WO2015027305A1 - Polinucleotídeos quimicamente modificados e processo de produção de polinucleotídeos quimicamente modificados - Google Patents

Polinucleotídeos quimicamente modificados e processo de produção de polinucleotídeos quimicamente modificados Download PDF

Info

Publication number
WO2015027305A1
WO2015027305A1 PCT/BR2014/000294 BR2014000294W WO2015027305A1 WO 2015027305 A1 WO2015027305 A1 WO 2015027305A1 BR 2014000294 W BR2014000294 W BR 2014000294W WO 2015027305 A1 WO2015027305 A1 WO 2015027305A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
polynucleotides
cons
formula
sequences
Prior art date
Application number
PCT/BR2014/000294
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Henning Ulrich
Vinícius BASSANEZE
Arthur Andrade NERY
José Eduardo KRIEGER
Original Assignee
Universidade De São Paulo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidade De São Paulo filed Critical Universidade De São Paulo
Priority to EP14839532.0A priority Critical patent/EP3078746A4/en
Priority to US14/915,170 priority patent/US20160376593A1/en
Publication of WO2015027305A1 publication Critical patent/WO2015027305A1/pt
Priority to US16/569,448 priority patent/US20200131512A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function

Definitions

  • This invention belongs to the field of compounds and preparations containing active organic ingredients; specifically, polynucleotide-containing compounds containing modified bases for cell identification.
  • This tool is characterized by the simultaneous synthesis and analysis of large libraries made up of compounds with related but structurally distinct molecular formulas, and the likelihood of successful identification of functional molecules increases with library diversity (Stoltenburg et al. 2007, Ulrich and Trujillo, 2008).
  • Polynucleotides are attractive compounds for combinatorial chemistry as they fold into defined secondary and tertiary structures and can be amplified by enzymatic synthesis.
  • polynucleotide libraries with randomized sequences with about IO 15 different molecules may be obtained by chemical synthesis and then used for the identification of various compounds for different purposes, such as high affinity binding to a particular target (polynucleotides of formula (I)) or catalytic activity (ribozymes and DNAzymes) (Stoltenburg et al., 2007, Ulrich and Trujillo, 2008).
  • RNA and DNA polynucleotides of formula (I) against a wide range of targets, including: ions (Ciesiolka et al., 1995), nucleotides (Sassanfar and Szostak, 1993), nucleic acids (Ko et al., 1999), carbohydrates (Yang et al., 1998), amino acids (Geiger et al., 1996), peptides (Bock et al., 1992), antibiotics (Berens et al., 2001) , complex targets such as membrane receptors (Ulrich et al., 1998, 2002) and whole cells (Wang et al., 2003, Homann and Goringer, 1999), among others.
  • targets including: ions (Ciesiolka et al., 1995), nucleotides (Sassanfar and Szostak, 1993), nucleic acids (Ko et al., 1999), carbohydrates (Yang et al., 1998), amino
  • polynucleotides of formula (I) bind to their targets with similar affinity and specificity as monoclonal antibodies, with affinity constants close to nano and molar femto, being able, for example, to differentiate ATP from dATP (Sassanfar and Szostak, 1993) or to discriminate differentiated PC12 cells into parental PC12 cell neurons (Wang et al., 2003).
  • Polynucleotides of formula (I) as protein binders or inhibitors are based on the property of DNA and RNA molecules to recognize specific protein epitopes, similar to the RNA-protein and DNA-protein interaction in the cell.
  • the aptamer In the presence of the target, with the formation of the binding complex, the aptamer undergoes adaptive conformational changes. Folding into a defined three-dimensional structure allows the aptamer to completely encapsulate small substances by generating a specific binding pocket.
  • binders especially those with potential for biomedical applications, optimizations in their selection protocols, as well as chemical modifications that improve their stability and pharmacokinetics, have been protected by patents.
  • One of these polynucleotides of formula (I), the pharmaceutical acugen TM (pegaptanib sodium injection by Pfizer-Eyetech Pharmaceuticals), which efficiently and selectively antagonizes the action of vascular endothelial growth factor (VEGF) isoform 165 has been the first aptamer to be approved in 2004 by the US Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of aging-related macular degeneration (Bell et al., 1999, Eyetech Study Group, 2002, Ishida et al., 2003, Majumder et al., 2009).
  • FDA US Food and Drug Administration
  • US7179894 demonstrates the production of nuclease-resistant polynucleotides of formula (I), which would enable the production of such molecules for in vivo applications such as the use of polynucleotides of formula (I) for disease treatment, in diagnostic use and even in validation of therapeutic targets as described in US20070066551.
  • the present invention aims to provide chemically modified polynucleotides of formula (I): 5'-CONS-SEQ. ID n-CONS-3 ', capable of identifying and isolating stem cells from adipose tissue, such as from human liposuction.
  • the present invention relates to a family of 32 chemically modified polynucleotide sequences of formula (I) by the addition of biotin or fluorescent probe at the 5 'end region and are relevant in any process involving identification, purification and mesenchymal stem cell concentration, including but not limited to its use as a reagent in such as in vivo and in vitro cytomic assays in diagnostic tests and as a high affinity cell enrichment binder for subsequent therapeutic applications such as regenerative therapy in bone diseases, arteriosclerosis, cardiovascular ischemia or brain and for transplantation in neurodegenerative diseases such as Parkinson's and amyotrophic lateral sclerosis among others.
  • Figure 1 Classes of sequences present in libraries R12 and BR5.
  • Figure 2 Class I structures and sequences of polynucleotides of formula (I) found in the sequencing of the BR5 and R12 libraries.
  • Figure 3 Class II structures and sequences of polynucleotides of formula (I) found in the sequencing of the BR5 and R12 libraries.
  • Figure 4 Class III structures and sequences of polynucleotides of formula (I) found in the sequencing of the BR5 and R12 libraries.
  • Figure 5 Class IV structures and sequences of polynucleotides of formula (I) found in the sequencing of the BR5 and R12 libraries.
  • Figure 6 Class V structures and sequences of polynucleotides of formula (I) found in the sequencing of the BR5 and R12 libraries.
  • Figure 7 Structures and sequences of polynucleotides of formula (I) found in the sequencing of the BR5 and R12 libraries including a randomized control region composed of a Poly-A sequence.
  • the present invention relates to the chemically modified polynucleotides of formula (I):
  • 5 'CONS is one of the SEQ identifier sequences. ID 33 and / or SEQ. ID 34;
  • CONS-3 ' is one of the SEQ identifier sequences. ID 33 and / or SEQ. ID 34;
  • SEQ.ID.n is alternately or separately, one or more of the identifying sequences of SEQ.ID. 1 to SEQ.ID 32 containing one or more modified pyrimidines and at least one inverted nucleotide.
  • 5'-CONS is the SEQ. ID 33;
  • CONS-3 ' is the SEQ. ID 34;
  • SEQ.ID.n is separately each of the identifying sequences of SEQ.ID. 1 to SEQ.ID 32 containing one or more modified pyrimidines and last inverted nucleotide.
  • Modifications of one or more pyrimidines are made by substituting 2-OH for a halogen atom.
  • modifications of one or more pyrimidines occur by substituting the 2'-H group of pyrimidine nucleotides for a fluorine atom.
  • the modified pyrimidines are 2'F-dCTP and 2'F-dCUTP.
  • the chemically modified polynucleotides of formula (I) undergo modifications in the 5 'and / or 3' regions by the addition of markers belonging to the group consisting of: FAM, TET, HEX, TAMRA, ROX, CY3, CY3. 5, Texas Red, CY5, CY5.5, CY7, fluorescent compounds of the Alexa family, and biotin.
  • Each of the chemically modified polynucleotides of formula (I) containing one or more modified pyrimidines have high protein and cell binding affinity and are therefore useful for the detection, identification and purification of proteins and cells.
  • the chemically modified polynucleotides of formula (I) may be useful in the selection of proteins and cells such as mesenchymal stem cells; preferably stem cells mesenchymal tissues of the adipose tissue.
  • the second object of the present invention is a process for producing the chemically modified polynucleotides of formula (I):
  • step (a) the primer polynucleotides of the SEQ sequences. ID 33 and SEQ. ID.34 are used to produce an ssDNA library containing approximately 10 20 polynucleotides encoding sequences containing a random region flanked by constant regions represented by polynucleotides that resemble SEQ primer sequences. ID 33 and SEQ. ID 34
  • step (b) the chemically modified polynucleotides of formula (I) 5'-CONS-SEQ.ID.n -CONS-3 'are incubated in selection buffer, and possible targets, and those that bind or remain on after washings in each wash cycle, are collected and directly pass to the enzymatic amplification steps through DNA polymerase chain reaction (PCR). This reaction is designed to find the molecules with the highest affinity for the target of interest.
  • PCR DNA polymerase chain reaction
  • possible targets of the chemically modified polynucleotides of formula (I) 5'-CONS-SEQ.ID.n -CONS-3 ' are the organic molecules of the mesenchymal stem cell membrane signature.
  • PCR begins by denaturing the collected molecules for about 10 min at a temperature of 75 to 85 ° C, followed by renaturation for about 15 min at a temperature of 20 to 25 ° C, then incubating with the target for a period of 10 minutes. 40 to 60 minutes at a temperature of 20 to 25 ° C.
  • Sequences with low or no affinity tend to remain free in the selection buffer consisting of 145mM NaCl, 5.3mM KCl, 1.8mM CaCl 2 »2H 2 0, 1.7mM MgCl 2 » 6H 2 0, and 25mM HEPES, adjusted between pH 7.0 to 7.5, while the others associate with the target.
  • the target polynucleotide complex of formula (I) is separated from free molecules by one of several available processes, which include: nitrocellulose filter adsorption, gel-shift separation, capillary electrophoresis, among others.
  • RNA or DNA molecules are eluted from their binding sites, collected and amplified by RT-PCR or PCR, respectively.
  • the resulting dsDNA collection, enriched with target affinity sequences, is prepared for a new round of selection.
  • dsDNA is denatured for the Purification of the sense ribbon used in the procedure, and in the case of RNA, the library is generated by in vitro transcription.
  • Step (c) occurs randomly, with 15 to 30 polymerase chain reactions (PCR) being performed simultaneously between 0.5 to 2 pmol / ⁇ of SEQ primer polynucleotides.
  • ID 33 dideoxynuclotides and reagents known to those skilled in the art, to approximately amplify 10fmol of ssDNA library polynucleotides. The reaction occurs in cycles of 4 to 6 minutes at a temperature between 90 to 100 ° C; followed by 4 to 6 minutes at 40 to 45 ° C and 10 minutes to 72 ° C. After this double-strand synthesis, the eQS primer is added.
  • ID 34 which confers a triple marker tail of biotin.
  • Amplification proceeds for about 1 to 5 minutes at a temperature of 90 to 100 C for strip separation and cycles of 30 to 60 seconds at a temperature of 90 to 100 C, followed by 30 to 60 seconds at a temperature. 40 to 50 C and a step of 1 to 5 minutes at a temperature of 70 to 75 C and this cycle is repeated 20 to 30 times before a final extension step of 5 to 12 minutes at a temperature of 70 to 75 C .
  • a sequence of target binding, selection and amplification events is called the SELEX loop. These steps are repeated several times until the library affinity for its target stabilizes.
  • the selected chemically modified polynucleotides of formula (I) are amplified by PCR and cloned into a bacterial vector, such as a vector such as pGEM or the like following the protocol provided by the manufacturer.
  • Clones are isolated and chemically modified polynucleotides of individual formula (I) are identified by sequencing and further characterized for target binding affinity and specificity.
  • Table 1 shows the chemically modified polynucleotides of formula (I) 5'-CONS-SEQ.ID.n-CONS-3 ', wherein SEQ.ID.n is independently and randomly a sequence from SEQ. ID 1 to SEQ. ID 32 produced according to the above process, and indicates the base number of each single DNA strand (ssDNA) and the presence index of each of the SEQ sequences. ID 1 to SEQ. ID 32 in an ssDNA library produced for the identification of polynucleotides capable of recognizing the membrane molecular signature of mesenchymal stem cells. index
  • Bold sequences are those that have a near presence index in the two libraries analyzed.
  • 5 polynucleotide classes were formed (I, II, III, IV and V) and four more sequences were evidenced, two with presence indices between 0.5 and 1.5 that had no similarity. with none other, and two sequences that had the highest and lowest presence index, indicating strong presence in BR5 and R12, respectively.
  • APT1-32 isolated polynucleotides
  • the last object of the present invention relates to a liposuction stem cell separation process comprising the use of the class I to V polynucleotides of formula (I) in the identification of stem cells.
  • the chemically modified polynucleotides of formula (I) have affinity for the marker molecules present on the stem cell membrane, the polynucleotides of formula (I) that have the highest affinity for said marker molecules bind to them, making it possible to identify them. cells by cellular identification apparatus known to those skilled in the art, such as a facset, and the like.
  • FIGs 8 and 9 show that chemically modified polynucleotides of formula (I) whose random sequence corresponds to SEQ. ID 4 and 10 alone are capable of accurately identifying a large percentage of stem cells.
  • the captions mean: Cells "(o).
  • Negative Control (Cnt-) are the labeling experiments with no antibody or chemically modified polynucleotides of formula (I); CD90 / CD34 / CD45 is the standardization. markers for these molecular markers where CD34
  • CD45 (B) have as axis FL-2, and are represented together because they are not known to mark stem cells from liposuction. Labeling of stem cells from liposuction to CD90 ( ⁇ ) was 98.0% of labeled events making it impossible to evaluate events within the cell region. From this point, each class of polynucleotides of formula (I) found was evaluated to verify which class has the highest efficiency in labeling cell subgroups; cells labeled only by CD90 ( ⁇ ) and APTx / CD90 (o) were obtained.
  • CD90 / CD34 / CD45 presents the standardization of labeling for these molecular markers, where CD34 (m) and CD45 (a) have as axis FL-2, and are represented together because, knowingly do not mark stem cells from the liposuction. Labeling of stem cells from liposuction to CD90 ( ⁇ ) was 98.2% of labeled events making it impossible to evaluate events within the cell region. From this point, we evaluated each of the classes of chemically modified polynucleotides of formula (I) found, where we could evaluate which ones would have the most efficiency in labeling cell subgroups; cells labeled only by CD90 ( ⁇ ) and APTx / CD90 (a) were obtained.
  • polynucleotide 5'-CONS-SEQ. ID.9-CONS-3 'alone was able to identify 15.8% of cells and 5'-CONS-SEQ. ID ll-CONS-3 'alone identified 23.7% of the isolated liposuction stem cells.
  • this is probably the number of cells that have a unique molecular signature not shared with other somatic cells present in adipose tissue, and each of the polynucleotides tested may be binding on different targets and with different affinity constants.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se aos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I): 5'- CONS-SEQ.ID.n-CONS-3' (I) contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e ao menos um nucleotídeo invertido; bem como, ao processo de produção dos mesmos.

Description

POLINUCLEOTIDEOS QUIMICAMENTE MODIFICADOS E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLINUCLEO IDEOS QUIMICAMENTE MODIFICADOS CAMPO DA INVENÇÃO
[01] Esta invenção pertence ao campo dos compostos e preparações contendo ingredientes orgânicos ativos; especificamente, aos compostos contendo polinucleotidios contendo bases modificadas para identificação de células.
ESTADO DA TÉCNICA
[02] A indústria farmacêutica e empresas de biotecnologia têm utilizado diversas técnicas de química combinatória como ferramenta para a identificação de novos materiais com propriedades específicas.
[03] Esta ferramenta é marcada pela síntese e análise simultânea de grandes bibliotecas constituídas de compostos com fórmulas moleculares relacionadas, mas estruturalmente distintas, sendo que a probabilidade de sucesso na identificação de moléculas funcionais cresce com a diversidade da biblioteca (Stoltenburg et al., 2007, Ulrich and Trujillo, 2008) .
[04] Os polinucleotídeos são compostos atrativos para a química combinatória, já que eles se dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas e podem ser amplificados por síntese enzimática.
[05] Bibliotecas de polinucleotídeos com sequências aleatórias, com aproximadamente IO15 moléculas diferentes, podem ser obtidas por síntese química e então utilizadas para a identificação de diversos compostos com diferentes finalidades, tal como alta afinidade de ligação a um determinado alvo (polinucleotídeos de fórmula (I)) ou atividade catalítica (ribozimas e DNAzimas) (Stoltenburg et al., 2007, Ulrich and Trujillo, 2008).
[06] Em 1990 foi descrita uma técnica para selecionar, a partir de bibliotecas combinatórias de oligonucleotideos (DNA ou RNA) , moléculas que se ligassem com alta afinidade e especificidade a alvos moleculares determinados. Essa técnica denominada SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) , foi desenvolvida simultânea e independentemente por Tuerk e Gold e por Ellington and Szostak (Tuerk e Gold., 1990 Ellington and Szostak., 1990) (U.S. Pat. No. 5, 475, 096 Gold and Tuerk, 1995; U.S. Pat . No 5,270,163 Gold and Tuerk, 1993)).
[07] As moléculas funcionais identificadas nesse procedimento são denominadas "polinucleotideos de fórmula (I)" (do latim, aptus o qual significa "se encaixar, adequado, ajustado", e do grego, meros o qual significa "uma das partes constituintes de um todo, partícula") (Ellington and Szostak, 1990) .
[08] A técnica SELEX tem sido usada para selecionar polinucleotideos de fórmula (I) de RNA e DNA contra uma ampla variedade de alvos, que incluem: íons (Ciesiolka et al., 1995), nucleotídeos (Sassanfar and Szostak, 1993), ácidos nucléicos (Ko et al., 1999), carboidratos (Yang et al., 1998), aminoácidos (Geiger et al., 1996), peptídeos (Bock et al.,1992), antibióticos (Berens et al., 2001), alvos complexos como receptores de membrana (Ulrich et al., 1998, 2002) e células inteiras (Wang et al., 2003, Homann and Gõringer, 1999), entre outros.
[09] Diversos polinucleotideos de fórmula (I) identificados se ligam aos seus alvos com afinidade e especificidade semelhante a dos anticorpos monoclonais, com constantes de afinidade próximas a nano e femto molar, sendo capazes, por exemplo, de diferenciar o ATP do dATP (Sassanfar and Szostak, 1993) ou ainda discriminar células PC12 diferenciadas em neurónios de células PC12 parentais (Wang et al. , 2003) .
[10] Polinucleotideos de fórmula (I) como ligantes ou inibidores de proteínas baseiam-se na propriedade das moléculas de DNA e RNA de reconhecer epítopos proteicos específicos, semelhante à interação RNA-proteína e DNA- proteína existentes na célula.
[11] Estruturas tridimensionais formadas pelos polinucleotideos de fórmula (I) , tendo como base suas sequências específicas que por sua vez levam a estruturas únicas, quando complexadas aos seus ligantes revelaram que a especificidade e afinidade da ligação deles aos seus alvos são conferidas pela combinação das seguintes propriedades: compatibilidade estrutural, preciso empilhamento de anéis aromáticos, interações de van der Waals e eletrostáticas e finalmente, formação de pontes de hidrogénio .
[12] Na presença do alvo, com a formação do complexo de ligação, o aptâmero sofre mudanças conformacionais adaptativas. O dobramento em uma estrutura tridimensional definida permite ao aptâmero encapsular completamente substâncias pequenas pela geração de um bolso de ligação específica.
[13] Para as moléculas com alta massa molecular, como proteínas, diferentes estruturas da superfície do alvo são envolvidas pela interação com o aptâmero (Hermann and Patel, 2000) . Nos últimos 20 anos, a investigação e o desenvolvimento dos polinucleotideos de fórmula (I) demonstraram o seu potencial como uma nova e efetiva classe de moléculas terapêuticas.
[14] A sequência destes ligantes, especialmente dos com potencial em aplicações biomédicas, otimizações em seus protocolos de seleção, assim como modificações químicas que melhoram sua estabilidade e farmacocinética, tem sido protegidos por patentes. Um destes polinucleotideos de fórmula (I) , o produto farmacêutico acugen™ (pegaptanib sodium injection da Pfizer-Eyetech Pharmaceuticals) , o qual antagoniza de forma eficiente e seletiva a ação da isoforma 165 do fator de crescimento endotelial-vascular (VEGF) , foi o primeiro aptâmero a ser aprovado, em 2004, pelo FDA (US Food and Drug Administration) , para o tratamento da degeneração macular relacionada ao envelhecimento (Bell et al., 1999, Eyetech Study Group, 2002, Ishida et al., 2003, Majumder et al., 2009).
[15] Diversas patentes descrevem ou utilizam a tecnologia SELEX. O documento US7179894, demonstra a produção de polinucleotideos de fórmula (I) resistentes a nucleases, o que possibilitaria a produção dessas moléculas para aplicações in vivo como a utilização de polinucleotideos de fórmula (I) para tratamentos de doenças, em uso diagnóstico e até em validação de alvos terapêuticos, como descrito no documento US20070066551.
[16] Com essa base tecnológica temos o desenvolvimento de polinucleotideos de fórmula (I) que se ligam com alta afinidade a proteínas plasmáticas como, por exemplo, a trombina, processo descrito no documento US7998939B2 e que visando utilização como forma terapêutica poderia ser expresso em células para a produção e secreção em locais específicos como demonstrado no documento US7700759.
[17] Especificamente, utilizando a técnica de Cell- SELEX, o documento US20090239762 demonstra a produção de polinucleotídeos de fórmula (I) para a identificação de células de câncer de pulmão, visando tanto o diagnóstico quanto a utilização dessas moléculas para futuras terapias.
[18] Portanto, o estado da técnica carece de informações relativas a polinucleotídeos ou sequências de DNA com sequências específicas ou envolvidos em processos exógenos de purificação de células, no caso células tronco mesenquimais de tecido adiposo, incluindo polinucleotídeos de fórmula (I) modificados.
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[19] A presente invenção tem por objetivo prover polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) : 5'- CONS-SEQ. ID. n-CONS-3' , capazes de identificar e isolar células-tronco provenientes do tecido adiposo, tal como por exemplo, provenientes do lipoaspirado humano.
[20] É ainda um objetivo desta invenção o processo de produção dos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I): 5'- CONS-SEQ. ID. n-CONS-3' .
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[21] A presente invenção refere-se a uma família de 32 sequências de polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) , pela adição de biotina ou sonda fluorescente na região terminal 5', sendo relevantes em qualquer processo que envolva a identificação, purificação e concentração de células tronco mesenquimais, incluindo, mas não limitando, o seu uso como reagente em ensaios farmacológicos, como por exemplo, ensaios in vivo e in vitro, de citômica, em testes de diagnóstico e como ligante de alta afinidade para enriquecimento de células para subsequentes aplicações terapêuticos como, por exemplo, terapia regenerativa em doenças de osso, arteriosclerose, isquemia cardiovascular ou cerebral e para transplante em doenças neurodegenerativas como por exemplo Parkinson e esclerose lateral amiotrófica entre outros.
[22] Foram caracterizados todos os polinucleotideos de fórmula (I) presentes nessa invenção, sendo que os de SEQ.ID.9 e SEQ.ID.ll demonstraram identificação de 16 e 23% respectivamente de células com assinatura exclusivas dentre a população inicial dita pura de células tronco mesenquimais de lipoaspirado .
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[23] Para se obter uma completa visualização dos objetivos da presente invenção, é necessária a leitura deste documento e a análise dos desenhos que o acompanham e aos quais se faz referências conforme segue abaixo.
[24] Figura 1: Classes de sequências presentes nas bibliotecas R12 e BR5.
[25] Figura 2: Estruturas e sequências da Classe I de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.
[26] Figura 3: Estruturas e sequências da Classe II de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.
[27] Figura 4: Estruturas e sequências da Classe III de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12. [28] Figura 5: Estruturas e sequências da Classe IV de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.
[29] Figura 6: Estruturas e sequências da Classe V de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.
[30] Figura 7: Estruturas e sequências de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12 incluindo uma sequência controle com a região randômica composta por uma sequência Poli-A.
[31] Figura 8: Caracterização por citometria com polinucleotideos de fórmula (I) isolados.
[32] Figura 9: Caracterização por citometria com polinucleotideos de fórmula (I) isolados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[33] A presente invenção trata dos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) :
5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I),
em que :
5' CONS é uma das sequencias identificadoras SEQ. ID. 33 e/ou SEQ. ID. 34;
CONS-3' é uma das sequencias identificadoras SEQ. ID. 33 e/ou SEQ. ID. 34;
SEQ.ID.n é alternada ou separadamente, uma ou mais das sequências identificadoras das SEQ.ID. 1 a SEQ.ID 32 contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e ao menos um nucleotideo invertido.
[34] Nos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I), preferencialmente :
5'-CONS é a SEQ. ID. 33;
CONS-3' é a SEQ. ID. 34;
SEQ.ID.n é separadamente cada uma das sequências identificadoras das SEQ.ID. 1 a SEQ.ID 32 contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e último nucleotídeo invertido .
[35] As modificações de uma ou mais pirimidinas são feitas pela substituição da 2-OH por um átomo de halogênio. Preferencialmente, as modificações de uma ou mais pirimidinas ocorre pela substituição do grupo 2'-H dos nucleotídeos de pirimidina por um átomo de flúor. Mais preferencialmente ainda, as pirimidinas modificadas são a 2'F-dCTP e a 2'F-dCUTP.
[36] Além disso, os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) sofrem modificações nas regiões 5' e/ou 3' pela adição de marcadores pertencentes ao grupo consistido de: FAM, TET, HEX, TAMRA, ROX, CY3, CY3.5, Texas Red, CY5, CY5.5, CY7, compostos fluorescentes da família Alexa, e biotina.
[37] Cada um dos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) contendo uma ou mais pirimidinas modificadas possuem alta afinidade de ligação à proteínas e células, sendo, portanto, úteis para a detecção, identificação e purificação de proteínas e células.
[38] Desta forma, os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) podem ser úteis na seleção de proteínas e células, tais como, as células-tronco mesenquimais; preferencialmente, células tronco mesenquimais do tecido adiposo.
[39] O segundo objeto da presente invenção trata de um processo para produção dos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I):
5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I);
que compreende as etapas de:
(a) Produção de uma biblioteca de polinucleotideos ;
(b) Apresentação dos polinucleotideos a possíveis alvos ligantes;
(c) Seleção e amplificação dos ligantes; e,
(d) Modificação dos ligantes.
[40] Na etapa (a) os polinucleotideos iniciadores das sequências SEQ. ID. 33 e SEQ. ID.34 são usados para produzir uma biblioteca de ssDNA contendo aproximadamente IO20 polinucleotideos que codificam sequências contendo uma região aleatória flanqueada por regiões constantes representadas pelos polinucleotideos que se pareiam com as sequências iniciadoras SEQ. ID. 33 e SEQ. ID. 34.
[41] Os polinucleotídios quimicamente modificados assim produzidos são identificados e isolados por meios conhecidos pelos versados na arte, tal como a medição do tamanho das cadeias por gel de acrilamida e/ou agarose, seguido de purificação com solução fenol/clorofórmio, além de outras.
[42] Na etapa (b) , os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -CONS-3' são incubados em tampão de seleção, e possíveis alvos, e aqueles que se ligarem ou permanecerem ligados após as lavagens em cada ciclo de lavagem, são coletados e diretamente passam para as etapas de amplificação, enzimática através da reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) . Esta reação destina-se a encontrar as moléculas com maior afinidade pelo alvo de interesse.
[43] Para fins desta invenção, os possíveis alvos dos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -CONS-3' são as moléculas orgânicas da assinatura molecular de membrana das células-tronco mesenquimais . O PCR tem inicio pela desnaturação das moléculas coletadas por cerca de 10 min a uma temperatura entre 75 a 85 °C, seguida de renaturação por cerca de 15 min a temperatura entre 20 a 25 C, depois é incubada com o alvo por um período de entre 40 a 60 minutos, em uma temperatura de entre 20 a 25 °C.
[44] As sequências com baixa ou nenhuma afinidade tendem a permanecer livres no tampão de seleção consistido de 145mM NaCl, 5.3mM KC1, 1.8mM CaCl2»2H20, 1.7mM MgCl2»6H20 e 25mM HEPES, ajustado entre pH 7.0 a 7.5, enquanto que as demais se associam ao alvo. O complexo polinucleotídeo de fórmula (I)-alvo é separado das moléculas livres por um dos vários processos disponíveis, que incluem: adsorção em filtro de nitrocelulose, separação por gel-shift, eletroforese capilar, entre outros.
[45] As moléculas de RNA ou DNA são eluídas dos seus sítios de ligação, coletadas e amplificadas por RT-PCR ou por PCR, respectivamente. A coleção de dsDNA resultante, enriquecida com sequências com afinidade pelo alvo, é preparada para um novo ciclo de seleção.
[46] Para os polinucleotídos quimicamente modificados de fórmula (I) de DNA, o dsDNA é desnaturado para a purificação da fita sense, utilizada no procedimento, e no caso dos de RNA, a biblioteca é gerada por transcrição in vitro .
[47] A etapa (c) ocorre aleatoriamente, sendo realizada simultaneamente entre 15 a 30 reações em cadeia da polimerase (PCR) cada uma entre 0,5 a 2 pmol/μΐ dos polinucleotideos iniciadores das SEQ. ID. 33, dideoxinuclotídeos e reagentes conhecidos por aqueles versados na arte, para amplificar aproximadamente lOfmol de polinucleotideos da biblioteca de ssDNA. A reação ocorre em ciclos de 4 a 6 minutos a uma temperatura entre 90 a 100 C; seguido de 4 a 6 minutos a uma temperatura entre 40 a 45 C e 10 minutos a 72 C. Após essa síntese da dupla fita, é adicionado o iniciador da e SEQ. ID. 34 que confere uma cauda marcadora tripla de biotina.
[48] A amplificação prossegue durante cerca de 1 a 5 minutos a uma temperatura entre 90 a 100 C para a separação das fitas e ciclos com 30 a 60 segundos a uma temperatura entre 90 a 100 C, seguidos de 30 a 60 segundos a uma temperatura entre 40 a 50 C e uma etapa de 1 a 5 minutos a uma temperatura entre 70 a 75 C sendo este ciclo repetido 20 a 30 vezes antes de uma etapa de extensão final de 5 a 12 minutos a uma temperatura entre 70 a 75 C.
[49] Uma sequência de eventos de ligação ao alvo, seleção e amplificação é chamada de ciclo de SELEX. Estas etapas são repetidas várias vezes até estabilizar a afinidade da biblioteca pelo seu alvo.
[50] Após o processo de seleção e estabilização das afinidades os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) selecionadas são amplificadas por PCR e clonadas em vetor bacteriano, como por exemplo, um vetor como pGEM ou semelhante seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Clones são isolados e polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) individuais são identificados por sequenciamento e posteriormente caracterizados quanto à afinidade e especificidade de ligação ao alvo.
[51] A tabela 1 apresenta os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -C0NS-3' , em que a SEQ.ID.n é independente e aleatoriamente uma sequência dentre a SEQ. ID. l a SEQ. ID. 32 produzidos de acordo com o processo acima, e indica o número de base de cada fita simples de DNA (ssDNA) e o índice de presença de cada uma das sequências de SEQ. ID. 1 a SEQ. ID. 32 em um biblioteca de ssDNA produzida para a identificação dos polinucleotídieos capazes de reconhecer a assinatura molecular de membrana das células-tronco mesenquimais . índice
Núcleo ideos Sequência n Nome
Presença
30 23, 50 GACCCAAGCCGACCGCCCCCCATGAGTCGGGGTGTA SEQ. ID. 1
33 0, 39 GAGGGCCGCCTGGAACAATGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 2
34 0,36 GCACGGACGGGCCGCACGCGCTTGAGCCCGGGGA SEQ. ID. 3
35 0,46 GCAGGGGCGGGCCGCATACGCTTGAGCCCGGGCGA SEQ. ID. 4
34 0, 43 GCAGGGGCGGGCCGCATGCGCTTGAGCCCGGGGA SEQ. ID. 5
34 48,00 GCCGCAGGCCGACCGGTTCCCTTGAGTCGGGGTGGA SEQ. ID. 6
35 0,26 GCCGAAGGGCGTCGGAGCGCGCCATCACAGGGGGA SEQ. ID. 7
35 0,26 GCCGGGGGGCGTCGGAGCGCGCCATCACAGGGGCA SEQ. ID. 8
35 0,30 GCCGGGGGGCGTCGGAGCGCGCCGTCCCAGGGGGA SEQ. ID. 9
34 0, 31 GGCGGGGGCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 10
33 0,26 GGCGGGGGGCGCCGGAGCGCGCCATCGCAGGGGGA SEQ. ID. 11
35 23, 00 GGGCAGGCCGACCGGTTCCCTTGAGTCGGGGTGGA SEQ. ID. 12
33 0,29 GGGGATCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCACGA SEQ. ID. 13 índice
Núcleotideos Sequência n Nome
Presença
33 0, 31 GGGGCACCGCCCTGGAGCGATGGGCTCGGGCTGTA SEQ. ID. 14
34 0, 31 GGGCACCGCCCTGGAGCGATGGGCTCGGGCTGCA SEQ. ID. 15
35 0, 66 GGGGCATCCCGCTGGACCCATGGCGTGCGCGGATA SEQ. ID. 16
35 0, 63 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGAGCTGGCA SEQ. ID. 17
35 0, 68 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGCCCGGATA SEQ. ID. 18
34 0, 59 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGCGCGAGGA SEQ. ID. 19
35 0, 63 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGCGCGGGTA SEQ. ID. 20
35 0, 67 GGGGCATCCCGTTTGGCACAATGCGTGCGCGGATA SEQ. ID. 21
34 0, 38 GGGGGACCGCCTGTAACGGTGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 22
34 0,28 GGGGGAGCGCGCCGGAGCGATGGGTTCCGGGGGTA SEQ. ID. 23
34 0, 35 GGGGGAGCGCGCTGGACGCTGGGGTCGCCGGGGGA SEQ. ID. 24
33 0, 30 GGGGGCCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCGTGA SEQ. ID. 25
33 0,29 GGGGGCCGCCTGGAACGATGGGTTCGGTGCGA SEQ. ID. 26
33 0,29 GTGGGGACCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 27
33 0, 31 . GTAGGCACCGCCCTGGAGCGATGGGCTCGGGCTGTA SEQ. ID. 28
33 0, 26 GTCGGGGGGCGTCGGAGCGCGCCATCACAGGTGGA SEQ. ID. 29
34 1,14 TACCCTAGCTCAAGCGCATGCGGCCCGTCCCTGC SEQ. ID. 30
35 18, 00 TCCACCCCGACTCAAGGGAACCGGTCGGCCCGCGC SEQ. ID. 31
33 1, 67 TCGCGCCGAACCCATCGTTCCAGGCGGTCCCCC SEQ. ID. 32
[52] Os polinucleotídeos da tabela 1 foram submetidos à busca de similaridades dentro da ferramenta BLAST do PUBMED, e o resultado desta busca não demonstrou nenhum correspondente natural, uma vez que na modalidade Blast-n apenas pedaços da sequência foram encontrados, e nenhuma das possíveis sequências 5' -CONS-SEQ . ID . n-CONS-3' (I) completa foi identificada como natural, e considerando o MEGABLAST que tende a procurar a sequência inteira, nenhuma das sequências apresentou respectivo correspondente natural.
[53] A partir das sequências identificadas na tabela 1, os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS-SEQ. ID. n-CONS-3' (I) obtidos, foram agrupados em classes de moléculas de acordo com suas similaridades de motivos de sequência na região previamente aleatória (Figura 1) . Dentro dessas classes, podemos verificar que além de terem sequências similares, as moléculas também compartilham alta conservação estrutural como demonstrado nas Figuras 2 a 7.
[54] As sequências em negrito são aquelas que apresentaram um índice de presença próximo nas duas bibliotecas analisadas. Percebe-se que no alinhamento por similaridade, 5 classes de polinucleotídeos foram formadas (I, II, III, IV e V) e mais quatro sequências ficaram evidenciadas, duas com índices de presença entre 0,5 e 1,5 que não tiveram similaridade com nenhuma outra, e duas sequências que tiveram o maior e o menor índice de presença, indicando forte presença em BR5 e R12, respectivamente. Em azul é possível verificar quais sequências foram selecionadas para sintetizarmos e seguirmos para os experimentos com polinucleotídeos isolados, que por sua vez receberam os nomes de APT1-32 de acordo com o processo de alinhamento descrito acima.
[55] O último objeto da presente invenção trata de um processo de separação de células-tronco presente no lipoaspirado que compreende a utilização dos polinucleotídeos de fórmula (I) de classes I a V, na identificação das células-tronco. Como os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) têm afinidade com as moléculas marcadoras presentes na membrana das células- tronco, os polinucleotídeos de fórmula (I) que apresentam maior afinidade com as ditas moléculas marcadoras, se ligam a elas tornando possível a identificação destas células pelos aparelhos de identificação celular conhecidos pelos versados nesta área técnica, tal como, um aparelho de facs, e outros.
[56] As Figuras 8 e 9 mostram que os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) cuja sequência aleatória corresponde às SEQ. ID 4 e 10 são capazes isoladamente de identificar com precisão um grande percentual de células-tronco . Na figura 8, as legendas significam: Células" ( o ) . Controle negativo (Cnt-) são os experimentos de determinação dos perfis de marcação sem nenhum anticorpo ou polinucleotidios quimicamente modificados de fórmula ( I ) ; CD90/CD34/CD45 é a padronização de marcação para esses marcadores moleculares, onde CD34
(a) e CD45 (B) têm como eixo FL-2, e estão representados juntos pois, sabidamente não marcam células-tronco provenientes do lipoaspirado . A marcação das células-tronco provenientes do lipoaspirado para CD90 (■) foi de 98,0% dos eventos marcados impossibilitando avaliar os eventos dentro da região de células. A partir desse ponto, foi realizada a avaliação de cada uma das classes de polinucleotideos de fórmula (I) encontradas, para a verificação de qual classe tem a maior eficiência em marcar sub-grupos celulares; sendo obtidas células marcadas apenas por CD90 (■) e APTx/CD90 ( o ) .
[57] Já a Figura 9 apresenta um experimento em que: os eventos são "Células" (■) . 0 controle negativo (Cnt-) é determinado pelos perfis de marcação sem nenhum anticorpo ou polinucleotidios quimicamente modificados de fórmula
( I ) ; CD90/CD34/CD45 apresenta a padronização de marcação para esses marcadores moleculares, onde CD34 (m) e CD45 ( a ) têm como eixo FL-2, e estão representados juntos pois, sabidamente não marcam células-tronco provenientes do lipoaspirado . A marcação das células-tronco provenientes do lipoaspirado para CD90 (■) foi de 98,2% dos eventos marcados impossibilitando avaliar os eventos dentro da região de células. A partir desse ponto, foi realizada a avaliação de cada uma das classes de polinucleotidios quimicamente modificados de fórmula (I) encontradas, onde poderíamos avaliar quais delas teriam uma maior eficiência em marcar sub-grupos celulares; sendo obtidas células marcadas apenas por CD90 (■) e APTx/CD90 ( a ) .
[58] Assim, conforme observado, o polinucleotídeo 5'- CONS-SEQ. ID.9-CONS-3' isoladamente foi capaz de identificar 15,8% das células e o 5'- CONS-SEQ. ID. ll-CONS-3' identificou isoladamente 23,7% das células-tronco isoladas do lipoaspirado. Indicando assim, que provavelmente esse é o número de células que apresentam assinatura molecular exclusiva e não compartilhada com outras células somáticas presentes no tecido adiposo, sendo que cada um dos polinucleotídeos testados pode estar se ligando em alvos diferentes e com constantes de afinidades distintas.
[59] Embora a presente invenção e os melhores modos da mesma tenham sido descritos de uma maneira que estabelece aqueles versados na técnica fazer e usar a mesma, será entendido e apreciado que há equivalentes para as modalidades de exemplo mostradas aqui e que modificações e variações podem ser realizadas, sem que se desvie do escopo e do espírito das invenções, os quais não devem ser limitados pelas modalidades exemplificadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Polinucleotídeos quimicamente modificados caracterizados por terem a fórmula (I) :
5' - CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (D
em que :
5' CONS é uma das sequências identificadoras SEQ. ID. 33 e/ou SEQ. ID. 34;
CONS-3' é uma das sequências identificadoras SEQ. ID. 33 e/ou SEQ. ID. 34;
SEQ.ID.n é alternada ou separadamente, uma ou mais das sequências identificadoras das SEQ.ID. 1 a
SEQ.ID 32 contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e ao menos um nucleotideo invertido.
2. Polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por na fórmula (I) :
5'-C0NS ser a SEQ. ID. 33;
CONS-3' ser a SEQ. ID. 34;
SEQ.ID.n ser separadamente cada uma das sequências identificadoras das SEQ.ID. 1 a SEQ.ID 32 contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e último nucleotideo invertido.
3. Polinucleotídeos, de acordo com as reivindicações 1, ou 2 caracterizados pelas modificações em uma ou mais pirimidinas ser feita pela substituição da 2-OH por um átomo de halogênio.
4. Polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizados pelas pirimidinas modificadas serem a 2'F-dCTP e a 2'F-dCUTP.
5. Polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados pelo fato de possuírem alta afinidade de ligação às células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano e quaisquer outra de origem mesenquimal.
6. Polinucleotideos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados por serem para detecção e identificação de células-tronco mesenquimais, preferencialmente, células mesenquimais humanas.
7. Processo de produção dos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I):
5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I);
que compreende as etapas de:
(a) Produção de uma biblioteca de polinucleotideos ;
(b) Apresentação dos polinucleotideos a possíveis alvos ligantes;
(c) Seleção e amplificação dos ligantes; e,
(d) Modificação dos ligantes.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por na etapa (a) os polinucleotideos iniciadores das sequências SEQ. ID. 33 e SEQ. ID.34 serem usados para produzir uma biblioteca de ssDNA contendo aproximadamente IO20 polinucleotideos que codificam sequências contendo uma região aleatória flanqueada por regiões constantes representadas pelos polinucleotideos que se pareiam com as sequências iniciadoras SEQ. ID. 33 e SEQ. ID. 34.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado por incubar os polinucleotideos de fórmula (I) em tampão de seleção, e possíveis alvos, e aqueles que se ligarem ou permanecerem ligados após as lavagens em cada ciclo de lavagem, serem coletados e diretamente passarem para as etapas de amplificação enzimática através da reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) .
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelos alvos dos polinucleotideos de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -C0NS-3' serem moléculas orgânicas da assinatura molecular de membrana das células-tronco mesenquimais .
11. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela etapa (c) ocorrer aleatoriamente, sendo amplificados os polinucleotideos da biblioteca de ssDNA; a reação ocorrendo em ciclos de entre 4 a 6 minutos a uma temperatura entre 90 a 100 C; seguido de 4 a 6 minutos a uma temperatura entre 40 a 45 C e 10 minutos a 72 C.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por após a síntese da dupla fita, ser adicionado o iniciador da SEQ. ID. 34 que confere uma cauda marcadora tripla de biotina.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 12, caracterizado pela amplificação prosseguir durante cerca de 1 a 5 minutos a uma temperatura entre 90 a 100 C para a separação das fitas e ciclos com
30 a 60 segundos a uma temperatura entre 90 a 100 C, seguidos de 30 a 60 segundos a uma temperatura entre 40 a 50 °C e uma etapa de 1 a 5 minutos a uma temperatura entre 70 a 75 C sendo este ciclo repetido 20 a 30 vezes antes de uma etapa de extensão final de 5 a 12 minutos a uma temperatura entre 70 a 75 C.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pela sequência de eventos de ligação ao alvo, seleção amplificação ser um ciclo de SELEX.
15. Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por se obter os polinucleotideos de fórmul (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -CONS-3' , em que a SEQ.ID.n independente e aleatoriamente uma sequência dentre a SEQ ID. 1 a SEQ. ID. 32.
PCT/BR2014/000294 2013-08-26 2014-08-25 Polinucleotídeos quimicamente modificados e processo de produção de polinucleotídeos quimicamente modificados WO2015027305A1 (pt)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14839532.0A EP3078746A4 (en) 2013-08-26 2014-08-25 Chemically modified polynucleotides and method for producing chemically modified polynucleotides
US14/915,170 US20160376593A1 (en) 2013-08-26 2014-08-25 Chemically modified polynucleotides and method for producing chemically modified polynucleotides
US16/569,448 US20200131512A1 (en) 2013-08-26 2019-09-12 Chemically modified polynucleotides and method for producing chemically modified polynucleotides

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRBR102013021701-8 2013-08-26
BRBR102013021701-8A BR102013021701A2 (pt) 2013-08-26 2013-08-26 Polinucleotídeos quimicamente modificados e processo de produção de polinucleotídeos quimicamente modificados

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/915,170 A-371-Of-International US20160376593A1 (en) 2013-08-26 2014-08-25 Chemically modified polynucleotides and method for producing chemically modified polynucleotides
US16/569,448 Continuation-In-Part US20200131512A1 (en) 2013-08-26 2019-09-12 Chemically modified polynucleotides and method for producing chemically modified polynucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015027305A1 true WO2015027305A1 (pt) 2015-03-05

Family

ID=52585317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BR2014/000294 WO2015027305A1 (pt) 2013-08-26 2014-08-25 Polinucleotídeos quimicamente modificados e processo de produção de polinucleotídeos quimicamente modificados

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160376593A1 (pt)
EP (1) EP3078746A4 (pt)
BR (1) BR102013021701A2 (pt)
WO (1) WO2015027305A1 (pt)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5475096A (en) 1990-06-11 1995-12-12 University Research Corporation Nucleic acid ligands
US7179894B2 (en) 1998-10-26 2007-02-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US20070066551A1 (en) 2004-09-07 2007-03-22 Keefe Anthony D Aptamer medicinal chemistry
US20090186356A1 (en) * 2006-05-26 2009-07-23 Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum DEVICE AND SUBSTANCE FOR THE IMMOBILIZATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS (MSCs)
US20090239762A1 (en) 2008-02-05 2009-09-24 Weihong Tan Aptamers that bind abnormal cells
US7700759B2 (en) 2002-05-30 2010-04-20 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Aptamer constructs
US7998939B2 (en) 2005-08-26 2011-08-16 Archemix Corporation Aptamers that bind thrombin with high affinity

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5475096A (en) 1990-06-11 1995-12-12 University Research Corporation Nucleic acid ligands
US7179894B2 (en) 1998-10-26 2007-02-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US7700759B2 (en) 2002-05-30 2010-04-20 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Aptamer constructs
US20070066551A1 (en) 2004-09-07 2007-03-22 Keefe Anthony D Aptamer medicinal chemistry
US7998939B2 (en) 2005-08-26 2011-08-16 Archemix Corporation Aptamers that bind thrombin with high affinity
US20090186356A1 (en) * 2006-05-26 2009-07-23 Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum DEVICE AND SUBSTANCE FOR THE IMMOBILIZATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS (MSCs)
US20090239762A1 (en) 2008-02-05 2009-09-24 Weihong Tan Aptamers that bind abnormal cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUO K.T. ET AL.: "A new technique for the isolation and surface immobilization of mesenchymal stem cells from whole bone marrow using high- specific DNA aptamers.", STEM CELLS., vol. 24, no. 10, 2006, pages 2220 - 2231, XP002465469 *
See also references of EP3078746A4 *
ZHU B. ET AL.: "Stem Cell Separation Technologies.", CURR. OPIN. CHEM. ENG., vol. 2, no. 1: PAG, February 2013 (2013-02-01), XP055300526 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160376593A1 (en) 2016-12-29
EP3078746A1 (en) 2016-10-12
EP3078746A4 (en) 2017-12-27
BR102013021701A2 (pt) 2015-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7431891B2 (ja) 化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集
US10392621B2 (en) Multiaptamer target detection
US10858647B2 (en) Removal of DNA fragments in mRNA production process
Wilson et al. Functional requirements for specific ligand recognition by a biotin-binding RNA pseudoknot
Kimoto et al. Generation of high-affinity DNA aptamers using an expanded genetic alphabet
US20130116129A1 (en) Method for detecting target molecules
Yang et al. Aptamers 101: aptamer discovery and in vitro applications in biosensors and separations
ES2764669T3 (es) Composiciones y métodos para la detección de microorganismos
Yüce et al. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment for aptamer selection
CN109385469A (zh) 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒
ES2776202T3 (es) Captura de conformación cromosómica dirigida
Yang et al. Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search
Singh et al. Structure-function analysis of DEAD-box helicase DDX43
ES2938896T3 (es) Un ensayo in vitro verdaderamente imparcial para perfilar la actividad fuera de objetivo de una o más nucleasas programables específicas de objetivo en células (ABNOBA-SEQ)
CN114317544B (zh) 特异性结合cd133的核酸适配体、其筛选方法及应用
WO2015027305A1 (pt) Polinucleotídeos quimicamente modificados e processo de produção de polinucleotídeos quimicamente modificados
Paloncýová et al. Computer Aided Development of Nucleic Acid Applications in Nanotechnologies
US20200131512A1 (en) Chemically modified polynucleotides and method for producing chemically modified polynucleotides
CN113249386A (zh) 一种甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用
US20150031585A1 (en) Multiaptamer Target Detection
Wawrzyniak-Turek et al. Enzymatic combinatorial nucleoside deletion scanning mutagenesis of functional RNA
JP2016171795A (ja) アプタマーの選抜方法
CN107663220B (zh) 修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用
Kakoti 4 Aptamer
Kisor et al. pH dynamics regulates transcription factor-DNA binding

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14839532

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014839532

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014839532

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14915170

Country of ref document: US