WO2015066779A1 - Biorreator para cultivo in vitro de plantas - Google Patents

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WO2015066779A1
WO2015066779A1 PCT/BR2013/000483 BR2013000483W WO2015066779A1 WO 2015066779 A1 WO2015066779 A1 WO 2015066779A1 BR 2013000483 W BR2013000483 W BR 2013000483W WO 2015066779 A1 WO2015066779 A1 WO 2015066779A1
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container
upper container
nutrient medium
bioreactor
carbon dioxide
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PCT/BR2013/000483
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English (en)
French (fr)
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Ricardo Miguel PENCHEL
Jocemar Palauro dos REIS
Mila Liparize de OLIVEIRA
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Fibria Celulose S.A
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Publication date
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    • A01G9/00—Cultivation in receptacles, forcing-frames or greenhouses; Edging for beds, lawn or the like
    • A01G9/24—Devices or systems for heating, ventilating, regulating temperature, illuminating, or watering, in greenhouses, forcing-frames, or the like
    • A01G9/249—Lighting means
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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Definitions

  • the present utility model relates to a temporary immersion-type bioreactor for in vitro plant cultivation, preferably to a bioreactor employed in a high-yield, high-yield eucalyptus micropile production system.
  • the bioreactors employed in the technique of plant seedling production are equipment for the aseptic cultivation of plants under permanent or temporary immersion in liquid or semi-solid nutrient medium.
  • a bioreactor comprises a set of containers containing compartments and accessories for optimal management of major growth factors to maximize the performance of biological reactions.
  • the use of bioreactors in the production of plants by the temporary immersion technique allows to obtain higher growth rates and multiplication of the crop through the continuous use of liquid nutrient medium, preferably supplemented with air injection and provided with artificial lighting.
  • bioreactors stand out as the establishment of a controlled environment for cultivation, by temporary or permanent immersion of cells, buds, embryos or any appropriate propagation for the creation of seedlings of species, such as forests, in commercial scale.
  • the automation and large-scale use of liquid cultivation for in vitro plant propagation has been considered the best strategy to overcome the barriers imposed by the high cost of producing cultivation in semi-solid (gelled) media. .
  • Bioreactors are classified primarily according to the stirring mode and container construction, including agitator aerator, rotary drum, rotary filter, bubbler, single or combined aeration and bubble column, air lift component, oxygen porous membrane, over-aeration component and type of temporary immersion.
  • Temporary immersion systems comprise bioreactors, which are the essential component of these systems and are characterized by container size, type of culture support, computer immersion control or simple timer, and additionally they comprise peristaltic pump, air pump or mechanical container movement pump for the displacement of the liquid medium, possibility of liquid medium recycling and separation (or incorporation) of the liquid medium reservoir relative to the culture vessel.
  • RITA Automatic Temporary Immersion Container
  • BIT Temporary Immersion Bioreactor
  • the type . RITA is characterized by an arrangement of overlapping containers for the material to be propagated and the liquid nutrient medium and the operation and control of the factors influencing the process carried out in an automated manner.
  • the main advantage of the RITA type is the maintenance of stable and uniform conditions throughout the process and the main disadvantage is the complexity and expensive operation.
  • the simplest and least expensive type BIT has the arrangement of the containers side by side and the duration of the immersion periods and the absence of the liquid medium in the micropropagation container, and the alternation of these periods is done by a common time controller (trimmer). ).
  • trimmer common time controller
  • the BIT type despite being less expensive and simpler to operate, requires a closer monitoring of the non-automated micropropagation process and requires much larger space for side-by-side placement of the containers.
  • Exemplary automated and non-automated bioreactors are described, for example, in US20040209346 which shows a. intermittent immersion carried out by means of a central pivoting mechanism whose operation is automated; WO2012061950 which details an automated bioreactor for obtaining an Antarctic species that requires special and well-controlled conditions for micropropagation; WO2012044239 describes a bioreactor consisting of a container comprising an upper compartment (for the plant tissue to be propagated) and a lower compartment (for the liquid nutrient medium) the liquid being conveyed by gas injection from the compartment.
  • WO2012156440 describes a system of temporary immersion bioreactors, wherein each bioreactor is composed of two containers, the upper one intended for the material to be propagated and the lower one intended for liquid nutrient medium which is transported to the upper container for the propagation. immersion cycle, the latter being characterized by the maximum space utilization of the micropropagation environment.
  • the present utility model aims to provide a customized bioreactor to meet the physiological demands for vegetative propagation of forest species, preferably eucalyptus, enabling intensive production in optimum quality standard, uniformity and vigor of the shoots produced, greater rooting of micropiles and better acclimatization and early production of clonal seedlings for large scale industrial use.
  • the present utility model is embodied in the form of a bioreactor (1) for in vitro plant cultivation of the temporary immersion type comprising: (i) a container upper (2) with transparent walls for the propagating material, preferably eucalyptus explants, said container (2) being provided with (a) gaseous exchange diffusers with the external environment, (b) humidifier (12), and (c) artificial lighting (14), preferably of the LED type; (ii) a bottom container (3) with transparent walls for the liquid nutrient medium having an aluminum tray (15) and a water and / or nutrient media entry point (13), preferably located in the center of the bottom of said container (3); (iii) air / oxygen / carbon dioxide inlet / outlet points (4) located on the transparent lid (5); (iv) point (11) of additional carbon dioxide injection with dripper pipe near the bottom of said upper container (2); (v) means (6) for airtight connection between the upper and lower containers for supplying / draining nutrient medium to and from the upper container; (vi)
  • Figure 1 shows the bioreactor according to the present mounted utility model in (A) right side view and (B) front view.
  • Figure 2 shows the bioreactor according to the present assembled utility model, it was (A) left side view and (B) rear view.
  • Figure 3 shows the bioreactor according to the present disassembled utility model in perspective viewed from below.
  • Figure 4 shows the bioreactor according to the present disassembled utility model, in perspective, viewed from the front.
  • Figure 5 schematically illustrates the bioreactor of the present utility model, wherein: (A) a bottom view of the container (3) is shown, (B) a front view of the bioreactor is shown, and (C) is shown. A side view.
  • the great differential of the BIT type bioreactor of the present utility model is its customized dimensions for the tree species habit of growth, mainly focusing on eucalyptus culture.
  • the present bioreactor has unique characteristics, such as valves and diffuser nozzles, to allow gas exchange (air, oxygen, carbon dioxide, water vapor), controlled as required by the culture.
  • artificial lamp illumination is provided, preferably of the LED type to supply light-intensity light photons and specific wavelengths to maximize photosynthetic rates, allowing to increase carbon assimilation rates and subsequently sequester it in plant biomass.
  • the bioreactor of the present utility model can be used as a photoautotrophic production system, that is, a system in which the plant grows without a carbohydrate source in the nutrient medium, and the environment is enriched with high photosynthetic radiation and with high concentration of carbon dioxide, and consequently resulting in high growth rates and plant productivity and survival.
  • Vegetative micropropagation performed in the bioreactor of the present utility model when compared to the production of seedlings in clonal gardens, allows a better control of the microclimatic and nutritional conditions of the culture through optimal and continuous supply of nutrients and growth regulators; "' Renewal of the culture atmosphere - with gas enrichment; change and adequacy of the nutrient medium according to the demand of the plant in its different stages of development and control of microorganisms.
  • the production of clonal seedlings of recalcitrant species and clones is a barrier.
  • vegetative micropropagation enables the automation of the production flow, which reduces the need for large areas of ditches in the clonal gardens, allowing for higher production of micropiles. reduced laboratory space and more efficient use of energy and labor used in plant multiplication.
  • vegetative micropropagation allows the optimization of operational aspects in the laboratory, since seedlings are produced in large lots and with less handling of plant material by increasing however, the reliability as to the purity and cleanliness of the multiplied clones.
  • the bioreactor (1) of the present utility model comprises an upper container (2) for the material to be propagated and a lower container (3) for the nutrient medium for immersing the vegetative propagating material.
  • Containers (2) and (3) are shaped to maximize the use of space in the micropropagation environment, eg box shape substantially rectangular or cubic, preferably rectangular in shape.
  • the walls of the containers (1) and (2) are transparent and made of suitable material not only to allow light to pass but also to respond positively to biological functionality and structural and thermal strength tests, eg acrylic material, polyethylene, polypropylene, polycarbonate and glass, preferably with high mechanical strength.
  • the upper container (2) is provided with gas diffusers made of suitable material, eg metal or plastic, between the upper container and the external environment of the bioreactor to allow gas exchange of the crop culture with the external environment and also to allow uniform enrichment of the upper vessel with carbon dioxide injected by the upper lid.
  • the diffusers are press fit into holes with silicone sealing rings on the inner side of the upper reservoir lid and additionally can be replaced by others with higher gas flow, as the internal atmosphere of the container needs to be managed.
  • the upper container (2) is provided with two or more injection or drainage points (4) of air, oxygen, carbon dioxide and any gaseous substance that must be controlled to enable optimal air conditions for vegetative propagation.
  • Said points (4) are located in the lid (5) of the upper container, also aiming to avoid loss of lateral space between the bioreactors placed in parallel on shelves, and are embodied in the form of holes provided with connecting means (6), for example by engaging, preferably threaded, transparent gas pipes, said means being made of material resistant to autoclave sterilization conditions.
  • the means (6) has double silicone ring locking for sealing the engagement between the upper and lower containers.
  • a support (7) preferably made of a stainless steel mesh, with a frame of polymeric material, for example nylon, to allow the exchange of different mesh fabrics.
  • the support (7) is provided with stems, one being centralized and the other molded on the screen, to facilitate the removal of all plant culture on the screen after the cultivation cycle.
  • the support (7) comprises a thin stainless steel screen with different yarn specifications (e.g. no. 6, no. 8, no. 10) and mesh thickness (eg No. 24, No. 26, No.
  • means (9) are provided for positioning and locking the container (2) over the container (3).
  • the positioning and locking means (8) and (9) are provided with a sealing ring, preferably silicone, and sliding rail outer tabs injected into the upper container (means) and the lower container (means 9). )).
  • the external safety locking tabs between the top and bottom container lids additionally allow the integrated assembly to be moved from one location to another without risk of decoupling between the containers.
  • the clips have double locking or double acting characteristics that give the bioreactor of the present utility model the following advantages: (1) no need to press the two drain sealing containers; (2) safety in the transportation of the set avoiding risks of accident with the separation of the containers; (3) double locking stage between the reservoirs, the first before autoclaving the set containers and culture medium and the second after autoclaving them.
  • the lower container (3) has a compressed air inlet / drain (10) for performing pneumatic movement of the liquid nutrient medium between the containers (2) and (3).
  • This pneumatic movement is provided by a timer (not shown) which is actuated by a solenoid valve (not shown), alternating the immersion periods (transfer of liquid medium to vessel (2) by increasing pressure in the (3)) and no immersion (transfer of the liquid medium to the container (3) by reducing the pressure in this container).
  • All parts of the upper (2) and lower (3) containers, including lids, tabs, rods, and mesh frames are injected into clear, translucent, polycarbonate resins or equivalent polymeric material having adequate strength properties for the performance of successive autoclaving at 121 ° C and 1 atm for 40 min, for example under standard conditions of temperature and pressure and duration.
  • the type of polymeric material, preferably polycarbonate, used should be such that it provides reduced bubble formation, provides greater resistance to high injection pressures and results in less structural deformations in temperature and pressure variations over time. injection time and repression time in the manufacturing process.
  • the bioreactor of the present utility model is appropriately sized to allow efficient vegetative micropropagation of tree species, preferably eucalyptus, while maximizing space utilization of the micropropagation environment.
  • the bioreactor may preferably be 300 mm long x 200 mm wide x 250 mm high.

Abstract

O presente modelo de utilidade objetiva proporcionar um biorreator para cultivo in vitro de plantas, do tipo de imersão temporária compreendendo: (i) um recipiente superior (2) com paredes transparentes para o material em propagação, preferencialmente explantes de eucalipto, dito recipiente (2) sendo provido de (a) difusores de troca gasosa com o ambiente externo, (b) umidificador (12), e (c) iluminação artificial (14); (ii) um recipiente inferior (3) com paredes transparentes para o meio nutriente líquido, tendo uma bandeja de alumínio (15) e um ponto (13) de entrada de água e/ou meio nutriente, localizado no fundo do dito recipiente (3); (iii) pontos (4) de injeção/retirada de ar/oxigênio/gás carbônico localizados na tampa transparente (5); (iv) ponto (11) de injeção adicional de gás carbônico com tubo gotejador, próximo ao fundo do dito recipiente superior (2); (v) meios (6) de conexão hermética entre os recipientes superior e inferior para o abastecimento/drenagem do meio nutriente para e do recipiente superior; (vi) suporte de tela (7) para o material em propagação, com possibilidade de troca de telas de diferentes malhas; (vii) meios (8) de travamento da tampa para fechamento hermético do recipiente superior; (viii) meios (9) de travamento do recipiente superior para fechamento hermético sobre o recipiente inferior; e (ix) meios (10) de movimentação pneumática do meio nutriente líquido entre o dito recipiente superior e dito recipiente inferior.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Modelo de Utilidade "BIORREATOR PARA CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS"
CAMPO DA INVENÇÃO
0 presente modelo de utilidade refere-se a um biorreator do tipo de imersão temporária para cultivo in vitro de plantas, preferencialmente a um biorreator empregado em um sistema de produção de microestacas de eucalipto em alta escala e alta produtividade.
FUNDAMENTOS DO MODELO DE UTILIDADE
Os biorreatores empregados na técnica de produção de mudas de plantas são equipamentos para o cultivo asséptico de plantas em regime de imersão permanente ou temporária em meio nutriente liquido ou semi-sólido. Em geral, um biorreator compreende um conjunto de recipientes que contêm compartimentos e acessórios para o manejo ótimo dos principais fatores de crescimento visando maximizar o desempenho das reações biológicas. O emprego de biorreatores na produção de plantas pela técnica de imersão temporária possibilita a obtenção de maiores taxas de crescimento e de multiplicação da cultura por meio do uso continuo de meio nutriente liquido, preferencialmente suplementado com a injeção de ar e provido de iluminação artificial .
A demanda por produtos florestais e a necessidade de boa qualidade da matéria-prima têm exigido altos investimentos no setor florestal, resultando em avanços consideráveis no processo produtivo e nas técnicas utilizadas que evoluíram desde a estaquia convencional até a moderna propagação vegetativa ou micropropagação.
Consequentemente, o melhoramento genético e a biotecnologia têm requerido o desenvolvimento de novos equipamentos para a produção de mudas in vitro, visando potencializar os benefícios da micropropagação e reduzir as suas inerentes dificuldades. Dentre esses equipamentos, os biorreatores se destacam como a concretização de um ambiente controlado para cultivo, por imersão temporária ou permanente, de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo apropriado para a criação de mudas de espécies, por exemplo, florestais, em escala comercial. Particularmente, a automação e o uso, em larga escala, do cultivo em meio líquido para a propagação in vitro de plantas vêm sendo considerados a melhor estratégia para superar as barreiras impostas pelo alto custo de produção do cultivo em meios semi-sólidos (gelifiçados ) .
Os biorreatores são classificados fundamentalmente de acordo com o modo de agitação e pela construção do recipiente, incluindo aerador agitador, tambor rotativo, filtro rotativo, borbulhador, aeração simples ou combinada e coluna de bolha, componente de levantamento de ar, membrana porosa ao oxigénio, componente de sobre-aeração e tipo de imersão temporária. Os sistemas de imersão temporária compreendem biorreatores, que são o componente essencial desses sistemas e que se caracterizam pelo tamanho do recipiente, tipo de suporte da cultura, existência de controle computadorizado da imersão ou simples timer, e adicionalmente compreendem bomba peristáltica, bomba de ar ou de movimentação mecânica do recipiente para o deslocamento do meio liquido, possibilidade de reciclo do meio liquido e separação (ou incorporação) do reservatório do meio liquido relativo ao recipiente de cultivo. Características comuns aos biorreatores são as paredes transparentes, para passagem de luz e verificação do processo de desenvolvimento da planta, e a possibilidade de serem esterilizados em autoclaves. Os dois tipos principais de biorreatores para micropropagação de células e tecidos vegetais, em meio nutriente líquido, são o tipo RITA (Recipiente de Imersão Temporária Automatizada) e o tipo BIT (Biorreator de Imersão Temporária) . O tipo . RITA caracteriza-se por uma disposição de recipientes, para o material a ser propagado e para o meio nutriente líquido, sobrepostos e pela operação e controle, dos fatores que influenciam o processo, realizados de modo automatizado. A principal vantagem do tipo RITA é a manutenção de condições estáveis e uniformes ao longo do processo e a principal desvantagem é a complexidade e dispendiosa operacionalização .
O tipo BIT mais simples e menos oneroso tem a disposição dos recipientes feita lado a lado e a duração dos períodos de imersão e ausência do meio líquido no recipiente de micropropagação, sendo que a alternância desses períodos é feita por um controlador comum de tempo ( tímer) . Entretanto, o tipo BIT, apesar de ser menos oneroso e de operacionalização mais simples, requer um acompanhamento mais próximo do processo de micropropagação que não é automatizado, além de exigir um espaço bem maior para a colocação lado ã lado dos recipientes.
Biorreatores automatizados e não automatizados exemplificativos são descritos, por exemplo, no documento US20040209346 que mostra um biorreator de . imersão intermitente realizada por meio de um mecanismo pivoteado central cuja operacionalização é automatizada; no documento WO2012061950 que detalha um biorreator automatizado para a obtenção de uma espécie da Antártida que requer condições especiais e bem controladas para a micropropagação; no documento WO2012044239 é descrito um biorreator consistindo de um recipiente que compreende um compartimento superior (para o tecido vegetal a ser propagado) e um compartimento inferior (para o meio nutriente liquido) sendo o liquido transportado, por meio de injeção de gás, do compartimento inferior para o compartimento superior de acordo com a programação do período de imersão; no documento WO2012156440 é descrito um sistema de biorreatores de imersão temporária, em que cada biorreator é composto de dois recipientes, sendo o superior destinado para o material a ser propagado e o inferior destinado ao meio nutriente líquido que é transportado para o recipiente superior para a realização do ciclo de imersão, sendo este último sistema caracterizado pelo aproveitamento máximo de espaço do ambiente de micropropagação. Apesar do avanço propiciado por esses biorreatores conhecidos do estado, podem ser percebidas certas desvantagens que influenciam negativamente na micropropagação, tais como maior dificuldade de colocação/retirada do material a ser propagado, menor eficiência na movimentação do meio nutriente, menos pontos de inj eção/retirada de gases, dentre outras desvantagens. Assim, nós verificamos que há a necessidade de um biorreator de imersão temporária em meio nutriente liquido suplementado com injeção de ar e enriquecimento de gás carbónico, sendo provida radiação fotossinteticamente ativa dentro do recipiente contendo o material em propagação, sendo que esse biorreator deve ser apropriado para a micropropagação de plantas florestais e ter formato e dimensões que maximizem o espaço do ambiente onde é realizada a propagação vegetativa, com simultânea facilidade de acesso ao recipiente de material a ser propagado.
SUMÁRIO DO MODELO DE UTILIDADE
O presente modelo de utilidade objetiva proporcionar um biorreator customizado para atender às demandas fisiológicas para a propagação vegetativa de espécies florestais, preferivelmente do eucalipto, possibilitando a produção intensiva em padrão ótimo de qualidade, uniformidade e vigor dos brotos produzidos, maior enraizamento de microestacas e melhor aclimatização e precocidade de produção de mudas clonais para uso industrial em larga escala.
0 presente modelo de utilidade é concretizado na forma de um biorreator (1) para cultivo in vitro de plantas, do tipo de imersão temporária compreendendo: (i) um recipiente superior (2) com paredes transparentes para o material em propagação, preferencialmente explantes de eucalipto, dito recipiente (2) sendo provido de (a) difusores de troca gasosa com o ambiente externo, (b) umidificador (12), e (c) iluminação artificial (14), preferencialmente do tipo LED; (ii) um recipiente inferior (3) com paredes transparentes para o meio nutriente liquido, tendo uma bandeja de alumínio (15) e um ponto (13) de entrada de água e/ou meio nutriente, preferencialmente localizado no centro do fundo do dito recipiente (3); (iii) pontos (4) de in eção/retirada de ar/oxigênio/gás carbónico localizados na tampa transparente (5); (iv) ponto (11) de injeção adicional de gás carbónico com tubo gotejador, próximo ao fundo do dito recipiente superior (2); (v) meios (6) de conexão hermética entre os recipientes superior e inferior para o abastecimento/drenagem do meio nutriente para e do recipiente superior; (vi) suporte de tela (7) para o material em propagação, com possibilidade de troca de telas de diferentes malhas; (vii) meios (8) de travamento da tampa para fechamento hermético do recipiente superior; (viii) meios (9) de travamento do recipiente superior para fechamento hermético sobre o recipiente inferior; e (ix) meios (10) de movimentação pneumática do meio nutriente líquido entre o dito recipiente superior e dito recipiente inferior.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra o biorreator de acordo com o presente modelo de utilidade montado, em (A) vista lateral direita e em (B) vista frontal. A Figura 2 mostra o biorreator de acordo com o presente modelo de utilidade montado, era (A) vista lateral esquerda e em (B) vista traseira.
A Figura 3 mostra o biorreator de acordo com o presente modelo de utilidade desmontado, em perspectiva, visto de baixo para cima.
A Figura 4 mostra o biorreator de acordo com o presente modelo de utilidade desmontado, em perspectiva, visto de frente. A Figura 5 ilustra esquematicamente o biorreator do presente modelo de utilidade, sendo que em: (A) é mostrada uma vista de fundo do recipiente (3), (B) é mostrada uma vista de frente do biorreator, e (C) é mostrada uma vista de lado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Existem no mercado diversos tipos de biorreatores de imersão temporária, sendo os principais o tipo RITA (Recipiente de Imersão Temporária Automatizado) , tipo BIT (Biorreator de Imersão Temporária) , . tipo SIT (Sistema de Imersão Temporária) e BioMint (Biorreator de Imersão Temporária) , tendo em comum, geralmente, o conceito de funcionamento pneumático de imersão temporária das plantas no meio nutritivo liquido. A grande diferença entre eles reside no formato dos compartimentos para as plantas e para armazenar o meio liquido. Na maioria deles, os recipientes de cultivo das plantas é separado e individualizado do compartimento de armazenamento do meio liquido. No biorreator objeto do presente modelo de utilidade, os recipientes são acoplados um sobre o outro, em uma única plataforma, permitindo redução de espaço. O grande diferencial do biorreator, tipo BIT, do presente modelo de utilidade são suas dimensões customizadas para o hábito de crescimento de espécies arbóreas, principalmente com foco na eucaliptocultura . Além disso, o presente biorreator possui características únicas, tais como válvulas e bicos difusores, para permitir trocas gasosas (ar, oxigénio, gás carbónico, vapor d' água), controlados conforme a necessidade da cultura. Adicionalmente é provida iluminação artificial com lâmpadas, preferencialmente do tipo diodo- led para suprir fótons de luz com intensidade luminosa e comprimentos de onda específicos para maximizar as taxas fotossintéticas, permitindo elevar as taxas de assimilação do carbono e subsequentemente seu sequestro em biomassa vegetal.
Desse modo, o biorreator do presente modelo de utilidade pode ser utilizado como um sistema de produção fotoautotrófico, ou seja, um sistema no qual a planta cresce sem fonte de carboidratos no meio nutriente, sendo que o ambiente é enriquecido com alta radiação fotossintética e com alta concentração de gás carbónico, e consequentemente, resultando em altas taxas de crescimento e de produtividade e sobrevivência das plantas.
A micropropagação vegetativa realizada no biorreator do presente modelo de utilidade, quando comparada à produção de mudas em jardins clonais, possibilita um melhor controle das condições microclimáticas e nutricionais da cultura, por meio de suprimento ótimo e continuo de nutrientes e reguladores do crescimento;"' renovação da atmosfera da cultura- com enriquecimento de gases; mudança e adequação do meio nutritivo de acordo com a demanda da planta em seus diferentes estágios de desenvolvimento e controle de microrganismos. A produção de mudas clonais de espécies e clones recalcitrantes é um entrave na propagação convencional porque o rejuvenescimento e/ou revigoramento das matrizes nem sempre é alcançado. Além disso, a micropropagação vegetativa possibilita a automatização do fluxo de produção, o que reduz a necessidade de áreas extensas de canaletes nos jardins clonais, permitindo maior produção de microestacas em espaço reduzido de laboratório e com maior eficiência no uso de energia e mão de obra empregada na multiplicação das plantas. Adicionalmente, a micropropagação vegetativa permite a otimização dos aspectos operacionais no laboratório, uma vez que as plântulas são produzidas em grandes lotes e com menor manuseio do material vegetal, aumentando, portanto, a confiabilidade quanto à pureza e limpeza dos clones multiplicados .
Como mostrado nas Figuras 1 e 2, o biorreator (1) do presente modelo de utilidade compreende um recipiente superior (2) para o material a ser propagado e um recipiente inferior (3) para o meio nutriente destinado à imersão do material em propagação vegetativa. Os recipientes (2) e (3) têm formato adequado para maximizar o aproveitamento do espaço no ambiente destinado à micropropagação, por exemplo, forma de caixa substancialmente retangular ou cúbica, preferencialmente de caixa retangular. As paredes dos recipientes (1) e (2) são transparentes e feitas de material adequado não só para permitir a passagem de luz como também para responder positivamente aos testes de funcionalidade biológica e de resistência estrutural e térmica, por exemplo, material acrílico, de polietileno, de polipropileno, de policarbonato e vidro, preferencialmente com elevada resistência mecânica.
O recipiente superior (2) é provido de difusores de gases, fabricados em material apropriado, por exemplo, metal ou plástico, entre o recipiente superior e o ambiente externo do biorreator para permitir trocas gasosas da cultura vegetal com o ambiente externo e também para permitir o enriquecimento uniforme do recipiente superior com gás carbónico injetado pela tampa superior. Os difusores são encaixados sob pressão em furos com anel de vedação de silicone no lado interno da tampa do reservatório superior e, adicionalmente, podem ser substituídos por outros de maior vazão de gases, conforme a necessidade do manejo da atmosfera interna do recipiente.
O recipiente superior (2) é provido com dois ou mais pontos (4) de injeção ou de drenagem de ar, oxigénio, gás carbónico e qualquer substância gasosa que deva ser controlada para possibilitar condições aéreas ideais para a propagação vegetativa. Os ditos pontos (4) estão localizados na tampa (5) do recipiente superior, também visando evitar perda de espaço lateral entre os biorreatores colocados em paralelo sobre prateleiras, e são concretizados na forma de orifícios providos de meios (6) de conexão, por exemplo, por engate, preferencialmente rosqueados, de tubulações transparentes de gases, sendo ditos meios feitos de material resistente às condições de esterilização em autoclave. Preferencialmente, os meios (6) possuem duplo travamento com anel de silicone para vedação do engate entre os recipientes superior e inferior.
No interior do recipiente superior (2) é disposto um suporte (7), feito preferencialmente de uma tela de aço inox, com moldura em material polimérico, por exemplo, nylon, para permitir a troca de telas de diferentes malhas. Preferencialmente, o suporte (7) é provido de hastes, sendo uma centralizada e a outra moldada na tela, para facilitar a remoção de toda a cultura vegetal sobre a tela após o ciclo de cultivo. É importante observar que, de acordo com o presente modelo de utilidade, de preferência, o suporte (7) compreende uma tela de inox delgada, com diferentes especificações de fios (por exemplo, n°6, n° 8, n° 10) e espessura de malhas (por exemplo, n° 24, n° 26, n° 28) e sem flanges inferiores, ditas telas sendo intercambiáveis para permitir colocação de diferentes tipos de materiais vegetal (por exemplo, segmentos nodais, ápices caulinares, caules isolados, brotos isolados, touças de multibrotações , tufos de multibrotações) . A tampa (5) é posicionada e travada sobre o recipiente
(2), através de meios (8), de modo estanque para evitar contaminação e possibilitar o adequado funcionamento de abastecimento e drenagem do meio nutriente líquido para e do recipiente (2) para execução dos períodos de imersão. Do mesmo modo também são providos meios (9) de posicionamento e travamento do recipiente (2) sobre o recipiente (3). Preferivelmente, os meios de posicionamento e travamento (8) e (9) são providos de anel de vedação, preferencialmente em silicone, e presilhas externas deslizantes em trilho injetado no recipiente superior (meios (8)) e no recipiente inferior (meios (9)). As presilhas externas de travamento de segurança entre as tampas dos recipientes superior e inferior, adicionalmente permite o transporte do conjunto integrado, de um local para outro, sem risco de desacoplamento entre os recipientes. Também deve ser observado que as presilhas possuem características de duplo travamento ou duplo efeito que conferem ao biorreator do presente modelo de utilidade seguintes vantagens: (1) desnecessidade de pressionar os dois recipientes para vedação do dreno; (2) segurança no transporte do conjunto evitando riscos de acidente com a separação dos recipientes; (3) duplo estágio de travamento entre os reservatórios, sendo o primeiro antes da autoclavagem do conjunto recipientes e meio de cultura e o segundo após autoclagem dos mesmos.
Adicionalmente, o recipiente inferior (3) possui uma entrada/dreno (10) para ar comprimido para a realização da movimentação pneumática do meio nutriente líquido entre os recipientes (2) e (3). Essa movimentação pneumática é proporcionada por um temporizador (não mostrado) que é acionado por uma válvula solenóide (não mostrada) , alternando os períodos de imersão (transferência do meio líquido para o recipiente (2) por aumento da pressão no recipiente (3)) e de ausência de imersão (transferencia do meio liquido para o recipiente (3) por redução da pressão neste recipiente) .
Todas as peças dos recipientes superior (2) e inferior (3), incluindo tampas, presilhas, hastes e molduras de telas são injetadas em resinas de policarbonato, ou material polimérico equivalente, translúcido e liso, com propriedades adequadas de resistência para a realização de sucessivas autoclavagens a 121°C e 1 atm, por 40 min, por exemplo, em condições normatizadas de temperatura e pressão e duração. É importante mencionar que o tipo de material polimérico, preferencialmente policarbonato, utilizado deve ser tal que proporcione a redução de formação de bolhas, confira maior resistência às altas pressões de injeção e resulte em menores deformações estruturais nas variações de temperatura e pressão, durante o tempo de injeção e tempo de recalque no processo de fabricação.
O biorreator do presente modelo de utilidade é dimensionado de forma apropriada para permitir a eficiente micropropagação vegetativa de espécies arbóreas, preferivelmente de eucalipto, enquanto é maximizado o aproveitamento de espaço do ambiente de micropropagação. Por exemplo, o biorreator pode, preferencialmente, ter as dimensões de 300 mm comprimento x 200 mm largura x 250 mm de altura total.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na presente descrição são indicativos do nivel daqueles especialistas na técnica ao qual o presente modelo de utilidade se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados a titulo de referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou cada pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a titulo de referência. Apesar de certas concretizações terem sido descritas, elas foram apresentadas como um modo exemplificativo somente, e não há intenção de limitar o escopo do presente modelo de utilidade. As reivindicações que acompanham esta descrição e suas equivalentes são consideradas como cobrindo tais formas ou modificações na medida em que elas podem estar dentro do escopo e espirito do presente modelo de utilidade.

Claims

RÈIVI DICAÇÃO
1. Biorreator para cultivo in vitro de plantas, do tipo de imersão temporária caracterizado por compreender: i. um recipiente superior com paredes transparentes para o material em propagação, dito recipiente superior sendo provido de:
(a) difusores de troca gasosa com o ambiente externo,
(b) umidificador (12), e
(c) iluminação artificial (14), preferencialmente do tipo LED; ii. um recipiente inferior com paredes transparentes para o meio nutriente liquido, tendo uma bandeja e um ponto de entrada de água e/ou meio nutriente, localizado no fundo do dito recipiente inferior; iii. pontos de inj eção/retirada de ar/oxigênio/gás carbónico localizados na tampa transparente que posiciona e veda o recipiente superior; iv. ponto de injeção adicional de gás carbónico com tubo gotejador, próximo ao fundo do dito recipiente superior; v. meios de conexão entre os recipientes superior e inferior para o abastecimento/drenagem do meio nutriente para e do recipiente superior; vi. suporte de tela para o material em propagação, com possibilidade de troca de telas de diferentes malhas ; O 2015/066779
vii. meios de posicionamento e travamento da tampa para fechamento hermético do recipiente superior; viii. meios de posicionamento e travamento do recipiente superior para fechamento hermético sobre o recipiente inferior; e ix. meios de movimentação do meio nutriente liquido entre o dito recipiente superior e dito recipiente inferior .
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