WO2015079080A1 - Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de lupinus spp, extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico. - Google Patents

Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de lupinus spp, extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico. Download PDF

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WO2015079080A1
WO2015079080A1 PCT/ES2014/000197 ES2014000197W WO2015079080A1 WO 2015079080 A1 WO2015079080 A1 WO 2015079080A1 ES 2014000197 W ES2014000197 W ES 2014000197W WO 2015079080 A1 WO2015079080 A1 WO 2015079080A1
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alkaloids
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lupinus
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PCT/ES2014/000197
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José MarÍa FERNÁNDEZ BOLANOS
Inés MAYA CASTILLA
Sergio MARTOS DELGADO
Rosa PÉREZ OTERO
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Universidad de Sevilla
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Universidad de Sevilla
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia

Definitions

  • the present invention is intended to provide solutions with respect to the treatment of the processing waters of the seeds that act as biocides, since due to the large amount of organic matter they contain they are susceptible to suffer gradual blackening, decomposition and rot.
  • this patent we describe the stabilization of these process waters and their use as an ecological biopesticide.
  • the technique object of the present patent falls within the area of agrochemistry and agriculture.
  • the Activity Sector in which the invention would be applied corresponds to that of plant protection products isolated from plants, specifically from different species of Lupinus.
  • the alkaloids most of them quinolizidine, account for between 0.4% and 5% by weight of the seed (Ganzera, M .; Krüger, A .; Wink, MJ Pharm. Biomed. Anal., 2010, 53, 1231 -1235), and give it a bitter taste.
  • These metabolites are synthesized by Lupinus plants as a defense mechanism against insects and herbivores (Kordan, B .; Dancewicz, K .; Wroblewska, A .; Gabrys, B. Phytochem. Lett, 2012, 5, 71-77), since they have neurotoxic properties. In humans, a high intake is necessary to have symptoms (Litkey, J .; Dailey, MW Am. J. Emerg. Med., 2007, 25, 215-217).
  • Lupanin is a quinolizidine alkaloid characteristic of the genus Lupinus since it is present in all species, often being the majority alkaloid. (Ganzera, M .; Krüger, A .; Wink, M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2010, 53, 1231-1235) It has an anticholinergic effect on the central nervous system, reversibly blocking acetylcholine neurotransmitter receptors. Some of the most common families of insecticides, such as nicotinoids and carbamates, act similarly.
  • the desmargamiento broths derived from the industrial preparation of lupine are abundant in alkaloids and other water-soluble metabolites present in the seed of Lupinus spp., Hence the interest in the use of such broths as an insecticide (Ortiz Falantes, J. 2008, WO 2008003795) and as plant growth promoters (Przybylak, JK; Ciesiolka, D .; Wysocka, W .; Garc ⁇ a-López, PM; Ru ⁇ z-López, MA; Wysocki, W .; Gulewicz, K. Ind. Crops Prod. , 2005, 21, 1-7).
  • mice have been determined (Stobiecki, M .; Blaszczyk, B .; Kowalczyk-Bronisz, SH; Gulewicz, KJ Appl. Toxicol., 1993, 13, 347-52) the toxicity in mice of both aqueous extracts of Lupinus spp. . containing 10% alkaloids (LD50> 4000 mg kg-1 of animal weight), as of different fractions.
  • this invention provides with respect to the state of the art, a process of stabilization of the processing waters of the seed of Lupinus spp., Which avoids a progressive degradation with a gradual darkening, appearance of insoluble matter and loss of activity as an insecticide
  • a soluble fraction is obtained in aprotic organic solvents (for example dichloromethane) consisting of the alkaloids present in the waters and another non-alkaloid fraction (very poor or lacking alkaloids) that is extracted from the column by treatment with non-polar protic solvents.
  • aprotic organic solvents for example dichloromethane
  • aqueous for example ethanol or methanol
  • Natural plant extracts often suffer progressive degradation that leads to the modification of their properties and the proliferation of microorganisms.
  • the broths obtained in the detachment of the lupine seed there is a gradual darkening that evidences the degradation of the product, in addition to presenting the inconvenience of losing visual attractiveness when marketing the product.
  • the dewatering broths are subjected to centrifugation to eliminate possible solid matter in suspension.
  • the solid fraction is discarded and the liquid fraction (supernatant) has been stabilized using various combinations of products as preservatives.
  • the greater activity of the pyrosulfite is due to its ability to give bisulfitic addition products by reaction with the carbonyl group of the reducing sugars. In this way, the initial stages of the Maillard reaction (or non-enzymatic browning) are inhibited, resulting in a complex route of chemical transformations in which sugars and amino acids / proteins are involved and that originates colored products.
  • the alkaloid fraction is obtained in a pale yellow oily form and the non-alkaloid fraction has a brown amorphous solid appearance. Both fractions were subjected to analysis by GC-MS and evaluated as insecticides.
  • the analyzes of the alkaloid fraction were performed on an Ag ⁇ lent GC 6890N gas chromatograph, equipped with an automatic sampler (Autosampler 7683 Agilent series) and a high resolution capillary column Agilent J&W Scientifics DB-5ms (30m ⁇ 0.25mm ⁇ 0.25 ⁇ m ).
  • the gas chromatograph is coupled with a Micromass AutospecQ mass spectrometer, where the ionization source operates in electronic impact mode (El) at 70 eV. Data is acquired from 50 to 650 m / z.
  • the efficacy as an insecticide of the alkaloid and non-alkaloid fractions obtained from the waters of lupinus seed detachment was evaluated.
  • these fractions were analyzed as an insecticide in the control of aphids Toxoptera citricidus Kirkaldi, the aphid that transmits the citrus sadness virus (CTV), and other insect species.
  • CTV citrus sadness virus
  • the containers were then placed in a culture chamber with controlled conditions of 23 ⁇ 2 ° C temperature, 70 ⁇ 5% relative humidity and 16 hours of photoperiod light.
  • the efficacy of the products was evaluated 24 hours after treatment (24 hdt), and then at 48 and 72 hours, recording the death of the individuals and considering as dead the aphids that showed no motor activity when touched with an entomological needle. .
  • Toxoptera citricidus a colony was placed with nymphs and adult apes attached to an Eureka lemon tree outbreak; Each colony consisted of 20 ⁇ 5 individuals and the tests were performed in triplicate.
  • Toxoptera aurantii in camellia bud Aphis pomi in apple tree, and Ctenarytaina spatulata in terminal bud of Eucalyptos globulus, 50 nymphs of each species were placed.
  • the percentages of mortality obtained were corrected using Abbott's formula, which allows the natural mortality effect present in the control treatment to be separated from the observed mortality.
  • Figure 1 Total ion chromatogram of the GC-MS analysis in full scan mode showing the alkaloids present: Spartein (1), Amodendrine (2), Albin (3), Angustifoline (4), a-isolupanin (5), Lupanin (6), N-methylalbine (7), Multiflorine (8), 17-Oxolupanin (9), 13a-Hydroxylpanpanin (10), 13a-Hydroximultiflorine (11), 13a-Tigloyloxylupanin (12).
  • both fractions are brought to dryness under reduced pressure. Once concentrated, the alkaloid fraction is obtained in a pale yellow oily form whose average weight is 300 mg. The non-alkaloid fraction has an aspect of brown amorphous solid whose average weight is 3 g. Both fractions were redissolved for analysis by GC-MS and its evaluation as an insecticide.
  • the analyzes of the alkaloid fraction were performed on an Agilent GC 6890N gas chromatograph, equipped with an automatic sampler (Autosampler 7683 series from Agilent) and a high resolution capillary column Agilent J&W Scientifics DB-5ms (30m ⁇ 0.25mm ⁇ 0.25 ⁇ m ).
  • the gas chromatograph is coupled with a Micromass AutospecQ mass spectrometer, where the ionization source operates in electronic impact mode (El) at 70 eV. Data is acquired from 50 to 650 m / z.
  • the analysis is carried out on 20 mL of the soluble fraction obtained after centrifuging the broth supplied from lot 2B of 24-4-09 containing 4.6 g of dry matter. From these 20 mL, 301 mg (6.5% of the dry matter) is extracted with an alkaloid mixture that was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), detecting and identifying the alkaloids detailed in the Table 3 and whose structures are represented in Figure 2. In addition, the retention time, molecular peak and other characteristic ions whose relative intensity appears in parentheses are described in the table.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • the insecticidal activity is shown in Table 4 and in the corresponding bar chart ( Figure 3), where the average Abbott efficacy values are collected for the tests carried out with the dewatering broth (entry 1), alkaloid fraction after neutralizing with acetic acid up to pH 5 (entry 2), the alkaloid fraction without neutralizing with acetic acid (pH 12, entry 3), the non-alkaloid fraction (entry 4), and the control (water-treated control, entry 5), at 24 and 48 hours after the intervention.
  • the results were not collected at 72 hours because almost all aphids had died within the previous interval. Nor is any differentiation established between nymph and adult stages of the aphid because no variation was observed in the effect obtained by the preparations.

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Abstract

La invención que se presenta pertenece al sector de la Agroquímica y la Agricultura y tiene como objeto proporcionar un procedimiento para la estabilización y conservación de las aguas de procesado de la semilla de Lupinus spp., con sulfitos o bisulfitos y su utilización con biocida. Asimismo, también aborda la separación de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas de dichas aguas con tierra de diatomeas macroporosas y su utilización como biocida ecológico.

Description

TITULO
Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp, extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, tiene por objeto aportar soluciones respecto al tratamiento de las aguas de procesado de las semillas que actúan como biocidas, ya que debido a la gran cantidad de materia orgánica que contienen son susceptibles de sufrir ennegrecimiento paulatino, descomposición y putrefacción. Así, en esta patente describimos la estabilización de estas aguas de procesado y su utilización como bioplaguicida ecológico.
La técnica objeto de la presente patente se encuadra en el área de la agroquímica y de la agricultura. El Sector de Actividad en el que se aplicaría la invención corresponde a la de productos fitosanitarios aislados de plantas, concretamente de distintas especies de Lupinus.
ANTECEDENTES EN EL ESTADO DE LA TÉCNICA
Atendiendo al estado de la técnica, son muchas las publicaciones científicas que describen la presencia de alcaloides de tipo quinolizidínico tanto en semillas de Lupinus spp. (Resta, D.; Boschin, G.; D'Agostina, A.; Arnoldi, A. Mol. Nutr. Food Res., 2008, 52, 490-495) como en las partes aéreas de la planta (Neto, A. T.; Oliveira, C. Q.; Ilha, V.; Pedroso, M.; Burrow, R. A.; Dalcol, I. I.; Morel, A. F. J. Mol. Struct., 2011 , 1004, 174-177; Cook, D.; Lee, S. T.; Pfister, J. A.; Stonecipher, C. A.; Welch, K. D.; Green, B. T.; Panter, K. E. Phytochem. Anal., 2012, 23, 278-284).
Los alcaloides, la mayor parte de ellos quinolizidínicos, suponen entre el 0.4% y el 5% en peso de la semilla (Ganzera, M.; Krüger, A.; Wink, M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2010, 53, 1231-1235), y le aportan sabor amargo a ésta. Estos metabolitos son sintetizados por las plantas de Lupinus como mecanismo de defensa frente a insectos y herbívoros (Kordan, B.; Dancewicz, K.; Wroblewska, A.; Gabrys, B. Phytochem. Lett, 2012, 5, 71-77), ya que presentan propiedades neurotóxicas. En humanos es necesaria una ingesta elevada para tener síntomas (Litkey, J.; Dailey, M. W. Am. J. Emerg. Med., 2007, 25, 215-217).
La lupanina es un alcaloide quinolizidínico característico del género Lupinus ya que está presente en todas las especies, siendo con frecuencia el alcaloide mayoritario. (Ganzera, M.; Krüger, A.; Wink, M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2010, 53, 1231-1235) Tiene un efecto anticolinérgico sobre el sistema nervioso central, bloqueando reversiblemente los receptores del neurotransmisor acetilcolina. Algunas de las familias más comunes de insecticidas, como los nicotinoides y los carbamatos actúan de manera similar. También ha sido descrita una actividad antimicrobiana de extractos ricos en alcaloides (Villa-Ruano, N.; Pacheco-Hernández, Y.; Rubio-Rosas, E.; Ruiz-González, N.; Cruz-Duran, R. Lozoya- Gloria, E.; Zurita-Vásquez, G.; Franco-Monsreal, J. Arch. Biol. Sci., 2012, 64, 1065-1071 ; Kügükboyaci, N.; Ózkan, S.; Tosun, F. Rec. Nat. Prod., 2012, 6:1 , 71-74) donde entre otros la lupanina y la 13-hidroxilupanina están presentes, así como una actividad antifúngica y alelopática (Erdemoglu, N.; Semiha, O.; Fatma, T. Phytochem. Rev. 2007, 6, 197-201).
Los caldos de desamargamiento derivados de la preparación industrial del altramuz, son abundantes en alcaloides y otros metabolitos hidrosolubles presentes en la semilla de Lupinus spp., de ahí el interés en el aprovechamiento de dichos caldos como insecticida (Ortiz Falantes, J. 2008, WO 2008003795) y como promotores del crecimiento de plantas (Przybylak, J. K.; Ciesiolka, D.; Wysocka, W.; García-López, P. M.; Ruíz-López, M. A.; Wysocki, W.; Gulewicz, K. Ind. Crops Prod., 2005, 21 , 1-7).
Los extractos acuosos de semillas de Lupinus spp. también presentan actividad insecticida (Bermúdez-Torres, K.; Martínez Herrera, J.; Figueroa Brito, R.; Wink, M.; Legal, L. BioControl, 2009, 54, 459-466), nematicida, (Yildiz, S. Afr. J. Biotechnol., 201 1 , 10, 13252-13255) antifúngica y antibacteriana (Erdemoglu, N.; Semiha, O.; Fatma, T. Phytochem. Rev. 2007, 6, 197-201). Se ha determinado (Stobiecki, M.; Blaszczyk, B.; Kowalczyk-Bronisz, S. H.; Gulewicz, K. J. Appl. Toxicol., 1993, 13, 347-52) la toxicidad en ratones tanto de extractos acuosos de la semilla de Lupinus spp. conteniendo un 10% de alcaloides (LD50 > 4000 mg kg-1 de peso del animal), como de distintas fracciones.
Recientemente se ha descrito la actividad antimicrobiana (Carreira, A.; Monteiro, S.; Ferreira, R. B. Brit. UK Pat. Appl., 2012, GB 2484509 A 20120418.), antifúngica y como promotor del crecimiento de plantas de un extracto de proteínas obtenidos a partir de semillas, cotiledones o plántulas (Ferreira, R. B.; Monteiro, S.; Teixeira, A. R.; Loureiro, V. PCT Int. Appl., 2007, WO 2007010459 A2 20070125). Se ha asignado dicha actividad al péptido BLAD (Banda Lupinus Alba Doce) de 20 kDa generado durante la germinación a partir de β-conglutina. (Monteiro, S.; Freitas, R.; Rajasekhar, B. T.; Teixeira, A. R.; Ferreira, R. B. PLoS One, 2010, 5, 1 1)
A modo de conclusión, esta invención aporta respecto al estado de la técnica, un procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de la semilla de Lupinus spp., que evita una degradación progresiva con un oscurecimiento gradual, aparición de materia insoluble y perdida de actividad como insecticida.
Así mismo, esta invención también aborda la separación de los alcaloides presentes en estos caldos que implica:
Extracción en fase sólida de los alcaloides utilizando columnas o cartuchos con relleno de tierra de diatomeas macroporosas, en sustitución de los procedimientos tradicionales de extracción líquido-líquido.
- Se obtiene así una fracción soluble en disolventes orgánicos apróticos (por ejemplo diclorometano) constituida por los alcaloides presentes en las aguas y otra fracción no alcaloidea (muy pobre o carente de alcaloides) que se extrae de la columna por tratamiento con disolventes polares próticos no acuosos (por ejemplo etanol o metanol).
Por último, en esta invención se describe la aplicación como plaguicida tanto de la fracción alcaloidea como de la fracción no alcaloidea.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
A modo de explicación de la invención "Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp, extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico" la misma trata de desplegar de forma secuencial los siguientes objetivos:
- Desarrollar un procedimiento para la estabilización de las aguas de desamargamiento derivados de la preparación industrial del altramuz (Lupinus spp.). - Establecer un procedimiento para la separación en fase sólida de los alcaloides presentes en las aguas.
- Utilizar los extractos alcaloideos y no alcaloideos como plaguicidas.
Para ello, el procedimiento propuesto con la presente invención se despliega en base a las siguientes etapas;
A. La centrifugación de los caldos de desamargamiento de la semilla de Lupinus spp. para eliminar materia insoluble si la hubiera.
B. La adición a la fracción soluble obtenida después de la centrifugación de alguno de los siguientes elementos:
Benzoato sódico y pirosulfito de sodio E223.
Pirosulfito de potasio E224,
Hidrógenosulfito de sodio E222.
Figure imgf000006_0001
Sulfito de sodio E221.
C. La conservación a 5 º C y en la oscuridad con objeto de prolongar la actividad.
D. Extracción alternativa de la fracción alcaloidea y no alcaloidea.
A continuación se hace un recorrido completo del procedimiento donde se describen cada una de las referidas etapas.
FASE 1 -Estabilización del color frente a microorganismos
Los extractos naturales de plantas con frecuencia sufren una degradación progresiva que conlleva la modificación de sus propiedades y la proliferación de microorganismos. En el caso de los caldos obtenidos en el desamargamiento de la semilla del altramuz, se produce un oscurecimiento gradual que evidencia la degradación del producto, además de presentar el inconveniente de perder atractivo visual a la hora de comercializar el producto.
Los caldos de desamargamiento se someten a centrifugación para eliminar posible materia sólida en suspensión. La fracción sólida se desecha y la fracción líquida (sobrenadante) se ha estabilizado utilizando diversas combinaciones de productos como conservantes.
Se ha procedido al estudio de la estabilización del color y aspecto del sobrenadante.
a. Hemos comprobado que se produce un ennegrecímiento marcado de la muestra conteniendo 2 g/L de benzoato sódico tras un mes a temperatura ambiente tanto con la muestra en un vial cerrado como expuesto al aire.
b. Hemos comparado la actividad del sulfito sódico (E221) y el pirosulfito sódico, también llamado pirosulfito sódico (E223) sobre la estabilización del color, comprobando que el pirosulfito resulta más efectivo que el sulfito. Así por ejemplo, el color del sobrenadante después de dos meses bajo luz indirecta y conteniendo una cantidad de 0.2 mg/mL de pirosulfito (ensayo 7, Tabla 1) es más claro que si usamos 2 mg/mL de sulfito (ensayo 5, Tabla 1). Utilizando 2 mg/mL de pirosulfito, la muestra es prácticamente incolora tras 2 meses.
La mayor actividad del pirosulfito se debe su capacidad de dar productos de adición bisulfítica por reacción con el grupo carbonílico de los azúcares reductores. De esta manera, se inhiben las etapas iniciales de la reacción de Maillard (o de pardeamiento no enzimático) que da lugar una compleja ruta de transformaciones químicas en las que están implicados azúcares y aminoácidos/proteínas y que origina productos coloreados.
Figure imgf000008_0001
Además hemos estudiado la influencia de otros factores como la temperatura y la luz solar comprobándose que ambos afectan negativamente a la conservación del color. Las muestras conservadas a 5 °C presentaban una coloración menor que las conservadas a temperatura ambiente. Las muestras expuestas a la luz directa del sol (ensayos 10-14, Tabla 1) presentan un color más oscuro que las expuestas a luz indirecta. Observándose como la intensidad del color disminuye al aumentar la concentración de pirosulfito.
En cuanto a la conservación del caldo frente a microorganismos, hemos comprobado que en caldos de desamargamiento de altramuz sin aditivos, se produce la putrefacción en menos de una semana con proliferación de microorganismos y aparición de un olor desagradable.
Hemos comprobado que tanto el benzoato como el pirosulfito sódico preserva a la muestra de la putrefacción durante al menos una semana a temperatura ambiente. La combinación de ambos conservantes en concentraciones de 1.0 mg/mL (Tabla 2) preserva la muestra durante al menos un mes.
Figure imgf000009_0001
Por tanto, la adición combinada de pirosulfito sódico (para estabilizar el color e impedir el crecimiento de microorganismos) y de benzoato sódico (contra los microorganismos) resulta ser muy efectiva. Por ejemplo a una concentración de 1 g/L de bisulfito sódico y 1g/L de benzoato sódico no se observa oscurecimiento de los caldos ni proliferación de microorganismos tras un mes a temperatura ambiente. Otras concentraciones e incluso otras combinaciones de estabilizantes también resultaron efectivas para dicho fin.
FASE 2-Extracción de alcaloides en fase sólida
Los caldos de desamargamiento sometidos a centrifugación y desechada la fracción sólida, la fracción líquida (sobrenadante) se basifica hasta pH 12, y se vuelve a centrifugar. El sobrenadante obtenido se introduce en una columna de tierra de diatomeas macroporosa y después de unos minutos para que el líquido se distribuya a lo largo de la columna, se hacen pasar CH2CI2 por la columna recolectando la fase orgánica (llamada fracción alcaloidea), mientras que la fase acuosa sigue retenida en el interior de la columna.
Se realiza una o más extracciones con diclorometano hasta que se observa que no se recupera más materia. A continuación se hacen pasar por la columna etanol 96% con lo que se recupera la materia retenida en la columna disuelta en agua-alcohol (denominada fracción no alcaloidea o hidrosoluble).
Ambas fracciones se concentran a sequedad a presión reducida. La fracción alcaloidea se obtiene en forma aceitosa de color amarillo pálido y la fracción no alcaloidea presenta un aspecto de sólido amorfo de color marrón. Ambas fracciones fueron sometidas a análisis por GC-MS y evaluadas como insecticidas.
FASE 3-Análisis de alcaloides
Los análisis de la fracción alcaloidea se realizaron en un cromatógrafo de gases Agílent GC 6890N, equipado con un muestreador automático (Autosampler 7683 series de Agilent) y una columna capilar de alta resolución Agilent J&W Scientifics DB-5ms (30m × 0.25mm × 0.25μm). El cromatógrafo de gases está acoplado con un espectrómetro de masas Micromass AutospecQ, donde la fuente de ionización opera en modo de impacto electrónico (El) a 70 eV. Los datos se adquieren desde 50 hasta 650 m/z.
FASE 4-Actividad como insecticida
Se evaluó la eficacia como insecticida de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas obtenidas de las aguas de desamargamiento de la semilla de lupinus. Como ensayo modelo se analizaron dichas fracciones como insecticida en el control de pulgones Toxoptera citricidus Kirkaldi, el áfido transmisor del virus de la tristeza de los cítricos (CTV), y sobre otras especies de insectos. Como ejemplos de los ensayos efectuados mostramos los resultados obtenidos utilizando distintos extractos sobre cuatro especies de homópteros: los áfidos Toxoptera citricidus y Toxoptera aurantii, el pulgón verde del manzano Aphis pomi y el psílido de los eucaliptos Ctenarytaina spatulata. Los experimentos se han realizado en torre de Potter con boquilla de con una boquilla de 0.6985 mm a una presión de trabajo de 0.7 kg/cm2. Se pulverizó 1 mi de los insecticidas sin diluir sobre cada placa Petri de 9 cm de diámetro conteniendo los insectos adheridos a su correspondiente soporte vegetal. Como testigos se emplearon colonias de áfidos de la misma especie y características, pero se trataron con 1 mi de agua destilada. Se dejó secar el exceso de tratamiento a temperatura ambiente, y posteriormente se introdujeron las colonias en recipientes de plástico con tapa horadada para permitir la aireación y una esponja húmeda de floristería en el fondo para evitar la desecación. Los recipientes se colocaron después en una cámara de cultivo con condiciones controladas de 23 ± 2 °C de temperatura, 70 ± 5% de humedad relativa y 16 horas de luz de fotoperiodo. La eficacia de los productos fue evaluada 24 horas después del tratamiento (24 h.d.t.), y después a las 48 y 72 horas, anotándose la muerte de los individuos y considerando como muertos los áfidos que no mostraban actividad motora al ser tocados con una aguja entomológica.
En el caso de Toxoptera citricidus se colocó una colonia con ninfas y adultos ápteros adheridos a un brote de limonero Eureka; cada colonia estaba formada por 20 ± 5 individuos y los ensayos se realizaron por triplicado. En el caso de Toxoptera aurantii en brote de camelia, Aphis pomi en manzano, y Ctenarytaina spatulata en brote terminal de Eucalyptos globulus, se colocaron 50 ninfas de cada especie.
Los porcentajes de mortalidad obtenidos se corrigieran utilizando la fórmula de Abbott , la cual permite separar de la mortalidad observada, el efecto de mortalidad natural presente en el tratamiento testigo.
%Eficacia de Abbott= [(Vt -Ve)/Vt] x100 donde Vt= individuos vivos en el testigo y Ve= individuos vivos en los productos ensayados. Descripción de los dibujos. -
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1. Cromatograma de ión total del análisis GC-MS en modo barrido completo que muestra los alcaloides presentes: Esparteína (1), Amodendrina (2), Albina (3), Angustifolina (4), a-isolupanina (5), Lupanina (6), N-metilalbina (7), Multiflorina (8), 17- Oxolupanina (9), 13a-Hidroxilupanina (10), 13a-Hidroximultiflorina (11), 13a- Tigloiloxilupanina (12).
Figura 2. Estructura de los alcaloides detectados
Figura 3. Actividad insecticida del caldo de cocción de semillas de lupinus albus y de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas frente a pulgones Toxoptera citricidus
Figura 4. Actividad insecticida del caldo de cocción de las semillas de Lupinus albus y de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas frente a distintas especies de insectos
EJEMPLO DE REALIZACIÓN PREFERENTE
En una realización preferida de la invención "Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp, extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico", la adición combinada de bisulfito sódico (1 g/L) y de benzoato sódico (1g/L) a los caldos de desamargamiento de la semillas resultó ser muy efectiva para evitar el oscurecimiento del caldo y la proliferación de microorganismos incluso tras dos meses a temperatura ambiente.
Para la separación de los alcaloides de las aguas de desamargamiento se centrifugan 20 mL de caldo durante 10 minutos a 3.500 rpm. Se separa el sobrenadante y se basifica con NaOH 2M hasta pH 12, y se vuelve a centrifugar durante 10 minutos a 3.500 rpm. El sobrenadante obtenido se introduce en una columna Extrelut® NT 20. Tras al menos 15 minutos en la columna, se hacen pasar 2 x40 mL de CH2CI2 por la columna recolectando la fase orgánica (fase alcaloidea). Una vez ha salido toda la fase orgánica, se hacen pasar por la columna 40 ml_ de etanol 96% con lo que se recupera la materia retenida en la columna como una solución agua-alcohol (fracción no alcaloidea o hidrosoluble).
Ambas fracciones se llevan a sequedad a presión reducida. Una vez concentrada, la fracción alcaloidea se obtiene en forma aceitosa de color amarillo pálido cuyo peso promedio es 300 mg. La fracción no alcaloidea presenta un aspecto de sólido amorfo de color marrón cuyo peso promedio es 3 g. Ambas fracciones fueron redisueltas para su análisis por GC-MS y su evaluación como insecticida.
Los análisis de la fracción alcaloidea se realizaron en un cromatógrafo de gases Agilent GC 6890N, equipado con un muestreador automático (Autosampler 7683 series de Agilent) y una columna capilar de alta resolución Agilent J&W Scientifics DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm). El cromatógrafo de gases está acoplado con un espectrómetro de masas Micromass AutospecQ, donde la fuente de ionización opera en modo de impacto electrónico (El) a 70 eV. Los datos se adquieren desde 50 hasta 650 m/z.
El análisis se lleva a cabo sobre 20 mL de la fracción soluble obtenida después de centrifugar el caldo suministrado del lote 2B de 24-4-09 que contienen 4.6 g de materia seca. De estos 20 mL se extraen con diclorometano 301 mg (6.5% de la materia seca) una mezcla de alcaloides que se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), llegándose a detectar e identificar los alcaloides detallados en la Tabla 3 y cuyas estructuras se representan en la figura 2. Además en la tabla se describe el tiempo de retención, el pico molecular y otros iones característicos cuya intensidad relativa aparece entre paréntesis.
Cabe destacar la presencia abundante de lupanina (67%) además de otros alcaloides quinolizidínicos como se muestra en la Tabla 3. El cromatograma de la fracción alcaloidea se muestra en la Fig 1 y la estructura de los alcaloides detectados en la mezcla se muestra en la Fig. 2. La presencia de lupanina como componente mayoritario de la mezcla de alcaloides se confirma mediante los espectros de 13C-RMN y 1H-RMN.
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Se evaluó la eficacia como insecticida de las fracciones alcaloideas a pH 5 y pH 12 y las no alcaloideas obtenidas de las aguas de desamargamiento de la semilla de lupinus frente a pulgones de Toxoptera citricidus Kirkaldi.
La actividad insecticida se muestra en la Tabla 4 y en el diagrama de barras correspondiente (Figura 3), donde se recogen los valores medios de eficacia Abbott para los ensayos realizados con el caldo de desamargamiento (entrada 1 ), fracción alcaloidea después de neutralizar con ácido acético hasta pH 5 (entrada 2), la fracción alcaloidea sin neutralizar con ácido acético (pH 12, entrada 3), la fracción no alcaloidea (entrada 4), y el control (testigo tratado con agua, entrada 5), a las 24 y 48 horas después de la intervención. No se han recogido los resultados a las 72 horas debido a que la práctica totalidad de pulgones habían muerto dentro del intervalo anterior. Tampoco se establece diferenciación alguna entre estadios ninfales y adultos del pulgón debido a que no se observó variación alguna en el efecto obtenido por los preparados.
Estos resultados demuestran el excelente comportamiento como bioinsecticida tanto de la fracción alcaloidea como no alcaloideas (Figuras 3 y 4). La máxima eficacia corresponde a la fracción alcaloidea a pH 5, seguido de la fracción alcaloidea a pH 12 y de las aguas de desamargamiento no fraccionadas. La fracción no alcaloidea también muestra una eficacia notable, ya que a las 72 h todos los insectos han muerto, actuando por un mecanismo de acción diferente al causado por los alcaloides.
Los resultados de los extractos sobre el áfido Toxoptera aurantii en brote de camelia se recogen en la Tabla 5, sobre el pulgón Aphis pomi en manzano en la Tabla 6, y sobre el psílido Ctenarytaina spatulata en brote terminal de Eucalyptos globulus se muestran en la Tabla 7.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp y extracción de alcaloides caracterizado por llevarse a cabo en base a un procedimiento que aborda las siguientes etapas:
A. La centrifugación de los caldos de desamargamiento de la semilla de Lupinus spp. para eliminar materia insoluble si la hubiera.
B. La adición a la fracción soluble obtenida después de la centrifugación de alguno de los siguientes elementos:
Benzoato sódico y pirosulfito de sodio E223.
Pirosulfito de potasio E224,
Hidrógenosulfito de sodio E222.
Figure imgf000018_0001
Sulfito de sodio E221.
C. La conservación a 5 º C y en la oscuridad con objeto de prolongar la actividad.
D. Extracción alternativa de la fracción alcaloidea y no alcaloidea.
2. Uso como biocida ecológico, tanto insecticida como fungicida, de los extractos acuosos obtenidos mediante el procedimiento descrito en la reivindicación 1 sin acometer la extracción de la fracción alcaloidea y no alcaloidea.
3. Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp y extracción de alcaloides según reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa D, el procedimiento de extracción de los alcaloides contenidos en los extractos acuosos obtenidos en el tratamiento (remojo, cocción o lavado) de la semilla de Lupinus sp, se lleva a cabo según el siguiente proceso:
A. El uso de una matriz de tierras diatomeas macroporosas como soporte para la extracción líquido-líquido de los alcaloides contenidos en extractos acuosos de Lupinus sp.
B. La elución de los alcaloides con un disolvente orgánico inmiscible con el agua.
C. La posterior adición a la matriz de un disolvente polar (etanol, agua) para la recuperación de una fracción libre de alcaloides.
4. Uso como biocida ecológico, tanto insecticida como fungicida, de la fracción alcaloidea obtenida mediante el procedimiento descrito en la reivindicación 1 y 3.
5. Uso como biocida ecológico, tanto insecticida como fungicida, de la fracción no alcaloidea obtenida mediante el procedimiento descrito en la reivindicación 1 y 3.
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