WO2015049221A1

WO2015049221A1 - Verfahren zum bestimmen der mengenverhältnisse von isoformen des wachstumshormons und dessen verwendung

Info

Publication number: WO2015049221A1
Application number: PCT/EP2014/070901
Authority: WO
Inventors: André Henrion; Cristian Arsene; Dirk Schulze; Rüdiger Ohlendorf
Original assignee: Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie, dieses vertreten durch den Präsidenten der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2015-04-09
Also published as: DE102013110868A1; DE102013110868B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons (GH), insbesondere des humanen Wachstumshormons (hGH), wie dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoform des humanen Wachstumshormons 22 kDa und der Isoform 20 kDa. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht dabei auf dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des GH auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektrometrisch bestimmten Fragmenten, wobei mindestens ein GH-Fragment spezifisch für eine Isoform ist. In einem weiteren Aspekt betrifft die Anmeldung die Verwendung eines solchen Verfahrens zum Nachweis der unerlaubten Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere der leistungsfördernden Einnahme von 22 kDa-hGH. Schließlich wird ein Kit zur Bestimmung der Einnahme von GH bereitgestellt.

Description

Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons und dessen Verwendung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons (GH), insbesondere des humanen Wachstumshormons (hGH), wie dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoform des humanen Wachstumshormons 22 kDa und der Isoform 20 kDa. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht dabei auf dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des GH auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektromet- risch bestimmten Fragmenten, wobei mindestens ein GH-Fragment spezifisch für eine Isoform ist. In einem weiteren Aspekt betrifft die Anmeldung die Verwendung eines solchen Verfahrens zum Nachweis der unerlaubten Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere die leistungsfördernde Einnahme von 22 kDa-hGH. Schließlich wird ein Kit zur Bestimmung der Einnahme von GH bereitgestellt.

Stand der Technik

Es wird angenommen, dass Wachstumshormon (GH) als leistungssteigerndes Mittel weit verbreitet eingesetzt wird. Ein solcher Einsatz findet sich in allen Bereichen des Sports und betrifft nicht nur die Leistungssteigerung beim Menschen sondern auch bei Tieren, z.B. im Pferdesport. Eine Übersicht über das Doping mit Wachstumshormon im Sport gibt Baumann G. P. in Endocrine Reviews, 2012, 33(2): 155-186. Hier wird ausführlich zur Verwendung von Wachstumshormon im Sport sowie zum Nachweis des Wachstumshormons insbesondere zum Nachweis von Doping ausgeführt. So werden dort die verschiedenen Mög- lichkeiten des Nachweises einer verbotenen Einnahme von Wachstumshormon beschrieben. Kernproblem ist die Erkennung der Einnahme von Wachstumshormon bei gleichzeitig vorhandenem körpereigenem (endogenem) Wachstumshormon. Hinzu kommt, dass das Hormon pulsatil im Körper erzeugt wird, dass also kurzzeitige Spitzen in der Serumkonzentration auftreten, die jedoch inner- halb kurzer Zeit wieder abgebaut werden. Darauf wird u.a. bei R. Holt und P.H . Sönksen British Journal of Pharmacology, 2008, 154, 542-556 eingegangen. Zum Nachweis macht man sich die Tatsache zunutze, dass unabhängig von der Konzentration, das Profil oder Mengenverhältnis der Isoformen aus denen sich das Wachstumshormon zusammensetzt, erhalten bleibt. Gleichzeitig wird aber nur mit einer einzelnen Isoform gedopt, die mittels biotechnischer Synthese erhalten wird; normalerweise ist dieses die 22 kDa-hGH Isoform. Dieses hat zwangsläufig eine Änderung der Mengenverhältnisse zur Folge, die zum Dopingnachweis herangezogen werden kann. Dieses macht man sich in den Tests zu Nutze.

Gegenwärtig werden, wie von Baumann et al ., siehe oben, ausgeführt, Immuno- assays eingesetzt, um die Mengenverhältnisse zwischen den hGH-lsoformen zu bestimmen. In einem Assay wird mit einem spezifischen Antikörper das 22 kDa- hGH bestimmt in einem zweiten wird ein anderer Antikörper eingesetzt, der alle Isoformen erkennt. Aus beiden Werten wird das Verhältnis gebildet. Zur Bestätigung der Ergebnisse ist ein zusätzlicher Assay gefordert.

Die Leistungsgrenze des Methodenprinzips Antikörper-basierter Assays ergibt sich vor allem aus der begrenzten Selektivität: Es ist nicht ganz auszuschließen, dass neben dem Ziel-Analyten andere im Serum vorhandene Substanzen (Proteine) ebenfalls erkannt werden; ein typischer Kandidat ist z.B. das GHBP (growth hormone binding protein). Dieses hat in der Vergangenheit zu Problemen bei der gerichtlichen Verwertbarkeit der Analysenergebnisse geführt. Mit- tels einer massenspektrometrischen Bestimmung von Mengenverhältnissen zwischen hGH-lsoformen können in Zukunft derartige Irrtumsrisiken vermieden werden . Neben dem Wachstumshormon-Isoformen-Test gibt es einen weiteren Test. Dieser basiert auf dem Nachweis von GH-Biomarkern. Damit wird indirekt GH nachgewiesen. Als Biomarker werden z.B. IGF-1 oder P-I II-NP eingesetzt. Dabei werden diese Biomarker im Blut bestimmt und darauf aufbauend auf die Verwendung von Wachstumshormon rückgeschlossen. Es besteht hier allerdings ein Problem in dem Mangel an Spezifität und Sensitivität. Außerdem sind die zur Verfügung stehenden Assays begrenzt und es können Probleme bei der Interpretation auftreten, da die Ergebnisse alters- und geschlechtsabhängig sein können. Schließlich können andere Biomarker im Harn oder im Schweiß genutzt werden, um einen Rückschluss auf den Einsatz von Wachstumshormon zu erlauben. Allerdings treten auch hier die Probleme auf, die sich ergeben, wenn indirekte Nachweissysteme eingesetzt werden. In EP 0 949 509 wird ein Verfahren zur Messung von humanem Wachstumshormon beschrieben. Dieses Verfahren beruht auf einem immunologischen Verfahren.

Von Bailly-Chouriberry L. et al ., 2008, Anal . Chem., 80, 8340-8347 wird die Identifizierung von rekombinantem Pferdewachstumshormon im Pferdeplasma mittels LC-MS/MS beschrieben. Vor Kurzem haben Arsene C. G. et. al . in J. Mas. Spektrom., 2012, 47,1 554-1560 die hoch sensitive massenspektrometri- sche Quantifizierung von 22 kDa-hGH im Serum durch amphiphile Peptidkonju- gation beschrieben. Arsene C. G., et al ., 2010, Anal. Biochem., 401 , 228-235 beschreiben die Quantifizierung von Wachstumshormon im Serum durch Isoto- penverdünnungs-Massenspektrometrie (ID-MS). Hierin wird die 22 kDa-hGH Isoform quantifiziert, in dem diese Form zunächst mit Trypsin proteolysiert wird. Anschließend erfolgt die Quantifizierung der erhaltenen Peptidfragmente mittels LC-MS/MS unter Verwendung von isotopenmarkierten internen Standards, die in definierter Menge zur Probe zugegeben werden. Es zeigte sich, dass dieses System für eine Quantifizierung von Wachstumshormon im Serum geeignet ist. Dabei wird ein tryptischer Verdau der 22 kDa-hGH Form beschrieben, der zur Ausbildung eines als T6 bezeichneten Peptidfragmentes und eines als T12 bezeichneten Peptidfragmentes führt. Es werden entsprechende Präparationen des 22 kDa-hGH oder dessen Fragmente zu humanem Serum hinzugefügt und anschließend bestimmt. Die gegenwärtig eingesetzten Verfahren, insbesondere die von der WADA gebilligten Verfahren, verwenden zur Erkennung und Quantifizierung der Isoformen Antikörper-basierte Messprinzipien, jedoch keine Massenspektrometrie. Wie ausgeführt, sind solche Antikörper-basierten Messprinzipien, also immunologische Messsysteme, anfällig für Kreuzreaktivitäten und erfordern die Durchfüh- rung verschiedener Tests. Einen massenspektrometrischen Ansatz zum Nachweis der 22 kDa und 20 kDa Isoformen oder anderer Isoformen des Menschen oder bei anderen Tieren gab es bislang nicht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Verfahren, die ein Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen von Wachstumshormon, insbesondere von humanem Wachstumshormon erlauben. Diese Verfahren dienen insbesondere dazu, einen Nachweis bei unerlaubter Einnahme von Wachstumshormon, wie humanem Wachstumshormon, zu führen. Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von mindestens zwei Isoformen des Wachstumshormons (GH), wobei sich diese mindestens zwei Isoformen in ihrer Masse unterscheiden, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Probe, die GH enthält; Behandeln dieser Probe zur Aufspaltung des GH in GH- Fragmente, wobei mindestens eines der durch Aufspaltung erhaltenen GH-Fragmente spezifisch für nur eine Isoform ist;

gegebenenfalls Anreicherung und/oder gegebenenfalls Isolierung der erhaltenen GH-Fragmente des Schritts b);

Bestimmen der Mengen der GH-Fragmente in der Probe mittels eines Massenspektrometers; und

Bestimmen der Mengenverhältnisse der Wachstumshormon- Isoformen auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektromet- risch bestimmten GH-Fragmenten, wobei mindestens ein GH- Fragment hiervon spezifisch für nur eine Isoform ist.

Der Ausdruck„Isoformen des Wachstumshormons" bezieht sich auf verschiede- ne Formen des Wachstumshormonproteins in der jeweiligen Spezies. Diese Formen können sowohl Isoformen betreffen, die sich durch unterschiedliches Splicen der codierenden Nukleinsäure ergeben, als auch durch Modifikationen auf Aminosäureebene einschließlich posttranslationalen Veränderungen. Der Ausdruck„Isoformen" wie er vorliegend verwendet wird, ist dabei im molekular- biologischen Sinne zu verstehen, derart, dass die Version des Gens, der RNA oder des Proteins mit leichten bis größeren Unterschieden auftritt. Ursache sind im Wesentlichen Spleißvarianten von RNA- und Protein-Isoformen. Weitere Isoformen ergeben sich durch posttranslationale Modifikation. Bevorzugt handelt es sich bei den Isoformen um solche, die Spleißvarianten der RNA bzw. des Pro- teins sind. Isoformen sind erfindungsgemäß keine isotopenmarkierte Formen des identischen Proteins, z.B. ein 22 kDA GH und ein ¹⁵N-22 kDa-GH . Beispielhaft seien hier die verschiedenen Isoformen des humanen Wachstumshormons genannt, z.B. die 22 kDa-hGH Isoform oder die 20 kDa-hGH Isoform als Hauptvertreter des humanen Wachstumshormons. Entsprechende Isoformen sind in den einschlägigen Datenbanken dokumentiert. Eine andere Form von Isoformen bezieht sich auf Isoformen des Wachstumshormons, wie sie z.B. bei Pferd und Rind beschrieben sind. Das rekombinante Pferdewachstumshormon (reGH) unterscheidet sich von dem nativen Pferdewachstumshormon (eGH) durch ein zu- sätzliches Methionin am N-Terminus. Das heißt, eine Isoform des Pferdewachstumshormons ist das reGH, während die andere Isoform das natürliche eGH ist. Beim Rind unterscheidet sich das rekombinante Wachstumshormon vom natürlichen Wachstumshormon durch den Austausch eines Alanins mit Methionin am N-Terminus.

Unter dem Ausdruck„Mengenverhältnisse" wird vorliegend auch eine solche Situation verstanden, wo ein Partner der beiden Verbindungen, die einander ins Verhältnis gesetzt werden, abwesend ist. Das heißt, das Mengenverhältnis kann entsprechend derart sein, dass nur eine der Isoformen vorliegt.

Der Ausdruck„durch Aufspaltung erhaltene GH-Fragmente spezifisch für nur eine Isoform" bzw.„bei der Masse von mindestens zwei massenspektrometrisch bestimmten GH-Fragmenten, wobei mindestens ein GH-Fragment hiervon spezi- fisch für nur eine Isoform ist" bedeutet, dass dieses GH-Fragment, das massenspektrometrisch unterscheidbar von anderen Fragmenten ist, nur durch Aufspaltung der Isoform des Wachstumshormons entsteht wenn eine bestimmte Isoform vorhanden ist, während dieses Fragment nicht bei Aufspaltung anderer Isoformen auftritt. D.h . auch, dass es sich erfindungsgemäß bei den Isoformen nicht um solche handelt, die sich lediglich durch Verwendung von Isotopen unterscheiden.

Unter dem Ausdruck„auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen" wird vorliegend verstanden, dass man die Integrationsfläche unter dem massenspektrometrischen Detektionssignal eines Fragmentes ins

Verhältnis setzt zur Integrationsfläche des Signals eines anderen Fragmentes.

Dabei ist eines der beiden Fragmente Isoform-spezifisch. Das zweite Fragment repräsentiert entweder spezifisch eine andere Isoform oder alle GH-Isoformen.

Um Unterschiede in der Detektions-Response der zu bestimmenden Fragmente zu kompensieren, können zur Verbesserung der Genauigkeit der Quantifizierung isotopenmarkierte interne Standards eingesetzt werden. Unter dem Ausdruck„22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da" wird vorliegend ein Protein verstanden, wie es unter der Genbank Hinterlegungsnummer 1 1 13438.1 , Uniprot Nr. P01241 -1 ausgeführt ist. Unter dem Ausdruck„20 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da" wird ein Protein verstanden mit der Hinterlegungsnummer Uniprot Nr.

P01241 -2.

Unter dem Ausdruck„Aufspaltung des GH in GH-Fragmente" wird vorliegend verstanden, dass das Ausgangs-GH derart verändert wird, dass ein Rest abge- spalten wird. Dieser Rest umfasst üblicherweise ein Peptidfragment, kann aber auch eine andere durch posttranslationale Modifikation vorliegende Gruppe betreffen.

Vorliegend haben die Erfinder festgestellt, dass mit Hilfe des erfindungsgemä- ßen Verfahrens sehr sensitiv und mit hoher Spezifität bestimmt werden kann, ob die Mengenverhältnisse von mindestens zwei Isoformen des Wachstumshormons in einer Probe den natürlichen Mengenverhältnissen der Isoformen des Wachstumshormons entsprechen oder nicht. Die massenspektrometrische Bestimmung der GH-Fragmente ist durch einen Vergleich der Intensitäten der Sig- nale für die beiden GH-Fragmente dazu geeignet, das Mengenverhältnis dieser beiden Fragmente mit hoher Spezifität zu bestimmen. Im Vergleich zu bisher eingesetzten biologischen Verfahren ist die Gefahr einer Kreuzreaktivität ausgeschlossen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere dazu, die Mengenverhältnisse der Isoformen des humanen GH zu bestimmen. Das humane

Wachstumshormon (hGH) ist ein beliebtes Mittel, die Leistungsfähigkeit bei Sportlern zu fördern. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Mengenverhältnisse der Isoformen des hGH bestimmt werden, insbesondere der Hauptisoformen, nämlich der 22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da und der weiteren Isoform 20 kDa-hGH mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da. Es existieren weitere kleinere Isoformen des humanen Wachstumshormons. Erfindungsgemäß kann dabei in einer Ausführungs- form das Mengenverhältnis einer der kleineren Isoformen oder der 20 kDa-hGH Isoform mit der 22 kDa-hGH Isoform bestimmt werden. Derzeit wird insbesondere die 22 kDa-hGH Isoform zur Leistungssteigerung eingesetzt. Das heißt, die Validität des Verfahrens im Vergleich zu bisherigen von der WADA gebilligten Verfahren, die auf immunologischen Tests basieren, ist erhöht bei gleich bleibender Sensitivität.

Durch Bestimmung der GH-Fragmente nach Aufspaltung kann die Detektions- schwelle gesenkt und damit die Sensitivität erhöht werden unter Beibehaltung der Spezifität der Messung.

Insbesondere erfolgt die Bestimmung der Mengenverhältnisse der Isoformen des Wachstumshormons auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen mittels eines Massenspektrometers, wobei das humane Wachstumshormon und hier die bestimmten Fragmente derart ausgewählt sind, dass ein Fragment spezifisch für die 22 kDa-hGH Isoform ist während ein mindestens weiteres Fragment spezifisch für eine weitere Isoform ist und/oder wobei eine weitere Isoform alle möglichen Isoformen des humanen Wachstumshormons umfasst.

In einer Ausführungsform richtet sich das Verfahren daher auf das Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des humanen Wachstumshormons hGH, wobei die Isoformen zumindest die 22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da umfasst und bevorzugt die mindestens eine weitere Isoform die 20 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da ist.

Da in der Praxis gegenwärtig zum Doping, d.h. zur Leistungssteigerung im Wesentlichen die rekombinante 22 kDa Isoform des hGH eingesetzt wird, verän- dern sich die Mengenverhältnisse dieser Isoform zu den weiteren Isoformen, wie der 20 kDa-hGH Isoform. Das heißt, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Nachweis einer unerlaubten Einnahme des GH insbesondere des hGH möglich. Dieses gilt genauso für die unerlaubte Gabe von rekombinantem Wachstumshormon bei Pferden oder Rindern. Wie ausgeführt, unterscheidet sich beim Pferd das rekombinante Wachstumshormon von dem natürlichen Wachstumshormon durch das Vorhandensein eines zusätzlichen Methionins am N-Terminus. Auch hier erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Gabe von rekombinantem Pferdewachstumshormon zu bestimmen, indem erfindungsgemäß die Mengenverhältnisse von Fragmenten der Isoformen bestimmt werden. Gleiches gilt für das Rind, wo sich die rekombinante Form von der natürlichen Form durch den Austausch eines Alanins durch ein Methionin am N-Terminus unterscheidet.

Für das humane Wachstumshormon sind verschiedene Isoformen beschrieben, wie in Baumann et al ., supra, ausgeführt. Wie genannt, ist eine wesentliche Isoform die 22 kDa-hGH, die zweite, die 20 kDa-hGH Isoform. Die Primärstruktur des 22 kDa humanen Wachstumshormons besteht aus 191 Aminosäuren, in der 20 kDa Isoform sind 15 Aminosäuren nicht vorhanden. Die Sequenz des humanen Wachstumshormons ist in SEQ ID Nr. 4 dargestellt. SEQ ID Nr. 5 entspricht der 20 kDa Isoform.

Die massenspektrometrische Unterscheidung dieser beiden Isoformen ist mög- lieh, allerdings ist aufgrund des großen Molekulargewichtes der beiden Isoformen (20 kDa bzw. 22 kDa) der Nachweis nicht sensitiv genug.

Erfindungsgemäß erfolgt daher zuvor eine Aufspaltung des Wachstumshormons, wie eine Aufspaltung des humanen Wachstumshormons z.B. enzymatisch oder chemisch, derart, dass die entsprechenden Fragmente massenspektrometrisch detektiert und gegebenenfalls quantifiziert werden.

In der Figur 1 sind die Sequenzen der Isoformen 22 kDa-hGH und 20 kDa-hGH des humanen Wachstumshormons dargestellt zusammen mit den Spaltungsstel- len für die Protease Trypsin. Ebenfalls dargestellt sind einige Fragmente, die nach Trypsin-Verdau erhalten werden, nämlich das als T6 bezeichnete Fragment, das für die 22 kDa Isoform spezifisch ist, das als T4 bezeichnete Fragment, das für die 20 kDa Isoform spezifisch ist, sowie das Fragment T12, das sowohl aus der 20 kDa als auch aus der 22 kDa Isoform wie auch mit den meisten anderen Isoformen erhalten wird und somit das gesamte Wachstumshormon widerspiegelt. Die Aufspaltung des Wachstumshormons ist bevorzugt enzymatisch oder chemisch. Dem Fachmann sind geeignete Mittel zur Aufspaltung bekannt. Eine en- zymatische Aufspaltung kann mit üblichen bekannten Enzymen, wie Proteasen erfolgen. Beispielhaft seien hier die Proteasen Trypsin, Chymotrypsin, V-8, Lys- C, Asp-N, Arg-C, Asp-C, Proteinase K, Pepsin, Thermolysin genannt. Alternativ kann eine chemische Spaltung der Proteine durchgeführt werden, z.B. mittels Bromcyan, 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-Bromindolenin (BNPS-Skatol), N-Bromsuccinimid, N-Chlor-Succinimid, lodosobenzoesäure.

In einer Ausführungsform kann dabei das erfindungsgemäße Verfahren weiter- hin den Schritt des Vergleichs des in der Probe bestimmten Mengenverhältnisses der Wachstumshormonisoformen mit einem Mengenverhältnis- Referenzwertebereich umfassen. Dieser Mengenverhältnis- Referenzwertebereich kann einer sein, in dem die Werte einer Gruppe zusam- mengefasst sind, die dem Wachstumshormon zugeführt wurde. Ein anderer Re- ferenzwertbereich kann dadurch erhalten werden, dass eine Gruppe analysiert wird, der eben kein Wachstumshormon zugeführt wurde.

Mit Hilfe des Vergleichs mit einem Mengenverhältnis-Referenzwertebereich ist es möglich zu bestimmen, ob Wachstumshormon zugeführt wurde.

Hierdurch ist insbesondere die unerlaubte Einnahme von Wachstumshormon nachweisbar, wie eine verbotene Leistungssteigerung bei Sportlern (Doping).

Die Probe, in der das Mengenverhältnis der Isoformen des Wachstumshormons bestimmt wird, kann eine biologische Probe sein, wie Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum. Die Probe wird isoliert bereitgestellt. Bei dieser Probe kann es sich um eine handeln, die vorher einem Objekt entnommen wurde. Die Probe kann dabei eine sein, die unmittelbar vorher der Person entnommen wurde, oder eine, die zwischengelagert wurde, z.B. durch Lagerung im Tieftemperaturbereich.

In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren eines, wobei die Aufspaltung des Wachstumshormons mit Trypsin erfolgt und, im Falle des humanen Wachstumshormons, die erhaltenen Fragmente die Fragmente T4 gemäß SEQ ID Nr. 1 , T6 gemäß SEQ ID Nr. 2 und T1 2, gemäß SEQ ID Nr. 3, enthalten. Hierbei ist das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 1 spezifisch für die 20 kDa Isoform, das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 2 spezifisch für die 22 kDa Isoform und das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 3 steht für die wesentlichen hGH-lsoformen.

Zur Erhöhung der Spezifität und zur Verbesserung der Quantifizierung der Fragmente wird isotopenmarkiertes Wachstumshormon, insbesondere isoto- penmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopenmarkiertes 20 kDa-hGH und/oder einzelne isotopenmarkierte bei der Aufbereitung erfindungsgemäß erhältliche GH-Fragmente zugegeben. Diese sind z.B. ¹³C oder ¹⁵N isotopenmarkierte Fragmente, insbesondere isotopenmarkierte hGH-Fragmente gemäß SEQ ID Nr. 1 , SEQ ID Nr. 2 und/oder SEQ ID Nr. 3. Diese können als interner Standard der Probe zugesetzt werden, um so die Genauigkeit der Bestimmung von GH- Fragmenten aus den Intensitätsverhältnissen der Signale zu verbessern.

Weiterhin kann parallel zu der zu untersuchenden Probe eine Kalibrierprobe mit Wachstumshormon und/oder Fragmenten hiervon dem erfindungsgemäßen Ver- fahren unterworfen werden, um das Massenspektrometer zu kalibrieren. Eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird weiter unten unter Bezug auf die Figur 2 näher erläutert.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, dass die Fragmente zur Ver- besserung der Sensitivität bei der massenspektrometrischen Quantifizierung einen Tag aufweisen, d.h., dass eine Markierung vorliegt, die die Sensitivität erhöht. Entsprechend geeignete Markierungen sind z.B. in Arsene, C. G. et al., J. Mas. Spektrom., 2012, 47,1554 bis 1560 beschrieben, z.B. ein Konjugat er- hältlich mit einem N-(3-iodopropyl)-N,N,N-dimethyloctylammoniumiodid. Das heißt, die Fragmente können durch chemische Modifikation modifiziert werden. Vorliegend werden die Ausdrücke„Tag" und„Marker" synonym verwendet. Die Erfindung betrifft somit insbesondere auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis der Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere der unerlaubten Einnahme von Wachstumshormon zur Leistungssteigerung, z.B. bei Mensch oder Tier, wie Pferden. Das Verfahren ist insbesondere geeignet zur Analyse von Doping zur Leistungssteigerung bei Sportlern.

Schließlich wird erfindungsgemäß ein Kit zur Bestimmung der Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere von humanem Wachstumshormon bereitgestellt, dieses Kit umfasst isotopenmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopen- markiertes 20 kDa-hGH und/oder isotopenmarkierte hGH-Fragmente hiervon; Mittel zur Aufspaltung des Wachstumshormons, insbesondere des hGH sowie ggf. Mittel zur Aufreinigung der Fragmente. Vorliegend wird unter dem Ausdruck "Kit" insbesondere ein Probenaufbereitungssystem verstanden. Das Probenaufbereitungssystem erlaubt die Bereitstellung von aufbereiteten Proben zur Bestimmung der Mengenverhältnisse von Isoformen des GH, insbesondere des hGH, z.B. mittels massenspektrometrischer Analyseverfahren. Dieses erfindungsgemäße Kit kann insbesondere angesetzt werden, um die massenspekt- rometrische Analyse des Wachstumshormons zu erlauben, z.B. im Bereich der Untersuchung der unerlaubten Leistungssteigerung bei Sportlern. Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne dass diese hierauf beschränkt ist.

Beispiele In der Figur 2 ist ein allgemeines Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons, vorliegend des humanen Wachstumshormons an den Beispielen der Fragmente T4, T1 2 und T6 dargestellt. In der Figur 2 wird ein Ablaufplan des Verfahrens zur Bestinnnnung des humanen Wachstumshormons mittels ID-MS ausgeführt. Hierbei wird eine zu analysierende Probe und eine Kalibrierlösung mit jeweils 500 μΙ Volumen verwendet. Zu beiden wird eine Mischung von isotopenmarkier- tem U-¹⁵N 22 kDa-hGH und U-¹⁵N 20 kDa-hGH als interne Standards in einem Verhältnis von 9:1 hinzugefügt. Anstatt U-¹⁵N 20 kDa-hGH kann man auch iso- topenmarkiertes T4 verwenden. Die Probe wie auch die Kalibrierprobe werden anschließend der Protolyse (Trypsinierung) unterworfen, um die entsprechenden Fragmente: T4, T6 und T12 neben anderen Fragmenten zu erhalten. Anschließend werden die Probe und die Kalibrierlösung identisch behandelt, indem sie einer RP-LC Aufreinigung (pH 2) mit einer sich anschließenden SCX-LC oder RP-LC Aufreinigung (zweimal) (1 . pH 2 und 2. pH 8) unterzogen werden. Die erhaltenen Fragmente werden wie beschrieben¹ mit N-(3-iodopropyl)-N,N- dimethyloctylammoniumiodid (IPDOA-iodid) konjugiert. Anschließend werden die so konjugierten Fragmente mittels RP-LC-MS/MS analysiert.

Beispiel 1

Um möglichst genaue Stoffmengenverhältnisse der Isoformen zu bestimmen, wird zur Quantifizierung der proteolytischen Fragmente die Isotopenverdün- nungs-Massenspektrometrie (ID-MS), wie kürzlich für die Bestimmung von 22 kDa-hGH beschrieben, eingesetzt. Für die Proteolyse des gesamten Serums wird vorliegend das Enzym Trypsin verwendet. Als Kaiibrator für die Quantifizie- rung wird gentechnisch hergestelltes 22 kDa GH (WHO 2. IS 98/574) in wässri- ger Lösung verwendet. Die Herstellung der Referenzlösung erfolgt nach den Angaben des Herstellers (NIBSC). Es wird eine weitere Referenzlösung hergestellt, die ebenfalls gentechnisch hergestelltes 20 kDa-GH enthält (Feidan, Quebec, Kanada). Die jeweilige GH-Konzentration dieser Referenzlösungen wird, wie beschrieben ³, mittels ID-MS-basierter Aminosäureanalyse bestimmt.

Parallel zu einer Serum-Probe mit einem typischen Volumen von ca. 500 μΙ_, wird eine Kalibriermischung hergestellt und gemessen. Dazu wird ein aliquoter Teil (500 [iL) von kommerziell erhältl ichem GH-abgereichertem Serum mit beiden Referenzlösungen aufgestockt. Die Konzentration an 20 kDa-GH und 22 kDa-GH wird in der Kalibriermischung entsprechend auf 0.1 und auf 0.9 ng/mL eingestellt. Die Probe und die Kalibriermischung wird mit entsprechenden Men- gen an isotopenmarkiertem 22 kDa GH und 20 kDa GH und/oder einzelnen iso- topenmarkierten tryptischen Fragmenten (Peptide) aufgestockt. Die isotopen- markierten Peptide werden durch Festphasen-Synthese hergestellt, aufgereinigt und als wässrige Lösungen bekannter Konzentration zum Aufstocken von Probe und Kalibriermischung benutzt. Die isotopenmarkierten Proteine (U-¹⁵N 22 kDa GH und U-¹⁵N 20 kDa GH) und einzelne isotopenmarkierte tryptische Peptide werden als interne Standards zur Quantifizierung einzelner Isoformen verwendet. Die Konzentration der internen Standards wird sowohl in der Probe als auch in der Kalibriermischung auf 0.1 ng/mL an U-¹⁵N 20 kDa GH oder an isotopenmarkiertem T4 und auf 0.9 ng/mL an U-¹⁵N 22 kDa-GH eingestellt. Probe und Kalibriermischung werden einer Proteolyse mit Trypsin unterzogen . Die tryptischen Fragmente: T4 (isotopenmarkiertes T4), T6 (isotopenmarkiertes T6) und T1 2 (isotopenmarkiertes T1 2) werden mittels reversed-phase (RP)- und anschl ießender strong cation exchange (SCX)-Flüssigchromatographie aus der Matrix isoliert. Alternativ zur SCX-Chromatograph ie kann in der zweiten Reini- gungsstufe auch eine RP-Flüssigchromatographie im basischen pH-Bereich (pH > 8) durchgeführt werden . Zur Isol ierung einzelner GH-Fragmente werden Fraktionen, die diese enthalten, entsprechend der Elutionszeiten der Fragmente automatisch gesammelt. Die Elutionszeiten der einzelnen tryptischen Fragmente T4, T6 und T1 2 werden zuvor durch Messung der Referenzmaterial ien ermittelt. Das isol ierte T4 und T6 wird zur Steigerung der Messempfindl ichkeit wie beschrieben¹ mit /V-(3-iodopropyl)-/V,/V,/\/-d imethyloctylammonium iodid (I PDOA- iodid) konjugiert. In Abbildung 3 ist der gesamte Ablauf der Bestimmung von GH skizziert. Messung mit LC-MS/MS

Die Messung von T4, T6 und T1 2 erfolgt typischerweise mittels (RP)-LC/MS-MS an einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen (1 200 Infin ity Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), der gekoppelt ist an einem Velos Pro- Orbitrap-ELITE Hybrid-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany). Zur Elution der Peptide wird eine Gradientenmischung A/B (A: Wasser, 0.1 % Ameisensäure, B: Acetonitril, 0.1 % Ameisensäure) verwendet mit 0% B (5% B für T4 und T6) innerhalb 0-3 min, 0% B bzw. 5% B für T4 und T6 zu 80% B innerhalb 37 min, 80% B für 5 min. Als Flüssigchromatographie-Säule wird z.B. die Discovery Bio Widepore C18 RP-Säule (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) in den Dimensionen 2x150 mm; 3 μιτι; 300 A, verwendet. Die Flussrate beträgt 0.2 mL/min. Das Orbitrap-Massenspektrometer wird auf eine Massenauflösung von 60000 eingestellt. Die Parameter der ESI-Quelle werden auf ma- ximale Signalintensität hin optimiert. In der ESI-Quelle wird eine Sprayer- Spannung von 4.2 kV und eine Trockengas (N2)-Temperatur von 270 °C eingestellt. Für T12 (isotopenmarkiertes T12) werden die Übergänge m/z

387.19^531 .25 (392.19^539.25) gemessen. Für isotopenmarkiertes T4, dass durch Proteolyse aus U-¹⁵N 20 kDa GH entsteht, wird der Übergang m/z

928.22>681 .347 gemessen. Für T6 (isotopenmarkiertes T6) werden die Übergänge m/z 939.16^671 .347 oder 1031 .56 (949.16^681 .347 oder 1042.56) gemessen. Für die Fragmentierung im Massenspektrometer im„collision induced dissociation" (CID)-Modus wird für T6 eine Kollisionsenergie von 35 eV eingestellt. Für T4 und T12 wird die Kollisionsenergie auf 20 eV reduziert.

Ergebnisse

In der Abbildung 3 sind die Spektren der Fragmentionen von T4, T6 und T12 dargestellt. Die Fragmentionen wurden durch CID-Fragmentierung im Velos Pro- Orbitrap-ELITE Hybrid-Massenspektrometer aus den selektierten Vorläufer- Ionen generiert.

In den Abbildungen 4, 5 und 6 sind (Beispiel)-Ionenstromchromatogramme dargestellt, die für die Quantifizierung von T4, T6 und T12 mit der Auswertungs- Software Xcalibur™2.2 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) aus den Messdaten generiert wurden. Die Daten stammen aus der Messung einer Probe, bestehend aus GH-abgereichertem Serum, 20-, 22-kDa-GH und den internen Standards. Die Probe wurde vor der Messung am Massenspektrometer der gesamten Probenvorbereitung unterzogen. Die Figuren zeigen dabei:

In der Figur 1 sind die Sequenzen der Isoformen 22 kDa-hGH und 20 kDa-hGH des humanen Wachstumshormons dargestellt zusammen mit den Spaltungsstel- len für die Protease Trypsin. Ebenfalls dargestellt sind einige Fragmente, die nach einer Proteolyse mit Trypsin erhalten werden, nämlich das als T6 bezeichnete Fragment, das für die 22 kDa Isoform spezifisch ist, das als T4 bezeichnete Fragment, das für die 20 kDa Isoform spezifisch ist, sowie das Fragment T12, das sowohl aus der 20 kDa als auch aus der 22 kDa Isoform wie auch mit den meisten anderen Isoformen erhalten wird und somit das gesamte Wachstumshormon widerspiegelt.

Figur 2 stellt den Ablaufplan des Verfahrens zur Bestimmung von GH mittels ID- MS dar. GH wird proteolytisch mit Hilfe des Enzyms Trypsin gespalten. GH- repräsentierende Fragmente T4, T6 und T12 (hier als Beispielfragmente ausgewählt) werden anstelle intakter Proteine quantifiziert. Als Referenzmaterialien werden 22 kDa GH (WHO IS 98/574) und 20 kDa GH in wässrigen Lösungen bekannter Konzentrationen verwendet. Gentechnisch hergestelltes U-¹⁵N 22 kDa GH, U-¹⁵N 20 kDa GH und isotopenmarkiertes T4 werden als interne Stan- dards verwendet. T4 (isotopenmarkiertes T4), T6 (isotopenmarkiertes T6) und T12 (isotopenmarkiertes T12) werden mittels semipräparativer RP- Flüssigchromatographie (pH 2) gefolgt von SCX- oder RP- Flüssigchromatographie (letztere bei pH 8) isoliert und mit LC-MS/MS gemessen^{1 2}.

Figur 3 zeigt Fragmentionenspektren für die tryptischen Peptide T4 (A), T6 (B), und T12 (C). Die Peptide wurden jeweils im„collision-induced dissociation" (CID)-Modus im Velos Pro-Orbitrap ELITE Hybrid-Massenspektrometer fragmentiert.

Figur 4 zeigt die LC-MS/MS-Response für T12 (isotopenmarkiertes T12). Die lonenstrom-Chromatogramme wurden für Analyt-spezifische MS/MS- Übergänge aufgenommen. Figur 5 zeigt die LC-MS/MS-Response für T4 (isotopenmarkiertes T4). Die lo- nenstrom-Chromatogrannnne wurden für Analyt-spezifische MS/MS- Übergänge aufgenommen.

Figur 6 zeigt die LC-MS/MS-Response für T6 (isotopenmarkiertes T6). Die lo- nenstrom-Chromatogramme wurden für Analyt-spezifische MS/MS- Übergänge aufgenommen. 1. Arsene CG., Schulze D., Kratzsch J., Henrion A., J. Mass Spectrom.47: 1554-

1560, 2012

2. Arsene CG., Henrion A., Diekmann N., Manolopoulou J., Bidlingmaier M., Anal. Biochem. 401 :228-235, 2010

3. Arsene CG., Ohlendorf, R., Burkitt, W., Pritchard, C, Henrion, A., O Connor, G., Bunk, D. M., Güttier, B., Anal. Chem. 80: 4154-4160, 2008.

Claims

Patentansprüche:

Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von mindestens zwei Isoformen des Wachstumshormons (GH), wobei sich diese mindestens zwei Isoformen in ihrer Masse unterscheiden, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Probe, die GH enthält;

b) Behandeln dieser Probe zur Aufspaltung des GH in GH- Fragmente, wobei mindestens eines der durch Aufspaltung erhaltenen GH-Fragmente spezifisch für nur eine Isoform ist;

c) gegebenenfalls Anreicherung und/oder gegebenenfalls Isolierung der erhaltenen GH-Fragmente des Schritts b);

d) Bestimmen der Mengen der GH-Fragmente in der Probe mittels eines Massenspektrometers; und

e) Bestimmen der Mengenverhältnisse der Wachstumshormon- Isoformen auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektromet- risch bestimmten GH-Fragmenten, wobei mindestens ein GH- Fragment hiervon spezifisch für nur eine Isoform ist.

Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des GH nach Anspruch 1 , wobei das GH das humane Wachstumshormon (hGH) ist und die Isoformen zumindest die 22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da umfasst und bevorzugt die mindestens eine weitere Isoform die 20 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei dieses Verfahren zum Nachweis der unerlaubten Einnahme des GH dient. 4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Probe eine biologische Probe, wie Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum ist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aufspaltung des GH enzymatisch oder chemisch erfolgt.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren zur Bestimmung der Mengenverhältnisse, insbesondere das Verfahren zum Bestimmen der Einnahme des humanen Wachstumshormons weiterhin den Schritt des Vergleichs des in der Probe bestimmten Mengenverhältnisses der Wachstumshormon-Isoformen gemäß Schritt e) mit einem Mengenverhältnis-Referenzwertebereich umfasst.

Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Referenzwertebereich einem entspricht von Individuen, die kein GH genommen haben und/oder Individuen, die GH genommen haben.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe gemäß Schritt a) isotopenmarkiertes hGH, insbesondere isotopenmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopenmarkiertes 20 kDa-hGH und/oder einzelne isotopenmarkierte bei der Aufspaltung gemäß Schritt b) erhaltbare hGH Fragmente zugegeben wird.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei neben der Probe eine Kalibrierprobe mit GH und/oder Fragmenten des GH den Schritten a) bis e) unterworfen wird, um das Massenspektrometer zu kalibrieren.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Isolierung de erhaltenen GH-Fragmente mittels Flüssigchromatographie, insbesondere reversed-phase-Flüssigchromatographie erfolgt.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die massenspekt rometrische Bestimmung im Falle des GH nach dem Prinzip der Isotopen- verdünnungs-Massenspektrometrie (ID-MS) erfolgt.

12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aufspaltung des GH mit Trypsin erfolgt, und im Falle des hGHs die erhaltenen hGH- Fragmente die hGH-Fragmente gemäß SEQ ID Nr. 1 (T4), SEQ ID Nr. 2 (T6) und SEQ ID Nr. 3 (T12) umfassen können, wobei das hGH-Fragment gemäß SEG ID Nr. 1 spezifisch für die 20 kDa Isoform, das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 2 spezifisch für die 22 kDa Isoform und das hGH- Fragment gemäß SEQ ID Nr. 3 für alle hGH Isoformen ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1 1 , wobei ¹³C und/oder ¹⁵N isotopenmarkierte hGH-Fragmente insbesondere isotopenmarkierte hGH-Fragmente gemäß

SEQ ID Nr. 1 , SEQ ID Nr. 2 und/oder SEQ ID Nr. 3, als interner Standard hinzugefügt werden.

14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die entstandenen GH-Fragmente mit einem Tag konjugiert sind, insbesondere mit /V-(3-iodopropyl)-/V,/V,/\/-dimethyloctylammoniumiodid konjugiert sind.

15. Kit zur Bestimmung der Einnahme von hGH umfassend isotopenmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopenmarkiertes 20 kDa-hGH und/oder isotopenmarkierte hGH-Fragmente hiervon; Mittel zur Aufspaltung des hGH und ggf. Mittel zur Aufreinigung der Fragmente.

16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zum

Nachweis der unerlaubten Einnahme von GH in der Dopinganalyse.