WO2015045333A1 - 心筋細胞増殖誘導剤及びこれを含有する医薬組成物、並びに心筋細胞の製造方法 - Google Patents

心筋細胞増殖誘導剤及びこれを含有する医薬組成物、並びに心筋細胞の製造方法 Download PDF

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WO2015045333A1
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acid sequence
polypeptide
seq
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望月　直樹
健 徳留
健太郎 大谷
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シミックホールディングス株式会社
独立行政法人国立循環器病研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to a cardiomyocyte proliferation inducer, a pharmaceutical composition containing the same, and a method for producing cardiomyocytes. More specifically, the present invention relates to a cardiomyocyte proliferation inducing agent containing a muskrin protein and / or a partial peptide thereof.
  • Acute loss of cardiomyocytes after myocardial infarction reduces cardiac function and leads to heart failure.
  • cardiomyocytes rapidly decrease due to apoptosis and necrosis, the interstitial vascular and non-vascular components are almost destroyed by ischemic damage, and the cardiomyocytes in the infarcted region are fibrotic non-muscular It is gradually replaced by cells and becomes scar tissue.
  • the amount of cardiomyocyte loss after myocardial infarction is a factor that determines the severity of cardiac dysfunction. In order to reduce heart failure after myocardial infarction, it is an important issue to recover the infarcted myocardial region.
  • cardiomyocytes were thought to lose the ability to terminally differentiate and divide after birth.
  • cardiomyocytes have been reported to divide under certain pathological conditions or physiological conditions (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • studies showing the division or regeneration of cardiomyocytes derived from cardiomyocytes resident immediately after myocardial infarction, stem cells circulating in the blood, or both, have been reported in the human heart (eg, non- Patent Document 2).
  • Patent Document 1 discloses a method for increasing bone formation using muskline. Subsequently, muskrin has a homologous region of natriuretic peptides (NP) and is reported to bind to natriuretic peptide receptor 3 competitively with atrial natriuretic peptide (ANP). (See Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 2 discloses a screening system for agonists and / or antagonists of muskline and its receptor.
  • the main object of the present invention is to provide a novel drug having an activity of inducing proliferation of cardiomyocytes.
  • the present inventors have found that muskrin protein and / or a partial peptide thereof has an activity to induce cardiomyocyte proliferation. Based on this finding, the present invention provides a cardiomyocyte proliferation inducing agent and a pharmaceutical composition containing any one or more of the following polypeptides (1) to (3) and / or partial peptides thereof.
  • This pharmaceutical composition can be suitably used for the treatment and / or prevention of heart disease, particularly ischemic heart disease.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and having an activity of inducing cardiomyocyte proliferation.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain any one or more of the following polypeptides (4) to (6).
  • (4) A polypeptide consisting of the 83rd to 112th amino acid sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • (5) A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • (6) A polypeptide consisting of the 80th to 130th amino acid sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the present invention relates to heart disease, particularly ischemic, comprising a procedure for administering to a subject (including humans and animals) any one or more of the following polypeptides (1) to (3) and / or partial peptides thereof:
  • a method of treating and / or preventing heart disease is also provided.
  • the present invention also provides the following method for producing cardiomyocytes.
  • a method for producing cardiomyocytes comprising a step of treating the isolated cardiomyocytes and / or progenitor cells thereof with any one or more of the following polypeptides (1) to (3) and / or partial peptides thereof: (1) A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. (2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and having an activity of inducing cardiomyocyte proliferation. (3) A polypeptide that exhibits 80% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and has an activity of inducing cardiomyocyte proliferation.
  • the present inventors have found that muskrin protein and / or partial peptides thereof have an activity of lowering blood pressure. Based on this finding, the present invention provides a blood pressure lowering agent containing any one or more of the following polypeptides (1) to (3) and / or partial peptides thereof. Therefore, the pharmaceutical composition according to the present invention can be suitably used for the treatment and / or prevention of hypertension and hypertension-related diseases in addition to the treatment and / or prevention of ischemic heart disease.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having an activity of lowering blood pressure.
  • the present invention relates to hypertension and hypertension-related diseases, including a procedure for administering to a subject (including humans and animals) any one or more of the following polypeptides (1) to (3) and / or partial peptides thereof: Also provided are methods of treatment and / or prevention.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having an activity of lowering blood pressure.
  • heart diseases particularly include ischemic heart diseases
  • examples of ischemic heart diseases include impending myocardial infarction, myocardial infarction, ischemic cardiomyopathy, angina pectoris, and heart failure after myocardial infarction.
  • the heart disease in the present invention widely includes heart diseases accompanied by myocardial cell death, such as congestive cardiomyopathy, hypertrophic obstructive cardiomyopathy, hypertrophic non-occlusive cardiomyopathy, idiopathic cardiomyopathy, It includes myocarditis, chronic heart failure, valvular disease, coronary artery disease, post-heart syndrome, post-myocardial infarction syndrome (Dressler syndrome), and the like.
  • Hypertension-related diseases include stroke, congestive heart failure; cardiac hypertension; cardiac fibrosis; hypertensive heart disease (hypertensiveperheart disease); post-infarction cardiomyopathy; nephropathy, angiopathy, neuropathy, etc. Disease; coronary vascular disease; restenosis after angioplasty; elevated intraocular pressure; glaucoma; abnormal vascular proliferation; hyperaldosteronism; anxiety and cognitive impairment.
  • a novel drug having an activity of inducing proliferation of cardiomyocytes is provided.
  • Cardiomyocyte proliferation inducer The present inventors have found that the gene transfer of musculin or administration of a partial peptide thereof induces the division and proliferation of cardiomyocytes (see Examples), and the muskrin protein and / or part thereof. It was revealed that the peptide is useful as a cardiomyocyte proliferation inducer.
  • the polypeptide which is an active ingredient in the cardiomyocyte proliferation inducing agent according to the present invention may be a human musculin protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide which is an active ingredient consists of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and has an activity of inducing proliferation of cardiomyocytes. It may be a polypeptide.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is not particularly limited as long as the polypeptide can maintain cardiomyocyte proliferation inducing activity.
  • the polypeptide as the active ingredient may be a polypeptide having the following amino acid sequence.
  • amino acids are classified into hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, Y), sulfur Amino acids having atom-containing side chains (C, M), amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), aromatic It is classified into amino acids (H, F, Y, W) having a containing side chain.
  • hydrophobic amino acids A, I, L, M, F, P, W, Y, V
  • hydrophilic amino acids R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T
  • G, A, V, L, I, P amino acid having
  • amino acids classified into each group are likely to maintain the activity of the polypeptide when substituted with each other, and such mutual substitution of amino acids is preferred.
  • examples thereof include substitution between glycine and proline, glycine and alanine or valine, leucine and isoleucine, glutamic acid and glutamine, aspartic acid and asparagine, cysteine and threonine, threonine and serine or alanine, and lysine and arginine.
  • the polypeptide which is an active ingredient consists of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and may be a polypeptide having an activity of inducing proliferation of cardiomyocytes. Good.
  • the sequence identity is not particularly limited as long as the peptide can maintain cardiomyocyte proliferation-inducing activity, but may be 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and particularly preferably 90%. More particularly, it may be 95% or more, most preferably 98% or more.
  • the polypeptide which is an active ingredient in the cardiomyocyte proliferation inducing agent according to the present invention includes, in addition to the human musculin protein represented by SEQ ID NO: 1, a mouse musculin protein, rat musculin protein, bovine musk represented by SEQ ID NO: 3. Includes phosphoproteins.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequences of human, bovine, mouse and rat musculin proteins.
  • the polypeptide which is an active ingredient includes a musculin homolog protein in various organisms such as monkeys, dogs, pigs and rabbits.
  • the active ingredient in the cardiomyocyte proliferation inducing agent according to the present invention may be a partial peptide of the above polypeptide.
  • the amino acid sequence of the partial peptide can be the amino acid sequence of any part of the polypeptide as long as it has cardiomyocyte proliferation inducing activity.
  • Preferred amino acid sequences of the partial peptide include the 83rd to 112th amino acid sequences of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and the 80th to 130th amino acid sequences of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 (implementation) See example).
  • FIG. 1 shows a polypeptide consisting of the 83rd to 112th amino acid sequence of amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 (humanM (83-112)) and the 80th to 130th amino acid sequence of amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of a polypeptide consisting of (mouse M (80-130)) is shown.
  • the amino acid sequence of “KKKR” present on the N-terminal side of humanM (83-112) and the amino acid sequence of “KRR” present on the C-terminal side are cleavage sites by proteases.
  • Musculin is presumed to be a secreted protein, and the musculin protein may exhibit cardiomyocyte proliferation-inducing activity in a state where it is cleaved by a protease at the above-mentioned cleavage site into a partial peptide. Therefore, as a partial peptide that can exhibit activity, first, a polypeptide consisting of the 83rd to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 (humanM (83-133)) and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 are used.
  • Examples include polypeptides consisting of amino acid sequences 80 to 130 (mousM (80-130)), and humanM (83-112) and humanM (116-133) and mouseM (80 -109) and mouseM (113-130) peptides (see FIG. 1).
  • the partial peptide as an active ingredient consists of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the partial peptide of the above polypeptide and has an activity of inducing cardiomyocyte proliferation. It may be a peptide.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is not particularly limited as long as the peptide can maintain cardiomyocyte proliferation inducing activity.
  • the partial peptide which is an active ingredient may be a polypeptide having the following amino acid sequence.
  • the active polypeptide is humanM (83-112), humanM (116-133), humanM (83-133), mouseM (80-109), mouseM (113-130) or mouseM (80-130).
  • a polypeptide having an activity of inducing proliferation of cardiomyocytes is not particularly limited as long as the peptide can maintain cardiomyocyte proliferation-inducing activity, but may be 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and particularly preferably 90%. More particularly, it may be 95% or more, most preferably 98% or more.
  • the partial peptides which are active ingredients in the cardiomyocyte proliferation inducing agent according to the present invention include humanM (83-112), humanM (116-133), humanM (83-133), mouseM (80-109), mouseM.
  • a partial peptide of musculin homologue in various organisms such as monkeys, dogs, cows, pigs, rats and rabbits, comprising humanM (83-112), Peptides consisting of amino acid sequences corresponding to humanM (116-133), humanM (83-133), mouseM (80-109), mouseM (113-130) and mouseM (80-130) are included.
  • the musculin protein and its partial peptide which are active ingredients in the cardiomyocyte proliferation inducing agent according to the present invention, may be modified with fatty acid or polyethylene glycol.
  • fatty acid or polyethylene glycol As long as an improvement in medicinal effect and safety is recognized, the length and degree of unsaturation of the modified fatty acid or the molecular weight and degree of branching of polyethylene glycol are not limited.
  • fatty acids having 10 to 20 carbon atoms or polyethylene glycol having a molecular weight of 4000 to 20000 are used.
  • Antihypertensive agent The present inventors have found that administration of a partial peptide of musculin protein lowers blood pressure (see Examples), and that musculin protein and / or its partial peptide are useful as a hypotensive agent. Was revealed.
  • the active ingredient in the antihypertensive agent according to the present invention is the same as the polypeptide of the above-mentioned cardiomyocyte proliferation inducer and its partial peptide.
  • composition Therapeutic / preventive agent for ischemic heart disease
  • the pharmaceutical composition according to the present invention effectively uses the above-mentioned cardiomyocyte proliferation inducer (or the polypeptide contained in the cardiomyocyte proliferation inducer and its partial peptide). Contains as a component. Since this pharmaceutical composition is capable of inducing cardiomyocyte division and proliferation, it is useful for regenerating cardiomyocytes damaged by heart disease, particularly ischemic heart disease, and restoring cardiac function. It can be suitably used for the treatment and / or prevention of myocardial infarction and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is the above-described antihypertensive agent (or a polypeptide and a partial peptide thereof contained in the antihypertensive agent). Is contained as an active ingredient. Since this pharmaceutical composition is capable of lowering blood pressure, it can be suitably used for the treatment and / or prevention of hypertension and hypertension related diseases (stroke, heart disease, kidney disease, etc.).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises a cardiomyocyte proliferation inducer or a blood pressure lowering agent (or a polypeptide and a partial peptide thereof) alone or mixed with a solubilizing agent, a bulking agent, an excipient or a carrier. Then, it can be used as preparations such as injections, tablets, granules, fine granules, powders, capsules, solutions and sustained-release agents.
  • a solubilizer, a bulking agent, an excipient or a carrier a pharmaceutically acceptable one is selected, and the type and composition thereof can be appropriately determined depending on the administration route and the administration method.
  • saccharides such as sodium chloride, glucose and mannitol are generally desirable.
  • starch, lactose, crystalline cellulose, magnesium stearate and the like are desirable.
  • the administration route of the pharmaceutical composition according to the present invention is systemically administered orally or parenterally by injection. Further, it may be administered remotely through a catheter or the like, or the drug may be bound to a stent, a graft, or an integrated stent graft. Furthermore, it may be administered in sustained release by indwelling in the body. In particular, oral administration is preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is determined in consideration of the type of dosage form, the administration method, the age and weight of the administration subject (including humans and animals), symptoms, etc.
  • the amount is sufficient to cure or at least partially block symptoms such as ischemic heart disease or hypertension.
  • the administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain, as an active ingredient, a drug that has already been clinically applied for the treatment of myocardial infarction or hypertension or a drug that is in the research stage.
  • Clinically applied myocardial infarction drugs include ⁇ -blockers, renin / angiotensin / aldosterone inhibitors (ACE inhibitors, angiotensin receptor antagonists, aldosterone antagonists, renin inhibitors), antiplatelet drugs, anticoagulants Drugs, lipid metabolism abnormality improvers (hyperlipidemic drugs, cholesterol-lowering drugs, HDL-elevating drugs), diabetes drugs, nitrate drugs, nicorandil, antiarrhythmic drugs and cardiotonic drugs, angiotensin receptor antagonists and neutral endopeptidases Inhibitor compounding agents and the like.
  • ACE inhibitors angiotensin receptor antagonists
  • aldosterone antagonists aldosterone antagonists
  • renin inhibitors antiplatelet drugs
  • Antihypertensive drugs include renin / angiotensin / aldosterone system inhibitors (ACE inhibitors, angiotensin receptor antagonists, aldosterone antagonists, renin inhibitors), ⁇ -blockers, calcium antagonists, diuretics, etc. . *
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be combined with the above-mentioned drug already applied clinically or a drug in the research stage.
  • “combined” means that when two or more medicaments are administered at different times, when each medicament is administered at the same time, one kind of pharmaceutical composition comprising two or more medicaments is administered. If you mean. In the former two cases, each of two or more medicaments may be administered by the same route of administration, or may be administered by different routes of administration. Each medicament is administered in an amount sufficient to cure or at least partially block symptoms to the patient. The administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • a cardiomyocyte proliferation-inducing agent containing muskulin protein and / or a partial peptide thereof can be used for producing cardiomyocytes in vitro.
  • the cardiomyocyte production method includes, as one aspect, the above-described cardiomyocyte proliferation inducer (or the polypeptide contained in the cardiomyocyte proliferation inducer and a portion thereof) on the isolated cardiomyocytes and / or precursor cells thereof. Peptide).
  • This step can be performed by culturing cells separated from a living body by a conventional method and adding musculin protein and / or a partial peptide thereof to the culture solution.
  • the cells divide and proliferate by a cardiomyocyte division-inducing action such as muskulin protein, and a large number of cardiomyocytes are obtained.
  • cardiomyocyte progenitor cell is not particularly limited, but cells having the ability to differentiate into cardiomyocytes such as embryonic stem cells (ES cells), inducible stem cells (iPS cells), and mesenchymal stem cells may be used. included.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells inducible stem cells
  • mesenchymal stem cells may be used. included.
  • the obtained cardiomyocytes can be used as a transplant material to the heart in the form of cell dispersion, cell sputum and cell sheet, etc., and can be used for various tests such as drug screening and toxicity evaluation using cardiomyocytes. it can.
  • the cardiomyocyte production method includes, as one aspect, the above-described cardiomyocyte proliferation inducer (or the cardiomyocyte proliferation inducer) on the isolated cardiomyocytes and / or precursor cells thereof. It may include a step of introducing a gene encoding a polypeptide to be contained and a partial peptide thereof in an expressible manner.
  • Musculin gene introduction may be carried out by introducing DNA comprising the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 2 and 4 into cells using a commonly used vector or gene introduction reagent.
  • a partial peptide of musculin can also be expressed by gene transfer by modifying the base sequence of DNA consisting of the base sequences described in SEQ ID NOs: 2 and 4 by a known technique.
  • Tg (Cmlc2: Fucci) strain (cell cycle visualization zebrafish) A transgenic line produced by crossing Tg (Cmlc2: mVenus zGeminin (1/100)) and Tg (Cmlc2: mCherry-zCdt1 (1/190)).
  • the Tg (Cmlc2: Fucci) line expresses mVenus-geminin (green) and mCherry-Cdt1 (red) in cardiomyocytes.
  • the Tol2 transposon system was used to establish the transgenic lines (2) and (3) above.
  • a sequence expressing mVenus-zGeminin (1/100), mCherry-zCdt1 (1/190), or NLS-mCherry was incorporated into the Tol2 transposon vector downstream of the Cmlc2 promoter.
  • 30 pg of plasmid DNA and 25 pg of Tol2 transferase mRNA were injected into the blastomere of 1 ⁇ cell stage embryo of AB strain.
  • Hearts were removed with tweezers from a cell cycle visualization zebrafish of a tricaine-anesthetized 84 hour embryo. Hearts were collected in HBSS on ice using a Pipetteman. After washing twice with PBS, 1 ml of enzyme solution (5 mg / ml trypsin, 1 mM EDTA / PBS, pH 8.0) was added to separate the cells. Incubating at 37 ° C. for 60 min while pipetting every 30 min. Thereafter, 200 ⁇ l of a reaction stop solution (30% FBS, 6 mM CaCl 2 / PBS) was added to stop the enzyme reaction.
  • a reaction stop solution (30% FBS, 6 mM CaCl 2 / PBS
  • the separated cardiomyocytes were separated using FACSAria III (BD). From SYTOX ⁇ ⁇ Blue dead cell stain (-) live cell populations, S / G2 / M phase cell population (mVenus (+) ⁇ mCherry (-)) and G0 / G1 phase cell population (mVenus (-) ⁇ mCherry (-) +)) Were separated and each recovered in suspension.
  • ⁇ Test Example 2 Identification of a gene expressed in dividing cardiomyocytes> By extracting mRNA from the dividing cardiomyocytes isolated in Test Example 1 and performing sequencing, genes expressed in the dividing cardiomyocytes were comprehensively identified.
  • RNA samples for RNASequence were prepared according to the method of the kit. After recovering 5,000 cells or more, Total RNA was extracted from the cells using NucleoSpin RNA XS (Takara). Reverse transcription from RNA to DNA was performed using cDNA Synthesis-Kits-SMARTer Ultra Low Input RNA RNA for Illumina Sequencing (Clontech). The reverse-transcribed DNA was amplified using Advantage 2 PCR PCR Kit (Takara), and cDNA library was prepared. Using Covaris S220 (MS Instruments Co., Ltd.), the cDNA was fragmented to 200 bp.
  • muskrin was identified as a gene whose expression is increased in dividing cardiomyocytes and a gene other than a cell cycle-related factor.
  • the expression level of musculin in mitotic cells was 5.67 times that of quiescent cells.
  • Example 3 Expression analysis of muskline in a myocardial injury model> The expression of musculin in the heart of a myocardial injury model was analyzed by the following procedure.
  • the fixed tissue was treated with 10% sucrose / PBS at 4 ° C. for 4 hours for 4 hours and 20% sucrose / PBS at 4 ° C. for overnight, then embedded and frozen in liquid nitrogen.
  • a cryostat CM 1850, Leica
  • a section with a thickness of 14 ⁇ m was prepared and affixed to a slide glass. It dried with the dryer (cold air) and preserve
  • the frozen section slide was washed with RNase-free water and then permeabilized with proteinase K (20 ⁇ g / ml). After adding 4% PFA / PBS and re-fixing at room temperature for 15 min, it was washed well with PBST. After prehybridization with hybridization solution at 65 ° C for 1 hr, add DIG (digoxigenin) -labeled RNA probe dissolved in hybridization solution and hybridize overnight at 65 ° C with parafilm on top to prevent drying. did.
  • DIG digoxigenin
  • Section slides are washed with maleic acid solution (0.1M maleic acid, pH 7.5) for 15 min at room temperature, blocking solution (0.1M maleic acid, pH 7.5, 5% sheep serum, 2% blocking reagent (Roche) ), Blocking for 60 min, followed by addition of anti-DIG antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche) and shaking at 4 ° C overnight. The next day, the plate was washed 5 times with PBST, and the staining reaction was started using BM-purple AP substarate (Roche). At the end of staining, the cells were washed with PBST and fixed with 4% PFA / PBS. After washing with PBST, it was gradually replaced with glycerol, and photographed with a stereomicroscope (MVX10, Olympus).
  • MVX10 stereomicroscope
  • the above DIG-labeled RNA probe was prepared as follows. A primer corresponding to the target gene sequence was prepared, and a pCR4blunt TOPO vector (Invitrogen) incorporating the full length of the zMusclin cDNA sequence (SEQ ID NO: 5) was prepared. Cleavage was performed using a restriction enzyme site present only on the upstream 5 ′ end side of the gene sequence, and the sample was precipitated with ethanol. To DNA 3 ⁇ g, add DIG mix (Roche) 1 ⁇ l, RNase inhibitor (Roche) 1 ⁇ l, T3 or T7 promoter RNA polymerase (Roche) 1 ⁇ l, 37 ° C, 120 min Reacted.
  • Example 1 Evaluation of cardiomyocyte proliferation-inducing action of muskline by in vivo gene transfer> Zebrafish musculin mRNA was introduced into embryos of the developing zebrafish by microinjection, and the proliferation-inducing activity of musculin on cardiomyocytes was evaluated.
  • mRNA was injected into the blastomere of 1 cell stage embryo of Tg (Cmlc2: NLS-mCherry) strain.
  • mRNA was synthesized using mMESSAGE®mMACHINE®kit® (Ambion) ®.
  • a cDNA sequence encoding the full length of the molecule to be synthesized was incorporated into pCS2 + vector (Clontech) and sequenced to confirm the sequence.
  • Proteinase K 100 mg / ml
  • 0.5% SDS treatment was performed, and the inactivated RNase was precipitated with ethanol and dissolved in RNase free-water.
  • MRNA was synthesized from the cleaved template DNA using SP6 RNA polymerase.
  • concentration of RNA was measured by NanoPhotometer® (IMPLEN), and it was confirmed that the RNA was not degraded by electrophoresis using an agarose gel.
  • transgenic zebrafish that expresses musculin downstream of the Cmlc2 promoter was prepared, and the effect of increasing the number of cardiomyocytes by gene introduction of musculin was examined.
  • Establishment of the transgenic line was carried out by the method described above.
  • Example 2 Evaluation of cardiomyocyte proliferation-inducing action of muskline by in vitro peptide treatment> The cultured cardiomyocytes were treated with a partial peptide of musculin protein, and the proliferation-inducing activity of musculin on cardiomyocytes was evaluated.
  • a mouse neonatal cardiomyocyte kit (Primary Cell) was used.
  • the attached fibronectin solution was added to the dish and allowed to stand overnight in a 37 ° C. incubator for coating.
  • the dish was washed twice with sterile water immediately before use.
  • Cardiomyocytes are seeded in the center of the dish using 200 ⁇ l of the attached culture medium so that the density becomes 1.3 ⁇ 10 5 cells / dish (first time) and 9 ⁇ 10 4 cells / dish (second day).
  • the cells were cultured in a 37 ° C. incubator in the presence of% CO 2 .
  • At 6 hr after sowing 1 ml of culture medium was added to the dish.
  • the culture medium was exchanged 16 hours after seeding to remove cells that did not adhere.
  • the culture medium was changed 88 hours after sowing only the samples treated for 6 days.
  • test substance was started 24 hours after seeding, and more reagents were added every 24 hours.
  • the following substances were used as test substances.
  • Two dishes were prepared for each test substance.
  • FGF2 human
  • peptide peptide consisting of amino acid sequence 80 to 130 of the amino acid sequence of mouse musculin (SEQ ID NO: 3) (Phoenix Pharmaceuticals), final concentrations 1 nM, 10 nM, 100 nM
  • hMusclin (83-112) peptide peptide consisting of the amino acid sequence of amino acids 83 to 112 of human mucrine amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) (Phoenix Pharmaceuticals), final concentrations 1 nM, 10 nM, 100 nM
  • EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) was added to a final concentration of 10 ⁇ M 6 hr after the start of the test substance treatment. In the case of 6-day stimulation, EdU was added 78 hours after the start of stimulation. From the start of the test substance treatment, the cells were washed twice with PBS for 72 hours or 144 hours, 4% PFA / PBS was added, and the cells were fixed at room temperature for 20 minutes.
  • the fixed samples were stained with EdU according to the method of Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging kit (Invitrogen), and then immunofluorescent stained.
  • 0.5% Triton X-100 / PBS was added and permeabilization was performed at room temperature for 20 min. Reaction cocktail was added and reacted at room temperature for 30 minutes, and Alexa-Fluor-647-side was added to EdU.
  • 4% BSA was treated at room temperature for 1 hr and blocked, and anti-MF20 antibody (IOWA hybridoma bank) as a primary antibody was diluted 200 times, and anti-Phospho-Histone H3 (Ser10) antibody (Millipore) was diluted 100 times and reacted for 1 hr. .
  • AlexaAFluorlex488 goat anti-rabbit IgG conjugate highly cross-absorbed Invitrogen
  • Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG conjugate highly cross-absorbed Invitrogen
  • FIG. A shows the percentage of EdU-positive cardiomyocytes when stimulated with mMusclin (80-130) peptide for 3 days.
  • B shows the percentage of EdU positive cardiomyocytes when stimulated with mMusclin (80-130) peptide or hMusclin (83-112) peptide for 6 days.
  • the vertical axis represents the average value of the ratio of dividing cardiomyocytes (EdU positive cardiomyocytes).
  • the treatment of Musclin 100 nM was able to induce the proliferation of cardiomyocytes to the same extent as the FGF treatment.
  • the proliferation-inducing action of cardiomyocytes was higher with the mMusclin (80-130) peptide than with the hMusclin (83-112) peptide.
  • Example 3 Evaluation of blood pressure-lowering effect of muskline by in vivo peptide administration> Mucrine protein partial peptides were intravenously administered to mice, and the blood pressure lowering effect of musculin was evaluated.
  • Example 4 Evaluation of cardiomyocyte proliferation-inducing action of muskline by in vivo peptide administration> Using a mouse myocardial infarction model, the proliferation-inducing activity of musculin on cardiomyocytes and the therapeutic effect of myocardial infarction were evaluated.
  • mice 8 week old male C57BL / 6J mice (20) were used.
  • an osmotic pump (with an intravenous administration catheter) filled with muskline was implanted subcutaneously under pentobarbital anesthesia, and the catheter was placed in the blood vessel from the left jugular vein.
  • mMusclin 80-130 dissolved in distilled water was administered at 0.05 ⁇ g / kg body weight / min in a total of about 50 to 100 ⁇ g. Distilled water was administered to the control group (10 animals).
  • the survival rate was determined with an observation period of 2 weeks, and the surviving mice were evaluated for cardiac function by echocardiography, and the heart weight was measured after killing the experiment. After preparing the tissue section, Masson trichrome staining was performed, and the positive staining site was evaluated as an infarct.
  • FIGS. FIG. 7 shows the survival rate change (2 weeks) of the control group and the test group.
  • FIGS. 8 and 9 show the macroscopic findings and tissue staining images of the hearts of the group (A), the control group (B), and the test group (C) subjected to sham operation (sham operation).
  • sham operation sham operation

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Abstract

心筋細胞の増殖を誘導する活性を有する新規薬剤として、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する心筋細胞増殖誘導剤及び医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、心疾患、特に虚血性心疾患の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。 （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。 （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。

Description

心筋細胞増殖誘導剤及びこれを含有する医薬組成物、並びに心筋細胞の製造方法
　本発明は、心筋細胞増殖誘導剤及びこれを含有する医薬組成物、並びに心筋細胞の製造方法に関する。より詳しくは、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドを含有する心筋細胞増殖誘導剤などに関する。
　心筋梗塞後の心筋細胞の急性損失は、心機能を低下させ、心不全をもたらす。心筋梗塞が生じた場合、心筋細胞はアポトーシスおよびネクローシスにより迅速に減少し、間質の脈管成分および非脈管成分が虚血性損傷によりほぼ破壊され、梗塞領域中の心筋細胞が線維性非筋細胞によって徐々に取って代わられ瘢痕組織になる。心筋梗塞後の心筋細胞の損失量は、心機能不全の重症度を決定する因子である。心筋梗塞後の心不全を軽減するため、梗塞心筋領域を回復することが重要な課題となっている。
　従来、心筋細胞は、生後、最終分化し、分裂する能力を失うと考えられていた。しかし、心筋細胞は、ある病態下または生理的条件下で分裂することが報告された（例えば、非特許文献１参照）。その後、心筋梗塞直後に常在する心筋細胞、血中を循環する幹細胞、またはこれらの両方の細胞に由来する心筋細胞の分裂または再生を示す研究が、ヒトの心臓において報告された（例えば、非特許文献２参照）。
　現在、心筋梗塞後、早期に再灌流および化学薬剤を投与することによって心筋細胞死を減少させ、梗塞心筋領域を縮小させる治療が試みられている。しかし、これらの治療では、損傷した心筋細胞を再生できず、心臓の損傷した機能を復帰させることもできない。
　ここで、本発明に関連して、ムスクリン（Ｍｕｓｃｌｉｎ）について説明する。ムスクリンは、当初、オステオクリン（ｏｓｔｅｏｃｒｉｎ）の名称で、骨格筋由来の分泌タンパクとして報告された（非特許文献３，４参照）。特許文献１には、ムスクリンを用いて骨形成を増加させる方法が開示されている。その後、ムスクリンは、ナトリウム利尿ペプチド（natriuretic peptides: NP）の相同領域を有し、心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic peptide: ANP）と競合的にナトリウム利尿ペプチド受容体３に結合することが報告された（非特許文献５参照）。特許文献２には、ムスクリンとその受容体のアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニング系が記載されている。
　これらのムスクリンに関する先行技術文献には、ムスクリンと心筋細胞との関連については一切報告がなされていない。
米国特許公開第２００７／００４９５２１号 米国特許公開第２０１１／０１０４７０５号
J. Circ. Res., 1998, 83,1-14 N. Eng. J. Med., 2001, 344, 1750-1757 J. Bio. Chem., 2004, 279, 19391-19395 J. Bio. Chem., 2003, 278, 50563-50571 J. Endocrinol., 2009, 201, 287-95
　心筋梗塞後の損傷した心筋細胞を再生させ、心臓の機能を復帰させるため、心筋細胞の分裂、増殖を誘導するための技術が求められている。そこで、本発明は、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有する新規薬剤を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが心筋細胞の増殖を誘導する活性を有することを見い出した。この知見に基づき、本発明は、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する心筋細胞増殖誘導剤及び医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、心疾患、特に虚血性心疾患の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
　本発明に係る医薬組成物は、以下の（４）～（６）のポリペプチドのいずれか１以上を含有するものであってもよい。
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目～１１２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（５）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（６）配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目～１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本発明は、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者（ヒト及び動物を含む）に投与する手順を含む、心疾患、特に虚血性心疾患の治療及び／又は予防方法をも提供する。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
　また、本発明は、以下の心筋細胞の製造方法も提供する。
　分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を処理する工程を含む、心筋細胞の製造方法。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
　さらに、本発明者らは、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが血圧を降下させる活性を有することを見い出した。この知見に基づき、本発明は、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する血圧降下剤を提供する。従って、本発明に係る上記医薬組成物は、虚血性心疾患の治療及び／又は予防に加えて、高血圧及び高血圧関連疾患の治療及び／又は予防のためにも好適に用いられ得る。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
　本発明は、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者（ヒト及び動物を含む）に投与する手順を含む、高血圧及び高血圧関連疾患の治療及び／又は予防方法をも提供する。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
　本発明において、心疾患には、特に虚血性心疾患が含まれ、虚血性心疾患としては、切迫心筋梗塞、心筋梗塞、虚血性心筋症、狭心症及び心筋梗塞後の心不全が例示される。さらに、本発明における心疾患には、心筋の細胞死を伴う心疾患が広く包含され、例えば、うっ血性心筋症、肥大型閉塞性心筋症、肥大型非閉塞性心筋症、特発性心筋症、心筋炎、慢性心不全、弁膜症、冠動脈疾患、心術後症候群、心筋梗塞後症候群（ドレスラー症候群）などが含まれるものとする。また、高血圧関連疾患には、脳卒中、うっ血性心不全；心臓性高血圧；心臓線維症；高血圧症性心臓疾患（hypertensive heart disease）；梗塞後心筋症；腎症、血管症、神経障害などの糖尿病合併症；冠血管疾患；血管形成術後の再狭窄；眼圧上昇；緑内障；異常血管増殖；高アルドステロン症；不安状態および認知障害が含まれるものとする。
　本発明により、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有する新規薬剤が提供される。
ヒト、ウシ、マウス及びラットのムスクリンのアミノ酸配列のアラインメントである。 心筋障害モデルにおけるムスクリンの発現解析結果を示す写真である。 ムスクリンmRNAをマイクロインジェクションしたゼブラフィッシュ胚における心筋細胞数の計測結果を示すグラフである。 ムスクリン発現トランスジェニックゼブラフィッシュにおける心筋細胞数の計測結果を示すグラフである。 ムスクリンの培養心筋細胞に対する増殖誘導活性を評価した結果を示すグラフである。 ムスクリンの血圧降下作用を評価した結果を示すグラフである。 マウス心筋梗塞モデルにムスクリンを投与し、生存率の変化を評価した結果を示すグラフである。 ムスクリンを投与したマウス心筋梗塞モデルの心臓の肉眼所見を示す写真である。（Ａ）は偽手術を行った群、Ｂは対照群（蒸留水投与群）、Ｃは試験群（ムスクリン投与群）の結果を示す。 ムスクリンを投与したマウス心筋梗塞モデルの心臓の組織染色像を示す写真である。（Ａ）は偽手術を行った群、Ｂは対照群（蒸留水投与群）、Ｃは試験群（ムスクリン投与群）の結果を示す。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
１．心筋細胞増殖誘導剤
　本発明者らは、ムスクリンの遺伝子導入あるいはその部分ペプチドの投与により、心筋細胞の分裂及び増殖が誘導されることを見出し（実施例参照）、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが心筋細胞増殖誘導剤として有用であることを明らかにした。
［ポリペプチド］
　本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分であるポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるヒトムスクリンタンパクであってよい。
　また、有効成分であるポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸数は、当該ポリペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り、特に限定されない。
　有効成分であるポリペプチドは、より具体的には、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。
（ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列の１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列に１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号１記載のアミノ酸配列に１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）～（ｉｖ）の欠失、置換、挿入もしくは付加が組み合わされたアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸が置換する場合は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニンまたはバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
　さらに、有効成分であるポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。配列同一性は、当該ペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り特に限定されないが、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であってもよく、特に好ましくは９０％以上、さらに特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であってもよい。
　従って、本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分であるポリペプチドには、配列番号１記載のヒトムスクリンタンパクに加えて、配列番号３記載のマウスムスクリンタンパク、ラットムスクリンタンパク、ウシムスクリンタンパクなどが含まれる。図１に、ヒト、ウシ、マウス及びラットのムスクリンタンパクのアミノ酸配列を示す。この他、有効成分であるポリペプチドは、サル、イヌ、ブタ及びウサギなどの種々の生物におけるムスクリンホモログのタンパクが含まれる。
［部分ペプチド］
　本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分は、上記ポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。部分ペプチドのアミノ酸配列は、心筋細胞増殖誘導活性を有する限りにおいて、上記ポリペプチドの任意の部分のアミノ酸配列とすることができる。
　部分ペプチドの好ましいアミノ酸配列としては、配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目～１１２番目のアミノ酸配列、及び、配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目～１３０番目のアミノ酸配列が例示される（実施例参照）。
　図１に、配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目～１１２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２））と、配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目～１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０））のアミノ酸配列を示す。ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）のＮ末端側に存在する「ＫＫＫＲ」のアミノ酸配列、及びＣ末端側に存在する「ＫＲＲ」のアミノ酸配列は、プロテアーゼによる切断部位である。
　ムスクリンは分泌タンパクと推定され、ムスクリンタンパクは上記の切断部位においてプロテアーゼにより切断されて部分ペプチドとなった状態で、心筋細胞増殖誘導活性を示している可能性がある。従って、活性を示し得る部分ペプチドとしては、まず、配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目～１３３番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｈｕｍａｎＭ（８３‐１３３））及び配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目～１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０））が挙げられ、さらにこれらのポリペプチドの切断によって生じるｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）及びｈｕｍａｎＭ（１１６‐１３３）並びにｍｏｕｓｅＭ（８０‐１０９）及びｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）のペプチドも挙げられる（図１参照）。
　また、有効成分である部分ペプチドは、上記ポリペプチドの部分ペプチドにおいて１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸数は、当該ペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り、特に限定されない。
　有効成分である部分ペプチドは、より具体的には、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。
（ｉ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列において、１～１５個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列の１～１５個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列に１～１５個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列に１～１５個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）～（ｉｖ）の欠失、置換、挿入もしくは付加が組み合わされたアミノ酸配列が挙げられる。
　さらに、有効成分であるポリペプチドは、ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）又はｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチドであってもよい。配列同一性は、当該ペプチドが心筋細胞増殖誘導活性を維持し得る限り特に限定されないが、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であってもよく、特に好ましくは９０％以上、さらに特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であってもよい。
　従って、本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分である部分ペプチドには、ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）及びｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）に加えて、サル、イヌ、ウシ、ブタ、ラット及びウサギなどの種々の生物におけるムスクリンホモログの部分ペプチドであって、ｈｕｍａｎＭ（８３‐１１２）、ｈｕｍａｎＭ（１１６－１３３）、ｈｕｍａｎＭ（８３－１３３）、ｍｏｕｓｅＭ（８０－１０９）、ｍｏｕｓｅＭ（１１３‐１３０）及びｍｏｕｓｅＭ（８０‐１３０）に対応するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。
　本発明に係る心筋細胞増殖誘導剤における有効成分であるムスクリンタンパク及びその部分ペプチドは、脂肪酸やポリエンチレングリコールで修飾されていてもよい。薬効や安全性の改善が認められる限り、修飾される脂肪酸の長さや不飽和度あるいはポリエチレングリコールの分子量や分岐度は限定されない。好ましくは、炭素数１０～２０の脂肪酸あるいは分子量４０００～２００００のポリエチレングリコールが用いられる。
２．血圧降下剤
　本発明者らは、ムスクリンタンパクの部分ペプチドの投与により、血圧が降下することを見出し（実施例参照）、ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドが血圧降下剤として有用であることを明らかにした。
　本発明に係る血圧降下剤における有効成分は、上述の心筋細胞増殖誘導剤のポリペプチド及びその部分ペプチドと同一である。
３．医薬組成物
（１）虚血性心疾患治療・予防薬
　本発明に係る医薬組成物は、上述の心筋細胞増殖誘導剤（あるいは、心筋細胞増殖誘導剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を有効成分として含有する。この医薬組成物は、心筋細胞の分裂及び増殖を誘導することが可能であるので、心疾患、特に虚血性心疾患により損傷した心筋細胞を再生させ、心臓の機能を復帰させるために有用であり、心筋梗塞等の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。
（２）高血圧及び高血圧関連疾患治療・予防薬
　また、本発明に係る医薬組成物は、他の一側面において、上述の血圧降下剤（あるいは、血圧降下剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を有効成分として含有する。この医薬組成物は、血圧を降下させることが可能であるので、高血圧及び高血圧関連疾患（脳卒中、心疾患及び腎疾患等）の治療及び／又は予防のため好適に用いられ得る。
　本発明に係る医薬組成物は、心筋細胞増殖誘導剤又は血圧降下剤（あるいは、それらに含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を単独で、又は溶解剤、増量剤、賦形剤あるいは担体と混合して、注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、溶液剤、徐放剤等の製剤として用いることができる。溶解剤、増量剤、賦形剤あるいは担体などの添加剤は、薬剤学的に許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって適宜決定され得る。例えば注射剤の場合、一般に食塩、グルコ－ス、マンニト－ル等の糖類が望ましい。経口剤の場合、でんぷん、乳糖、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム等が望ましい。
　本発明に係る医薬組成物の投与経路は、経口的又は注射剤により非経口的に全身性に投与される。また、カテーテル等により遠隔的に投与してもよく、ステントやグラフトあるいは一体化させたステントグラフトに薬剤を結合させてもよい。さらに、体内に留置することにより徐放性に投与してもよい。特に経口投与が好ましい。
　本発明に係る医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、投与対象（ヒト及び動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものであるが、患者の虚血性心疾患又は高血圧等の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量とされる。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
　本発明に係る医薬組成物は、心筋梗塞治療又は高血圧治療のために既に臨床応用されている薬剤や研究段階にある薬剤を有効成分として含有していてもよい。臨床応用されている心筋梗塞治療薬としては、β遮断薬、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系阻害薬（ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、レニン阻害薬）、抗血小板薬、抗凝固薬、脂質代謝異常改善薬（高脂血症治療薬、コレステロール低下薬、HDL上昇薬）、糖尿病治療薬、硝酸薬、ニコランジル、抗不整脈薬及び強心薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬と中性エンドペプチダーゼ阻害薬の配合剤などが挙げられる。また、高血圧治療薬としては、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系阻害薬（ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、レニン阻害薬）、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、利尿薬などが挙げられる。　
　本発明に係る医薬組成物は、他の態様として、上述した既に臨床応用されている薬剤や研究段階にある薬剤と組み合わされてなるものであってもよい。ここで、「組み合わせてなる」とは、２以上の医薬のそれぞれを異なる時間に投与する場合、それぞれの医薬を同時に投与する場合、２以上の医薬を含んで成る１種類の医薬組成物を投与する場合、を意味する。前二者の場合、２以上の医薬のそれぞれを同一の投与経路で投与してもよく、又は別の投与経路で投与してもよい。各医薬は、患者に対して症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
４．心筋細胞の製造方法
（１）ペプチド処理
　ムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドを含む心筋細胞増殖誘導剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける心筋細胞製造のために用いることが可能である。
　本発明に係る心筋細胞製造方法は、一態様として、分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、上述の心筋細胞増殖誘導剤（あるいは、心筋細胞増殖誘導剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）を処理する工程を含む。
　当該工程は、生体から分離された細胞を定法によって培養し、培養液中にムスクリンタンパク及び／又はその部分ペプチドを添加することよって行うことができる。該工程では、ムスクリンタンパク等の心筋細胞分裂誘導作用により細胞が分裂、増殖し、多数の心筋細胞が得られる。
　ここで、「心筋細胞の前駆細胞」としては、特に限定されないが、胚性幹細胞（ES細胞）、誘導性幹細胞（iPS細胞）、間葉系幹細胞などの心筋細胞への分化能を有する細胞が含まれる。
　得られた心筋細胞は、細胞分散液、細胞隗及び細胞シートなどの形態で、心臓への移植材料として利用できるほか、心筋細胞を用いた薬剤スクリーニングや毒性評価などの種々の試験に供することができる。
（２）遺伝子導入
　なお、本発明に係る心筋細胞製造方法は、一態様として、分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、上述の心筋細胞増殖誘導剤（あるいは、心筋細胞増殖誘導剤に含まれるポリペプチド及びその部分ペプチド）をコードする遺伝子を発現可能に導入する工程を含むものであってもよい。
　ヒトムスクリンタンパク及びマウスムスクリンタンパクをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号２、４に示す。ムスクリンの遺伝子導入は、通常用いられるベクターや遺伝子導入試薬によって、配列番号２、４記載の塩基配列からなるＤＮＡを細胞内に導入することによって行えばよい。また、配列番号２、４記載の塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列を公知の手法により改変することによって、ムスクリンの部分ペプチドを遺伝子導入により発現させることもできる。
＜材料＞
１．ゼブラフィッシュ系統
　以下の系統のゼブラフィッシュを実験に用いた。
（１）AB系統（野生型ゼブラフィッシュ）
（２）Tg(Cmlc2: mVenus-zGeminin(1/100))系統及びTg(mCherry-zCdt1(1/190)）系統
　Cmlc2 (Cardiac myosin-light chain 2)プロモーターの下流で、心筋細胞特異的にFucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)を発現するトランスジェニック系統。
（３）Tg(Cmlc2 : NLS-mCherry)系統
　心筋細胞の核内にNLS (nuclear localization signal)-mCherryを発現するトランスジェニック系統。
（４）Tg(Cmlc2 : Fucci)系統（細胞周期可視化ゼブラフィッシュ）
　Tg(Cmlc2 : mVenus zGeminin(1/100))とTg(Cmlc2 : mCherry- zCdt1(1/190))の交配により作出されたトランスジェニック系統。Tg(Cmlc2 : Fucci)系統は、心筋細胞にmVenus-geminin（緑）、mCherry-Cdt1（赤）を発現する。GemininはＧ０／Ｇ１期に分解し、Cdt1はＳ／Ｇ２／Ｍ期で分解するため、Tg(Cmlc2 : Fucci)系統では、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期（分裂期）の心筋細胞が緑色で、Ｇ０／Ｇ１期（静止期）の細胞が赤色で可視化される。
　上記（２）及び（３）のトランスジェニック系統の樹立には、Tol2トランスポゾンシステムを利用した。Tol2トランスポゾンベクター内にCmlc2プロモーターの下流でmVenus-zGeminin(1/100)、mCherry-zCdt1(1/190)、またはNLS-mCherryを発現する配列を組み込んだ。マニピュレーターを使用して、30 pgのプラスミドDNAと25 pgのTol2転移酵素mRNAをAB系統の1 cell stage 胚の割球中へ注入した。
＜試験例１：分裂心筋細胞の分離＞
　細胞周期可視化ゼブラフィッシュ（Tg(Cmlc2 : Fucci)系統）の心臓からＳ／Ｇ２／Ｍ期にある分裂心筋細胞を以下の手順により分離した。
　トリカイン麻酔した84時間胚の細胞周期可視化ゼブラフィッシュからピンセットで心臓を摘出した。心臓はピペットマンを使用して氷上のHBSS中に回収した。PBSで2回洗浄し、酵素溶液 (5mg/ml trypsin, 1mM EDTA / PBS, pH 8.0)を1 ml加えて細胞を分離した。30 minおきにピペッティングをしながら、37℃にて60 minインキュベーションした。その後、反応停止溶液 (30% FBS, 6 mM CaCl2 / PBS)を200 μl加えて酵素反応を停止した。PBSで洗浄し、200 μl の懸濁溶液 (1% FBS, 0.8 mM CaCl2, 50 U/ml penicillin, 0.05 mg/ml streptomycin, DMEM, 50 ml)に懸濁した。死細胞を除去するために、SYTOX Blue dead cell stain (invitrogen)を加え15 min室温にてインキュベートし、死細胞を染色した。
　分離した心筋細胞は、FACSAria III (BD)を使用して分離した。SYTOX Blue dead cell stain (-)の生細胞集団から、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期の細胞集団（mVenus(+)・mCherry(-)）とＧ０／Ｇ１期の細胞集団（mVenus(-)・mCherry(+)）を分離し、それぞれ懸濁溶液中に回収した。
　NucleoSpin RNA XS (Takara) を使用してmRNAを抽出するために、回収した細胞はPBSにて2回洗浄後、PBSを良く取り除き、TECPを添加したRA1溶液中に溶解して-20℃で保存した。
＜試験例２：分裂心筋細胞に発現する遺伝子の同定＞
　試験例１で分離した分裂心筋細胞からmRNAを抽出し、シークエンスを行うことにより、分裂心筋細胞で発現する遺伝子を網羅的に同定した。
　RNASequence用のサンプルは、すべてキットの方法に従って調製した。5,000細胞以上回収した後、NucleoSpin RNA XS(Takara)を用いてTotal RNAを細胞から抽出した。cDNA Synthesis Kits-SMARTer Ultra Low Input RNA for Illumina Sequencing (Clontech)を用いてRNAからDNAに逆転写した。Advantage 2 PCR Kit (Takara) を用いて、逆転写したDNAを増幅し、cDNA library作製した。Covaris S220 (エムエス機器株式会社)を用いて、cDNAを200bpに断片化した。NEBNext DNA Library Preparation (NEW ENGLAND BioLabs)とNEBNext Multiplex oligos For Illumina (NEW ENGLAND BioLabs)を用いてcDNA LibraryにTagを付け、cDNA library (Tag付き)をMi-seq (Illumina)を用いて解析した。
　解析の結果、分裂心筋細胞で発現が亢進している遺伝子であって、かつ細胞周期関連因子以外の遺伝子として、ムスクリンを同定した。分裂期細胞におけるムスクリンの発現量は、静止期細胞に対して５．６７倍であった。
＜試験例３：心筋障害モデルにおけるムスクリンの発現解析＞
　心筋障害モデルの心臓におけるムスクリンの発現を以下の手順により解析した。
　4～12カ月のゼブラフィッシュをトリカイン麻酔下で開胸して心臓を押し出し、心尖部に液体窒素で冷却した直径0.5 mmの銅線を押し当てて壊死させた。手術後3日目、7日目、14日目に心臓を摘出し、4%PFA/PBSで固定した。
　固定した組織を10%スクロース/PBSで4℃, 4 hr、20％スクロース/PBSで4℃, 一晩の条件で処理後、包埋し、液体窒素で凍結した。クライオスタット (CM 1850, Leica) を用いて厚さ14 μmの切片を作製し、スライドグラに貼りつけた。ドライヤー（冷風）で乾燥させ-80℃で保存した。
　凍結切片スライドをRNase freeの水で洗浄した後にproteinase K (20 μg/ml)による透過処理を行った。4%PFA/PBSを加え、室温、15minで再固定したのちにPBSTでよく洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液で65℃、1 hrプレハイブリダイゼーションしたのち、ハイブリダイゼーション溶液に溶解したDIG (digoxigenin)標識したRNA probeを加え、乾燥を防ぐためにパラフィルムを載せた状態で65℃、一晩ハイブリダイズした。翌日、サンプルを洗浄液I (75% ホルムアミド, 2 x SSC)、洗浄液II (50% ホルムアミド, 2 x SSC)、洗
浄液III (25% ホルムアミド, 2 x SSC)、洗浄液IV (2 x SSC)を用いてそれぞれ65℃, 10 minの条件で1回ずつ洗浄し、洗浄液V (0.2 x SSC)を用いて65℃, 30 minの条件で2回、洗浄液VI (0.1 x SSC)を用いて室温, 10 minの条件で1回洗浄した。
　切片スライドをマレイン酸溶液(0.1M マレイン酸, pH7.5)を用いて15 min 室温で洗浄し、ブロッキング溶液(0.1M マレイン酸, pH7.5, 5% sheep serum, 2% blocking reagent(Roche))で60 minブロッキングを行い、次にanti-DIG antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche)を加えて4℃、一晩振とうした。翌日、PBSTで5回洗浄し、BM-purple AP substarate (Roche)を用いて染色反応を開始した。染色を終了する際は、PBSTで洗浄し、4%PFA/PBSで固定した。PBSTで洗浄したのちに、グリセロールへと段階的に置換して実体顕微鏡(MVX10, Olympus)にて撮影した。
　上記のDIG標識RNA probeは、以下のように作成した。目的とする遺伝子配列に対応するプライマーを作製し、pCR4blunt TOPO vector (Invitrogen) にzMusclin cDNA配列全長（配列番号５）を組み込んだものを作製した。遺伝子配列の上流5'末端側にのみ存在する制限酵素サイトを用いて切断し、サンプルをエタノールで沈殿させた。DNA 3 μgに対して、DIG mix (Roche) 1 μl、RNase inhibitor (Roche) 1 μl、3'末端下流に存在するT3またはT7プロモーターのRNA polymerase (Roche) 1 μlを加え、37℃、120 min反応させた。DNaseを1μl 添加し、37℃、15 min反応した。サンプルを塩化リチウムで沈殿させ、RNase free waterを25 μl加えた。アガロースゲルを用いた電気泳動でprobeが出来ていることを確認し、ハイブリダイゼーション溶液を添加して-20℃で保存した。
　結果を図２に示す。障害を加えた心尖部では、３日目以降ムスクリンの発現が観察され、障害後の分裂心筋細胞において、ムスクリンの発現が増加していることが明らかとなった。なお、対照は、障害を加えていない心尖部の結果を示す。
＜実施例１：in vivo遺伝子導入による、ムスクリンの心筋細胞増殖誘導作用の評価＞
　発生期のゼブラフィッシュの胚にゼブラフィッシュムスクリンmRNAをマイクロインジェクションにより遺伝子導入し、ムスクリンの心筋細胞に対する増殖誘導活性を評価した。
　マニピュレーターを使用し、Tg(Cmlc2 : NLS-mCherry)系統の1 cell stage 胚の割球中へ200pgのmRNAを注入した。mRNAはmMESSAGE mMACHINE kit (Ambion) を用いて合成した。pCS2+vector (Clontech)に合成する分子の全長をコードするcDNA配列を組み込み、シーケンスを行って配列を確認した。制限酵素NotIで切断した後、Proteinase K (100mg/ml)/0.5%SDS処理を行い、RNaseを失活させたものをエタノールで沈殿し、RNase free-waterに溶解した。SP6 RNA polymerase を用い、切断した鋳型DNAからmRNAを合成した。RNAはNanoPhotometer (IMPLEN)で濃度を測定し、アガロースゲルを用いた電気泳動により分解されていないことを確認した。
　mRNAをインジェクション後２日で、赤色蛍光を呈する心筋細胞の数が有意に増加していた（図３参照）。これらの結果より、ムスクリンが発生期のゼブラフィッシュにおいて心筋細胞の増殖を促進あるいは誘導する作用を有することが明らかとなった。
　次に、Cmlc2プロモーター下流でムスクリンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、ムスクリンの遺伝子導入による心筋細胞数の増加効果を検討した。トランスジェニック系統の樹立は上述の方法により行った。
　結果を図４に示す。ムスクリンを発現するトランスジェニック系統（図中Ｍ）では、野生型系統（同（－））に比して有意な心筋細胞の増加が確認された。
＜実施例２：in vitroペプチド処理による、ムスクリンの心筋細胞増殖誘導作用の評価＞
　培養心筋細胞にムスクリンタンパクの部分ペプチドを処理し、ムスクリンの心筋細胞に対する増殖誘導活性を評価した。
　マウスの新生仔心筋細胞キット(Primary Cell)を使用した。付属のフィブロネクチン溶液をディッシュに加え、37℃インキュベーター内で一晩静置してコーティングした。ディッシュは使用直前に滅菌水で二回洗浄した。心筋細胞は付属の培養メディウム200 μlを使用して1.3×105cells/dish（1回目）、9×104cells/dish (2日目)となるようにディッシュの中央部に播種し、5%CO2存在下の37℃インキュベーターで培養した。播種後6 hrにディッシュに培養メディウム1mlを追加した。また、播種後16 hrに培養メディウムを交換して付着しなかった細胞を取り除いた。6日間処理サンプルのみ播種後88 hrにも培養メディウムを交換した。
　播種後24 hrに試験物質の添加を開始し、24 hr毎にさらに試薬を添加した。試験物質には、以下のものを用いた。各試験物質について、2枚ずつディッシュを用意した。
（１）FGF2 (human)：最終濃度25ng/ml
（２）mMusclin(80-130)ペプチド：マウスムスクリンのアミノ酸配列（配列番号３）の８０～１３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド (Phoenix Pharmaceuticals) 、最終濃度1nM, 10 nM, 100 nM
（３）hMusclin (83-112)ペプチド：ヒトムスクリンアミノ酸配列（配列番号１）の８３～１１２番目のアミノ酸配列からなるペプチド (Phoenix Pharmaceuticals)、最終濃度1nM, 10 nM, 100 nM
　Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging kit (Invitrogen)を用いてDNAを合成した細胞を検出した。試験物質処置開始後6 hrにEdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) を最終濃度10μMとなるように添加した。6日刺激の場合は刺激開始後78 hr後にEdU を添加した。試験物質処置開始から、72 hrまたは144 hrにPBSで2回洗浄し、4%PFA/PBSを加えて室温20 minで細胞を固定した。
　固定したサンプルは、Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging kit (Invitrogen)の方法に従ってEdUの染色をした後、免疫蛍光染色を行った。0.5% Triton X-100/PBSを加え室温, 20 minで透過処理を行った。Reaction cocktailを加えて室温30 min で反応させ、EdUにAlexa Fluor 647 asideを付加した。4%BSAを室温 1 hr 処理しブロッキングし、一次抗体として抗MF20抗体 (IOWA hybridoma bank)を200倍希釈、抗Phospho-Histone H3 (Ser10)抗体 (Millipore) を100倍希釈して1hr反応させた。PBSで洗浄したのち、二次抗体としてAlexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG conjugate highly cross-absorbed (Invitrogen)、Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG conjugate highly cross-absorbed (Invitrogen)をそれぞれ300倍希釈して1 hr反応させた。PBSで洗浄後、0.5 ng/ml DAPI中で30 min インキュベートし、倒立共焦点レーザー顕微鏡(fv-1000, Olympus)で観察した。各サンプルについて8視野ずつ撮影し、MF20陽性の心筋細胞数と、心筋細胞中のEdU陽性細胞数を数えて、EdU陽性心筋細胞の割合の平均値を求めた。
　結果を図５に示す。Ａに、mMusclin(80-130)ペプチドで３日間刺激した時のＥｄＵ陽性心筋細胞の割合を示す。Ｂに、mMusclin(80-130)ペプチド又はhMusclin (83-112)ペプチドで６日間刺激した時のＥｄＵ陽性心筋細胞の割合を示す。縦軸は、分裂心筋細胞（EdU陽性心筋細胞）の割合の平均値を示す。
　Ａに示すように、Musclin 100 nMの処理によって、FGF処理と同程度に心筋細胞の増殖を誘導できた。また、Ｂに示すように、心筋細胞の増殖誘導作用は、hMusclin (83-112)ペプチドに比してmMusclin(80-130)ペプチドでより高かった。
＜実施例３：in vivoペプチド投与による、ムスクリンの血圧降下作用の評価＞
　マウスにムスクリンタンパクの部分ペプチドを静脈内投与し、ムスクリンの血圧降下作用を評価した。
　12週齢のオスC57BL/6Jマウスを使用した。イソフルランにて吸入麻酔後、気管内挿管し、1.5%イソフルランにて持続麻酔を行った。また、マウスをヒートパッド上に置いて直腸温をモニターし、実験中は37℃に保った。左頸静脈を剥離後、ヘパリン化生理食塩水を満たした1.2Frポリウレタンカテーテルを挿入し、薬剤投与ラインとした。次に右頸動脈を剥離後、Millar社製1Fr圧・容積測定用カテーテル（PVR-1045）を挿入し、血圧をモニターした。なお、圧データはPowerLab4/26 (ADI INSTRUMENTS社製)を経由して、ノートパソコンに持続的に波形として表示させた。
　ANPを30 pmol静脈内投与したところ、収縮期血圧で約20 mmHgの速やかな血圧下降が見られた（図６Ａ参照）。投与後、約30秒で血圧は回復した。次に、mMusclin(80-130)を30pmol静脈内投与したところ、ANPと同程度の速やかな血圧の下降が見られた（図６Ｂ参照）。ANPと同様に、投与後、約30秒後に血圧の回復が認められた。
＜実施例４：in vivoペプチド投与による、ムスクリンの心筋細胞増殖誘導作用の評価＞
　マウス心筋梗塞モデルを用いて、ムスクリンの心筋細胞に対する増殖誘導活性と心筋梗塞の治療効果を評価した。
　8週齢のオスC57BL/6Jマウス（20頭）を使用した。心筋梗塞作製前日にムスクリンを充填した浸透圧ポンプ（静脈内投与用カテーテルを装着）を、ペントバルビタール麻酔下にて皮下に埋め込み、カテーテルを左頸静脈から血管内に留置した。試験群（10頭）には、蒸留水に溶解したmMusclin(80-130)を0.05 μg/kg体重/minで、合計約50～100 μｇ投与した。対照群（10頭）には、蒸留水を投与した。
　翌日、イソフルランにて吸入麻酔後、気管内挿管し、1.5%イソフルランにて持続麻酔を行った。マウスをヒートパッド上に置いて直腸温をモニターし、実験中は37℃に保った。左胸部肋間を開創して、心臓周囲の脂肪組織を除去後、左心耳直下にて冠動脈を6-0ナイロン糸にて結紮した。心筋組織の白色化、及び四肢誘導（aVL）心電図におけるST上昇を確認した後、創部を縫合した。
　観察期間を2週間として生存率を求め、生存したマウスは心エコーにて心機能を評価し、さらに実験殺後心臓重量を測定した。組織切片を作製後、マッソントリクローム染色を行い、陽性染色部位を梗塞巣として評価した。
　結果を図７～図９に示す。図７は、対照群及び試験群の生存率変化（２週間）を示す。図８及び図９は偽手術（シャムオペ）を行った群（Ａ）、対照群（Ｂ）、試験群（Ｃ）の心臓の肉眼所見と組織染色像を示す。対照群では２週間で８０％のマウスが死亡したのに対して、試験群では半数が生存した（図７参照）。また、対照群では、冠状動脈結紮による心筋梗塞に伴って、心拡大（図８Ｂ参照）と広範な梗塞巣（図９Ｂ実線矢印参照）がみられた。一方、試験群では、心拡大が軽減され（図８Ｃ参照）、梗塞巣も減少した(図９Ｃ破線矢印参照)。これらの結果から、心筋梗塞の治療のためにムスクリンが有用であることが示された。

Claims (9)

  1. 　以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する医薬組成物。
    （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
    （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
  2. 　以下の（４）～（６）のポリペプチドのいずれか１以上を含有する請求項１記載の医薬組成物。
    （４）配列番号１記載のアミノ酸配列の８３番目～１１２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （５）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （６）配列番号３記載のアミノ酸配列の８０番目～１３０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  3. 　心疾患の治療及び／又は予防のための請求項１記載の医薬組成物。
  4. 　前記心疾患が、虚血性心疾患である、請求項３記載の医薬組成物。
  5. 　以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する心筋細胞増殖誘導剤。
    （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
    （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
  6. 　以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を含有する血圧降下剤。
    （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
    （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
  7. 　分離された心筋細胞及び／又はその前駆細胞に、以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を処理する工程を含む、心筋細胞の製造方法。
    （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
    （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
  8. 　以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者に投与する手順を含む、心疾患の治療及び／又は予防方法。
    （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
    （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、心筋細胞の増殖を誘導する活性を有するポリペプチド。
  9. 　以下の（１）～（３）のポリペプチド及び／又はその部分ペプチドのいずれか１以上を対象者に投与する手順を含む、高血圧及び高血圧関連疾患の治療及び／又は予防方法。
    （１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
    （３）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を示し、血圧を降下させる活性を有するポリペプチド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019156216A1 (ja) * 2018-02-09 2019-08-15 国立大学法人京都大学 心筋細胞増殖促進剤及びその利用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005245428A (ja) * 2003-06-16 2005-09-15 Takeda Chem Ind Ltd 新規蛋白質
WO2008038394A1 (fr) * 2006-09-30 2008-04-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Récepteur de la muscline et son utilisation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005245428A (ja) * 2003-06-16 2005-09-15 Takeda Chem Ind Ltd 新規蛋白質
WO2008038394A1 (fr) * 2006-09-30 2008-04-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Récepteur de la muscline et son utilisation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P.MOFFATT ET AL.: "Visions & Reflections (Minireview) Osteocrin-Beyond just another bone protein?", CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCE, vol. 66, 2009, pages 1135 - 1139 *
SHUNBUN KITA ET AL.: "Competitive binding of musclin to natriuretic peptide receptor 3 with atrial natriuretic peptide", JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY, vol. 201, no. 2, 2009, pages 287 - 295 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019156216A1 (ja) * 2018-02-09 2019-08-15 国立大学法人京都大学 心筋細胞増殖促進剤及びその利用
JPWO2019156216A1 (ja) * 2018-02-09 2021-03-11 国立大学法人京都大学 心筋細胞増殖促進剤及びその利用
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