 10 mM phosphate) with a KCI concentration of 10 mg / ml.
  • the chromatogram presented FIG. 4 is obtained by following the UV signal at 214 nm and demonstrates the separation of beta-5 blockers on the monolithic capillary coionne photo ⁇ g refected with the SMES.
  • the entire monolithic capillary column is in a first step functionalized with vinyl trimethyloxysilane, as described in Example 1, then undergoes an inerting of the residual OH functions of the silica, collectively on the whole column monolithic by treatment with HMDZ (Hexamethyldisilazane) at 160 ° C for 2 hours.
  • HMDZ Hexamethyldisilazane
  • zone Z cation exchange zone (1 cm in length)
  • the monolithic column functionalized with the vinyl functions is filled with a solution to carry out the photo-grafting consisting of 0.0164 g of sodium 2-mercaptoetesulphonate (SMES) and 0 36 ml of a 22.1% aqueous solution. mg / ml of 2,2'-azobis (2-methylpropionamide) dihydrochloride (AIBA) in 0.864 ml of water.
  • SMES sodium 2-mercaptoetesulphonate
  • AIBA 2,2'-azobis (2-methylpropionamide) dihydrochloride
  • the capillary is filled with this solution and capped at its ends by siiicone plugs.
  • the capillary is then irradiated for 5 minutes at 365 nm, taking care to mask the zone corresponding to the zone.
  • the masking is carried out by introducing the entire zone corresponding to zone Z 'into a UV-opaque PEE tube.
  • the column is then washed under a flow of water for 20
  • zone I3 ⁇ 4 Functionalization of zone I3 ⁇ 4 (reversed phase polarity, 9 cm ligu ur)
  • the photo-grafting mixture consists of 0.573 g of ODT and 0.1 ml of a 0.0455 g / ml solution of benzophenone in THF in 19 ml of THF.
  • the capillary is filled with the The capillary is then irradiated for 5 minutes at 365 nm, taking care to mask the area.
  • the masking is done by introducing the whole zone Z * in a UV-opaque PEE tube.
  • the column is then washed under THF flow for 20 minutes.
  • the sample is injected by pressure (3 bars, 0.2 min).
  • the separation is carried out initially with a mobile phase consisting of 70% by volume of methanol and 30% by volume of a solution of KCl 50 mg / mt
  • the chromatogram shown in FIG. 5 is obtained by following the UV signal at 214 nm and shows the separation obtained from the mixture of propranol, benzene and toluene on the multimodal monolithic capillary column (1 cm of cation exchange (S ES) and 9 cm reverse phase (ODT) ⁇ ,
  • the first peak corresponds to the dead time of the column, the three solutes are then perfectly separated.
  • the addition of salt in the mobile phase makes it possible to mask the retention by cation exchange linked to the zone Z% of the capillary.
  • the separation is based mainly on a sharing mechanism in reversed phase chromatography.
  • the most polar solute propranoioi
  • toluene having a methyl group in addition to benzene is the most preferred solute.
  • a second analysis is carried out in a mobile phase methanol / water (70/30, v / v) without salt.
  • the separation is presented on the chromatogram shown in FIG. 6, obtained by following the UV signal at 214 nm,
  • the chromatogram obtained by following the UV signal at 214 nm is shown in FIG. 7 and shows the lowering of its base line corresponding to the mobile phase change (presence of salt) and intervening at the dead time of the column. Subsequently, a single peak is detected at the retention time of the propranoioi identified during the first analysis (chromatogram of Figure S).
  • a multimodal column consisting of a cation exchange part (1 cm at the column inlet) and a reversed phase phase phase part (9 cm) was made by photochemistry according to the method detailed in the present invention.
  • This muilimodal column makes it possible to separate neutral and charged compounds according to a dual mechanism (mixed mode) of reverse phase chromatography and cation exchange chromatography.
  • the cation exchange part makes it possible to establish interactions with the charged compounds. positively (responsible for the retention of propranoioi in the absence of salt in its mobile phase) and the functionalized zone C18 makes it possible to separate the solutes seion their hydrophobic character (responsible for the separation of 3 solutes in the presence of salt).
  • the sample consists of a mixture of 3 beta-toxins (Nactoiol, OxprenoSoi and propranoioi) in solution in a methanol / water mixture (70/30, v / v) .
  • the chromatogram obtained by following the UV signal at 214 nn is presented.
  • Fig S Volume injected 5 nanoliters, Separation performed at 12 bar
  • a mobile salt phase Héthanoi / water (70/30, v / v) with 15 mg / ml of KO
  • the presence of se! mask the retention of the cation exchange part, the compounds are then essentially separated, according to a reverse phase sharing mechanism.
  • the sample is then diluted 20-fold and the analysis is repeated in the same separation conditions as before.
  • the result of the separation is presented in the chromatogram of FIG. 9 (volume injected at 5 nanoliters, separation at 12 bars, detection at 214 nm).
  • solute trots Only the solvent peak is clearly visible, the peaks of solute trots are hardly detectable in the background noise. The concentration of solutes is thus measured by the limit of detection.
  • This multimodal column makes it possible to separate neutral and charged compounds according to a dual mechanism (mixed mode) of reverse phase polarity c romatography and cation exchange chromatography.
  • the cation exchange part makes it possible to establish interactions with the positively charged compounds (responsible for the retention of propranolol in the absence of salt in the mobile phase) and the C18 functionalized ion makes it possible to separate the solutes by their hydrophobic character (responsible for the separation of the 3 solutes in the presence of salt),

Abstract

La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un cirait micro-fluidique, ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones distinctes, dont au moins une zone (Z) porteuse d'une fonctionnalité R liée au monolithe poreux par une liaison covalente, et obtenue grâce par photo-greffage avec utilisation d'un couple de fonctions X et Y définies comme suit : - soit X est une fonction comportant un hydrogène abstractlbie choisie parmi les fonctions -SH, -OH, les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène, porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène et Y comporte une insaturation; ~ soit X comporte une Insaturation et Y est une fonction comportant un hydrogène abstractlbie choisie parmi les fonctions -SH, -OH, les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène, porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène.

Description

La présente invention concerne le domaine technique de la chromatographle. En particulier, l'invention concerne un procédé de fabrication par photo-greffage de dispositifs multlmodaux, de très petite taille, particulièrement adaptés à la chromatographle en phase liquide.
Les techniques chromatographiques regroupent les techniques séparatives reposan sur l'Interaction d'un soluté avec une phase stationnaire et une phase mobile. La phase stationnaire peut être disposée à l'Intérieur de différents types de circuit micro-ffuidique, notamment: à l'intérieur d'une colonne chromatographique, se présentant sous la forme d'un tube, ou à l'intérieur de canaux ouverts ou fermés, aménagés dans un substrat II est de plus en plus recherché des dispositifs miniaturisés de chromatographle en phase liquide notamment, pour proposer des dispositifs portatifs, et qui permettent de réaliser des analyses dans des volumes de Tordre du nanolitre. La limitation des volumes, par rapport aux outils ··< classiques » d'HPLC ou UHPLC notamment, est importante dans Ses domaines où le volume d'échantillon est limitant (biologie-santé, environnement). Or, la miniaturisation des techniques chromatographiques implique la synthèse de phases stationnâmes innovantes dans des systèmes rnicro-fluidiques, du type colonne. K. Faure décrit dans Eiectrophoresls, 2010, 31, 2499-2511 l'utilisation d'une phase stationnaire dans des systèmes chromatographiques constituée d'un polymère réticulé se trouvant sous la forme d'un monolithe poreux.
De plus, dans le domaine de la chromatograp le., les systèmes de détection par spectrométrie de masse deviennent incontournables. La sensibilité de ces systèmes de détection est dépendante des débits de liquide en sortie de colonne chromatographique. En particulier, les débits optimums pour des colonnes de quelques dizaines de microns de diamètr interne (de l'Ordre de la centaine de nanofltres/min) sont bien adaptés pour les sources nano-spray de ce type de détecteur. De plus,, les techniques chromatographiques se doivent d'être adaptées à l'analyse de matrices de plus en pius om lexes; le challenge étant de pouvoir séparer,, en une seule analyse, le plus de composés possible,
Dans ce contexte, deux approches principales ont été envisagées : (i) l'utilisation de colonnes de très grande longueur et (II) des analyses en chromatographîe associant/couplant différents modes chromatographiques (analyse multidimensionnelle). Dans ce cadre, on peut citer deux techniques d'analyse multidimensionnelle, La première consiste à réaliser en ligne une, voire plusieurs,, étape(s) de préparation d'échantillon, en amon de l'étape de séparation/détection, Cette technique ne donne pas satisfaction car, à chaque fois qu'un tel couplage physique est réalisé,, les risques d'ajouter des volumes morts, de perdre en efficacité et de créer des fuites, sont importants. La deuxième technique d'analyse mu tidimenslonnelle concerne le couplage d'au moins deux colonnes de séparation différentes (chromatographîe bidimenslonnelle notée LCxLC). Actuellement, un tel couplage d'étapes en ligne est, le plus souvent, réalisé :
- soit en couplant deux dispositifs de chromatographîe (souvent par l'intermédiaire de vannes dinjection 10 voies, par exemple) ;
- soit en fabriquant des colonnes de chromatographîe comprenant deux lits de phase s ationnatre à l'Intérieur, ou résultant du couplage physique de plusieurs colonnes (par le biais d'un connecteur).
Dans la première solution, l méthode est puissante, mais il est difficile de synchroniser les dispositifs entre eux. Des colonnes multimodales correspondant à la deuxième solution ont également été proposées.
La publication de Chen et al, Journal of chroma ography A, 2012, 1233 91-99 décrit la synthèse m situ dans un tube capillaire de deux monolithes différents, obtenus en remplissant le capillaire avec deux mélanges différents et en réalisant le greffage des fonctions souhaitées ihermiquement Une première zone (segment A) est obtenue en remplissant le capillaire d'un mélange d'un monomère de silice, d'un vinyl silane, d'un initiateur et d'un monomère fonctionnel aorylate. Une deuxième zone (segmen B) est obtenue en remplissant e capillaire d'un mélange d'un monomère de silice et d'un virsyl siiane. Les mélanges réactionnals sont introduits dans le capillaire successivement A lissue de la synthèse, le capillaire est rempli par un segment de monolithe fonctionnalisé (segment A) et inactivé d'un point de vue chimique grâce à la réaction entre les fonctions vinyle et le monomère acryiate Initiée par un initiateur thermique et par un segment « réactif » de monolithe (segment 8) portant des fonctions vinyle en surface. Ces dernières sont, dans une deuxième étape, impliquées dans une réaction de polymérisation initiée thermiquement suite à l'introduction dans l'ensemble de la colonne d'un mélange réactionne! comportant un monomère fonctionnel thiolé et un initiateur thermique (AÎBN).
Le brevet US 5,431,807 s'intéresse à la synthèse de monolithes, de type organique, préparés par polymérisation initiée par voie radicalaire et utilise donc la lumière pour initier la réaction. Ensuite, une réactio d'abstraction sur des groupements C-H de ces monolithes organiques est réalisée, toujours par irradiation, afin de greffer différentes fonctionnalisations organiques et ainsi créer une colonne muttimodaie. Or, il est connu que l'abstraction d'hydrogène sur des groupements C-H n'est pas très spécifique par nature. De ce fait, la technique décrite ne permet pas de contrôler les points d'accroché des fonctionnalités et ne conduit pas à une fonctionnalisation homogène,
La demande de brevet US 2004/101442, quant à elle, décrit un procédé de séparation multimodal, sans pour autant décrire un procédé pour préparer le support chromatographique à utiliser. Le procédé de séparation multimodal proposé est basé sur un matériau unique, présentant plusieurs domaines de taille de pores, chaque domaine de taille de pores contenant des groupements de surface de fonctionnalité différente» Aucune information n'est donnée sur le mode de greffage au sein des pores,, si ce n'est qu'il est nécessaire d'utiliser des procédés permettant de greffer, de façon sélective, des pores d'une taille donnée, ce qui pose des problèmes de mise en œuvre pratique. Une solution consistant en l'utilisation de colonnes monolithiques de silice a été proposée pour répondre simultanément aux besoins de miniaturisation et d'augmentation de capacité d pics, Ces monolithes présentent comme avantage, par rapport aux colonnes remplies de particules de silice standard; d'avoir une plus grande perméabilité (permettant de travailler sur de plus grandes longueurs}, d'être synthétis bles in situ dans des colonnes capillaires de silice fondue (permettant de s'affranchir d'utiliser des frittés pour bloquer les particules dans la colonne) et d'être donc compatibles avec une détection en spectrométrie de masse»
II a déjà été proposé de fonctionnaliser de tels monolithes poreux. On peut citer les travaux de Zajlckova Z, et al dans Journal of liquid chroma ography and related techniques, 2010, 33 :18, 1640-1648 qui met en œuvre une réaction photochimique sur monolithe de silice, par greffage d'un silane porteur d'une fonction mét acrylate et réaction de photo- polymérisation d'un monomère méthacrylate, amorcée par de la benzophénone, en tan qu'Initiateur de radicaux libres» Néanmoins, le couple méthacrylate-méthacrylate pose des problèmes pour conserver des propriétés chromatographiques optimales. L'utilisation de monomères acrylates a également été mise en œuvre par R. El Debs et ai. . Sep. Sel, 2013, 36, 993-1001, Dans cet article, un monolithe de silice est préparé dans un tube capillaire., une silanisation avec un silane acrylate est ensuite menée, suivie d'une fonctlonnailsation avec des monomères acrylates en utilisant i'éther de méthyl benzoïne (BME), en tant qu'agent initiateur de radicaux libres. La localisation de la réaction photochimique est démontrée, mais la mise en œuvre du couple acrylate-acrylate est là encore difficile à mettre en œuvre pour ne pas altérer îes propriétés chromatographiques. Les fonctions chimiques sur le support; et en solution étant de même nature, (Initiation radicaiaîre se fait aussi bien à la surface que dans le volume de la solution. Les couches obtenues ne sont donc pas mono-moléculaires, maïs plutôt polymériques. Les fabricants de colonnes chromatographiques privilégient, depuis longtemps, les colonnes fonctionnalisées par des couches homogènes et mono-moléculaires au détriment des colonnes polymériques, afin de maximiser la reproductibité des lots de synthèse.
Aussi, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un circuit micro-fl uidique, ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones distinctes, dont au moins une zone (I) porteuse d'une fonctionnalité R liée au monolithe poreux par une liaison covalente, et obtenue grâce aux étapes successives suivantes :
a) l'obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives X à {Intérieur du circuit mlcro-fluidique,
b} la fonctjonnalisation, par mise en contact du monolithe poreux porteur des fonctions réactives J€ avec un réactif comprenant une fonction réactive Y et la fonctionnalité souhaitée sur la zone déterminée (Z), en présence d'un initiateur de radicaux libres pa abstraction d'hydrogène,, suivie d'une illumination localisée de la zone ciblée (Z), entraînant la réaction des fonctions et Y, de manière à obtenir un pont covalerït,
c) le rinçage du monolithe poreux,
les fonctions 1 et Y étant définies comme suit :
- soit X est une fonction comportant un hydrogène abstractible choisie parmi les fonctions -SH, -OH, les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alph par rapport à l'atome d'oxygène et Y comporte une insaturation ;
- soit X comporte une insaturation et Y est une fonction comportant un hydrogène abstractible choisie parmi les fonctions -SH, ~Q f les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène, Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention permet la fabncetion d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un circuit micro-fluidique, ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones (¾ et Za)., chaque zone étant porteuse d'une fonctionnalité {¾ et ¾) différente liée au monolithe poreux par une liaison covaiente, et comprend les étapes successives suivantes :
a) l'obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives X à l'intérieur du circuit micro-fluidique,
b) une première fonctionnalisatlon localisée, par mise en contact du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y* et la fonctionnalité R± souhaitée sur une zone déterminée if en présence d'un initiateur de radicaux libres par abstraction d'hydrogène, suivie d'une illumination localisée de la zone ciblée ¾, entraînant la réaction des fonctions X et Ys, de manière à obtenir un pont avaient,
c) le rinçage du monolithe poreux,,
d) une deuxième fonctionnalisatlon localisée, par mise en contact du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Ya et la fonctionnalité R¾ souhaitée sur une autre zone déterminée Z¾ en présence d'un initiateur de radicaux libres par abstraction d'hydrogène, suivie d'une illumination localisée de la zone ciblée Z¾ entraînant la réaction des fonctions et Y¾ de manière è obtenir un pont codaient, et
e) le rinçage du monolithe poreux,
les fonctions X, Yi et Y2 étant définies comme suit :
~ soit X est une fonction comportant un hydrogèn abstractibte choisie parmi les fonctions -SHf -OH, les fonctions alkylamine présentant un atome dliydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote,, et les fonctions éthet présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène et Y* et: identiques ou différents, comportent une insaturation ; - soit X comporte une insaturation et Υχ et Y2, identiques ou différents, sont une fonction comportant un hydrogène abstractïbie choisie parmi les fonctions -SH ~OH, les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène porté par on carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et ies fonctions éther présentant un atonie d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène.
Bien entendu., plus de deux fonctionnalisations pourront être réalisées. Le procédé selon l'invention consiste à coupler la synthèse situ de monolithe poreux dans des systèmes micro-fiuidiques, notamment du type colonne ou tube capillaire, ou micro-canal, avec une fonctionnailsation du monolithe localisée permettant d'élaborer des dispositifs présentant des modes chr natographiques différents.
Dans le cadre de {Invention, un monolithe poreux est préparé directement à l'intérieur du circuit micro-fiukiîque. Les monolithes élaborés., de nature essentiellement inorganique, portent des fonctions organiques leur apportant une réactivité d surface appropriée., nommées fonctions réactives X, Ces fonctions réactives X peuvent être insérées directement au cours de la synthèse du monolithe en utilisant un précurseur porteur de telles fonctions, ou bien apportées après la synthèse du monolithe par le biais d'agents de couplage adaptés.
Ensuite,, un réactif comprenant une fonction réactive nommée génériquement Y (et Yi dans le cas de la première fonctionnalisation, Y¾ dans le cas d'une deuxième ..,) et la fonctionnalité souhaitée R. (et R% dans le cas de la première fonctionnailsation, ¾ dans le cas d'une deuxième ...) sur une zone déterminée est utilisé sous irradiation lumineuse,, pour obtenir la fonctionnailsation souhaitée dans une zone souhaitée du monolithe. Le choix de la fonctionnalité du réactif et donc de la fonctionnalité greffée au final sur 1e monolithe, dépend du mode chromatographique envisagé. Les réactions photochimiques mises en œuvre dans le cadre de l'invention sont plus rapides (quelques minutes, voire dizaine de minutes) que les réactions initiées thermlquement utilisées dans l'art antérieur pour la fonctionnai isatïon monomodale de colonne, De plus., une telle actlvatlon photochimique permet de localiser la zone modifiée, En réalisant au moins deux étapes successives d'Irradiation focalisée avec des réactifs comprenant des fonctionnalités différentes, il est possible d'obtenir dans un même circuit micro-fluidique au moins deux zones présentant chacune une fonctionnalité différente. Il est ainsi possible de coupler dans un même circuit micro-fluidique différents modes chromatographiques.
Dans le cadre de l'invention, on met en œuvre à chaque fonctionnalisation, une réaction photo-chimique entre deux fonctions réactives différentes appelées X ou Y, Une des deux fonctions réactives X ou
Y possède un hydrogène facilement abstractihle. Par contre, la fonction X ou
Y qui possède un hydrogène facilement abstractihle ne présentera pas d'insaturation pour ne pas rentrer en compétition avec l'autre fonction X ou Y,
La réaction entre les fonctions et Y (en particulier la réaction entre les fonctions X et Y* et/ou X et Y2) entraîne un simple greffage covalent, sans réaction de polymérisation e surface. Aussi, par rapport à la méthode précédente (méthaerylate/acrylate), cette méthode permet d'éviter la photo-polymérisation en surface. Il s'agit donc juste d'un photo-greffage en surface de molécules fonctionnalisées. La fonctionnalisation utilisée dans le procédé selon l'invention conduit, en générai, â une couche mono- moléculaire, Le procédé selon l'Invention permet également d'éviter le couplage physique, c'est-â-dlre le couplage de colonnes par le biais d'union (connecteur) ou le couplage par le biais de vanne dlnjectlon qui nécessite plusieurs systèmes de pompage.
Le procédé selon l'invention va être détaillé dans la description qui va suivre.
Par « hydrogène abstractihle », on entend un atome d'hydrogène capable d'être enlevé sous photo-activatlon, en présence d'un initiateur de radicaux libres abstracteur d'hydrogène, pour former un radical A titre de fonctions porteuses d'un hydrogène abstratibie, on utilisera une fonction -Sri, -OH, une fonction alkylamine présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, ou une fonction éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène, qui possède au moins un hydrogène facilement abstractîble. li est, notamment, reconnu que ies tiilois et les alkylamines présentant un atome d'hydrogène en position aipha par rapport à l'atome d'azote, et en particulier du type aminés tertiaires, sont des donneurs d'hydrogène efficaces (permettant d'obtenir des transferts d'hydrogène efficaces). Ces donneurs d'hydrogène permettent donc de cibler la réaction sur ces groupements spécifiques même en présence d'autres molécules possédant des hydrogènes comme des acrylates ou méthacrylates par exemple.
La fonction qui comporte une insaturation est, quant à elle, par exemple, choisie parmi les groupes comprenant une double liaison ~OC~ ou triple liaison -OC-, notamment parmi les aicényies tels que le groupe vinyle, les alcynyles, Ses acryiates, les acrylamides, les vinyi éthers, les vinyl esters, norbornènes les /V-vinyl amides, tes allyltriazines, les AK nylamldes, les aiiyiéthers, les aiiyiisocyanurates, ies esters insaturés., les maiéimides M- substitués, i'acrylonitrile, le styrène et les diènes conjugués.
Le procédé selon l'invention n'est nullement limité à des monolithes inorganiques particuliers. Le monolithe est un matériau monobloc poreux et continu, formé d'un squelette inorganique délimitant un réseau de macropores interconnectés sur lequel sont ou vont être greffées des fonctions organiques. Le matériau peut être à base d'oxyde inorganique, et notamment d'oxyde de silicium, d'oxyde de titane ou d'oxyde de zirconium, ou encore d'oxyde d'hafnium. Le monolithe peut être préparé avec un seul précurseur ou avec un mélange de plusieurs précurseurs dont certains au moins, sont mono ou multifonctîonneis. Le monolithe poreux présentera une porosité adaptée aux procédés de chromatographie. En particulier, il pourra présenter une porosité mixte, avec une macroporoslté pour Técoulement d'une phase mobile et une méso- ou microporosité pour augmenter la La synthèse in situ du monolithe à l'intérieur du circuit icro-iiuidique est, de manière classique, menée par mise en uvre d'un procédé sol-gel avec au moins un agent porogène du type tensio-aetifs ou polymères, qui confère la porosité au monolithe obtenu et permet d'obtenir la porosité souhaitée (Nakanishi et al, J SOL-GEL SCI TECH MOL (1997) 8 :i, 547-552). Les techniques classiques de synthèse par voie sol-gel telles que décrites dans Ou J. et al, R cent advances în préparation and application of hyfarid organic-silica monoiithic capillary coiumns, Electrophoresls 2013, 34, 126-140 ou Ashraf Ghartem, Tohru Ikegarn Récent advances in slca-hased monoiiths: Préparations, cbaracterlzations and applications, 1 Sep, Sa. 2011, 34f 1945-1957) pourront être utilisées,
La fonction réactive X permettant la réaction de photo-greffage peut être insérée directement sur le monolithe lors de sa synthèse dans le circuit micro-fioidique ou greffée après synthèse lorsque le monolithe est déjà positionné dans le circuit micro-fluldique. En effet., l'obtention du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X peut être réalisée par fonctlonnalîsat on d'un monolithe poreux inorganique, de préférence obtenu par procédé sol-gel L'obtention do monolithe poreux porteur de fonctions réactives X peur, aussi être réalisée en une seule étape, directement à l'intérieur du circuit mtcro-ftuidique, par mise en œuvre d'un procédé sol-gel avec utilisation d'un précurseur fonctionnalisé.
Avec une synthèse directe, on utilisera un mélange de précurseurs, dont l'un est porteur de la fonction réactive X, l'autre permettant à la fois la formation du réseau inorganique et l'obtention de la concentration souhaitée en fonctions réactives X, Lorsqu'un seul précurseur est utilisé ou lorsque les précurseurs utilisés ne comprennent pas ia fonction réactive , une étape additionnelle est utilisée pour introduire tes fonctions réactives X, En particulier, un ou plusieurs composés organosiliciés (alkoxy-sîlane, chloro- silane diméthylamino-silane, disilazane par exemple) porteur d'une fonction X sera Introduit, de manière à former par réaction sur les OH résiduels de surface du monolithe, des ponts H -Sif avec M - ¾ T\f Hf ou Zr, par exemple, en fonction de la nature de ia structure inorganique du monolithe. Les acides phosphoniques et les phosphonates se lient également à ia surface de monolithes à base de ΤΊΟ2 ou Zr€¾ notamment, et pourront être utilisés pour Introduire les fonctions réactives M. Les molécules portant un motif catéchol sont également capables de produire des couches qui adhèrent fortement sur le titane et pourront donc être utilisées pour fonctionnaliser des monolithes poreux à bas de TK¾. Lorsque plusieurs précurseurs sont utilisés,, υπ sera porteur de fonctions réactives X pour réaliser ultérieurement l'étape de fonctionna lisation par photo-greffage,
Le groupement réactif peut être directement lié à un atome de silicium,, titane, zirconium ou hafnlum du monolithe ou lié par I Intermédiaire d'un bras de liaison. En général, les fonctions réactives seront présentes sur le monolithe poreux à raison de 0,1 à 10 pmol/m2.
Compte-tenu du mode de fonc onnalisation photochimique, le monolithe doit être transparent aux longueurs d'onde d'Irradiation utilisées. Les oxydes métalliques précédemment cités sont parfaitement adaptés.
Le monolithe ainsi formé a l'intérieur du circuit micro-fWdique porteur de fonctions réactives X est ensuite mis en contact avec le réactif porteur., à une extrémité, d'une fonction réactive Y qui va réagir avec les fonctions X portées par ie monolithe et, à l'autre extrémité, d'un groupement fonctionnel R permettant de conférer à la zone de monolithe sélectionnée les propriétés ehromatographiques désirées. Ces deux extrémités peuvent être directement reliées entre elles ou liées par un bras de liaison. Le bras de liaison qui peut être utilisé entre ie monolithe et la fonction M et/ou entre les fonctions ¥ et R peut être., par exemple, une chaîne alkyiène (alkyle bivalent) linéaire ou ramifiée ou un motif particulier comme, par exemple, un motif de type oxyde d'éthylène. Ce motif peut être répétitif (polymérique) ou non.
De préférence, on utilisera un rapport fonctions Y/fonctions X supérieur ou égal à i# de manière à optimiser la densité de fonctionna lisation obtenue au final sur le monolithe.
Le plus souvent, une solution contenant le réactif porteur de la fonction réactive ¥ et de la fonctionnalité H et l'agent initiateur sera utilisée pour imprégner le monolithe poreux. Une telle solution est préparée soit directement dans le réactif à greffer, soit dans un solvant Le solvant peut être un solvant organique, un mélange de solvants organiques, un solvant aqueux ou un mélange hydro-organique. A titre d'exemples de solvant, on peut citer le THF, le méihanol, acétonitrile, l'eau et leurs mélanges. L'agent initiateur est, de préférence, soluble dans ladite solution, Il est également envisageable de réaliser des réactions de photo-greffage après adsorptioo de l'agent Initiateur sur le monolithe poreux, voire de réaliser t'adsorption du réactif et de l'agent initiateur avant l'irradiation, La concentration en réactif porteur de la fonction réactive Y et de la fonctionnalité R, dans la solution utilisée, est, en général,, de 0,2 à 1M
De manière préférée, l'ensemble des réactifs nécessaires pour réaliser le greffage de la fonctionnalité R d'intérêt, à savoir le réactif porteur de fa fonctionnalité il et de la fonction réactive Y qui va réagir avec le monolithe réactif et l'agent initiateur, son introduits dans un même mélange réactionnel avec lequel te monolithe réactif va être mis en contact et soumis à une photo-irradiation» La photo-irradiation étant menée de façon localisée, la totalité du monolithe poreux peut être mis en contact avec le réactif et l'agent initiateur,
L'agent initiateur est, de préférence, activable sous rayonnement UV, bien qu'une activation sous rayons X ou gamma puisse également être envisagée, A titre d'exemples d'agents initiateurs adaptés, on peut citer la benzophénone et ses dérivés,, les thioxanthones, la benzoïne et ses éthers; le benzyle et ses cétals; i'acétophénone et ses dérivés, les aikylphénones et leurs dérivés; les alpha hydroxycétones; les acyiphosphine oxydes; et les titanocènes, On utilisera, de préférence, un agent initiateur du type Morrish type IL
Dans le cadre de { nvention, l'agent initiateur est utilisé dans des quantités suffisantes pour permettre l'abstraction d'hydrogène sans écranter (masquer) la lumière incidente. La quantité d'agent initiateur sera dépendante de l'agent initiateur utilisé et sera adaptée par l'homme du métier. En général, la quantité d'agent initiateur utilisée sera comprise entre 0 à ÎO % en masse par rapport à la masse totale de la solution d'imprégnation utilisée. L'illumination localisée conduisant au photo-greffage est, 1e plus souvent, réalisée à une longueur d'onde appartenant à la gamme allant de 200 à 600 nm, en particulier à la gamme allant de 240 à 380 nm.
L'énergie dirradiation est,, en général, de 0,05 j.cm-2 à 9 J.cm-2, et plus particulièrement, de 1 à 3 J.cm-2. La durée d'Irradiation est, par exemple, de i à 20 min, de préférence de 1 à 10 min. L'Irradiation est, en général, réalisée, sous des conditions normales de température (température ambiante) et de pression (pression atmosphér que),
Lirradiation est localisée par utilisation d'un masque ou d'une irradiation focalisée, afin d'obtenir la fonctionnalisation souhaitée par réaction des fonctions X et ¥ dans la zone ciblée, Lirradiation est dite localisée, car seule est irradiée la zone dans laquelle on souhaite obtenir la fonctionnalisation. Si plusieurs fonctionnalisations sont successivement mises en œuvre, à chaque fois une zone différente sera irradiée, Une fois une première fonctionnalisation réalisée par réaction des fonctions X et Y (nommées Y% dans 1e cas de la première fonctionnalisation), le monolithe poreux est rincé, par exemple, avec le solvant de réaction qui peut être notamment le THF, le méthanol, l' cétonitrile ou l'eau, puis, une deuxième fonctionnalisation peut être mise en œuvre, La Figure i illustre schématiquement un exemple du procédé selon l'invention, avec irradiation localisée au moyen d'un masque, utilisé dans un exemple qui va suivre.
De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention, on réalisera au moins une fonctionnalisation conduisant à une fonctionnalité R choisie parmi ;
~ les chaînes alkyle,
- les chaînes polymérlques, par exemple, du type polyéthylène glycol,
~ les groupes porteurs de fonction ionisable comme les acides carboxyliques et les aminés,
- les groupements ionisés et/ou zwittérioniques,. tels que les groupes sulfates, sulfonates, ammonium quaternaires, phosphates, phosp onates, bétaïne et s lfobétaïne, - les molécules biologiques telles que les aptamères, les acides nucléiques,, les phospho!ipidesf les protéines les sucres, tes fragments d'anticorps,
- les agents chéiatants tels que i'aclde nitrllotriacétique, l'acide nithiodiacétique,.
- les groupements polaires tels que les amides,, et
- les sélecteurs ehiraux.
Selon des modes de réalisation préférés, au moins deux fonctionnalisations différentes seront réalisées avec des réactifs sélectionnés pour obtenir :
- deux zones de polarités différentes,
~ une zone échangeuse d'ions et une zone hydrophobe,
- une zone échangeuse dlorts et une zone hydrophile, ou bien
- une zone hydrophile et une zone hydrophobe.
Dans ie cadre de l'invention, le circuit rnlcro-fluldique sera, le plus souvent, délimité par une colonne de ehromatographie, ou par un ou plusieurs canaux aménagés dans un substrat. Dans de tels circuits micro- fluidiques, la distance traversée par le faisceau dlrradiation utilisé dans rétape de photo-greffage, qui correspond à la profondeur ou au diamètre dudit circuit, est inférieure à 500 pm, de préférence à 100 pm. Ceci permet notamment de garantir que la lumière reçue sera relativement homogène au sein du monolithe poreux» Dans le cas d'un substrat dans lequel un ou plusieurs canaux sont aménagés, de tels canaux sont, le plus souvent, de section transversale rectangulaire avec le plus grmà côté de leur section transversale qui appartient à la gamme allant de 10 à 200 microns» Bien souvent, les canaux auront une section transversale fermée, de sorte que la lumière devra traverser le substrat pour pouvoir réaliser la photo-initiation., comme c'est le cas avec les colonnes chromatographiques.
En effet, ie procédé selon l'invention étant basé sur l'utilisation de sources d'irradiation pour initier une réaction radicaiaire, le matériau délimitant la colonne ou les canaux devra être transparent à l'irradiation utilisée. De préférence, le matériau constitutif du substrat ou de la colonne sera transparent à la lumière dans une gamme de longueurs d'onde allant de 200 à 500 nm., en particulier dans une gamme allan de 240 à 380 nm, les irradiations se faisant en général à une longueur d'onde de 254 nm; 365 nm ou 380 nm.
Par il e rs; le matériau constitutif du substrat ou de la colonne est, pour ce type d'applications en chrornatographie, de préférence, inerte chimiquement vis-à-vis des principaux solvants utilisés en cliromatographie liquide. On pourra choisir un matériau constitutif du substrat ou de la colonne qui ne réagira pas avec le solvant utilisé dans l'application chromatographique, notamment avec acétonitrile, le méthanol, le tétrahydrofurane, le l-prapanol, le 2~propanol et/ou l'acétone, A titre d'exemples de tels matériaux, on peut citer le verre., la silice fondue, le quartz, le COQ et pour des applications en biocbromatographie (nécessitant des conditions d'analyse respectueuses des molécules biologiques),, il est envisageable d'utiliser le PDMS (polydiméfhylsiloxane), le ΡΜΜΆ (polyméthylméthacrylate} ou le PS (polystyrène),, en fonction de la longueur d'onde choisie pour l'irradiation et des solvants utilisés dans la phase mobile.
Le procédé, selon !lnvention, permet de fabriquer des dispositifs chro atographlques autorisant ia circulation de milieux gazeux ou liquides. Dans ce dernier cas, la circulation sera assurée par des système(s) de pompage (pompe HPLC, par exemple), utilisation de champs électriques (électrochromatographie), ou de force centrifuge (Lab on CD, par exemple). Les dispositifs obtenus pourront être utilisés en techniques séparatives, pour réaliser différentes étapes successives de préparation d'échantillon (immunopréconeentration, purification, déplétion, par exemple), traitement d'échantillon (digestion anzymatique, marquage) et séparation chromatographlque (phase inversée, HIUC, échange dlons).
Ce type de dispositifs miniaturisés et multi-fonctionnels revêt un intérêt particulier dans les domaines de la protéomique (HudPit) ou de l'environnement, par exemple, ils pourront aussi faire l'objet d'intégration dans des systèmes plus complexes (ou intégrés) type Laboratoire sur puce (« lab on chip »). Les exemples ci-après,, en référence aux Figures 2 à 11 annexées qui présentent des ehrornatogrammes obtenus en suivant le signal UY à 214 nm, sont donnés à titre purement illustras! et permettent de mieux comprendre ilnvention,
Figure imgf000018_0001
Le support de départ est une colonne monolithique de silice synthétisée dans un tube capillaire de siilce fondue de 75 uni de diamètre interne revêtu par un film téflon transparent aux UY, L'ensemble de la colonne capillaire est dans une première étape fonctionnalisé avec du vinyl triméthoxysilane. Le mélange réactionnel est obtenu en mélangeant 50 pi de vinyl triméthoxysilane et 25 μί de triét ylamlne à 1 mi d'un mélange méthanol/eau (95/5 ; v v). Le capillaire est rempli du mélange réactionnel et placé dans un four à 80°C pendant 6 heures.
Pour réaliser le photo-greffage, la colonne monolithique fonctionnalisée avec les fonctions vinyie est ensuite remplie d'une solution constituée de 0,573 g d'1-octadécanethioi (ODT) et de 0,1 ml d'une solution à 0,0455 g/mL de benzophénone dans du THF, dans 1, ml de THF. Le capillaire est bouché à ses extrémités par des bouchons en silicone et placé dans un four d'illumination à une longueur d'onde de 365 nmf pendant 5 minutes. La colonne est ensuite lavée sous débit de THF pendant 20 minutes.
La colonne est caractérisée par chromatograp ie à polarité de phases inversée, La phase mobile est un mélange méthanol/eau (8G/2G, v/v). L'analyse est réalisée en injectant trois solutés (thiourée, pentylbenzène et hexyibenzène}> Le chromatogramme obtenu est présenté Figure 2 et met en évidence la séparation du penzylbenzene et de hexylbenzene (la thiourée est utilisée pour marquer le temps mort de la colonne) sur la colonne photo- greffée avec l'ODT.
Les facteurs de rétention pour le pentylbenzène et Itsexyl enzène sont respectivement de 2,5 et 3,6. Le coefficient de variation inter-capillaire obtenu sur 3 colonnes différentes obtenues selon l mode opératoire de l'exemple 1 est de 2%. Il est montré que le procédé de photo-greffage utilisé n'altère pas l'efficacité intrinsèque du support. En effet, après photogreffage, l'efficacité des colonnes est similaire aux efficacités des colonnes avant greffage (mesures effectuées en mode HILIC sur la silice),
La rétention des colonnes par le procédé de photo-greffage est comparable voire supérieure aux colonnes monolithiques fonctionnalisées par voie « classique ». Les colonnes chromatograpblques particuiaires ou monolithiques utilisées en mode de phase Inversée sont majoritairement obtenues par greffage d'un sllane monofonctionnel très réactif comme le (diméthylamlno)dîméthyl(oct3décyl)sllane (C18-ODS). Ce réactif permet d'obtenir des couches monomoléculaires denses. La justification de l'utilisation d'un sllane monofonctionnel repose sur la qualité et la reproductibilité des couches obtenues, Ces supports de chromatographie sont classiquement pris comme référence. La fonctionnalisatlon des mêmes supports monolithiques fonctionnalisés avec le
{diméthyiamlno)diméthyl{octadécyl)sliane (C18-ODS) est utilisée comme point de référence, Il convient de noter que dans ce cas, ce type de réaction n'est pas localisable. La comparaison de colonnes obtenues par le procédé photochimique et de colonnes obtenues avec le C18-ODS montre que ces colonnes donnent des rétentions du même ordre de grandeur,
Un deuxième test chromatographique est utilisé pour apprécier la nature des couches obtenues.
En utilisant la même phase mobile méthanol/eau (80/20,. v/v), deux hydrocarbures aromatiques poly-cycllques: le triphénylène et l'ortho- terphényle ont été étudiés,, tous tes deux ayant des propriétés hydrophobes analogues, mais des différences d'encombrement stérique, Cette analyse permet d'observer la façon dont sont organisées les chaînes carbonées de la phase stattonnaire, L'ortho-terphényle possédant un structure tridimensionnelle, est donc encombrant et si les chaînes ne sont pas alignées mais entremêlées il ne pourra pas passer à l'intérieur des chaînes et sera donc moins retenu que le triphénylène, Le triphénylène, quant à lui, possède une structure plane, il est donc plus facilement retenu par la phase stationnaire. De ce fait, en calculant: leur sélectivité {a- k (tri)/ k {o-ter}), il est possible d'avoir une idée sur l'organisation des chaînes au sein de la phase stationnaire, Ainsi, plus la sélectivité est importante, plus les chaînes sont entremêlées,, ce qui se traduit par le fait que la phase stationnaire sépare mieux les composés., du fait de leur taille,
Les valeurs de sélectivité calculées avec la colonne photo-greffée avec ΟΟΤ sont de l'ordre de 1,5 et sont semblables à ce qui est obtenu pour des couches C18-ODS. Ce test montre clairement que la fonctionnalîsation obtenue se rapproche plus d'une couche monomoléculaîre, à l'Instar des couches obtenues par silanisatlon avec le C18-ODS, que d'une couche poiymérique comme celle obtenue par réaction d'acrylate ou méthacrylate sur des surfaces acrylate ou méthacrylate ou par silanisatlon avec des sîlanes
Figure imgf000020_0001
Une colonne monolithique fonctionnalisée avec les fonctions vinyie obtenue, conformément à l'exemple 1, est remplie d'une solution pour réaliser le photo-greffage constituée de 0432 g de cystéîne et de 0436 ml d'une solution aqueuse à 224 mg/mL de dihydrochlorure de 2,2 '-aze>bi$(2- méthylpropionamîde) (AÎBA), dans 0,864 ml d'eau. Le capillaire est bouché à ses extrémités par des bouchons en sllicone et placé dans un four d'illumination à une longueur d'onde de 365 nrn, pendant 5 minutes. La colonne est ensuite lavée sous débit avec de l'eau pendant 30 minutes.
La colonne a été caractérisée en mode HILIC pour la séparation d'un mélange d'uraciie, d'adénosine, de cytosine, de cytîdine et de naphtalène. La phase mobile est un mélange acétonitriie/eau (90/10 v/v).
Le chromatogramme présenté Fig r 3 est obtenu en suivant le signal UV à 214 nm et met en évidence la séparatio en mode HILIC de ruradle, de i'adénosine, de la cytosine et de la cytidine (le naphtalène est utilisé comme marqueur de temps mort) sur la colonne capillaire monolithique photo- greffée cystéîne. La modification de la siiice par un monomère hydrosoiubie (la cystèine dans ce cas) en milieu aqueux est donc réalisable en utilisant un photo-
Figure imgf000021_0001
Une colonne monolithique fonctionnalisée avec les fonctions vinyie obtenue, conformément à l'exemple if est remplie d'une solution pour réaliser le photo-greffage constituée de 0,0164 g de sodium 2- mercaptoéthanesulfonate (SHES) et de 0f136 mL d'une solution aqueuse à 22,1 mg/mL de dihydrochlorure de 2,2 '~a∑ODis(2~methyipropionamlde) (AIBA), dans 0,864 mL d'eau. Le capillaire est bouché à ses extrémités par des bouchons en silicone et placé dans un four d'illumination à une longueur d'onde de 365 nm, pendant 5 minutes. La colonne est ensuite lavée sous débit avec de i'eau pendant 30 minutes,
Les tests sur ies colonnes échangeuses de cations sont menés avec un mélange de bétabloquants dans une phase mobile acétonitri le/tampon phosphate (pH 2,5, 10 roM phosphate) avec une concentration en KCI de 10 mg/mL
Le chromatogramme présenté Figyre 4 est obtenu en suivant le signal UV à 214 nm et met en évidence la séparation de beta-5 bloquants sur la coionne capillaire monolithique photo~g refiée avec le SMES.
Il apparaît donc que le greffage d'un monomère chargé a été réalisé avec succès et permet de séparer des espèces chargées positivement, Les mesures de capacité réalisées avec i'aténoloi donnent des valeurs de Tordre de 4,5 nmol/cm de monolithe (dans un capillaire de 75 pm de diamètre interne), L'élaboration de ce type de support en amont de colonnes hydrophobes revêt un intérêt tout particulier pour ies analyses muitidimensionelles de peptides. Deux étapes de photo-fonctionnalisation sont réalisées à la suite dans un capillaire de silice fondue de 75 pm de diamètre interne, 10 centimètres de longueur et rempli de monolithe de silice. L'ensemble de la colonne capillaire monolithique est dans une première étape fonctionnalisé avec le vinyl trimé hoxysiSane, comme décrit à l'exemple 1, puis subit un Inertage des fonctions OH résiduelles de la silice, de façon collective sur i'ensembie de la colonne monolithique par un traitement au HMDZ (Hexaméthyldisilazane) à i60*C pendant 2 heures.
Fonctionnaiisation de la zone Z (zone échangeuse de cations (1 cm de longueur)
La colonne monolithique fonctionnalisée avec les fonctions vinyle est remplie d'une solution pour réaliser le photo-greffage constituée de 0,0164 g de 2-mercaptoét anesulfonate de sodium (SMES) et de 0 36 ml d'une solution aqueuse à 22,1 mg/rnL de dihydrochlorure de 2,2 '-azobis(2- méthyipropionamîde) (AIBA), dans 0,864 mi d'eau. Le capillaire est rempli avec cette solution et bouché à ses extrémités par des bouchons en siiicone. Le capillaire est ensuite Irradié pendant 5 minutes à 365 nm en prenant soin de masquer la zone correspondant à la zone Le masquage est réalisé ers introduisant l'ensemble de la zone correspondant à la zone Z-» dans un tube en PEE opaque aux UV. La colonne est ensuite lavée sous débit d'eau pendant 20 minutes.
Fonctionnaiisation de la zone I¾ (polarité de phases Inversée, 9 cm de ligu ur)
Le mélange de photo-greffage est constitué de 0,573 g d'ODT et de 0,1 mL d'une solution à 0,0455 g/mL de benzophénone dans du THF, dans 1 9 mL de THF, Le capillaire est rempli avec la solution de photo-greffage et bouché à ses extrémités par des bouchons en siiicone, Le capillaire est ensuite irradié pendant 5 minutes à 365 nm en prenant soin de masquer la zone∑i. Le masquage est réalisé en introduisant i'ensembie de la zone Z* dans un tube en PEE opaque aux UV. La colonne est ensuite lavée sous débit de THF pendant 20 minutes.
L'échantillon est constitué d'un mélange de benzène, toluène et propanolol (pKa=9,42) dans une solution de méthanol/eau (70/30, v/v). L'échantillon est injecté par pression (3 bars, 0,2 min), La séparation est réalisée dans un premier temps avec une phase mobile constituée de 70 % en volume de méthanol et de 30 % en volume d'un solution de KC1 à 50 mg/mt Le chromatogramme présenté Figure 5 est obtenu en suivant le signai UV à 214 nm et met en évidence la séparation obtenue du mélange de propranoioi, Benzène et Toluène sur la colonne capillaire monolithique multimoda!e (1 cm d'échange de cations (S ES) et 9 cm de phase inverse (ODT)},
Le premier pic correspond au temps mort de la colonne, les trois solutés sont ensuite parfaitement séparés. L'ajout de sel dans la phase mobile permet de masquer la rétention par échange de cations liée à la zone Z% du capillaire, La séparation repose principalement sur un mécanisme de partage en ehromatographie à polarité de phases Inversée. Le soluté le plus polaire (propranoioi) est élué en premier, alors que le toluène présentant un groupement méthyle en plus par rapport au benzène est l soluté le plus retenu.
Une seconde analyse est réalisée dans une phase mobile méthanol/eau (70/30, v/v) sans sel. La séparation est présentée sur le chromatogramme présenté Figure 6, obtenu en suivant le signal UV à 214 nm,
Sur le chromatogramme,, à part le pic du solvant (temps mort),, seuls le benzène et te toluène sont élués de la colonne. Sans sel, pou masquer la partie échangeuse de cations, le propanolol ionisé positivement à pH neutre interagit fortement avec le support et est retenu dans la zone ¾. Dans ces conditions il est possible dans un premier temps de séparer sélectivement les produits neutres et de retenir, dans la colonne, les composés chargés positivement. Afin d'éluer le propranoioi de la partie échangeuse dlons, une nouvelle élutlon est réalisée en ajoutant dans la phase mobile des sels (HeOH/eauf 70/30,. v/v, avec 15 mg/mL de KO).
Le chromatogramme obtenu en suivant Se signal UV à 214 nm est présenté Figure 7 et met en évidence l'abaissement de Sa ligne de base correspondant au changement de phase mobile (présence de sel) et Intervenant au temps mort de la colonne. Par la suite., un seul pic est détecté au temps de rétention du propranoioi identifié iors de la première analyse (chromatogramme de la figure S).
En conclusion, une colonne multimodaie constituée d'une partie échangeuse de cations (1cm en entrée de colonne) et d'une partie phase à polarité de phases inversées (9 cm) a été réalisée par photochimie selon le procédé détaillé dans la présente Invention. Cette colonne muilimodale permet de séparer des composés neutres et chargés selon u double mécanisme (mode mixte) de chromatographie de polarité de phases inversée et de chromatographie d'échange de cations, La partie échangeuse de cations permet d'établir des interactions avec les composés chargés positivement (responsables de la rétention du propranoioi en l'absence de sel dans Sa phase mobile) et la zone fonctionnalisée C18 permet de séparer les solutés seion leur caractère hydrophobe (responsable de la séparation des 3 solutés en présence de sel).
Sème exemple de foncti j nalisation ; !ElalsoratfOfs d'une colonne ca pillaire mot loïithic ne de séoarati n multimodaie infeéq rant lippe une zone Z de tvoe é ianaeuse de cations et une deuxième Zc me Z? oerm et&mt de séparer les anal yles après éitiHon clans la
Z€ sue Z? p*$r ch araohie à polarité d« e piia es inversée
Une colonne identique à celle décrite à l'exemple 4 est utilisée,
L'échantillon est constitué d'un mélange de 3 bêtabtoquants (Nactoiol, OxprenoSoi et propranoioi} en solution dans un mélange métnanol/eau (70/30, v/v}. Le chromatogramme obtenu en suivant le signal UV à 214 n n est présenté Fig re S (Volume injecté 5 nanolïtres, Séparation réalisée à 12 bars) et met en évidence la séparation obtenue avec une phase mobile saline (Héthanoi/eau (70/30, v/v) avec 15 mg/ml de KO), La présence de se! masque la rétention de la partie échangeuse de cations, les composés sont alors essentiellement séparés, selon un mécanisme de partage en phase inverse.
L'échantillon est ensuite dilué 20 fois et l'analyse est répétée clans tes mêmes conditions de séparation que précédemment Le résultat de la séparation est présenté sur ie chromatogramme de la Figure 9 (volume injecté 5 nanolitres, séparation réalisée à 12 bars, détection à 214 nm).
Seul le pic de solvant est clairement visible, les pics des trots solutés sont difficilement détectables dans le bruit de fond. La concentration des solutés se trouve donc procbe de la limite de détection.
Dans une troisième expérience, le volume injecté est augmenté de S ni à 100 riL (20 fois plus),, afn de pré-concentrer les bêtabloquants solubilisés dans une phase mobile sans sel sur la partie échangeuse de cations., les autres conditions sont maintenues constantes. Le chromatogramme obtenu est présenté sur la Figure îû.
On observe l'abaissement de la ligne de base qui correspond au changement de phase mobile (présence de sel) intervenant au temps mort de la colonne. Par la suite, les pics élués correspondent au nadoloi, oxprenoiol et propranolol Identifiés lors de la première analyse (Figyna S), Ces composés ont été Injectés en continu pendant 4 minutes sous une pression de 3 bars (volume 20 fois supérieur au volume injecté dans la cas du chromatogramme de la lgyr 9) et pré-concentrés en tête d colonne sur la zone échangeuse de cations avant d'être élués et séparés dans la zone de phase inverse» En réalisant la même expérience, mais en diluant l'échantillon avec un solvant contenant du KG, il n'est plus possible d'obtenir une séparation correcte des solutés (chromatogramme de la Figure 11). En effet, l'injection de i'échantiHon, en présence de sel. masque la partie échangeuse de cation, les solutés avancent donc dans la colonne sans pré- concentration, Ce résultat confirme que la pré-concentration est bien réalisée sur la partie échangeuse de cations, En conclusion, une colonne muiîimodaie constituée d'une partie échangeuse de cations (icm en entrée de colonne) et d'une partie phase à polarité de phase inversée (9 cm) a été réalisée par photochimie selon le procédé détaillé dans fa présente invention. Cette colonne multimodale permet de séparer des composés neutres et chargés selon un double mécanisme (mode mixte) de c romatographie de polarité de phases inversée et de chromatographie d'échange de cations. La partie échangeuse de cations permet d'établir des interactions avec les composés chargés positivement (responsable de la rétention du propranoiol en rabsence de sel dans la phase mobile) et la∑one fonctionnalisée C18 permet de séparer les solutés seion leur caractère hydrophobe (responsable de la séparation des 3 solutés en présence de sel),

Claims

1 - Procédé de fabrication d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un circuit icro-fiuidtque, ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones distinctes, dont au moins une zone (1) porteuse d'une fonctionnalité liée au monolithe poreux par une liaison eovalente,, et obtenue grâce aux étapes successives suivantes ;
a) l'obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives X à l'Intérieur du circuit micro-fluidîque,
b) la fonction nalisation, par mise en contact du monolithe poreux, porteur des fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive ¥ et la fonctionnalité souhaitée sur la zone déterminée (1), en présence d'un initiateur de radicaux libres par abstraction d'hydrogène, suivie d'une illumination localisée de la zone ciblée (Z), entraînant la réaction des fonctions X et Y, de manière à obtenir un pont covalent,
c) le rinçage du monolithe poreux, les fonctions X et Y étant définies comme suit :
~ soit M est une fonction comportant un hydrogène abstractibie choisie parmi les fonctions -SH ~OHf les fonctions alkyiamine présentant un atonie d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atonie d'oxygène et Y comporte une insaturation ;
- soit X comporte une insaturation et Y est une fonction comportant un hydrogène abstractibie choisie parmi les fonctions ~SH, ~GH les fonctions alkyiamine présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène,
2 - Procédé de fabrication, selon la revendication i, d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un circuit mlcro-fluidlque, ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones ¾ et∑2f chaque zone étant porteuse d'une fonctionnalité ¾. ou ¾> différente liée au monolithe poreux par une liaison covalente, comprenant les étapes successives suivantes :
a) l'Obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives X à l'intérieur du circuit micro-fluidique,
b) une première fonctionna lsation localisée, par mise en contact du monolithe poreux, porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Yi et la fonctionnalité ¾i souhaitée sur une zone déterminée Z*, en présence d'un initiateur de radicaux libres par abstraction d'hydrogène,, suivie d'une illumination localisée de la zone ciblée ¾, entraînant la réaction des fonctions X et Y*, de manière à obtenir un pont covaient,
c) le rinçage du monolithe poreux.,
d) une deuxième fonctionnallsation localisée, par mise en contact du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y2 et la fonctionnalité Ri souhaitée sur une autre zone déterminée ∑2, en présence d'un initiateur de radicaux libres par abstraction d'hydrogène, suivie d'une Illumination localisée de la zone ciblée ¾, entraînant la réaction de fonctions X et Y¾ de manière à obtenir un pont covaient, et
e) le rinçage du monolithe poreux,
les fonctions X, Y* et Y2 étant définies comme suit :
- soit X est une fonction comportant un hydrogène abstractibie choisie parmi les fonctions ~5Hf ~OH, les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène et Yi et Y2i identiques ou différents, comportent une Insaturation ;
- soit X comporte une insaturation et Y% et identiques ou différents, sont une fonction comportant un hydrogène abstractibie choisie parmi les fonctions -SH, -OHf les fonctions alkylamine présentant un atome 2? d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d Oxygène,
3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que X est la fonction comportant un hydrogène abstractible choisie parmi les fonctions ~SH, -OH, les fonctions alkylamine présentant un atome d'hydrogène porté par on carbone en position alph par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène.
4 - Procédé selon la revendication 1, 2 o 3 caractérisé en ce que la fonction qui comporte une insaturation est choisie parmi les groupes comprenant une double liaison ~~OC~ ou une triple liaison ~-C≡C~f notamment parmi tes alcényles tels que le groupe vinyle, tes alcynyles, les acryiates, les acrylamides, les vinyl éthers, les vlnyi esters, les norbomènes., les νίηγΙ amidesf les allyltrrazines, les AM/inylarnides, les ailyiéthers, les allylfsocyanurates, les esters insaturés, les malél ides N-substitués, f'acrylonitrile, le styrène et les diènes conjugués,
5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 4 caractérisé en ce que le monolithe poreux est à base d'un matériau Inorganique, notamment choisi parmi la silice, l'oxyde de titane, l'oxyde de zlrconlum et l'oxyde d'hafnium.
6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 5 caractérisé en ce que la réaction entre les fonctions et ¥ entraîne un simple greffage covalent, sans réaction de polymérisation en surface.
7 ~ Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 6 caractérisé en ce que l'obtention du monolithe poreux, porteur de fonctions réactives X, est réalisé par fonctionnalisatlon d'un monolithe poreux inorganique, de préférence, préalablement obtenu par procédé sol-gel à l'intérieur du circuit micro-fluidique,
i ~ Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 6 caractérisé en ce que l'obtention à l'intérieur du circuit mlcro-fluldique du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X, est réalisé en une seule étape par mise en œuvre d'un procédé sol-gel avec utilisation d'un précurseur fonctionnalisé,
§ - Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 8 caractérisé en ce que llllumlnatlon localisée est réalisée à une longueur d'onde appartenant à la gamme allant de 200 à 600 nm, en particulier dans une gamme allant de 240 à 380 nm.
10 - Procédé selon Tune quelconque des revendications 1 à caractérisé en ce que la mise en contact du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y et l fonctionnalité R souhaitée sur une zone déterminée est réalisée par Imprégnation du monolithe avec une solution contenant le réactif et l'agent initiateur, par exemple, dans un solvant notamment choisi parmi le THF, le méthanoi, i'acétonitrlle, l'eau et leurs mélanges.
11 - Procédé selon Tune quelconque des revendications i à 10 caractérisé en ce que l'agent initiateur de radicaux libres est choisi parmi la benzophénone et ses dérivés., les thioxan hones, la benzotn et ses éthers; le benzyle et ses cétais; Tacétop énone et: ses dérivés ; les alkylphénones et leurs dérivés; les alpha hydroxycétones; les acylphosphine oxydes et les titanocènes.
12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications î à il caractérisé en ce qu'on réalise au moins une fonctionnaiisation conduisant à une fonctionnalité choisie parmi :
- les chaînes alkyle,
- les chaînes polymériques, par exemple, du type polyéthylène gfycol,
- les groupes porteurs de fonction ionisahle comme les acides carboxyliques et les aminés,
- les groupements Ionisés et/ou z ittérioniques, tels que les groupes sulfates, suifonates, ammonium quaternaires, phosphates, phosphonates, bétaïne et suifo étaïne,
~ les molécules biologiques telles que les aptamères, les acides nucléiques, les phospholipides, les protéines, les sucres, les fragments d'anticorps, - tes agents ehéiatants tels que l'acide nitrllotriacétique, l'acide nîtrïlodsacétique, et
~ les groupements polaires teis que les amides,
Î3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 12 caractérisé en ce qu'au moins deux fonctlonnallsations différentes sont réalisées avec des réactifs sélectionnés pour obtenir ;
- deux zones de polarités différentes,
~ une zone échangeuse dions et une zone hydrophobe,
- une zone échangeuse d'ions et une zone hydrophile,, ou bien
- une zone hydrophile et une zone hydrophobe,
14 - Procédé selon Tune quelconque des revendications i à 13 caractérisé en ce que le circuit micro-fluidique est délimité par une colonne de ehromatographie, ou par un ou plusieurs canaux aménagés dans un substrat,
15 ~ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 caractérisé en ce que le circuit micro-fluidique présente une profondeur ou un diamètre inférieur à 500 pm, de préférence à 100 pm.
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