WO2015057047A1 - Proceso para obtener una molécula que sirve como elicitor de péptidos antimicrobianos - Google Patents

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WO2015057047A1 PCT/MX2014/000161 MX2014000161W WO2015057047A1 WO 2015057047 A1 WO2015057047 A1 WO 2015057047A1 MX 2014000161 W MX2014000161 W MX 2014000161W WO 2015057047 A1 WO2015057047 A1 WO 2015057047A1
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Ernesto PRADO MONTES DE OCA
Juan Carlos MATEOS DÍAZ
Marisela GONZÁLEZ ÁVILA
Daniel Alberto GRAJALES HERNÁNDEZ
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Centro De Investigación Y Asistencia En Tecnología Y Diseño Del Estado De Jalisco A.C.
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    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention is developed in the field of chemical technology, specifically in the design of elicitors of antimicrobial and interferon peptides type II (gamma) validated in human cell lines.
  • the object of this invention is the development of a method for obtaining a molecule that serves as an elicitor of antimicrobial peptides, which exhibits indirect and immunomodulatory antimicrobial activity by inducing the expression or overexpression of antimicrobial and interferon type II (interferon- ⁇ ) peptides in Human cell lines for the treatment of infectious and chronic degenerative diseases.
  • interferon- ⁇ interferon type II
  • Elicitors of antimicrobial peptides are classified into physical (class I), chemical (class II) and biological (class III).
  • the present invention includes elicitors of class II antimicrobial peptides that produce overexpression of the CAMP and / or DEFB1 and / or IFNG genes.
  • the products of the CAMP and DEFB1 genes which are LL-37 and human beta defensin 1 (hBD-1) respectively, are immunomodulatory peptides that exhibit extensive antimicrobial activity against gram-positive, gram-negative bacteria, viruses, fungi and protozoa (Prado Montes de Oca E, 2013., Elicitors of antimicrobial peptides: new hope for the post-antibiotic era).
  • the most relevant antecedents to the present invention of elicitors of antimicrobial peptides and the process of obtaining reported, patented and patent procedures are described below.
  • an acid catalyst eg, boron trifluoride / ethanol solution
  • V.A.E. Shaikh et al. (2003, synthesis of mesomorphic behavior of lithocolic acid derivatives), published the synthesis of litocoil acetate and propionate by treating lithocolic acid with acetyl and propionyl chloride, respectively, using dichloromethane as a solvent in the presence of pyridine a 60-70 ° C in a nitrogen atmosphere for 24 hours.
  • the previous work refers to synthesis reactions already reported, which employ short chain alkyl substituents (less than 4 carbons) without unsaturations.
  • the reaction conditions used in this work are: higher temperature, an inert atmosphere and catalysts such as pyridine are used.
  • oleic acid is used as an acylation agent, which is a long-chain fatty acid (18 carbons) that contains unsaturation (more labile and less reactive molecule), biological catalysts (enzymes) and mild reaction conditions (50 ° C), ensuring the integrity of the synthesis molecule.
  • the synthesis processes mentioned above are carried out chemically and require the protection of the carbonyl group to avoid secondary reactions (e.g. polymerization of lithocolic acid).
  • the acylating groups used are anhydrides or short chain acyl chlorides or require a coupling agent (DCC). They differ from the process requested in the present invention since the synthesis of esters of lithocolic acid by enzymatic route such as lithoyl oleate is not described.
  • the process of our invention is also carried out under mild reaction conditions, using a long and unsaturated chain acylating agent.
  • SCFA short chain fatty acids
  • cystic fibrosis acute myeloid leukemia, malignant glioma and sickle cell anemia is currently being investigated. They propose the application of sodium butyrate as an elicitor of antimicrobial peptides particularly the CAMP gene. They have known molecules and intend to patent their application in mainly infectious diseases. They do not suggest methods of synthesis or purification unlike the present invention. They only mention that BNa and PBNa function as elicitor of the CAMP gene.
  • Raqib et al. (2012) suggest 4-phenylbutyric acid, butyric acid or a butyrate salt such as sodium butyrate or glyceryltributyrate to be used as elicitors of antimicrobial peptides against M. tuberculosis, Pseudomonas sp. , Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis.
  • oleic acid is bactericidal against skin infection caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a concordant therapy with evolutionary medicine
  • MRSA methicillin-resistant S. aureus skin infections
  • oleic acid is a widely known molecule.
  • DEFB1 is a tumor suppressor gene, since overexpression of the DEFB1 gene in cancer cells SW156 resulted in apoptosis mediated by caspase 3. They suggest that point mutations may be responsible for the loss Specific expression of DEFB1 in cancer.
  • FIG. 1 A. The molecule causes 2.23 times overexpression of the LL-37 cathelicidin (CAMP) gene compared to the non-elicitor control at 48 h exposure in human lung epithelium cells A-549.
  • Figure 2 Proton profile by NMR of the lithocoyl oleate in accordance with Figure 1 B.
  • Figure 3. Carbon profile by NMR of the lithocoil oleate in accordance with Figure 1 B.
  • Figure 4. Profile of methines, methyl and methylene by NMR Litocoil oleate in accordance with Figure 1 B.
  • Figure 5 Absolute value of the correlated spectroscopy gradient and filtered by double quanta (DQF-COZY) by NMR of the lithocoyl oleate according to Figure 1 B.
  • Figure 6 Potentialized correlation gradient of how many heteronuclear multiples in two dimensions (2D HMQC) with X-NMR coupling of the lithocoyl oleate according to Figure 1 B.
  • Figure 10 Expression of the IFNG gene in normal keratinocytes on exposure to ascorbic acid.
  • FIG. 1 Expression of the CAMP gene in normal keratinocytes on exposure to ascorbic acid. There are no significant changes in cell viability at the concentration in which it induces elicitor / immunoregulator function (0 mM).
  • Figure 12 Percentage of viability of keratinocytes on exposure with ascorbic acid for 24 hrs. There are no significant changes in cell viability at the concentration in which it induces elicitor / immunoregulator function (0 mM).
  • Figure 13 Expression of the DEFB1 gene in normal keratinocytes on glucose exposure.
  • Figure 14. IFNG gene expression in normal keratinocytes on glucose exposure.
  • Figure 15. Percentage of cell viability in glucose exposure for 24 hrs. Regarding your control.
  • Figure 16. Percentage of cell viability in glucose exposure for 48 hrs. Regarding your control.
  • Figure 17 Percentage of cell viability in glucose exposure for 72 hrs. Regarding your control.
  • Figure 18 Dissociation curve of the HPRT reference gene (hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase) amplicon.
  • Figure 20 Dissociation curve of the amplicon of the DEFB1 gene (human ⁇ -defensin 1.
  • Figure 21 Dissociation curve of the IFNG (interferon gamma) gene amplicon.
  • Figure 22 Scheme of the synthesis and purification procedure for obtaining lithocoyl oleate.
  • litocoyl oleate was designed in silico in a conventional manner with databases and open access software.
  • Litocoyl oleate was synthesized and purified from oleic acid and lithocolic acid which are elicitors of antimicrobial peptides.
  • the molecule obtained is a conjugate esterified in the alpha 3-hydroxy position of lithocolic acid with oleic acid (cis-9-octadecenoic acid).
  • the molecule is a yellowish oily liquid with a molecular weight of 641 gr / mol and chemical formula C42H72O .
  • the elicitor of the molecules normalized the loading of RNA and cDNA.
  • the HPRT gene was also used as the reference gene.
  • the method of Pfaffl (2001) was used where the amplification efficiency of each of the pairs of primers in the PCR conditions used is included in the formula.
  • Litocoil oleate, glucose and ascorbic acid function as elicitors of antimicrobial peptides of the CAMP gene (LL-37 peptide, lithocoyl oleate), DEFB1 (hBD-1 peptide, glucose) and both genes (ascorbic acid).
  • Such gene expression was measured by primers designed for this purpose (HPRT1 gene, first EXHP; IFNG gene, first EXIG; CAMP gene, first EXCA; DEFB1 gene, first KBB1) as shown in Table 1.
  • elicitors exhibit indirect and immunomodulatory antimicrobial activity by inducing the expression / overexpression of antimicrobial and interferon peptides type II (gamma) in human cell lines.
  • the elicitors of the present invention do not exhibit cytotoxicity at the recommended concentration and / or exposure time in human lung epithelium cells (A-549) or in normal human neonate keratinocytes (ATCC)
  • the new molecule (litocoyl oleate) can be used to overexpress antimicrobial peptide genes such as DEFB1, human beta 2A defensin
  • the present invention has the purpose of reducing the high cost of synthesis, purification and storage as well as increasing the bioavailability of endogenous antimicrobial peptides by inducing their expression and decreasing the risk of inducing resistance to endogenous antimicrobial peptides, since it is an indirect strategy.
  • the present invention is also proposed as an alternative solution to the high incidence of strains resistant to conventional antibiotics and the side effects they cause.
  • the reaction mixture is heated from 20 ° C to 50 ° C with magnetic stirring of 50 to 750 RPM for 120 uninterrupted hours.
  • the Product formation is monitored every 24 hours using thin layer chromatography (TLC).
  • TLC thin layer chromatography
  • litocoil oleate The fractions with the compound of interest are mixed, concentrated in a centrifugal evaporator and finally stored at -20 ° C. The purification yield is 5-20%. The purity of litocoyl oleate was 95-99%. The rest are the two mother molecules oleic acid and lithocolic acid. Litocoyl oleate (10, 13-dimethyl-3-oleoxyloxy-hexadecahydro-1 H-cyclopentaphenanthrene-17-yl pentanoic acid) is a yellowish oily liquid of 641.03 Daltons.
  • the molecule obtained is a conjugate esterified in the alpha 3-hydroxy position of lithocolic acid with oleic acid (cis-9-octadecenoic acid).
  • the molecule is a yellowish oily liquid with a molecular weight of 641 gr / mol and chemical formula C 42 H 72 0 4. It consists of a steroidal nucleus with four fused rings, three with six carbons and one with five, numbered as shown in Figure 1b. Carbon 10 and 13 are methylated.
  • the hydroxyl group is esterified with oleic acid, an 18-carbon fatty acid with an instability of isomerism c / s in carbon 9 '.
  • carbon 17 it is attached a 4-carbon alkyl substituent with a 4 "carbon methylation and a terminal carboxylic acid.
  • the process described above serves for the synthesis of litocoyl oleate. Applying litocoyl oleate together with glucose and ascorbic acid function as elicitors of antimicrobial peptides.
  • reaction mixture was heated at 50 ° C with magnetic stirring at 500 RPM for a period of 120 hours.
  • Product formation was monitored every 24 hours using thin layer chromatography (TLC).
  • TLC thin layer chromatography
  • reaction mixtures were filtered with a 0.45 m membrane of Millipore brand nylon to remove the catalyst from the reaction mixture, finally the mixture was fully concentrated by a rotary evaporator and stored at -20 ° C.
  • reaction mixture was incorporated into a 150 mL volume chromatography column, packed with silica gel mesh 130-270, previously mixed with petroleum ether.
  • lithium oleate, glucose and ascorbic acid were tested separately in a normal human keratinocyte cell line of the newborn.
  • the elicitor that was stored at -20 ° C was weighed, dissolved and filtered with a syringe without a needle and a 0.22 ⁇ filter.
  • a working solution of 10 mL volume, 80 mM (0.08 M 0.8x10 8 nM) was prepared, this depends on the available quantity of the elicitor and the final concentration required in each well of the 6-well plate.
  • the final concentrations were 1, 2 and 4 mM and 5% or less of the elicitor was placed with respect to the final volume of 2000 ⁇ L ⁇ (maximum 100 ⁇ L ⁇ per elicitor well dissolved in the solvent).
  • the total volume of all wells was the same in all experiments (2000 ⁇ ). When it was required to take less than 2 ⁇ L of cells, they were diluted in 1X phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS 1X phosphate buffered saline
  • Serum-free keratinocyte media (K-sfm) was placed for keratinocyte cell line and 1 x 10 6 cells were added (variable vol according to the count in the optical microscope by hemocytometer, typically 2 to 10 ⁇ ) in each of the wells of the culture plates of 6.
  • K-sfm Serum-free keratinocyte media
  • 1 x 10 6 cells were added (variable vol according to the count in the optical microscope by hemocytometer, typically 2 to 10 ⁇ ) in each of the wells of the culture plates of 6.
  • For a final concentration eg of 0, 1, 2 and 4mM of a typical elicitor each sample was prepared in triplicate for each day including also the triplicate of the control without elicitor- 0 mM- for each day
  • 2 plates of 6 wells per day were required. It was distributed according to table 2:
  • the PCR was optimized by a curve of different concentrations of primers and / or by modifying the alignment temperature and turned to make point 1 for them.
  • the baseline biological condition was specified in "select reference / biological replica of reference group" and the reference or control sample without elicitor in "reference sample”.
  • Litocoyl oleate was synthesized and purified as in example 1 of in vitro tests. Likewise, litocoyl oleate, glucose and ascorbic acid were tested as in example 2 of in vitro tests, only the cell line was changed to the lung epithelial line A-549 and the Dulbecco-modified Eagle medium (DMEM) was used. with 10% fetal bovine serum. Likewise, the cell viability was estimated by contacting the elicitors at the different concentrations and times as in example 2 of in vitro tests. The evaluation of the efficacy of elicitors by means of relative gene expression by real-time PCR was performed as in example 3 of in vitro tests. Results Litocoyl oleate is not cytotoxic at 24 hours of exposure (Figure 8) at concentrations induced by an overexpression effect of the CAMP gene (Figure 1A) and has indirect in vitro antimicrobial activity (Figure 7).
  • lepromatous leprosy tuberculoid leprosy
  • indeterminate leprosy atopic dermatitis, Crohn's disease, ulcerative colitis
  • infectious colitis in general inflammatory bowel diseases
  • systemic infections skin , intestines, lungs, heart, and / or oral and genital mucous membranes by gram-negative, gram-positive bacteria, fungi and viruses including Candida sp.
  • Staphylococcus sp. Pseudomonas sp., Kleibsella sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp., Shigella sp., Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), infectious meningitis, traveler's diarrhea (caused by Escherichia coli), caries, anaphylactic shock sepsis, Vibrio cholera, herpes simplex virus (warts and fires), genital herpes, herpes Zoster, dengue virus, adenovirus, Sendai virus, influenza, influenza, prevention of sexual transmission by HIV-1 and HIV-2 and inhibition of its replication , adjuvant of vaccines of living organisms, inactivated or subunit and recombinant vaccines of bacteria, mycobacteria, viruses, protozoa, leishmaniasis, disease of Chagas, breast, prostate, renal, gastric, carcinoma, chronic myelogen
  • Mechanism of action overexpression of the cathelicidin gene (cathelicidin, CAMP gene; hCAP-18 precursor, LL-37 peptide) and beta defensin 1 expression (DEFB1 gene, hBD-1 peptide) and / or IFNG gene overexpression.
  • Drug presentation tablets, capsules, pearls, intravenous, intradermal, intramuscular, subcutaneous solution, suppositories, enema, aerosol, syrup, suspension, emulsion, ointment, cream, emollient, slow release patch, talcum powder, powder.
  • reaction conditions were with 10mM lithocolic acid and 15mM oleic acid in isooctane, with 50mg / mL catalyst (Sigma brand Antarctic Candida Lipase B). The reaction was brought to 50 ° C with magnetic stirring at 500 RPM for a period of 120 hours. The maximum conversion was 10%.
  • the primers work best at a final concentration of the PCR reaction mixture of 0.5-1 ⁇ .
  • Beta defensin 1 a potential tumor suppressor on chromosome 8p: control of transcription and induction of apotosis in renal cell carcinoma. Cancer Res 66 (17): 8542-9.

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Abstract

La presente invención refiere un método para sintetizar enzimáticamente el litocoil oleato y purificarlo de manera eficiente. El litocoil oleato es una molécula que sirve como elicitor de péptidos antimicrobianos, el cual presenta actividad antimicrobiana indirecta e inmunomoduladora al inducir la expresión o sobreexpresión de péptidos antimicrobianos e interferón tipo II (interferón-γ). El litocoil oleato es un derivado del ácido litocólico esterificado con ácido oleico en la posición alfa 3-hidroxi. Es un líquido oleoso amarillento a temperatura ambiente con un peso molecular de 641 gr/mol y fórmula química C42H72O4. Esta molécula se puede utilizar sola o en combinación de ácido ascórbico y/o glucosa, los cuales se demuestra en esta invención que son elicitores de péptidos antimicrobianos, para el tratamiento de enfermedades infecciosas y crónico-degenerativas en el humano.

Description

PROCESO PARA OBTENER UNA MOLÉCULA QUE SIRVE COMO ELICITOR DE
PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se desarrolla en el campo de la tecnología química, específicamente en el diseño de elicitores de péptidos antimicrobianos e interferón tipo II (gamma) validados en líneas celulares humanas.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de esta invención es el desarrollo de un método para obtener una molécula que sirve como elicitor de péptidos antimicrobianos, la cual presenta actividad antimicrobiana indirecta e inmunomoduladora al inducir la expresión o sobreexpresión de péptidos antimicrobianos e interferón tipo II (ínterferón-γ) en líneas celulares humanas para el tratamiento de enfermedades infecciosas y crónico-degenerativas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los elicitores de péptidos antimicrobianos se clasifican en físicos (clase I), químicos (clase II) y biológicos (clase III). La presente invención incluye elicitores de péptidos antimicrobianos de clase II que producen la sobreexpresión de los genes CAMP y/o DEFB1 y/o IFNG. Los productos de los genes CAMP y DEFB1, los cuales son LL-37 y la beta defensina 1 humana (hBD-1 ) respectivamente, son péptidos inmunomoduladores que presentan amplia actividad antimicrobiana contra bacterias gram-positivas, gram-negativas, virus, hongos y protozoarios (Prado Montes de Oca E, 2013., Elicitores de péptidos antimicrobianos: nueva esperanza para la era post-antibióticos). Los antecedentes más relevantes a la presente invención de elicitores de péptidos antimicrobianos y proceso de obtención reportados, patentados y en vías de patente se describen a continuación.
Dentro de los elicitores de péptidos antimicrobianos clase II se encuentran los ácidos grasos de cadena corta como el ácido litocólico y el ácido oleico. Los ésteres del ácido litocólico como la molécula obtenida se sintetizan mediante la reacción de esterificación de un ácido graso como el ácido oleico en la posición (OH-3) del ácido litocólico. En la solicitud de patente US 2010/0204191 A1 , Makishima y cois. (2010, agonista del receptor de vitamina D selectivo de función), reivindican un proceso para la síntesis del litocoil propionato que puede llevarse por los siguientes métodos (1 ) ó (2). (1 ) Un método en el cual el ácido litocólico y anhídrido propiónico se calientan en un medio orgánico como el tetrahidrofurano en presencia de catalizador ácido (p.ej., solución de trifluoruro de boro/etanol); y (2) un método donde el grupo carboxilo del ácido litocólico se protege con un grupo bencilo o semejante y el sustituyente (OH-3) se reacciona con el cloruro del ácido propiónico en presencia de piridina para remover el grupo protector.
Por otro lado, V.A.E. Shaikh y cois., (2003, síntesis de comportamiento mesomórfico de los derivados de ácido litocólico), publicaron la síntesis del litocoil acetato y propionato tratando el ácido litocólico con cloruro de acetilo y propionilo, respectivamente, utilizando diclorometano como solvente en presencia de piridina a 60-70°C en una atmósfera de nitrógeno durante 24h. El trabajo anterior se refiere a reacciones de síntesis ya reportadas, que emplean sustituyentes alquilo de cadena corta (menor a 4 carbonos) sin insaturaciones. Las condiciones de reacción empleadas en este trabajo son: mayor temperatura, una atmósfera inerte y se utilizan catalizadores como la piridina. En nuestro proceso se utiliza ácido oleico como agente de acilación, que es un ácido graso de cadena larga (18 carbonos) que contiene una insaturación (molécula más lábil y menos reactiva), catalizadores biológicos (enzimas) y condiciones suaves de reacción (50°C), asegurando la integridad de la molécula de síntesis.
Además Nahar L. y cois. (2003, Síntesis de dímeros de ácido litocólico unido por éster) sintetizaron dímeros del ácido litocólico por esterificación en presencia de DCC/DMAP en diclorometano a temperatura ambiente durante 72h. En el trabajo anterior, aunque las condiciones de reacción son suaves, los catalizadores empleados son altamente tóxicos. No se emplea el ácido oleico como agente de acilación como en nuestra invención.
Los procesos de síntesis mencionados anteriormente son llevados por vía química y requieren la protección del grupo carbonilo para evitar reacciones secundarias (p. ej. polimerización del ácido litocólico). Los grupos acilantes empleados son anhídridos o cloruros de acilo de cadena corta o requieren de un agente de acoplamiento (DCC). Difieren del proceso solicitado en la presente invención ya que no se describe la síntesis de ésteres del ácido litocólico por vía enzimática como el litocoil oleato. El proceso de nuestra invención además se lleva a cabo en condiciones suaves de reacción, empleando una agente acilante de cadena larga e insaturada.
En cuanto a los elicitores, Alam K. y cois., (1999, ácidos grasos de cadena corta mejora las características clínicas, patológicas y microbiológicas de la shigelosis experimental) demostraron que ácidos grasos de cadena corta (SCFA) reducen sangre fecal, congestión mucosa, infiltración celular y cambios necróticos y conteo de Shigella flexneri en colon de conejos adultos. La mezcla de SCFA fue acetato de sodio 60 mM, propionato de sodio 30 mM y n-butirato de sodio 40 mM con una osmolaridad de 300 mOsm/L, ajustado a pH 7.2 con 0.1 N NaOH. Son moléculas previamente reportadas y no se describe el mecanismo de acción como elicitores de péptidos antimicrobianos a diferencia de nuestra invención.
En la patente US6388108 (WO2000-09137), Rao y cois. (2002, Compuestos de aminosteroles y sus aplicaciones), se proponen compuestos derivados de aminosterol para tratamiento de infecciones. Este esterol fue identificado en el tiburón Squalus acanthias. Se mencionan moléculas ya conocidas y no se describe el mecanismo de acción como elicitores de péptidos antimicrobianos sólo como directamente antimicrobianas.
Gudmundsson GH y cois., en el 2008, aplicaron para una solicitud de patente (US2011/01 18217 A1 ) donde solicitan la protección del butirato de sodio (BNa) y fenilbutirato de sodio (PBNa) como elicitores de péptidos antimicrobianos y su aplicación en el tratamiento de infecciones. El PBNa es comercializado por las empresas Ucyclid Pharma (Hunt Valley, EU) con el nombre de "Buphenyl" y por la Swedish Orphan International (Suecia) con el nombre de "Ammonaps" como principio activo del medicamento el cual se utiliza para el tratamiento de enfermedades del ciclo de la urea. Se investiga actualmente su utilidad en fibrosis quística, leucemia mieloide aguda, glioma maligno y anemia falciforme. Proponen la aplicación del butirato de sodio como un elicitor de péptidos antimicrobianos particularmente el gen CAMP. Presentan moléculas conocidas y pretenden patentar su aplicación en enfermedades principalmente infecciosas. No sugieren métodos de síntesis ni purificación a diferencia de la presente invención. Sólo mencionan que el BNa y el PBNa funcionan como elicitor del gen CAMP.
Steinmann J. y cois., en el 2009, hacen referencia a las moléculas de Gudmundsson GH y cois., en el 2008. La diferencia es que para el caso del gen DEFB1 el PBA funciona como un inhibidor en el reporte y como elicitor de péptidos antimicrobianos en la aplicación de patente, siendo un resultado ambiguo. En la presente solicitud de patente se comprueba que el litocoil oleato es un elicitor de péptidos antmicrobianos.
En su aplicación de patente Raqib y cois., (2012) sugieren las moléculas 4-ácido fenilbutírico, ácido butírico o una sal de butirato como butirato de sodio o gliceriltributirato para ser utilizado como elicitores de péptidos antimicrobianos contra M. tuberculosis, Pseudomonas sp., Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.
Zhang HH y cois., en el 2010 (los potentes efectos adyuvantes de la beta defensina 1 de pollo cuando se fusiona genéticamente con el gen del virus VP2 de la enfermedad de infección de bolsa), mencionan la fusión del gen de la beta defensina 1 del pollo con el VP2 para estimular la respuesta inmune y específicamente aplicar esta construcción como adyuvante. No mencionan la aplicación de elicitores de péptidos antimícrobianos sino la fusión del gen de la defensina a diferencia de nuestra invención.
Nakatsuji T y cois., en el 20 0 (ácidos grasos libres en sebo potencializa la defensa inmune innata de los sebocitos humanos sobreexpresando la expresión de beta defensina 2) reportaron que los ácidos grasos sobreexpresan la beta defensina 2 en sebocitos. Sólo reportan estos ácidos grasos en sebocitos in vitro mas no como terapia, sólo como ciencia básica. Utilizan moléculas ya conocidas y no proponen métodos de síntesis ni purificación a diferencia de nuestra invención.
Chen CH y cois., en el 201 1 (el ácido oleico innato es bactericida contra infección en piel provocada por Staphylococcus aureus resistente a meticilina: una terapia concordante con la medicina evolutiva) reportan que infecciones de la piel por S. aureus resistente a meticilina (MRSA) podrían ser tratadas aplicando ácido oleico como elicitor de péptidos antimicrobianos. A diferencia de nuestra invención, el ácido oleico es una molécula ampliamente conocida.
Mily A y cois., en el 2013 (ingesta oral de fenilbutirato con o sin vitamina D3 sobreexpresa catelicidina LL-37 en macrófagos humanos: un estudio para encontrar la dosis para el tratamiento de la tuberculosis). Reportan la búsqueda de una dosis mínima efectiva para tuberculosis con BNa y/o vitamina D para el tratamiento de la tuberculosis. Reportan moléculas conocidas. No proponen métodos de síntesis ni purificación de las mismas.
En cuanto a las aplicaciones potenciales de péptidos antimicrobianos humanos en la clínica se encuentran los siguientes antecedentes: Peyrin Biroulet y cois., (2010) demostraron que una variante funcional en promotor que es requerida para la expresión de DEFB1 confiere protección contra colitis e ileocolitis en la enfermedad de Crohn, la cual pertenece a las enfermedades inflamatorias de intestinos. Fattorini y cois., (2004) reportaron que la hBD-1 es activa in vitro contra M. tuberculosis y hace sinergia cuando se prueba con isoniazida. Ozturk y cois., (2010) reportaron que variantes en el promotor del gen DEFB1 están asociados a una mayor susceptibilidad a caries probablemente correlacionada con el nivel de expresión de DEFB1.
Por otro lado, Prado Montes de Oca y cois., en 2009 demuestran que ciertos polimorfismos del gen DEFB1 están asociados a la lepra lepromatosa y sugieren que la deficiencia de DEFB1 causada por estos polimorfismos hace susceptible a los pacientes con lepra presentar la forma más agresiva y diseminada que es la lepra lepromatosa. Además Prado Montes de Oca y cois., en 2007 demuestran que ciertos polimorfismos del gen DEFB1 están asociados a dermatitis atópica y sugieren que la deficiencia de DEFB1 causada por estos polimorfismos hace susceptible a los individuos a la dermatitis atópica.
Bentley-Hewitt y cois., (2012) sugieren que ácidos grasos de cadena corta del kiwi verde pueden proteger contra infecciones intestinales al inducir sobreexpresión de los genes DEFB1 y DEFB4. Zapata y cois., en 2008 demostraron que la homocigosidad en el polimorfismo 692G del promotor del gen DEFB1, región que regula los niveles de expresión del gen, fue significantemente más frecuente en población expuesta pero seronegativa al VIH. Barnea y cois., en 2008 demostraron que la glucosa e insulina son necesarias para una sobreexpresión de DEFB1 en líneas celulares humanas.
Sun y cois, en 2006 demostraron que DEFB1 es un gen supresor de tumores, ya que la sobreexpresión del gen DEFB1 en células cancerígenas SW156 resultó en la apoptosis de las mismas mediada por caspasa 3. Sugieren que las mutaciones puntuales pueden ser responsables por la pérdida específica de la expresión de DEFB1 en cáncer.
Basado en los criterios expuestos con anterioridad, se presenta y reclama un proceso para la síntesis enzimática de la molécula obtenida mediante lipasas así como las aplicaciones en medicina humana, animal, agroindustria y tecnología de alimentos de estas moléculas pequeñas inspiradas en ácidos grasos (elicitores de péptidos antimicrobianos clase II). A pesar de que ya se ha reportado la propiedad elicitora de los ácidos litocólico y oleico de manera individual, el principal aporte de la presente invención es el proceso de la unión covalente de estos dos ácidos para la obtención de una molécula elicitora de péptidos antimicrobianos.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. A. La molécula provoca sobreexpresión 2.23 veces del gen de la catelicidina LL-37 (CAMP) comparado con el control sin elicitor a las 48 h de exposición en células de epitelio pulmonar humano A-549. B. Estructura del litocoil oleato obtenida con evidencia de resonancia magnética nuclear (NMR).
Figura 2 Perfil de protones por NMR del litocoil oleato en concordancia con la figura 1 B. Figura 3. Perfil de carbonos por NMR del litocoil oleato en concordancia con la figura 1 B. Figura 4. Perfil de metinos, metilos y metilenos por NMR del litocoil oleato en concordancia con la figura 1 B.
Figura 5. Valor absoluto del gradiente de espectroscopia correlacionada y filtrada por cuantos dobles (DQF-COSY) por NMR del litocoil oleato en concordancia con la figura 1 B. Figura 6. Gradiente potencializado de correlación de cuantos múltiples heteronuclear en dos dimensiones (2D HMQC) con acoplamiento X por NMR del litocoil oleato en concordancia con la figura 1 B.
Figura 7. Actividad antimicrobiana indirecta ¡n vitro de 1 mM de litocoi! oleato. El litocoil oleato incrementa la actividad antimicrobiana de células de epitelio pulmonar A-549 y selectiva contra S. aureus, un patógeno humano gram-positivo (p<0.01 ). Las células se expusieron a litocoil oleato (LO) por 48 h y se obtuvo el sobrenadante. SA, sobrenadante de células A-549 sin elicitor; Tet, tetraciclina 1 mM aplicada directamente a la placa para el ensayo antimicrobiano.
Figura 8. Viabilidad de células A-549 en la exposición a litocoil oleato.
Figura 9. Efecto del ácido ascórbico en la sobreexpresión del gen DEFB1 a 24, 48 y 72 h en queratinocitos normales de humano. A las 24 horas a 5mM disminuyó a 0.3 veces con respecto a su control sin elicitor se muestra significancia (p=0.015) así como también se muestra significancia en la expresión a las 72 horas a 20 mM de 47,499 veces mayor (p=0.022) con respecto a su control sin elicitor de ese mismo día.
Figura 10. Expresión del gen IFNG en queratinocitos normales en la exposición a ácido ascórbico.
Figura 1 1. Expresión del gen CAMP en queratinocitos normales en la exposición a ácido ascórbico. No hay cambios significativos en la viabilidad celular a la concentración en la cual induce función de elicitor/inmunoregulador ( 0 mM).
Figura 12. Porcentaje de viabilidad de queratinocitos en la exposición con ácido ascórbico por 24 hrs. No hay cambios significativos en la viabilidad celular a la concentración en la cual induce función de elicitor/inmunoregulador ( 0 mM).
Figura 13. Expresión del gen DEFB1 en queratinocitos normales en la exposición a glucosa. Figura 14. Expresión del gen IFNG en queratinocitos normales en la exposición a glucosa. Figura 15. Porcentaje de viabilidad celular en la exposición con glucosa por 24 hrs. respecto a su control. Figura 16. Porcentaje de viabilidad celular en la exposición con glucosa por 48 hrs. respecto a su control.
Figura 17. Porcentaje de viabilidad celular en la exposición con glucosa por 72 hrs. respecto a su control.
Figura 18. Curva de disociación del amplicón del gen de referencia HPRT (hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa).
Figura 19. Curva de disociación del amplicón del gen CAMP (catelicidina LL-37).
Figura 20. Curva de disociación del amplicón del gen DEFB1 (β-defensina 1 humanaj.
Figura 21. Curva de disociación del amplicón del gen IFNG (interferón gamma).
Figura 22. Esquema del procedimiento de síntesis y purificación para la obtención del litocoil oleato.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Con base en las propiedades de las moléculas madre ácido oleico y ácido litocólico, el litocoil oleato se diseñó in silico de manera convencional con bases de datos y software de acceso libre. Se sintetizó y purificó el litocoil oleato a partir de ácido oleico y ácido litocólico los cuales son elicitores de péptidos antimicrobianos. La molécula obtenida es un conjugado esterificado en la posición alfa 3-hidroxi del ácido litocólico con el ácido oleico (ácido cis-9- octadecenoico).La molécula es un líquido oleoso amarillento con un peso molecular de 641 gr/mol y fórmula química C42H72O . Consiste de un núcleo esteroideo con cuatro anillos fusionados, tres con seis carbonos y uno con cinco, numerados como se muestra en la figura 1 b. Los carbonos 10 y 13 se encuentran metilados. En el carbono 3, el grupo hidroxilo está esterificado con el ácido oleico, un ácido graso de 18 carbonos con una instauración de isomería cis en el carbono 9'. En el carbono 17 está unido un sustituyente alquilo de 4 carbonos con una metilación en el carbono 4' y un ácido carboxílico terminal. Para llevar a cabo la reacción de esterificación de esteres del ácido litocólico se emplearon distintos ácidos grasos y lipasas como biocatalizadores en presencia de solventes tanto polares como apolares. La purificación de las moléculas de síntesis se realizó por cromatografía en columna de acuerdo al procedimiento presentado. Para evaluar el efecto elicitor de las moléculas se normalizó la carga de RNA y cDNA. Asimismo se utilizó el gen HPRT como gen de referencia. Se utilizó el método de Pfaffl (2001) donde se incluye en la fórmula la eficiencia de amplificación de cada uno de los pares de primers en las condiciones de PCR utilizadas. El litocoil oleato, la glucosa y ácido ascórbico funcionan como elicitores de péptidos antimicrobianos del gen CAMP (péptido LL-37, litocoil oleato), DEFB1 (péptido hBD-1 , glucosa) y ambos genes (ácido ascórbico). Tal expresión génica se midió mediante los primers diseñados para este fin (gen HPRT1, primer EXHP; gen IFNG, primer EXIG; gen CAMP, primer EXCA; gen DEFB1, primer KBB1 ) como se muestra en la Tabla 1.
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TABLA 1
Estos nuevos elicitores presentan actividad antimicrobiana indirecta e inmunomoduladora al inducir la expresión/sobreexpresión de péptidos antimicrobianos e interferón tipo II (gamma) en líneas celulares humanas. Los elicitores de la presente invención no presentan citotoxicidad a la concentración y/o tiempo de exposición recomendados en células humano de epitelio pulmonar (A-549) ni en queratinocitos humanos normales de neonato (ATCC
PCS-200-010). La nueva molécula (litocoil oleato) se puede utilizar para sobreexpresar genes de péptidos antimicrobianos tales como DEFB1, beta defensina 2A humana
(DEFB4A), beta defensina 2B humana {DEFB4B), beta defensina 3A humana (DEFB103A), beta defensina 3B humana (DEFB103B), beta defensina 4A humana (DEFB104A), beta defensina 4B humana {DEFB104B), beta defensinas humanas 5A y 5B (DEFB105A y B), beta defensinas humanas 6A y 6B (DEFB106A y B), beta defensinas humanas 7A y 7B
(DEFB107A y B), beta defensinas humanas 8A y 8B (DEFB108A y B), beta defensina humanas 1 10-136 (DEFB110- 136), CAMP, hepcidina (HAMP), psoriasina (S100A7), histatina 1 (HIS1), alfa defensina 1 humana {DEFA1), alfa defensina 1 B humana (DEFA1B), alfa defensina 3 humana (DEFA3), DEFA4 (alfa defensina 4 humana), DEFA5 (alfa defensina 5 humana), DEFA6 (alfa defensina 6 humana).
Las admisiones hospitalarias a nivel mundial debido a los efectos adversos a medicamentos son del orden de 2-7% del total de admisiones. En particular las reacciones adversas a antibióticos son causa de hasta el 23.3% de estas admisiones y hasta 1.63 % del total de las admisiones. La incidencia de anafilaxis es de 1/5000 exposiciones a antibióticos y una incidencia de 500 casos de anafilaxis letal al año a nivel mundial debida al uso y abuso de antibióticos. El mercado mundial de fármacos anti-infecciosos ronda los 50 mil millones de dólares al año y la tendencia va en aumento debido al surgimiento de las cepas multiresistentes.
La presente invención tiene la finalidad de reducir el alto costo de síntesis, purificación y almacenaje así como incrementar la biodisponibilidad de péptidos antimicrobianos endógenos al inducir su expresión y disminuir el riesgo a inducir resistencia a los péptidos antimicrobianos endógenos, ya que es una estrategia indirecta. Asimismo la presente invención se propone como una solución alternativa a la alta incidencia de cepas resistentes a antibióticos convencionales y a los efectos secundarios que provocan.
MÉTODO DE SÍNTESIS Y PURIFICACIÓN
A continuación se describen las etapas y condiciones del proceso (Figura 22) para lograr la síntesis y purificación de la molécula que se solicita en esta invención:
1. Mezclar ácido litocólico. En viales ámbar se colocan de 10 a 50mM de ácido litocólico se agregan de 15 a 75mM donadores de acilo (10 a 50mM ácidos y 15 a 75mM esteres vinílicos) y se afora a un volumen de 20 mL de solvente polar y apolar. Además se agregan de 50 a 100 mg/ml de lipasas (por ejemplo: Lipasa B de Candida antárctica o Candida rugosa) que actúan como biocatalizadores.
2. Calentar y evaporar. La mezcla de reacción se calienta de 20°C a 50°C con agitación magnética de 50 a 750 RPM durante 120 horas ininterrumpidas. La formación del producto se monitorea cada 24 horas utilizando cromatografía en capa fina (TLC). La reacción alcanza de 3 a 10% de conversión.
3. Remover la mezcla de reacción. Las mezclas de reacción se filtran con una membrana de 0.22 a 0.45 pm de nylon para retirar el catalizador de la mezcla de reacción. La mezcla se concentra a totalidad mediante un evaporador rotatorio y debe ser almacenado para su conservación en un congelador a una temperatura de entre -20 °C a -80°C.
4. Purificar. Se empaca en una columna de cromatografía de 20-200 mL de volumen, malla de sílica gel de 130-270 suspendidas en éter de petróleo. Se incorpora a la columna empacada la totalidad de la mezcla de reacción.
5. Recuperar compuesto. Para separar el producto deseado es necesario eluir con distintas proporciones de mezclas de éter de petróleo (EP): éter etílico (95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40). La identificación del compuesto en fracciones de 55 a 60 se logra mediante cromatografía de capa fina.
6. Obtener litocoil oleato. Las fracciones con el compuesto de interés se mezcla, se concentran en un evaporador centrífugo y finalmente se almacenan a -20°C. El rendimiento de purificación es de 5-20%. La pureza de litocoil oleato fue del 95-99%. El resto son las dos moléculas madre ácido oleico y ácido litocólico. El litocoil oleato (10, 13-dimetil-3-oleoxiloxi-hexadecahidro-1 H-ciclopentafenantreno-17-il ácido pentanoico) es un líquido oleoso amarillento de 641.03 Daltons.
La molécula obtenida es un conjugado esterificado en la posición alfa 3-hidroxi del ácido litocólico con el ácido oleico (ácido cis-9-octadecenoico).La molécula es un líquido oleoso amarillento con un peso molecular de 641 gr/mol y fórmula química C42H7204. Consiste de un núcleo esteroideo con cuatro anillos fusionados, tres con seis carbonos y uno con cinco, numerados como se muestra en la figura 1b. Los carbonos 10 y 13 se encuentran metilados. En el carbono 3, el grupo hidroxilo está esterificado con el ácido oleico, un ácido graso de 18 carbonos con una instauración de isomería c/s en el carbono 9'. En el carbono 17 está unido un sustituyente alquilo de 4 carbonos con una metilación en el carbono 4" y un ácido carboxílico terminal.
Esfera de la tecnología a la que aplica:
El proceso descrito anteriormente sirve para la síntesis del litocoil oleato. El aplicar el litocoil oleato junto con la glucosa y el ácido ascórbico funcionan como elicitores de péptidos antimicrobianos.
EJEMPLO 1 - SÍNTESIS Y PURIFICACIÓN DE LITOCOIL OLEATO
1. En viales ámbar se colocaron 20mL de una solución de ácido litocólico 10mM-50mM y donadores de acilo (ácidos grasos y esteres vinílicos) de 15-75mM en solventes polares y apolares (e.g. tert-butanol e iso-octano), con distintas lipasas como biocatalizadores 50-100 mg/mL (e.g Lipasa B de Candida antárctica y Candida rugosa marca Sigma).
2. La mezcla de reacción se calentó a 50°C con agitación magnética a 500 RPM durante un plazo de 120 horas. La formación del producto se monitoreó cada 24 horas utilizando cromatografía en capa fina (TLC). La reacción alcanzó de 3 a 10% de conversión (analizado cualitativamente en placas de TLC).
3. Posteriormente las mezclas de reacción fueron filtradas con una membrana 0.45 m de nylon marca Millipore para retirar el catalizador de la mezcla de reacción, finalmente la mezcla se concentró a totalidad mediante un evaporador rotatorio y se almacenó a -20°C.
4. Finalmente para la purificación se incorporó la totalidad de la mezcla de reacción en una columna de cromatografía de 150 mL de volumen, empacada con silica gel malla 130-270, previamente mezclada con éter de petróleo.
5. Para la separación del producto deseado fue necesario eluir con distintas proporciones de mezclas: éter de petróleo (EP) y éter etílico (EE).
6. La identificación del compuesto en las fracciones de la purificación se logró mediante cromatografía de capa fina. 7. Finalmente las fracciones con el compuesto de interés se mezclaron, se concentraron en un evaporador centrífugo (Speedvac) y finalmente se almacenaron a -20°C. El rendimiento de purificación fue de 5-20%. El resto son las dos moléculas madre ácido oleico y ácido litocólico. El litocoil oleato (10, 13-dimetil-3-oleoxiloxi- hexadecahidro-1 H-ciclopentafenantreno-17-il ácido pentanoico) es un líquido oleoso amarillento de 641.03 Daltons.
EJEMPLO 2 - PRUEBAS IN VITRO. QUERATINOCITOS NORMALES HUMANOS DE NEONATO (ATCC PCS-200-010).
Asimismo se probaron por separado el litocoil oleato, la glucosa y el ácido ascórbico en una línea celular de queratinocitos normales humanos de neonato.
1. Se pesó el elicitor que estaba almacenado a -20° C, se disolvió y se filtró con una jeringa sin aguja y un filtro de 0.22μΐη. Se preparó una solución de trabajo de 10 mL de volumen, 80 mM (0.08 M=0.8x108 nM), esto depende de la cantidad disponible del elicitor y de la concentración final requerida en cada pozo de la placa de 6 pozos. Las concentraciones finales fueron 1 , 2 y 4 mM y se colocó 5% o menos del elicitor respecto al volumen final de 2000 μL· (máximo 100 μL· por pozo de elicitor disuelto en el solvente). El volumen total de todos los pozos fue el mismo en todos los experimentos (2000 μΐ). Cuando se requirió tomar menos de 2 μL· de células, éstas se diluyeron en buffer salino de fosfatos (PBS) 1X.
2. Se colocó medio para queratinocitos libre de suero (K-sfm) para línea celular de queratinocitos y se agregaron 1 x 106 de células (vol. variable según el conteo en el microscopio óptico mediante hemocitómetro, típicamente son de 2 a 10 μί) en cada uno de los pozos de las placas de cultivo de 6. Para una concentración final p.ej. de 0, 1 , 2 y 4mM de un elicitor típico (se preparó cada muestra por triplicado para cada día incluyendo también el triplicado del control sin elicitor- 0 mM- para cada día) y se requirieron 2 placas de 6 pozos por día. Se repartió según la tabla 2:
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TABLA 2
Día 1 del desafío: 2 placas
Placa 1
A1 0 mM A2 0 mM A3 0 mM
B1 1 mM B2 1 mM B3 1 mM
Placa 2
A4 2 mM A5 2 mM A6 2 mM
B4 4 mM B5 4 mM B6 4 mM
Nota: Para tomar muestra los días 2 y 3 es repartir como están las placas 1 y 2: -Para tomar muestra el día 2: placa 3 y 4 -Para tomar muestra el día 3: placa 5 y 6
3. Se fijó con cinta masking los lados más cortos de la placa. Se guardó en la incubadora con 5% C02 a 37° C.
4. Se guardó la solución de trabajo del elicitor a -20° C.
5. Se tomó muestra de sobrenadante en 2 tubos de 1.5 (1 mL de muestra c/u) a las 24, 48 y 72 h.
6. Se purificó el RNA inmediatamente después de colectar las muestras a las 24, 48 y 72 h mediante el kit MagMax 96 para aislamiento de RNA total (Ambion, Life Technologies). 7. Se realizó transcripción reversa de cada muestra para obtener el ADN complementario (ADNc) mediante la enzima transcriptasa reversa del kit RNA a Ct 1 paso SYBR (Life Technologies) y se procedió a medir la expresión génica (número de moléculas de RNA mensajero) relativa de las células en contacto con los elicitores tomando como referencia el gen HPRT1 (fosforibosíltransferasa 1 de hipoxantina).
8. En las condiciones de mayor expresión génica relativa se repitió el experimento y se estimó la viabilidad celular cuantificado como porcentaje del número de células viables y adheridas a la placa comparadas con el control sin elicitor, el cual se considera como el 100%.
EJEMPLO 3 -PRUEBAS IN VITRO. ENSAYOS DE EXPRESIÓN GÉNICA RELATIVA
1. Se cuantificó la eficiencia de amplificación génica de cada par de primers (y/o combinación de diferentes concentraciones de los mismos), se realizó curva de diluciones seriales de 1 :10 de 5 puntos y por triplicado (15 pozos) de un cDNA de alta concentración (normalmente el control sin exposición o condición basal). El tipo de ensayo es "curva estándar relativa" del software StepOne v. 2.1 (Life Technologies). Una eficiencia del 100% significa que en cada ciclo se van a obtener un número doble de amplicones respecto al ciclo inmediato anterior.
2. Para aquellos pares de primers donde la eficiencia fue baja (menor al 80%) o amplicones no deseados (ver punto 6) se optimizó la PCR mediante una curva de diferentes concentraciones de primers y/o modificando la temperatura de alineamiento y se volvió a realizar el punto 1 para ellos.
3. Colocar la misma cantidad de cDNA o RNA o normalizar la cantidad de carga en Excel en el punto 8. Cuando las concentraciones de RNA son menores a 10 nanogramos por microlitro se recomienda no volver a hacer diluciones para evitar su contaminación o degradación y normalizar en el punto 8. En todos los casos se realizó la transcripción reversa a más tardar al día siguiente de extraer el RNA y durante ése tiempo se guardó a -80° C. 4. Se aplicó el método de Pffafl (2001). Se colocó la eficiencia de amplificación en porcentaje de cada par de primers en "ajustes de análisis/ajustes de cuantificación relativa/eficiencia". Una eficiencia de amplificación del 80% es igual a 1.845 en logaritmo base 10.
5. Se especificó la condición biológica basal en "seleccionar referencia/réplica biológica de grupo de referencia" y la muestra de referencia o control sin elicitor en "muestra de referencia".
6. En "análisis/curva de desnaturalización" se corroboró que no hubiera amplicones indeseados, definidos como picos en temperaturas no esperadas según la predicción in silico. En caso de haber amplicones no deseados se optimizó la PCR según el punto 2 y se volvió a empezar en el punto 1. En "expresión génica" observó y registró en Excel el valor de cuantificación relativa (RQ) expresado como cambio en número de veces respecto a la muestra sin elicitor.
7. En Excel se realizaron pruebas de F para los triplicados de cada condición, cuando se encontraron diferencias significativas en la varianza (p<0.05) se utilizó la prueba de t para varianzas diferentes. Cuando no hubo diferencias entre varianzas se utilizó la prueba de t para varianzas iguales. Se gráfico el promedio de la expresión relativa (RQ) con la barra de error (+SEM, error estándar de la media, llamado "error típico" en Excel). La condición basal o control sin elicitor siempre se normalizó como equivalente a 1 y todos los valores de expresión fueron relativos a este control. Siempre se analizaron las muestras de cada día con su control sin elicitor de ese día.
Resultados. Se observó una sobreexpresion de genes DEFB1 (Figuras 9 y 13), CAMP (Figuras 1A y 1 1 ) e IFNG (Figuras 6 y 10). Las moléculas no son citotóxicas en las concentraciones que inducen un efecto de sobreexpresion de genes de péptidos antimicrobianos, como es el caso de glucosa a las 24 (Figura 15), 48 (Figura 16) y 72 h (Figura 17) de exposición, así como con ácido ascórbico a las 24 h de exposición (Figura 12). La especificidad de los iniciadores (primers) se demuestra en las curvas de disociación para los genes HPRT (Figura 18), CAMP (Figura 19), DEFB1 (Figura 20) e IFNG (Figura 21). EJEMPLO 4 DE PRUEBAS IN VITRO. CELULAS EPITELIALES DE PULMON A-549
Se sintetizó y purificó el litocoil oleato como en el ejemplo 1 de pruebas in vitro. Asimismo se probó el litocoil oleato, la glucosa y el ácido ascórbico como en el ejemplo 2 de pruebas in vitro sólo se cambió la línea celular por la línea epitelial de pulmón A-549 y se utilizó el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10%. Asimismo se estimó La viabilidad celular poniendo en contacto los elicitores en las diferentes concentraciones y tiempos como en el ejemplo 2 de pruebas in vitro. La evaluación de la eficacia de los elicitores mediante expresión génica relativa por PCR en tiempo real se realizó como en el ejemplo 3 de pruebas in vitro. Resultados. El litocoil oleato no es citotóxico a las 24 h de exposición (Figura 8) en las concentraciones que induce un efecto de sobreexpresión del gen CAMP (Figura 1A) y presenta actividad antimicrobiana indirecta in vitro (Figura 7).
POSIBILIDADES DE USO O APLICACIÓN
Puede utilizarse como tratamiento contra tuberculosis pulmonar y extrapulmonar en todas sus formas, lepra lepromatosa, lepra tuberculoide, lepra indeterminada, dermatitis atópica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, colitis infecciosa (en general las enfermedades inflamatorias de intestinos), infecciones sistémicas, en piel, intestinos, pulmones, corazón, y/o mucosas orales y genitales por bacterias gram-negativas, gram-positivas, hongos y virus incluyendo Candida sp. , Staphylococcus sp., Pseudomonas sp., Kleibsella sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp., Shigella sp., Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), meningitis infecciosa, diarrea del viajero (causada por Escherichia coli), caries, choque anafiláctico y sepsis, Vibrio cholera, herpes simplex virus (verrugas y fuegos), herpes genital, herpes Zoster, virus del dengue, adenovirus, virus Sendai, influenza, gripe, prevención de transmisión sexual por VIH-1 y VIH-2 e inhibición de su replicación, adyuvante de vacunas de organismos vivos, inactivados o vacunas subunitarias y recombinantes de bacterias, micobacterias, virus, protozoarios, leishmaniasis, enfermedad de Chagas, cáncer de mama, de próstata, renal, gástrico, carcinoma, leucemia mielógena crónica, sobre leucemia mielógena aguda y enfermedades crónico degenerativas en humano como diabetes tipo I y tipo II, e industria agropecuaria. Mecanismo de acción: sobreexpresion del gen catelicidina (cathelicidin, gen CAMP; precursor hCAP-18, péptido LL-37) y lo expresión de beta defensina 1 (gen DEFB1, péptido hBD-1 ) y/o sobreexpresion de gen IFNG. Presentación de fármaco: comprimidos, cápsulas, perlas, solución intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea, supositorios, enema, aerosol, jarabe, suspensión, emulsión, ungüento, crema, emoliente, parche de liberación lenta, talco, polvo.
MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN
SÍNTESIS Y PURIFICACIÓN
Las mejores condiciones de reacción fueron con ácido litocólico 10mM y ácido oleico 15mM en isooctano, con 50mg/mL de catalizador (Lipasa B de Candida antárctica marca Sigma). La reacción se llevó a 50°C con agitación magnética a 500 RPM durante un plazo de 120 horas. La máxima conversión fue de 10%.
Las mejores condiciones para la purificación se lograron al incorporar la totalidad de la mezcla de reacción en una columna de cromatografía de 150 mL de capacidad, empacada con sílica gel malla 130-270, previamente mezclada con éter de petróleo. La separación del producto deseado se logró al eluir con 150mL de una mezcla 60:40 EP:EE. El producto se recolectó en 60 fracciones de 5 mL de la mezcla de solventes.
METODO DE TAMIZA JE DE ELICITORES IN VITRO
El desafío de elicitores potenciales con células en cultivo, funciona mejor en placas de 6 pozos con superficie CELL-BIND (patente de Corning) con 1 a 3 mL de medio de cultivo para queratinocitos K-sfm (adicionado con 0.2-0.6mM de CaCI2, ejemplo 1 ) o suero bovino fetal (FBS) 8-12% + DMEM para el caso de la línea celular A-549 (ejemplo 2). ENSAYOS DE EXPRESIÓN GÉNICA RELATIVA
Los primers funcionan mejor en una concentración final de la mezcla de reacción de la PCR de 0.5-1 μΜ.
REFERENCIAS
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Barnea M. y cois., 2008. Glucosa e insulina es requerida para una expresión óptima en líneas celulares humanas. BiochemBiophys Res Commun. 367(2):452-6. Bentley-Hewitt KL. Y cois., 2012. El kiwi verde digerido y fermentado incrementa la producción de beta defensinas 1 y 2 in vitro. Plants Foods Hum Nutr 67(3): 208-14.
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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito lo suficiente la invención como antecede, se considera de nuestra exclusiva propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Método para obtener una molécula de litocoil oleato que comprende:
a. mezclar ácido litocólico: colocando de 10 a 50mM de ácido litocólico, 15 a 75mM donadores de acilo y aforando a 20 ml_ con solventes polares o apolares, agregar de 50 a 100 mg/ml de lipasas;
b. calentar y evaporar: se calienta de 20-50°C con agitación de 50-750 RPM durante 120 horas ininterrumpidas;
c. remover la mezcla de reacción: se filtran las mezclas con una membrana de 0.22 a 0.45 μιη de nylon y se concentra a totalidad mediante un evaporador rotatorio y se almacena de 0 a -80° C.
d. purificar: se empaca en una columna de cromatografía de 20 a 200mL de volumen, sílica gel malla 130-270 suspendida en éter de petróleo. Se incorpora a la columna empacada la totalidad de la mezcla de reacción., e. recuperar compuesto: se eluye la mezcla de reacción en fracciones de 5 mL con las siguientes proporciones de mezclas de éter de petróleo: éter etílico 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40; mediante cromatografía de capa fina se se identifica el compuesto de interés en las fracciones 55 a 60 obtenidas con la relación de éter de petróleo: éter etílico 60:40.
f. obtener litocoil oleato: las fracciones con el compuesto de interés se mezclan, se concentran en un evaporador centrífugo y finalmente se almacenan a - 20°C.
2. Molécula de litocoil oleato caracterizado porque es un conjugado esterificado en la posición alfa 3-hidroxi del ácido litocólico con el ácido oleico (ácido cis-9- octadecenoico).l_a molécula es un líquido oleoso amarillento con un peso molecular de 641 gr/mol y fórmula química C42H7204 Consiste de un núcleo esteroideo con cuatro anillos fusionados, tres con seis carbonos y uno con cinco, numerados como se muestra en la figura 1 b. Los carbonos 10 y 13 se encuentran metilados. En el carbono 3, el grupo hidroxilo está esterificado con el ácido oleico, un ácido graso de 18 carbonos con una instauración de isomería cis en el carbono 9'. En el carbono 17 está unido un sustituyente alquilo de 4 carbonos con una metilación en el carbono 4" y un ácido carboxílico terminal.
3. Molécula de litocoil oleato de acuerdo a reivindicación 2 caracterizada porque se obtiene a partir del proceso descrito en la reivindicación .
4. Molécula de litocoil oleato de acuerdo a reivindicación 3, caracterizada porque tiene una pureza del 95-99%.
5. Molécula de litocoil oleato de acuerdo a reivindicación 3 y 4, caracterizada por presentar la estructura de 10, 13-dimetil-3-oleoxiloxi-hexadecahidro-1 H- ciclopentafenantreno-17-il ácido pentanoico.
6. Molécula de litocoil oleato de acuerdo a reivindicación 3 y 4, caracterizada porque es un líquido oleoso amarillento de 641.03 Daltons
7. El uso de una composición que comprende como agente litocoil oleato capaz de funcionar como elicitor de péptidos antimicrobianos e interferón tipo II (interferón-γ).
8. El uso de una composición de acuerdo a reivindicación 7, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento contra tuberculosis pulmonar y extrapulmonar en todas sus formas, lepra lepromatosa, lepra tuberculoide, lepra indeterminada, dermatitis atópica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, colitis infecciosa (en general las enfermedades inflamatorias de intestinos), infecciones sistémicas, en piel, intestinos, pulmones, corazón, y/o mucosas orales y genitales por bacterias gram-negativas, gram-positivas, hongos y virus incluyendo Candida sp. , Staphylococcus sp.,
Pseudomonas sp:, Kleibsella sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp., Shigella sp.,
Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), meningitis infecciosa, diarrea del viajero
(causada por Escherichia coli), caries, choque anafiláctico y sepsis, Vibrio cholera, virus herpes simple (verrugas y fuegos), herpes genital, herpes Zoster, virus del dengue, adenovirus, virus Sendai, influenza, gripe, prevención de transmisión sexual por VIH-1 y VIH-2 e inhibición de su replicación, adyuvante de vacunas de organismos vivos, inactivados o vacunas subunitarias y recombinantes de bacterias, micobacterias, virus, protozoarios, leishmaniasis, enfermedad de Chagas, cáncer de mama, de próstata, renal, gástrico, carcinoma, leucemia mielógena crónica, sobre leucemia mielógena aguda y enfermedades crónico degenerativas en humano como diabetes tipo I y tipo II, e industria agropecuaria. Mecanismo de acción: sobreexpresión del gen catelicidina (cathelicidin, gen CAMP; precursor hCAP-18, péptido LL-37) y lo expresión de beta defensina 1 (gen DEFB1, péptido hBD-1) y/o sobreexpresión de gen IFNG.
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