WO2015049221A1 - Verfahren zum bestimmen der mengenverhältnisse von isoformen des wachstumshormons und dessen verwendung - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for determining the proportions of growth hormone (GH) isoforms, particularly human growth hormone (hGH), such as the determination of the ratios of the human growth hormone isoform 22 kDa and the isoform 20 kDa.
- the method according to the invention is based on the determination of the quantitative ratios of the isoforms of the GH on the basis of the intensity ratios of the signals of the ions in the masses of at least two mass-spectrometrically determined fragments, wherein at least one GH fragment is specific for an isoform.
- the application relates to the use of such a method for detecting the unauthorized ingestion of growth hormone, in particular the performance-enhancing intake of 22 kDa hGH.
- a kit will be provided to determine the intake of GH.
- growth hormone is widely used as a performance enhancing agent.
- Such an application is found in all areas of sport and affects not only the increase in performance in humans but also in animals, for example in equestrian sports.
- the use of growth hormone in sports as well as for the detection of growth hormone in particular for the detection of doping is detailed.
- the core problem is the recognition of the growth hormone intake with simultaneous endogenous growth hormone.
- the hormone is produced pulsatilely in the body, so that short-term peaks in the serum concentration occur, which are, however, degraded within a short time.
- This is used by R. Holt and PH. Sönksen British Journal of Pharmacology, 2008, 154, 542-556.
- doping takes place only with a single isoform, which is obtained by means of biotechnical synthesis; usually this is the 22 kDa hGH isoform. This inevitably leads to a change in the proportions that can be used for proof of doping. This one makes use of in the tests.
- immunoassays are used to determine the proportions between the hGH isoforms.
- a specific antibody is used to determine the 22 kDaHGH and in a second, another antibody is used to recognize all isoforms. From both values, the ratio is formed. To confirm the results, an additional assay is required.
- the performance limit of the method principle of antibody-based assays results in particular from the limited selectivity: it can not be completely ruled out that other substances (proteins) present in the serum besides the target analyte are also recognized; A typical candidate is eg the GHBP (growth hormone binding protein).
- GHBP growth hormone binding protein
- biomarkers are determined in the blood and based on the conclusion of the use of growth hormone inferred. However, there is a problem here in the lack of specificity and sensitivity. In addition, the available assays are limited and there may be problems with interpretation, as the results may be age and gender dependent. Finally, other biomarkers can be used in the urine or in sweat, to allow a conclusion on the use of growth hormone. However, the problems that arise when indirect detection systems are used also appear here.
- EP 0 949 509 describes a method for measuring human growth hormone. This method is based on an immunological method.
- Bailly-Chouriberry L. et al., 2008, Anal. Chem., 80, 8340-8347 describes the identification of recombinant horse growth hormone in equine plasma by LC-MS / MS.
- Arsene CG et. al. in J. Mas. Spektrom., 2012, 47,1 554-1560 describes the highly sensitive mass spectrometric quantification of 22 kDa-hGH in serum by amphiphilic peptide conjugation.
- Arsene CG, et al., 2010, Anal. Biochem., 401, 228-235 describe the quantitation of growth hormone in serum by isotope dilution mass spectrometry (ID-MS).
- the 22 kDa hGH isoform is quantified in which this form is first proteolysiert with trypsin. Subsequently, the quantification of the resulting peptide fragments by means of LC-MS / MS using isotopically labeled internal standards added to the sample in a defined amount. It was found that this system is suitable for quantification of growth hormone in serum.
- a tryptic digest of the 22 kDa hGH form is described which results in the formation of a peptide fragment designated T6 and a peptide fragment designated T12. Appropriate preparations of the 22 kDa hGH or its fragments are added to human serum and subsequently determined.
- these methods serve to provide evidence of unauthorized ingestion of growth hormone, such as human growth hormone.
- the present invention relates in a first aspect to a method for determining the proportions of at least two isoforms of growth hormone (GH), wherein these differ in their mass at least two isoforms, comprising the steps:
- step b) if appropriate, enrichment and / or optionally isolation of the resulting GH fragments of step b);
- growth hormone isoforms refers to various forms of the growth hormone protein in the particular species, which may involve both isoforms resulting from differential splicing of the coding nucleic acid, as well as modifications at the amino acid level including post-translational alterations
- Isoforms as used herein is to be understood in the molecular biological sense, such that the version of the gene, the RNA or the protein occurs with slight to major differences.
- the causes are mainly splice variants of RNA and protein isoforms. Further isoforms result from posttranslational modification.
- the isoforms are preferably those which are splice variants of the RNA or of the protein.
- Isoforms are according to the invention no isotope-labeled forms of the identical protein, eg, a 22 kDa GH and a 15 kDa N-22-GH.
- the various isoforms of human growth hormone for example the 22 kDa hGH isoform or the 20 kDa hGH isoform as the main representative of the human growth hormone.
- Corresponding isoforms are documented in the relevant databases.
- Another form of isoforms refers to isoforms of growth hormone, as described, for example, in horses and cattle.
- Recombinant horse growth hormone (reGH) differs from native horse growth hormone (eGH) by additional methionine at the N-terminus.
- one isoform of horse growth hormone is the reGH, while the other isoform is the natural eGH.
- recombinant growth hormone differs from natural growth hormone by replacing an alanine with methionine at the N-terminus.
- the term "quantitative ratios" also means a situation in which a partner of the two compounds which are put in relation to one another is absent, ie the quantitative ratio can be correspondingly such that only one of the isoforms is present.
- GH fragments obtained by resolution specific for only one isoform or "at the mass of at least two mass spectrometrically determined GH fragments, at least one GH fragment of which is specific for only one isoform” means that this GH fragment which is mass spectrometrically distinguishable from other fragments, only by splitting the isoform of growth hormone formed when a particular isoform is present, while this fragment does not occur in the resolution of other isoforms.
- the isoforms are not those which differ only by the use of isotopes.
- Ratio sets to the integration area of the signal of another fragment.
- One of the two fragments is isoform-specific.
- the second fragment either specifically represents another isoform or all GH isoforms.
- isotope-labeled internal standards can be used to improve the accuracy of the quantification.
- the expression "22 kDa-hGH isoform having a molecular weight of about 22,000 Da" as used herein refers to a protein as set forth by Genbank Accession No. 113438.1, Uniprot No. P01241-1.
- hGH isoform having a molecular weight of about 20,000 Da is understood to mean a protein with the accession number Uniprot no.
- splitting of the GH into GH fragments means that the starting GH is changed in such a way that one residue is cleaved off, this residue usually comprising one peptide fragment but can also be another group which is present by posttranslational modification affect.
- the inventors have found that it is possible with the aid of the method according to the invention to determine very sensitively and with high specificity whether or not the proportions of at least two isoforms of growth hormone in a sample correspond to the natural proportions of the growth hormone isoforms.
- the mass spectrometric determination of the GH fragments is suitable for determining the quantitative ratio of these two fragments with high specificity by comparing the intensities of the signals for the two GH fragments. In comparison to previously used biological methods, the risk of cross-reactivity is excluded.
- the method according to the invention is particularly suitable for determining the quantitative ratios of the isoforms of human GH.
- hGH Growth hormone
- the proportions of the isoforms of hGH can be determined, in particular the major isoforms, namely the 22 kDa hGH isoform having a molecular weight of about 22,000 Da and the further isoform 20 kDa hGH having a molecular weight of about 20,000 Da ,
- the ratio of one of the smaller isoforms or the 20 kDa hGH isoform with the 22 kDa hGH isoform can be determined.
- the 22 kDa hGH isoform is used to increase performance. That is to say, the validity of the method compared to previous WADA-approved methods based on immunological tests is increased with constant sensitivity.
- the detection threshold can be lowered and thus the sensitivity can be increased while maintaining the specificity of the measurement.
- the quantitative ratios of the growth hormone isoforms are determined on the basis of the intensity ratios of the signals of the ions in the masses by means of a mass spectrometer, wherein the human growth hormone and here the particular fragments are selected such that a fragment is specific for the 22 kDa hGH isoform while at least one further fragment is specific for another isoform and / or wherein another isoform comprises all possible human growth hormone isoforms.
- the method is directed to determining the proportions of the human growth hormone isoforms hGH, wherein the isoforms comprises at least the 22 kDa hGH isoform having a molecular weight of about 22,000 Da and preferably the at least one further isoform comprises the 20 kDa hGH isoform with a molecular weight of about 20,000 Da.
- the proportions of this isoform to the other isoforms change. That is, with the aid of the method according to the invention, it is possible to prove an unauthorized ingestion of the GH, in particular of the hGH. This also applies to the unauthorized administration of recombinant Growth hormone in horses or cattle. As stated, in the horse, the recombinant growth hormone differs from the natural growth hormone by the presence of an additional methionine at the N-terminus.
- the method according to the invention allows the administration of recombinant horse growth hormone to be determined by determining the proportions of fragments of the isoforms according to the invention.
- splitting of the growth hormone such as splitting of the human growth hormone, e.g. enzymatically or chemically, such that the corresponding fragments are detected by mass spectrometry and optionally quantified.
- FIG. 1 shows the sequences of the human growth hormone 22 kDa-hGH and 20 kDa hGH isoforms together with the cleavage sites for the protease trypsin. Also shown are some fragments obtained after trypsin digestion, namely the fragment designated T6 which is specific for the 22 kDa isoform, the fragment designated as T4 which is specific for the 20 kDa isoform and the fragment T12, the is obtained from both the 20 kDa and 22 kDa isoforms as well as most other isoforms and thus reflects all growth hormone.
- the splitting of the growth hormone is preferably enzymatic or chemical. The person skilled in the art is familiar with suitable means of decomposition.
- Enzyme decomposition can be carried out using customary known enzymes, such as proteases.
- proteases trypsin, chymotrypsin, V-8, Lys-C, Asp-N, Arg-C, Asp-C, proteinase K, pepsin, thermolysin may be mentioned here.
- a chemical cleavage of the proteins can be carried out, for example by means of cyanogen bromide, 2- (2-nitrophenylsulfenyl) -3-methyl-3-bromoindolenine (BNPS-Skatol), N-bromosuccinimide, N-chloro-succinimide, iodosobenzoic acid.
- the method according to the invention may further comprise the step of comparing the ratio of growth hormone isoforms determined in the sample with a quantitative ratio reference value range.
- This quantitative ratio reference range may be one in which the values are summarized in a group supplied to the growth hormone.
- Another range of reference ranges can be obtained by analyzing a group that has not been given growth hormone.
- the sample in which the ratio of growth hormone isoforms is determined may be a biological sample such as body fluids, particularly blood, plasma or serum.
- the sample is provided isolated. This sample may be one that was previously taken from an object.
- the sample may be one immediately before the person was removed, or one that has been stored, for example by storage in the low temperature range.
- the method according to the invention is one wherein the growth hormone is cleaved with trypsin and, in the case of the human growth hormone, the resulting fragments comprise fragments T4 according to SEQ ID NO: 1, T6 according to SEQ ID NO: 2 and T1 2 SEQ ID NO: 3, included.
- the hGH fragment according to SEQ ID No. 1 is specific for the 20 kDa isoform
- the hGH fragment according to SEQ ID No. 2 specific for the 22 kDa isoform
- the hGH fragment according to SEQ ID No. 3 stands for the essential hGH isoforms.
- isotope-labeled growth hormone in particular isotope-labeled 22 kDa hGH and / or isotope-labeled 20 kDa hGH and / or individual isotopically labeled GH fragments obtainable in the preparation according to the invention.
- isotope-labeled growth hormone in particular isotope-labeled 22 kDa hGH and / or isotope-labeled 20 kDa hGH and / or individual isotopically labeled GH fragments obtainable in the preparation according to the invention.
- These are, for example, 13 C or 15 N isotope-labeled fragments, in particular isotope-labeled hGH fragments according to SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and / or SEQ ID No. 3.
- SEQ ID No. 1 in particular isotope-labeled hGH fragments according to SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and / or
- a calibration sample containing growth hormone and / or fragments thereof can be subjected to the method according to the invention in order to calibrate the mass spectrometer.
- a possible embodiment of the method according to the invention will be explained in more detail below with reference to FIG.
- the fragments it is possible for the fragments to have a tag for improving the sensitivity in mass spectrometric quantification, ie, a label which increases the sensitivity.
- a tag for improving the sensitivity in mass spectrometric quantification ie, a label which increases the sensitivity.
- suitable labels are described, for example, in Arsene, CG et al., J. Mas. Spectrom., 2012, 47, 1554 to 1560, eg a conjugate with a N- (3-iodopropyl) -N, N, N-dimethyloctylammonium iodide. That is, the fragments can be modified by chemical modification.
- the terms "tag” and "marker” are used synonymously.
- the invention thus also relates in particular to the use of the method according to the invention for detecting the growth hormone intake, in particular the unauthorized intake of growth hormone for increasing performance, eg in humans or animals, such as horses.
- the method is particularly suitable for the analysis of doping to increase performance in athletes.
- kit for determining growth hormone ingestion in particular human growth hormone
- kit comprises isotopically-labeled 22 kDa hGH and / or isotopically-labeled 20 kDa hGH and / or isotopically-labeled hGH fragments thereof; Agent for the breakdown of the growth hormone, in particular the hGH and, if appropriate, means for the purification of the fragments.
- the term "kit” is understood in particular to mean a sample preparation system.
- the sample conditioning system allows the provision of prepared samples for determining the proportions of isoforms of GH, particularly hGH, e.g. using mass spectrometric analysis methods.
- this kit of the invention can be used to allow mass spectrometric analysis of growth hormone, e.g. in the field of investigation of unauthorized performance increase in athletes.
- the invention is explained in more detail with the aid of the following examples, without being limited thereto.
- FIG. 2 shows a general principle of the method according to the invention for determining the ratios of growth hormone isoforms, in the present case of the human growth hormone, to the examples of fragments T4, T1 2 and T6.
- a flow chart of the human growth hormone refining process is carried out by means of ID-MS. In this case, a sample to be analyzed and a calibration solution of 500 ⁇ volume each is used.
- the resulting fragments are conjugated as described 1 with N- (3-iodopropyl) -N, N-dimethyloctylammonium iodide (IPDOA-iodide). Subsequently, the thus conjugated fragments are analyzed by RP-LC-MS / MS.
- isotope dilution mass spectrometry (ID-MS), as described recently for the determination of 22 kDa hGH, is used to quantify the proteolytic fragments.
- ID-MS isotope dilution mass spectrometry
- genetically engineered 22 kDa GH (WHO 2. IS 98/574) in aqueous solution is used.
- the reference solution is prepared according to the manufacturer's instructions (NIBSC).
- Another reference solution is also prepared which also contains genetically engineered 20 kDa GH (Feidan, Quebec, Canada). The respective GH concentration of these reference solutions is determined as described 3 by means of ID-MS-based amino acid analysis.
- a calibration mixture is prepared and measured. This is an aliquot Part (500 [iL) of commercially available GH-depleted serum supplemented with both reference solutions. The concentration of 20 kDa GH and 22 kDa GH is set accordingly in the calibration mixture to 0.1 and to 0.9 ng / mL. The sample and the calibration mixture are supplemented with corresponding amounts of isotopically labeled 22 kDa GH and 20 kDa GH and / or individual isotopepen labeled tryptic fragments (peptides).
- the isotope-labeled peptides are prepared by solid-phase synthesis, purified and used as aqueous solutions of known concentration to replenish sample and calibration mixture.
- the isotopically labeled proteins U- 15 N 22 kDa GH and U- 15 N 20 kDa GH
- single isotope-labeled tryptic peptides are used as internal standards to quantify individual isoforms.
- the concentration of the internal standards is set to 0.1 ng / mL of U- 15 N 20 kDa GH or isotope-labeled T4 in both the sample and the calibration mixture, and to U- 15 N 22 kDa GH to 0.9 ng / mL.
- T4 isotopically labeled T4
- T6 isotopically labeled T6
- T1 2 isotopically labeled T1 2
- RP reversed-phase
- SCX strong cation exchange
- the elution times of the individual tryptic fragments T4, T6 and T1 2 are determined beforehand by measuring the reference materials.
- the isolated T4 and T6 are conjugated to / V- (3-iodopropyl) - / V, / V, / d-imethyloctylammonium iodide (I PDOA iodide) to increase the sensitivity as described 1 .
- Figure 3 outlines the entire process of determining GH. Measurement with LC-MS / MS
- T4, T6 and T1 2 are typically carried out by (RP) -LC / MS-MS on a high-pressure liquid chromatograph (1 200 Infin ity Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) coupled to a Velos Pro Orbitrap ELITE Hybrid Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany).
- a gradient mixture A / B (A: water, 0.1% formic acid, B: acetonitrile, 0.1% formic acid) is used with 0% B (5% B for T4 and T6) within 0-3 min, 0% B or 5% B for T4 and T6 to 80% B within 37 min, 80% B for 5 min.
- the liquid chromatography column used is, for example, the Discovery Bio Widepore C18 RP column (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo., USA) in the dimensions 2x150 mm; 3 ⁇ ; 300 A, used.
- the flow rate is 0.2 mL / min.
- the Orbitrap mass spectrometer is set to a mass resolution of 60000.
- the parameters of the ESI source are optimized for maximum signal intensity. In the ESI source, a sprayer voltage of 4.2 kV and a dry gas (N2) temperature of 270 ° C is set.
- T12 isotopically labeled T12
- T6 isotopically labeled T6
- the transitions m / z 939.16 ⁇ 671 .347 or 1031 .56 (949.16 ⁇ 681 .347 or 1042.56) are measured.
- CID collision induced dissociation
- a collision energy of 35 eV is set for T6 and the collision energy is reduced to 20 eV for T4 and T12.
- Figure 3 shows the spectra of the fragment ions of T4, T6 and T12.
- the fragment ions were generated by CID fragmentation in the Velos Pro-Orbitrap ELITE hybrid mass spectrometer from the selected precursor ions.
- Figures 4, 5 and 6 show (example) ion current chromatograms generated from the measurement data for the quantification of T4, T6 and T12 using the Xcalibur TM 2.2 analysis software (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany).
- the data are from the measurement of a sample consisting of GH-depleted serum, 20-, 22-kDa GH and the internal standards. The sample was subjected to the entire sample preparation before measurement on the mass spectrometer.
- the figures show:
- FIG. 1 shows the sequences of the human growth hormone 22 kDa-hGH and 20 kDa hGH isoforms together with the cleavage sites for the protease trypsin. Also shown are some fragments obtained after proteolysis with trypsin, namely the T6-designated fragment specific for the 22 kDa isoform, the T4-designated fragment specific for the 20 kDa isoform, and the T12 fragment which is obtained from both the 20 kDa and 22 kDa isoforms as well as most other isoforms and thus reflects all growth hormone.
- FIG. 2 shows the flow chart of the method for the determination of GH by means of ID-MS.
- GH is cleaved proteolytically with the aid of the enzyme trypsin.
- GH-representing fragments T4, T6 and T12 are quantified instead of intact proteins.
- 22 kDa GH (WHO IS 98/574) and 20 kDa GH are used in aqueous solutions of known concentrations.
- Genetically engineered U- 15 N 22 kDa GH, U- 15 N 20 kDa GH and isotope-labeled T4 are used as internal standards.
- T4 isotopically labeled T4
- T6 isotopically labeled T6
- T12 isotopically labeled T12
- FIG. 3 shows fragment ion spectra for the tryptic peptides T4 (A), T6 (B), and T12 (C).
- the peptides were each fragmented in the collision-induced dissociation (CID) mode in the Velos Pro-Orbitrap ELITE hybrid mass spectrometer.
- CID collision-induced dissociation
- Figure 4 shows the LC-MS / MS response for T12 (isotopically labeled T12). The ion current chromatograms were recorded for analyte-specific MS / MS transitions.
- Figure 5 shows the LC-MS / MS response for T4 (isotopically labeled T4). The ionic current chromatograms were recorded for analyte-specific MS / MS transitions.
- Figure 6 shows the LC-MS / MS response for T6 (isotopically labeled T6).
- the ionic current chromatograms were recorded for analyte-specific MS / MS transitions. 1.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons (GH), insbesondere des humanen Wachstumshormons (hGH), wie dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoform des humanen Wachstumshormons 22 kDa und der Isoform 20 kDa. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht dabei auf dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des GH auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektrometrisch bestimmten Fragmenten, wobei mindestens ein GH-Fragment spezifisch für eine Isoform ist. In einem weiteren Aspekt betrifft die Anmeldung die Verwendung eines solchen Verfahrens zum Nachweis der unerlaubten Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere der leistungsfördernden Einnahme von 22 kDa-hGH. Schließlich wird ein Kit zur Bestimmung der Einnahme von GH bereitgestellt.
Description
Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons und dessen Verwendung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons (GH), insbesondere des humanen Wachstumshormons (hGH), wie dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoform des humanen Wachstumshormons 22 kDa und der Isoform 20 kDa. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht dabei auf dem Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des GH auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektromet- risch bestimmten Fragmenten, wobei mindestens ein GH-Fragment spezifisch für eine Isoform ist. In einem weiteren Aspekt betrifft die Anmeldung die Verwendung eines solchen Verfahrens zum Nachweis der unerlaubten Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere die leistungsfördernde Einnahme von 22 kDa-hGH. Schließlich wird ein Kit zur Bestimmung der Einnahme von GH bereitgestellt.
Stand der Technik
Es wird angenommen, dass Wachstumshormon (GH) als leistungssteigerndes Mittel weit verbreitet eingesetzt wird. Ein solcher Einsatz findet sich in allen Bereichen des Sports und betrifft nicht nur die Leistungssteigerung beim Menschen sondern auch bei Tieren, z.B. im Pferdesport. Eine Übersicht über das Doping
mit Wachstumshormon im Sport gibt Baumann G. P. in Endocrine Reviews, 2012, 33(2): 155-186. Hier wird ausführlich zur Verwendung von Wachstumshormon im Sport sowie zum Nachweis des Wachstumshormons insbesondere zum Nachweis von Doping ausgeführt. So werden dort die verschiedenen Mög- lichkeiten des Nachweises einer verbotenen Einnahme von Wachstumshormon beschrieben. Kernproblem ist die Erkennung der Einnahme von Wachstumshormon bei gleichzeitig vorhandenem körpereigenem (endogenem) Wachstumshormon. Hinzu kommt, dass das Hormon pulsatil im Körper erzeugt wird, dass also kurzzeitige Spitzen in der Serumkonzentration auftreten, die jedoch inner- halb kurzer Zeit wieder abgebaut werden. Darauf wird u.a. bei R. Holt und P.H . Sönksen British Journal of Pharmacology, 2008, 154, 542-556 eingegangen. Zum Nachweis macht man sich die Tatsache zunutze, dass unabhängig von der Konzentration, das Profil oder Mengenverhältnis der Isoformen aus denen sich das Wachstumshormon zusammensetzt, erhalten bleibt. Gleichzeitig wird aber nur mit einer einzelnen Isoform gedopt, die mittels biotechnischer Synthese erhalten wird; normalerweise ist dieses die 22 kDa-hGH Isoform. Dieses hat zwangsläufig eine Änderung der Mengenverhältnisse zur Folge, die zum Dopingnachweis herangezogen werden kann. Dieses macht man sich in den Tests zu Nutze.
Gegenwärtig werden, wie von Baumann et al ., siehe oben, ausgeführt, Immuno- assays eingesetzt, um die Mengenverhältnisse zwischen den hGH-lsoformen zu bestimmen. In einem Assay wird mit einem spezifischen Antikörper das 22 kDa- hGH bestimmt in einem zweiten wird ein anderer Antikörper eingesetzt, der alle Isoformen erkennt. Aus beiden Werten wird das Verhältnis gebildet. Zur Bestätigung der Ergebnisse ist ein zusätzlicher Assay gefordert.
Die Leistungsgrenze des Methodenprinzips Antikörper-basierter Assays ergibt sich vor allem aus der begrenzten Selektivität: Es ist nicht ganz auszuschließen, dass neben dem Ziel-Analyten andere im Serum vorhandene Substanzen (Proteine) ebenfalls erkannt werden; ein typischer Kandidat ist z.B. das GHBP (growth hormone binding protein). Dieses hat in der Vergangenheit zu Problemen bei der gerichtlichen Verwertbarkeit der Analysenergebnisse geführt. Mit-
tels einer massenspektrometrischen Bestimmung von Mengenverhältnissen zwischen hGH-lsoformen können in Zukunft derartige Irrtumsrisiken vermieden werden . Neben dem Wachstumshormon-Isoformen-Test gibt es einen weiteren Test. Dieser basiert auf dem Nachweis von GH-Biomarkern. Damit wird indirekt GH nachgewiesen. Als Biomarker werden z.B. IGF-1 oder P-I II-NP eingesetzt. Dabei werden diese Biomarker im Blut bestimmt und darauf aufbauend auf die Verwendung von Wachstumshormon rückgeschlossen. Es besteht hier allerdings ein Problem in dem Mangel an Spezifität und Sensitivität. Außerdem sind die zur Verfügung stehenden Assays begrenzt und es können Probleme bei der Interpretation auftreten, da die Ergebnisse alters- und geschlechtsabhängig sein können. Schließlich können andere Biomarker im Harn oder im Schweiß genutzt werden, um einen Rückschluss auf den Einsatz von Wachstumshormon zu erlauben. Allerdings treten auch hier die Probleme auf, die sich ergeben, wenn indirekte Nachweissysteme eingesetzt werden. In EP 0 949 509 wird ein Verfahren zur Messung von humanem Wachstumshormon beschrieben. Dieses Verfahren beruht auf einem immunologischen Verfahren.
Von Bailly-Chouriberry L. et al ., 2008, Anal . Chem., 80, 8340-8347 wird die Identifizierung von rekombinantem Pferdewachstumshormon im Pferdeplasma mittels LC-MS/MS beschrieben. Vor Kurzem haben Arsene C. G. et. al . in J. Mas. Spektrom., 2012, 47,1 554-1560 die hoch sensitive massenspektrometri- sche Quantifizierung von 22 kDa-hGH im Serum durch amphiphile Peptidkonju- gation beschrieben. Arsene C. G., et al ., 2010, Anal. Biochem., 401 , 228-235 beschreiben die Quantifizierung von Wachstumshormon im Serum durch Isoto- penverdünnungs-Massenspektrometrie (ID-MS). Hierin wird die 22 kDa-hGH Isoform quantifiziert, in dem diese Form zunächst mit Trypsin proteolysiert wird. Anschließend erfolgt die Quantifizierung der erhaltenen Peptidfragmente mittels
LC-MS/MS unter Verwendung von isotopenmarkierten internen Standards, die in definierter Menge zur Probe zugegeben werden. Es zeigte sich, dass dieses System für eine Quantifizierung von Wachstumshormon im Serum geeignet ist. Dabei wird ein tryptischer Verdau der 22 kDa-hGH Form beschrieben, der zur Ausbildung eines als T6 bezeichneten Peptidfragmentes und eines als T12 bezeichneten Peptidfragmentes führt. Es werden entsprechende Präparationen des 22 kDa-hGH oder dessen Fragmente zu humanem Serum hinzugefügt und anschließend bestimmt. Die gegenwärtig eingesetzten Verfahren, insbesondere die von der WADA gebilligten Verfahren, verwenden zur Erkennung und Quantifizierung der Isoformen Antikörper-basierte Messprinzipien, jedoch keine Massenspektrometrie. Wie ausgeführt, sind solche Antikörper-basierten Messprinzipien, also immunologische Messsysteme, anfällig für Kreuzreaktivitäten und erfordern die Durchfüh- rung verschiedener Tests. Einen massenspektrometrischen Ansatz zum Nachweis der 22 kDa und 20 kDa Isoformen oder anderer Isoformen des Menschen oder bei anderen Tieren gab es bislang nicht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Verfahren, die ein Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen von Wachstumshormon, insbesondere von humanem Wachstumshormon erlauben. Diese Verfahren dienen insbesondere dazu, einen Nachweis bei unerlaubter Einnahme von Wachstumshormon, wie humanem Wachstumshormon, zu führen. Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von mindestens zwei Isoformen des Wachstumshormons (GH), wobei sich diese mindestens zwei Isoformen in ihrer Masse unterscheiden, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer Probe, die GH enthält;
Behandeln dieser Probe zur Aufspaltung des GH in GH- Fragmente, wobei mindestens eines der durch Aufspaltung erhaltenen GH-Fragmente spezifisch für nur eine Isoform ist;
gegebenenfalls Anreicherung und/oder gegebenenfalls Isolierung der erhaltenen GH-Fragmente des Schritts b);
Bestimmen der Mengen der GH-Fragmente in der Probe mittels eines Massenspektrometers; und
Bestimmen der Mengenverhältnisse der Wachstumshormon- Isoformen auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektromet- risch bestimmten GH-Fragmenten, wobei mindestens ein GH- Fragment hiervon spezifisch für nur eine Isoform ist.
Der Ausdruck„Isoformen des Wachstumshormons" bezieht sich auf verschiede- ne Formen des Wachstumshormonproteins in der jeweiligen Spezies. Diese Formen können sowohl Isoformen betreffen, die sich durch unterschiedliches Splicen der codierenden Nukleinsäure ergeben, als auch durch Modifikationen auf Aminosäureebene einschließlich posttranslationalen Veränderungen. Der Ausdruck„Isoformen" wie er vorliegend verwendet wird, ist dabei im molekular- biologischen Sinne zu verstehen, derart, dass die Version des Gens, der RNA oder des Proteins mit leichten bis größeren Unterschieden auftritt. Ursache sind im Wesentlichen Spleißvarianten von RNA- und Protein-Isoformen. Weitere Isoformen ergeben sich durch posttranslationale Modifikation. Bevorzugt handelt es sich bei den Isoformen um solche, die Spleißvarianten der RNA bzw. des Pro- teins sind. Isoformen sind erfindungsgemäß keine isotopenmarkierte Formen des identischen Proteins, z.B. ein 22 kDA GH und ein 15N-22 kDa-GH . Beispielhaft seien hier die verschiedenen Isoformen des humanen Wachstumshormons genannt, z.B. die 22 kDa-hGH Isoform oder die 20 kDa-hGH Isoform als Hauptvertreter des humanen Wachstumshormons. Entsprechende Isoformen sind in den einschlägigen Datenbanken dokumentiert. Eine andere Form von Isoformen bezieht sich auf Isoformen des Wachstumshormons, wie sie z.B. bei Pferd und Rind beschrieben sind. Das rekombinante Pferdewachstumshormon (reGH) unterscheidet sich von dem nativen Pferdewachstumshormon (eGH) durch ein zu-
sätzliches Methionin am N-Terminus. Das heißt, eine Isoform des Pferdewachstumshormons ist das reGH, während die andere Isoform das natürliche eGH ist. Beim Rind unterscheidet sich das rekombinante Wachstumshormon vom natürlichen Wachstumshormon durch den Austausch eines Alanins mit Methionin am N-Terminus.
Unter dem Ausdruck„Mengenverhältnisse" wird vorliegend auch eine solche Situation verstanden, wo ein Partner der beiden Verbindungen, die einander ins Verhältnis gesetzt werden, abwesend ist. Das heißt, das Mengenverhältnis kann entsprechend derart sein, dass nur eine der Isoformen vorliegt.
Der Ausdruck„durch Aufspaltung erhaltene GH-Fragmente spezifisch für nur eine Isoform" bzw.„bei der Masse von mindestens zwei massenspektrometrisch bestimmten GH-Fragmenten, wobei mindestens ein GH-Fragment hiervon spezi- fisch für nur eine Isoform ist" bedeutet, dass dieses GH-Fragment, das massenspektrometrisch unterscheidbar von anderen Fragmenten ist, nur durch Aufspaltung der Isoform des Wachstumshormons entsteht wenn eine bestimmte Isoform vorhanden ist, während dieses Fragment nicht bei Aufspaltung anderer Isoformen auftritt. D.h . auch, dass es sich erfindungsgemäß bei den Isoformen nicht um solche handelt, die sich lediglich durch Verwendung von Isotopen unterscheiden.
Unter dem Ausdruck„auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen" wird vorliegend verstanden, dass man die Integrationsfläche unter dem massenspektrometrischen Detektionssignal eines Fragmentes ins
Verhältnis setzt zur Integrationsfläche des Signals eines anderen Fragmentes.
Dabei ist eines der beiden Fragmente Isoform-spezifisch. Das zweite Fragment repräsentiert entweder spezifisch eine andere Isoform oder alle GH-Isoformen.
Um Unterschiede in der Detektions-Response der zu bestimmenden Fragmente zu kompensieren, können zur Verbesserung der Genauigkeit der Quantifizierung isotopenmarkierte interne Standards eingesetzt werden.
Unter dem Ausdruck„22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da" wird vorliegend ein Protein verstanden, wie es unter der Genbank Hinterlegungsnummer 1 1 13438.1 , Uniprot Nr. P01241 -1 ausgeführt ist. Unter dem Ausdruck„20 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da" wird ein Protein verstanden mit der Hinterlegungsnummer Uniprot Nr.
P01241 -2.
Unter dem Ausdruck„Aufspaltung des GH in GH-Fragmente" wird vorliegend verstanden, dass das Ausgangs-GH derart verändert wird, dass ein Rest abge- spalten wird. Dieser Rest umfasst üblicherweise ein Peptidfragment, kann aber auch eine andere durch posttranslationale Modifikation vorliegende Gruppe betreffen.
Vorliegend haben die Erfinder festgestellt, dass mit Hilfe des erfindungsgemä- ßen Verfahrens sehr sensitiv und mit hoher Spezifität bestimmt werden kann, ob die Mengenverhältnisse von mindestens zwei Isoformen des Wachstumshormons in einer Probe den natürlichen Mengenverhältnissen der Isoformen des Wachstumshormons entsprechen oder nicht. Die massenspektrometrische Bestimmung der GH-Fragmente ist durch einen Vergleich der Intensitäten der Sig- nale für die beiden GH-Fragmente dazu geeignet, das Mengenverhältnis dieser beiden Fragmente mit hoher Spezifität zu bestimmen. Im Vergleich zu bisher eingesetzten biologischen Verfahren ist die Gefahr einer Kreuzreaktivität ausgeschlossen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere dazu, die Mengenverhältnisse der Isoformen des humanen GH zu bestimmen. Das humane
Wachstumshormon (hGH) ist ein beliebtes Mittel, die Leistungsfähigkeit bei Sportlern zu fördern. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Mengenverhältnisse der Isoformen des hGH bestimmt werden, insbesondere der Hauptisoformen, nämlich der 22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da und der weiteren Isoform 20 kDa-hGH mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da. Es existieren weitere kleinere Isoformen des humanen Wachstumshormons. Erfindungsgemäß kann dabei in einer Ausführungs-
form das Mengenverhältnis einer der kleineren Isoformen oder der 20 kDa-hGH Isoform mit der 22 kDa-hGH Isoform bestimmt werden. Derzeit wird insbesondere die 22 kDa-hGH Isoform zur Leistungssteigerung eingesetzt. Das heißt, die Validität des Verfahrens im Vergleich zu bisherigen von der WADA gebilligten Verfahren, die auf immunologischen Tests basieren, ist erhöht bei gleich bleibender Sensitivität.
Durch Bestimmung der GH-Fragmente nach Aufspaltung kann die Detektions- schwelle gesenkt und damit die Sensitivität erhöht werden unter Beibehaltung der Spezifität der Messung.
Insbesondere erfolgt die Bestimmung der Mengenverhältnisse der Isoformen des Wachstumshormons auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen mittels eines Massenspektrometers, wobei das humane Wachstumshormon und hier die bestimmten Fragmente derart ausgewählt sind, dass ein Fragment spezifisch für die 22 kDa-hGH Isoform ist während ein mindestens weiteres Fragment spezifisch für eine weitere Isoform ist und/oder wobei eine weitere Isoform alle möglichen Isoformen des humanen Wachstumshormons umfasst.
In einer Ausführungsform richtet sich das Verfahren daher auf das Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des humanen Wachstumshormons hGH, wobei die Isoformen zumindest die 22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da umfasst und bevorzugt die mindestens eine weitere Isoform die 20 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da ist.
Da in der Praxis gegenwärtig zum Doping, d.h. zur Leistungssteigerung im Wesentlichen die rekombinante 22 kDa Isoform des hGH eingesetzt wird, verän- dern sich die Mengenverhältnisse dieser Isoform zu den weiteren Isoformen, wie der 20 kDa-hGH Isoform. Das heißt, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Nachweis einer unerlaubten Einnahme des GH insbesondere des hGH möglich. Dieses gilt genauso für die unerlaubte Gabe von rekombinantem
Wachstumshormon bei Pferden oder Rindern. Wie ausgeführt, unterscheidet sich beim Pferd das rekombinante Wachstumshormon von dem natürlichen Wachstumshormon durch das Vorhandensein eines zusätzlichen Methionins am N-Terminus. Auch hier erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Gabe von rekombinantem Pferdewachstumshormon zu bestimmen, indem erfindungsgemäß die Mengenverhältnisse von Fragmenten der Isoformen bestimmt werden. Gleiches gilt für das Rind, wo sich die rekombinante Form von der natürlichen Form durch den Austausch eines Alanins durch ein Methionin am N-Terminus unterscheidet.
Für das humane Wachstumshormon sind verschiedene Isoformen beschrieben, wie in Baumann et al ., supra, ausgeführt. Wie genannt, ist eine wesentliche Isoform die 22 kDa-hGH, die zweite, die 20 kDa-hGH Isoform. Die Primärstruktur des 22 kDa humanen Wachstumshormons besteht aus 191 Aminosäuren, in der 20 kDa Isoform sind 15 Aminosäuren nicht vorhanden. Die Sequenz des humanen Wachstumshormons ist in SEQ ID Nr. 4 dargestellt. SEQ ID Nr. 5 entspricht der 20 kDa Isoform.
Die massenspektrometrische Unterscheidung dieser beiden Isoformen ist mög- lieh, allerdings ist aufgrund des großen Molekulargewichtes der beiden Isoformen (20 kDa bzw. 22 kDa) der Nachweis nicht sensitiv genug.
Erfindungsgemäß erfolgt daher zuvor eine Aufspaltung des Wachstumshormons, wie eine Aufspaltung des humanen Wachstumshormons z.B. enzymatisch oder chemisch, derart, dass die entsprechenden Fragmente massenspektrometrisch detektiert und gegebenenfalls quantifiziert werden.
In der Figur 1 sind die Sequenzen der Isoformen 22 kDa-hGH und 20 kDa-hGH des humanen Wachstumshormons dargestellt zusammen mit den Spaltungsstel- len für die Protease Trypsin. Ebenfalls dargestellt sind einige Fragmente, die nach Trypsin-Verdau erhalten werden, nämlich das als T6 bezeichnete Fragment, das für die 22 kDa Isoform spezifisch ist, das als T4 bezeichnete Fragment, das für die 20 kDa Isoform spezifisch ist, sowie das Fragment T12, das
sowohl aus der 20 kDa als auch aus der 22 kDa Isoform wie auch mit den meisten anderen Isoformen erhalten wird und somit das gesamte Wachstumshormon widerspiegelt. Die Aufspaltung des Wachstumshormons ist bevorzugt enzymatisch oder chemisch. Dem Fachmann sind geeignete Mittel zur Aufspaltung bekannt. Eine en- zymatische Aufspaltung kann mit üblichen bekannten Enzymen, wie Proteasen erfolgen. Beispielhaft seien hier die Proteasen Trypsin, Chymotrypsin, V-8, Lys- C, Asp-N, Arg-C, Asp-C, Proteinase K, Pepsin, Thermolysin genannt. Alternativ kann eine chemische Spaltung der Proteine durchgeführt werden, z.B. mittels Bromcyan, 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-Bromindolenin (BNPS-Skatol), N-Bromsuccinimid, N-Chlor-Succinimid, lodosobenzoesäure.
In einer Ausführungsform kann dabei das erfindungsgemäße Verfahren weiter- hin den Schritt des Vergleichs des in der Probe bestimmten Mengenverhältnisses der Wachstumshormonisoformen mit einem Mengenverhältnis- Referenzwertebereich umfassen. Dieser Mengenverhältnis- Referenzwertebereich kann einer sein, in dem die Werte einer Gruppe zusam- mengefasst sind, die dem Wachstumshormon zugeführt wurde. Ein anderer Re- ferenzwertbereich kann dadurch erhalten werden, dass eine Gruppe analysiert wird, der eben kein Wachstumshormon zugeführt wurde.
Mit Hilfe des Vergleichs mit einem Mengenverhältnis-Referenzwertebereich ist es möglich zu bestimmen, ob Wachstumshormon zugeführt wurde.
Hierdurch ist insbesondere die unerlaubte Einnahme von Wachstumshormon nachweisbar, wie eine verbotene Leistungssteigerung bei Sportlern (Doping).
Die Probe, in der das Mengenverhältnis der Isoformen des Wachstumshormons bestimmt wird, kann eine biologische Probe sein, wie Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum. Die Probe wird isoliert bereitgestellt. Bei dieser Probe kann es sich um eine handeln, die vorher einem Objekt entnommen wurde. Die Probe kann dabei eine sein, die unmittelbar vorher der Person
entnommen wurde, oder eine, die zwischengelagert wurde, z.B. durch Lagerung im Tieftemperaturbereich.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren eines, wobei die Aufspaltung des Wachstumshormons mit Trypsin erfolgt und, im Falle des humanen Wachstumshormons, die erhaltenen Fragmente die Fragmente T4 gemäß SEQ ID Nr. 1 , T6 gemäß SEQ ID Nr. 2 und T1 2, gemäß SEQ ID Nr. 3, enthalten. Hierbei ist das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 1 spezifisch für die 20 kDa Isoform, das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 2 spezifisch für die 22 kDa Isoform und das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 3 steht für die wesentlichen hGH-lsoformen.
Zur Erhöhung der Spezifität und zur Verbesserung der Quantifizierung der Fragmente wird isotopenmarkiertes Wachstumshormon, insbesondere isoto- penmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopenmarkiertes 20 kDa-hGH und/oder einzelne isotopenmarkierte bei der Aufbereitung erfindungsgemäß erhältliche GH-Fragmente zugegeben. Diese sind z.B. 13C oder 15N isotopenmarkierte Fragmente, insbesondere isotopenmarkierte hGH-Fragmente gemäß SEQ ID Nr. 1 , SEQ ID Nr. 2 und/oder SEQ ID Nr. 3. Diese können als interner Standard der Probe zugesetzt werden, um so die Genauigkeit der Bestimmung von GH- Fragmenten aus den Intensitätsverhältnissen der Signale zu verbessern.
Weiterhin kann parallel zu der zu untersuchenden Probe eine Kalibrierprobe mit Wachstumshormon und/oder Fragmenten hiervon dem erfindungsgemäßen Ver- fahren unterworfen werden, um das Massenspektrometer zu kalibrieren. Eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird weiter unten unter Bezug auf die Figur 2 näher erläutert.
In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, dass die Fragmente zur Ver- besserung der Sensitivität bei der massenspektrometrischen Quantifizierung einen Tag aufweisen, d.h., dass eine Markierung vorliegt, die die Sensitivität erhöht. Entsprechend geeignete Markierungen sind z.B. in Arsene, C. G. et al., J. Mas. Spektrom., 2012, 47,1554 bis 1560 beschrieben, z.B. ein Konjugat er-
hältlich mit einem N-(3-iodopropyl)-N,N,N-dimethyloctylammoniumiodid. Das heißt, die Fragmente können durch chemische Modifikation modifiziert werden. Vorliegend werden die Ausdrücke„Tag" und„Marker" synonym verwendet. Die Erfindung betrifft somit insbesondere auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis der Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere der unerlaubten Einnahme von Wachstumshormon zur Leistungssteigerung, z.B. bei Mensch oder Tier, wie Pferden. Das Verfahren ist insbesondere geeignet zur Analyse von Doping zur Leistungssteigerung bei Sportlern.
Schließlich wird erfindungsgemäß ein Kit zur Bestimmung der Einnahme von Wachstumshormon, insbesondere von humanem Wachstumshormon bereitgestellt, dieses Kit umfasst isotopenmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopen- markiertes 20 kDa-hGH und/oder isotopenmarkierte hGH-Fragmente hiervon; Mittel zur Aufspaltung des Wachstumshormons, insbesondere des hGH sowie ggf. Mittel zur Aufreinigung der Fragmente. Vorliegend wird unter dem Ausdruck "Kit" insbesondere ein Probenaufbereitungssystem verstanden. Das Probenaufbereitungssystem erlaubt die Bereitstellung von aufbereiteten Proben zur Bestimmung der Mengenverhältnisse von Isoformen des GH, insbesondere des hGH, z.B. mittels massenspektrometrischer Analyseverfahren. Dieses erfindungsgemäße Kit kann insbesondere angesetzt werden, um die massenspekt- rometrische Analyse des Wachstumshormons zu erlauben, z.B. im Bereich der Untersuchung der unerlaubten Leistungssteigerung bei Sportlern. Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne dass diese hierauf beschränkt ist.
Beispiele In der Figur 2 ist ein allgemeines Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Mengenverhältnisse von Isoformen des Wachstumshormons, vorliegend des humanen Wachstumshormons an den Beispielen der Fragmente T4, T1 2 und T6 dargestellt.
In der Figur 2 wird ein Ablaufplan des Verfahrens zur Bestinnnnung des humanen Wachstumshormons mittels ID-MS ausgeführt. Hierbei wird eine zu analysierende Probe und eine Kalibrierlösung mit jeweils 500 μΙ Volumen verwendet. Zu beiden wird eine Mischung von isotopenmarkier- tem U-15N 22 kDa-hGH und U-15N 20 kDa-hGH als interne Standards in einem Verhältnis von 9:1 hinzugefügt. Anstatt U-15N 20 kDa-hGH kann man auch iso- topenmarkiertes T4 verwenden. Die Probe wie auch die Kalibrierprobe werden anschließend der Protolyse (Trypsinierung) unterworfen, um die entsprechenden Fragmente: T4, T6 und T12 neben anderen Fragmenten zu erhalten. Anschließend werden die Probe und die Kalibrierlösung identisch behandelt, indem sie einer RP-LC Aufreinigung (pH 2) mit einer sich anschließenden SCX-LC oder RP-LC Aufreinigung (zweimal) (1 . pH 2 und 2. pH 8) unterzogen werden. Die erhaltenen Fragmente werden wie beschrieben1 mit N-(3-iodopropyl)-N,N- dimethyloctylammoniumiodid (IPDOA-iodid) konjugiert. Anschließend werden die so konjugierten Fragmente mittels RP-LC-MS/MS analysiert.
Beispiel 1
Um möglichst genaue Stoffmengenverhältnisse der Isoformen zu bestimmen, wird zur Quantifizierung der proteolytischen Fragmente die Isotopenverdün- nungs-Massenspektrometrie (ID-MS), wie kürzlich für die Bestimmung von 22 kDa-hGH beschrieben, eingesetzt. Für die Proteolyse des gesamten Serums wird vorliegend das Enzym Trypsin verwendet. Als Kaiibrator für die Quantifizie- rung wird gentechnisch hergestelltes 22 kDa GH (WHO 2. IS 98/574) in wässri- ger Lösung verwendet. Die Herstellung der Referenzlösung erfolgt nach den Angaben des Herstellers (NIBSC). Es wird eine weitere Referenzlösung hergestellt, die ebenfalls gentechnisch hergestelltes 20 kDa-GH enthält (Feidan, Quebec, Kanada). Die jeweilige GH-Konzentration dieser Referenzlösungen wird, wie beschrieben 3, mittels ID-MS-basierter Aminosäureanalyse bestimmt.
Parallel zu einer Serum-Probe mit einem typischen Volumen von ca. 500 μΙ_, wird eine Kalibriermischung hergestellt und gemessen. Dazu wird ein aliquoter
Teil (500 [iL) von kommerziell erhältl ichem GH-abgereichertem Serum mit beiden Referenzlösungen aufgestockt. Die Konzentration an 20 kDa-GH und 22 kDa-GH wird in der Kalibriermischung entsprechend auf 0.1 und auf 0.9 ng/mL eingestellt. Die Probe und die Kalibriermischung wird mit entsprechenden Men- gen an isotopenmarkiertem 22 kDa GH und 20 kDa GH und/oder einzelnen iso- topenmarkierten tryptischen Fragmenten (Peptide) aufgestockt. Die isotopen- markierten Peptide werden durch Festphasen-Synthese hergestellt, aufgereinigt und als wässrige Lösungen bekannter Konzentration zum Aufstocken von Probe und Kalibriermischung benutzt. Die isotopenmarkierten Proteine (U-15N 22 kDa GH und U-15N 20 kDa GH) und einzelne isotopenmarkierte tryptische Peptide werden als interne Standards zur Quantifizierung einzelner Isoformen verwendet. Die Konzentration der internen Standards wird sowohl in der Probe als auch in der Kalibriermischung auf 0.1 ng/mL an U-15N 20 kDa GH oder an isotopenmarkiertem T4 und auf 0.9 ng/mL an U-15N 22 kDa-GH eingestellt. Probe und Kalibriermischung werden einer Proteolyse mit Trypsin unterzogen . Die tryptischen Fragmente: T4 (isotopenmarkiertes T4), T6 (isotopenmarkiertes T6) und T1 2 (isotopenmarkiertes T1 2) werden mittels reversed-phase (RP)- und anschl ießender strong cation exchange (SCX)-Flüssigchromatographie aus der Matrix isoliert. Alternativ zur SCX-Chromatograph ie kann in der zweiten Reini- gungsstufe auch eine RP-Flüssigchromatographie im basischen pH-Bereich (pH > 8) durchgeführt werden . Zur Isol ierung einzelner GH-Fragmente werden Fraktionen, die diese enthalten, entsprechend der Elutionszeiten der Fragmente automatisch gesammelt. Die Elutionszeiten der einzelnen tryptischen Fragmente T4, T6 und T1 2 werden zuvor durch Messung der Referenzmaterial ien ermittelt. Das isol ierte T4 und T6 wird zur Steigerung der Messempfindl ichkeit wie beschrieben1 mit /V-(3-iodopropyl)-/V,/V,/\/-d imethyloctylammonium iodid (I PDOA- iodid) konjugiert. In Abbildung 3 ist der gesamte Ablauf der Bestimmung von GH skizziert. Messung mit LC-MS/MS
Die Messung von T4, T6 und T1 2 erfolgt typischerweise mittels (RP)-LC/MS-MS an einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen (1 200 Infin ity Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), der gekoppelt ist an einem Velos Pro-
Orbitrap-ELITE Hybrid-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany). Zur Elution der Peptide wird eine Gradientenmischung A/B (A: Wasser, 0.1 % Ameisensäure, B: Acetonitril, 0.1 % Ameisensäure) verwendet mit 0% B (5% B für T4 und T6) innerhalb 0-3 min, 0% B bzw. 5% B für T4 und T6 zu 80% B innerhalb 37 min, 80% B für 5 min. Als Flüssigchromatographie-Säule wird z.B. die Discovery Bio Widepore C18 RP-Säule (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) in den Dimensionen 2x150 mm; 3 μιτι; 300 A, verwendet. Die Flussrate beträgt 0.2 mL/min. Das Orbitrap-Massenspektrometer wird auf eine Massenauflösung von 60000 eingestellt. Die Parameter der ESI-Quelle werden auf ma- ximale Signalintensität hin optimiert. In der ESI-Quelle wird eine Sprayer- Spannung von 4.2 kV und eine Trockengas (N2)-Temperatur von 270 °C eingestellt. Für T12 (isotopenmarkiertes T12) werden die Übergänge m/z
387.19^531 .25 (392.19^539.25) gemessen. Für isotopenmarkiertes T4, dass durch Proteolyse aus U-15N 20 kDa GH entsteht, wird der Übergang m/z
928.22>681 .347 gemessen. Für T6 (isotopenmarkiertes T6) werden die Übergänge m/z 939.16^671 .347 oder 1031 .56 (949.16^681 .347 oder 1042.56) gemessen. Für die Fragmentierung im Massenspektrometer im„collision induced dissociation" (CID)-Modus wird für T6 eine Kollisionsenergie von 35 eV eingestellt. Für T4 und T12 wird die Kollisionsenergie auf 20 eV reduziert.
Ergebnisse
In der Abbildung 3 sind die Spektren der Fragmentionen von T4, T6 und T12 dargestellt. Die Fragmentionen wurden durch CID-Fragmentierung im Velos Pro- Orbitrap-ELITE Hybrid-Massenspektrometer aus den selektierten Vorläufer- Ionen generiert.
In den Abbildungen 4, 5 und 6 sind (Beispiel)-Ionenstromchromatogramme dargestellt, die für die Quantifizierung von T4, T6 und T12 mit der Auswertungs- Software Xcalibur™2.2 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) aus den Messdaten generiert wurden. Die Daten stammen aus der Messung einer Probe, bestehend aus GH-abgereichertem Serum, 20-, 22-kDa-GH und den internen Standards. Die Probe wurde vor der Messung am Massenspektrometer der gesamten Probenvorbereitung unterzogen.
Die Figuren zeigen dabei:
In der Figur 1 sind die Sequenzen der Isoformen 22 kDa-hGH und 20 kDa-hGH des humanen Wachstumshormons dargestellt zusammen mit den Spaltungsstel- len für die Protease Trypsin. Ebenfalls dargestellt sind einige Fragmente, die nach einer Proteolyse mit Trypsin erhalten werden, nämlich das als T6 bezeichnete Fragment, das für die 22 kDa Isoform spezifisch ist, das als T4 bezeichnete Fragment, das für die 20 kDa Isoform spezifisch ist, sowie das Fragment T12, das sowohl aus der 20 kDa als auch aus der 22 kDa Isoform wie auch mit den meisten anderen Isoformen erhalten wird und somit das gesamte Wachstumshormon widerspiegelt.
Figur 2 stellt den Ablaufplan des Verfahrens zur Bestimmung von GH mittels ID- MS dar. GH wird proteolytisch mit Hilfe des Enzyms Trypsin gespalten. GH- repräsentierende Fragmente T4, T6 und T12 (hier als Beispielfragmente ausgewählt) werden anstelle intakter Proteine quantifiziert. Als Referenzmaterialien werden 22 kDa GH (WHO IS 98/574) und 20 kDa GH in wässrigen Lösungen bekannter Konzentrationen verwendet. Gentechnisch hergestelltes U-15N 22 kDa GH, U-15N 20 kDa GH und isotopenmarkiertes T4 werden als interne Stan- dards verwendet. T4 (isotopenmarkiertes T4), T6 (isotopenmarkiertes T6) und T12 (isotopenmarkiertes T12) werden mittels semipräparativer RP- Flüssigchromatographie (pH 2) gefolgt von SCX- oder RP- Flüssigchromatographie (letztere bei pH 8) isoliert und mit LC-MS/MS gemessen1 2.
Figur 3 zeigt Fragmentionenspektren für die tryptischen Peptide T4 (A), T6 (B), und T12 (C). Die Peptide wurden jeweils im„collision-induced dissociation" (CID)-Modus im Velos Pro-Orbitrap ELITE Hybrid-Massenspektrometer fragmentiert.
Figur 4 zeigt die LC-MS/MS-Response für T12 (isotopenmarkiertes T12). Die lonenstrom-Chromatogramme wurden für Analyt-spezifische MS/MS- Übergänge aufgenommen.
Figur 5 zeigt die LC-MS/MS-Response für T4 (isotopenmarkiertes T4). Die lo- nenstrom-Chromatogrannnne wurden für Analyt-spezifische MS/MS- Übergänge aufgenommen.
Figur 6 zeigt die LC-MS/MS-Response für T6 (isotopenmarkiertes T6). Die lo- nenstrom-Chromatogramme wurden für Analyt-spezifische MS/MS- Übergänge aufgenommen. 1. Arsene CG., Schulze D., Kratzsch J., Henrion A., J. Mass Spectrom.47: 1554-
1560, 2012
2. Arsene CG., Henrion A., Diekmann N., Manolopoulou J., Bidlingmaier M., Anal. Biochem. 401 :228-235, 2010
3. Arsene CG., Ohlendorf, R., Burkitt, W., Pritchard, C, Henrion, A., O Connor, G., Bunk, D. M., Güttier, B., Anal. Chem. 80: 4154-4160, 2008.
Claims
Patentansprüche:
Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse von mindestens zwei Isoformen des Wachstumshormons (GH), wobei sich diese mindestens zwei Isoformen in ihrer Masse unterscheiden, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer Probe, die GH enthält;
b) Behandeln dieser Probe zur Aufspaltung des GH in GH- Fragmente, wobei mindestens eines der durch Aufspaltung erhaltenen GH-Fragmente spezifisch für nur eine Isoform ist;
c) gegebenenfalls Anreicherung und/oder gegebenenfalls Isolierung der erhaltenen GH-Fragmente des Schritts b);
d) Bestimmen der Mengen der GH-Fragmente in der Probe mittels eines Massenspektrometers; und
e) Bestimmen der Mengenverhältnisse der Wachstumshormon- Isoformen auf Basis der Intensitätsverhältnisse der Signale der Ionen bei den Massen von mindestens zwei massenspektromet- risch bestimmten GH-Fragmenten, wobei mindestens ein GH- Fragment hiervon spezifisch für nur eine Isoform ist.
Verfahren zum Bestimmen der Mengenverhältnisse der Isoformen des GH nach Anspruch 1 , wobei das GH das humane Wachstumshormon (hGH) ist und die Isoformen zumindest die 22 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 22000 Da umfasst und bevorzugt die mindestens eine weitere Isoform die 20 kDa-hGH Isoform mit einem Molekulargewicht von ca. 20000 Da ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei dieses Verfahren zum Nachweis der unerlaubten Einnahme des GH dient. 4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Probe eine biologische Probe, wie Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aufspaltung des GH enzymatisch oder chemisch erfolgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren zur Bestimmung der Mengenverhältnisse, insbesondere das Verfahren zum Bestimmen der Einnahme des humanen Wachstumshormons weiterhin den Schritt des Vergleichs des in der Probe bestimmten Mengenverhältnisses der Wachstumshormon-Isoformen gemäß Schritt e) mit einem Mengenverhältnis-Referenzwertebereich umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Referenzwertebereich einem entspricht von Individuen, die kein GH genommen haben und/oder Individuen, die GH genommen haben.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe gemäß Schritt a) isotopenmarkiertes hGH, insbesondere isotopenmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopenmarkiertes 20 kDa-hGH und/oder einzelne isotopenmarkierte bei der Aufspaltung gemäß Schritt b) erhaltbare hGH Fragmente zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei neben der Probe eine Kalibrierprobe mit GH und/oder Fragmenten des GH den Schritten a) bis e) unterworfen wird, um das Massenspektrometer zu kalibrieren.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Isolierung de erhaltenen GH-Fragmente mittels Flüssigchromatographie, insbesondere reversed-phase-Flüssigchromatographie erfolgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die massenspekt rometrische Bestimmung im Falle des GH nach dem Prinzip der Isotopen- verdünnungs-Massenspektrometrie (ID-MS) erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aufspaltung des GH mit Trypsin erfolgt, und im Falle des hGHs die erhaltenen hGH- Fragmente die hGH-Fragmente gemäß SEQ ID Nr. 1 (T4), SEQ ID Nr. 2 (T6) und SEQ ID Nr. 3 (T12) umfassen können, wobei das hGH-Fragment gemäß SEG ID Nr. 1 spezifisch für die 20 kDa Isoform, das hGH-Fragment gemäß SEQ ID Nr. 2 spezifisch für die 22 kDa Isoform und das hGH- Fragment gemäß SEQ ID Nr. 3 für alle hGH Isoformen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1 1 , wobei 13C und/oder 15N isotopenmarkierte hGH-Fragmente insbesondere isotopenmarkierte hGH-Fragmente gemäß
SEQ ID Nr. 1 , SEQ ID Nr. 2 und/oder SEQ ID Nr. 3, als interner Standard hinzugefügt werden.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die entstandenen GH-Fragmente mit einem Tag konjugiert sind, insbesondere mit /V-(3-iodopropyl)-/V,/V,/\/-dimethyloctylammoniumiodid konjugiert sind.
15. Kit zur Bestimmung der Einnahme von hGH umfassend isotopenmarkiertes 22 kDa-hGH und/oder isotopenmarkiertes 20 kDa-hGH und/oder isotopenmarkierte hGH-Fragmente hiervon; Mittel zur Aufspaltung des hGH und ggf. Mittel zur Aufreinigung der Fragmente.
16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zum
Nachweis der unerlaubten Einnahme von GH in der Dopinganalyse.
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