WO2014204275A1 - 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 - Google Patents

리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 Download PDF

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riovirus
inhibiting angiogenesis
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김만복
황준성
김보연
성낙균
정기석
김준
이상훈
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Korea University Research and Business Foundation
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Korea University Research and Business Foundation
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • composition for inhibiting angiogenesis containing riovirus as an active ingredient [technical field]
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, comprising a reovirus as an active ingredient, and a health food for preventing and improving angiogenesis-related diseases.
  • Wild type oncolytic viruses are inherently potent oncolytic viruses (Roberts et al., 2006; Liu et al., 2007; Bluming et al., 1971). It is known to induce destruction of tumor cells by specifically infecting and proliferating cancer cells deficient or attenuated by intracellular antiviral immunity (Kim et al., 2010; Parato et al., 2005).
  • Reovirus is a non-enveloped virus whose entire genome consists of 10 double-stranded RNA fragments, ubiquitous to the general environment, and asymptomatic in a host with immune function. It is an epigenetic virus. Infectious in humans is known to be limited to the upper respiratory tract and gastrointestinal tract (Tyler's 2001).
  • Rioviruses have long been known to exhibit potent cytotoxic activity when infected with certain types of transformed cells (Duncan et al, 1978; Hashiro et al, 1977). It's going on. In healthy hosts infected with wild-type rioviruses, symptoms do not occur, but the risk of damage to the host's immune system increases, so the clinical potential of rioviruses in patients such as cancer patients may be limited. However, as studies on the tumor destroying activity of riovirus continue, It has been reported that cells containing Ras-signaling pathways are susceptible to Riovirus (Type 3 Dearing strain) infection in vitro and in vivo (Coffey et al, 1998; Strong et al, 1998).
  • riovirus therapies for cancer patients with no limitation of immune system damage are currently used in clinical practice (Norman etal, 2005).
  • Induction of neovascularization is a process in which new blood vessels are formed from existing blood vessels.
  • Normal development that is, embryonic development, female reproductive cycle (DM Noden, Am. Rev. Respir. Dis. 140) , 1097-1103 (1989)), as well as essential for growth and wound healing, and are closely related to diseases such as cancer, arthritis, diabetic retinopathy and atherosclerosis (O'Brien, ER et al., J. Pathol. 145, 883-894 (1994).
  • biovascular induction during metastasis of cancer one of the processes of developing malignant tumors, is considered an essential process.
  • the mechanism of growth of cancer can be identified, and it can be used for early diagnosis, prevention and treatment of cancer, as well as related diseases such as rheumatoid arthritis, chronic inflammation, diabetic retinopathy and hemangioma. Due to its widespread use in the treatment of diseases, ongoing research and development continues (W. Auerbach et al., Pharnac. Ther., 61, 265-311 (1994)). Trials are in progress (R. Bicknel et al., TiPS, 16, 57 (1995)).
  • FVB / NJ mice are known to have a significantly higher incidence of skin-induced skin cancer than other mouse species.
  • 7,12-dimethylbenzo [ ⁇ ] anthracene (7,12-dimethylbenz [a] anthracene; DMBA) 100 and phorbol-12-myristate-13-acetate in FVB / NJ mice e_13—acetate; TPA) 5 // g of skin produced 11.8 papalomas per mouse, and the papilloma was a malignant tumor of squamous cell carcinomas; sec) has been reported to be significantly higher than other mouse species 1 "10 61 3 14:11, 2353-2358).
  • the present inventors have tried to find viruses with new angiogenesis inhibitory activity.
  • the riovirus shows the effect of destroying the tissue layer of vascular endothelial cells in cancer cell lines.
  • the lyovirus can be used as an active ingredient of the composition for inhibiting angiogenesis, the present invention was completed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, which contains a reovirus as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, which additionally contains a foreign gene for inhibiting angiogenesis as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food for preventing and improving angiogenesis-related diseases containing riovirus as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for inhibiting angiogenesis comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition containing a riovirus belonging to the riovirus family as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of riovirus belonging to the riovirus family for use as a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis.
  • the present invention provides a use of riovirus for use as a health food for preventing and improving angiogenesis-related diseases.
  • the present invention is a reovirus (reovirus) shows a significant angiogenesis inhibitory effect on a tumor induced to occur naturally, it can be usefully used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis and the composition for health foods .
  • reovirus reovirus
  • 1 and 2 show the effect of inhibiting the growth of cancer cell lines and vascular endothelial tissue layer destruction by riovirus in a microfluidic chip model in which MCF7, a breast cancer cell line, grows and destroys the vascular endothelial cell layer. It is a figure which shows.
  • FIG. 3 shows Papilloma tissue induced 6 weeks after application of Phorbo 1-12—myri stat e-13-acetate (TPA) to FVB / NJ mice. It is a figure which shows. 4 is a diagram showing papilloma tissue grown 10 weeks after TPA was applied to FVB / NJ mice.
  • reovirus 5 is a diagram showing the inhibition of papilloma growth by reovirus (reovirus).
  • FIG. 6 is a diagram showing inhibition of angiogenesis by riovirus.
  • 6A shows the papilloma tissue of the control group
  • FIG. 6B shows angiogenesis behind the papilloma tissue of the control group
  • FIG. 6C shows papilloma tissue of the group containing
  • FIG. 6D shows angiogenesis behind the papilloma tissue of the experimental group.
  • Arrows indicate papilloma tissue and associated blood vessels.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, which contains a reovirus as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for inhibiting angiogenesis, which comprises a monotherapy for administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition containing a riovirus belonging to the riovirus family.
  • the present invention also provides the use of riovirus belonging to the riovirus family for use as a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis.
  • the lyovirus is preferably a wild type virus, but is not limited thereto.
  • the lyovirus can be derived from any lyovirus and is preferably a member of the Reoviridea family, which can be obtained from a variety of sources, and is preferably serotype l (Lang), type 2 (jones) or type 3 ( Dealing and Aneny) Rio virus is more preferred, but is not limited thereto.
  • the liovirus is a primate except for humans (chimpanzees, gorillas, macaques, monkeys, etc.), rodents (mouse, rats, garyville mice, hamsters, rabbits, guinea pigs, etc.), dogs, cats, general livestock It may be derived from, but is not limited to, one or more lioviruses that exhibit tropism for cells of other mammalian species, including (bovine, horse, pig, goat).
  • the pharmaceutical composition is preferably able to prevent or treat diseases caused by angiogenesis, the disease is cancer, hemangioma, hemangiofibromas, arthritis, diabetic ret ionpathy, retinopathy of premature infants, neovascular glaucoma , Neovascularized corneal disease, macular degeneration, spot degeneration, pterygium, retinal degeneration, posterior capsular fibrosis, granuloconjunctivitis, psoriasis, capsulodilation, purulent granulomas, psoriasis, seborrheic dermatitis It is preferably at least one disease selected from the group consisting of, the cancer is Liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular myeloma, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anal muscle muscle cancer
  • the lyovirus may additionally include a heterologous gene in a essential region or a non-essential region in a lyovirus gene.
  • heterologous gene means to accept any gene not found in the viral genome.
  • the foreign gene can be an allelic variant of the wild type gene or a mutant gene.
  • the foreign gene is preferably operably linked to a control sequence that allows expression of the electric foreign gene in cells in vivo.
  • the virus of the present invention can be used to deliver foreign genes / genes to cells in vivo conditions where the foreign genes can be expressed.
  • the foreign gene is preferably an anti-angiogenic gene, a tumor suppressor gene, an antigenic gene, a cytotoxic gene, a cytostatic gene, a suicide gene, an anti-vascular and an immune-regulatory gene.
  • anti-angiogenic gene is a nucleotide sequence whose expression causes extracellular secretion of anti-angiogenic factors.
  • Anti-angiogenic factors include angiostatin, vascular endothelial growth factor (VEGF) and Inhibitors of placental growth factor (P1GF), for example, soluble VEGFRl (sFLT-l) [PNAS (USA), 95, 8795-8800 (1998)], endostatin and apolipoprotein (a) Kringle Region LK8 is included, but is not limited to this.
  • tumor suppressor gene is a nucleotide sequence whose expression in target cells can inhibit the tumor phenotype and / or induce apoptosis.
  • tumor suppressor genes include the p53 gene, APC gene, DPC-4 / Smad4 gene, BRCA-1 gene, BRCA-2 gene, WT-1 gene, retinoblastoma gene [Lee et al. Nature, 329, 642 (1987)], MMAC-1 gene, adenomatous polyposis coil protein (US Pat. No.
  • DCC deficiency colorectal cancer gene
  • ⁇ SC-2 gene
  • chromosome 3p21.3 Located nasopharyngeal cancer suppressor genes [Cheng et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 95 3042-3047 (1998)], including but not limited to the MTS1 gene, the CDK4 gene, the NF-1 gene, the NF-2 gene, the VHL gene, and the like.
  • antigenic gene is a nucleotide sequence whose expression in a target cell results in the production of a cell surface antigen protein that can be recognized by the immune system.
  • antigenic genes are cancerous antigens (CEA), CD3. , CD133, CD44 and p53 (International Patent Publication TO94 / 02167).
  • CAA cancerous antigens
  • CD133, CD44 and p53 International Patent Publication TO94 / 02167.
  • antigenic genes can be combined with a C-type I antigen.
  • cytotoxic gene is a nucleotide sequence that exhibits a toxic effect when expressed in a cell.
  • examples of cytotoxic genes include nucleotide sequences encoding Pseudomonas exotoxin, lysine toxin, diphtheria toxin, and the like.
  • the "cytostatic inhibitory gene” is a nucleotide sequence that induces cell cycle arrest when expressed in a cell.
  • Cell proliferation inhibitory genes include p21, retinoblastoma genes, E2F-Rb fusion proteins, genes encoding cyclin-dependent kinase inhibitors (eg, P16, pl5, pl8 and pl9), growth arrest specific homeobox genes (International Patent Publications W097 / 16459 and W096 / 30385) and the like.
  • the "suicide gene”' is a nucleotide that induces cell death through apoptosis when expressed in a cell.
  • the suicide gene is herpes simplex. Viral thymidine kinase, chicken pox thymidine kinase, cytosine deaminase, purine nucleoside phosphorylase, beta-lactanase, carboxypeptidase G2, cytochrome P450-2B1, nitroderactase, beta-glu Kuronidase, TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand), and the like.
  • Immune-regulatory gene is a nucleotide sequence that regulates humoral and cellular immune responses when expressed in cells.
  • Immune-regulatory genes include, but are not limited to, genes encoding CD16, CTLA-4, IL24, GM-CSF, and the like.
  • the lyovirus may be mounted on a virus carrier cell (Moruscular Therapy. 2009 Vol 17: 1667-1676), which may further increase the therapeutic effect in vivo, but is not limited thereto.
  • a virus carrier cell (Moruscular Therapy. 2009 Vol 17: 1667-1676), which may further increase the therapeutic effect in vivo, but is not limited thereto.
  • a microfluidic chip model that invasions the vascular endothelial cell layer as the breast cancer cell line MCF7 grows is developed.
  • the riovirus also inhibited the growth of the MCF7 cell line as the vascular endothelial cell layer disappeared almost (see FIGS. 1 and 2).
  • the neovascularization inhibitory ability of riovirus was confirmed by observing the back surface of the papilloma tissue. In the case, it was confirmed that the formation of blood vessels was significantly reduced or slowed compared to the control group (see FIG. 6).
  • the riovirus of the present invention exhibits the effect of riovirus destroying the tissue layer of vascular endothelial cells in a microfluidic chip model of vascular endothelial cell destruction by cancer cell lines, and significant angiogenesis for tumors induced to occur naturally. Since it shows an inhibitory effect, it can be usefully used as an active ingredient in the pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis.
  • the compositions of the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical formulations.
  • Dosage forms may be oral, mucosal (eg, nasal, sublingual, vaginal, bucal, or rectal), parenteral (eg, subcutaneous, intravenous, blues injection, intramuscular or intraarterial), topical (eg, Eye), transdermal or transcutaneous mode, but is not limited thereto.
  • parenteral eg, subcutaneous, intravenous, blues injection, intramuscular or intraarterial
  • topical eg, Eye
  • transdermal or transcutaneous mode but is not limited thereto.
  • dosage forms include tablets; Caplets; Capsules such as soft elastic gelatin accelerators; Cachets; Trocky; Lozenges; dispersants; Suppositories; powder; Aerosols (eg nasal sprays or inholers); Gels; Liquid dosage forms suitable for oral or mucosal administration to a patient, including suspensions (eg, aqueous or non-aqueous liquid suspensions, oil-in-water emulsions, or water-in-oil liquid emulsions) solutions and elixirs; Liquid dosage forms suitable for injection administration to a patient; To eye drops or other ophthalmic agents suitable for topical administration; And sterile solid preparations (eg, crystalline or amorphous solids) that can be reconstituted to provide liquid dosage forms suitable for injection administration to a patient.
  • suspensions eg, aqueous or non-aqueous liquid suspensions, oil-in-water emulsions, or water-in-oil liquid emulsions
  • the type, shape, and type of dosage forms of the present invention generally vary widely depending on their use.
  • the dosage form used for the acute treatment of a disease may comprise a greater amount of active ingredient than the dosage form used for the chronic treatment of the same disease.
  • parenteral dosage forms may comprise less active ingredient than oral dosage forms used to treat the same disease. Dosage forms and modes encompassed by the present invention It is very versatile, which is apparent to those of ordinary skill in the art (see Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, East on PA (1990)).
  • composition of the present invention may comprise one or more excipients.
  • Excipients can be in a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration.
  • excipients suitable for use in oral liquid or aerosol dosage forms include, but are not limited to, water, glycols, oils, alcohols, flavoring ingredients, preservatives, and coloring ingredients.
  • excipients suitable for use in solid oral dosage forms include starch, sugar, microcrystalline cellulose, excipients, granulating agents, glidants, binders and disintegrants. One is not limited thereto. Because of the convenience of administration, tablets and capsules are the most useful oral dosage unit forms, in which case solid excipients are applied.
  • tablets may be coated using standard aqueous or nonaqueous techniques.
  • excipients that can be used in oral dosage forms of the invention include, but are not limited to, binders, fillers, disintegrants, and glidants.
  • Suitable binders for use in pharmaceutical compositions and dosage forms include cornstarch, potato starch, or other starches, natural and synthetic gums such as gelatin, acacia, sodium alginate, alginic acid, other alginates, powdered tragacanth Guar gum, cellulose and its derivatives (e.g.
  • ethyl cellulose cellulose acetate, carboxymethyl cellulose calcium, sodium carboxymethyl cellulose
  • polyvinyl pyrrolidone Methylcellulose
  • Methylcellulose pre-gelatinized starch
  • hydroxypropyl methyl cellulose eg, Nos. 2208, 2906, 2910
  • microcrystalline cellulose and combinations thereof, including, but not limited to .
  • Disintegrants that can be used in the compositions of the present invention are used to disintegrate when the tablet is exposed to an aqueous environment. Tablets containing too much disintegrant may disintegrate during storage, while tablets containing too little do not disintegrate at the desired rate under the desired conditions. Therefore, not too much or too little of sufficient disintegrant, so as not to be bad for controlling the release of active ingredient. Amounts should be used to form the solid oral dosage forms of the present invention. The amount of disintegrants used varies depending on the type of formulation and can be readily determined by one of ordinary skill in the art. Typically, from about 0.5 to about 15 weight percent and a disintegrant, preferably from about 1 to about 5 weight percent of disintegrant.
  • Glidants that can be used in the compositions of the present invention include calcium stearate, magnesium stearate, mineral oil, light mineral oil, glycerin, sorbide, manny, polyethylene glycol, other glycols, stearic acid, sodium la Usyl sulfate, talc, hydrogenated vegetable oils (e.g. peanut oil, cottonseed sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil), zinc stearate, ethyl oleate, ethyl laurate, agar and their Including, but not limited to, the complex.
  • hydrogenated vegetable oils e.g. peanut oil, cottonseed sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil
  • zinc stearate ethyl oleate
  • ethyl laurate e.g., agar and their Including, but not limited to, the complex.
  • compositions of the present invention may comprise one or more compounds that can reduce the rate at which the active ingredient degrades.
  • Such compounds include, but are not limited to, stabilizers, antioxidants such as ascorbic acid, pH buffers, or salt buffers.
  • compositions of the present invention may be present in separate dosage forms such as tablets (e.g. chewable tablets), caplets, capsules, and solutions (e.g. flavored syrups) for oral administration.
  • dosage forms comprise a predetermined amount of active ingredient and can be prepared by pharmaceutical methods well known in the art to which this invention pertains (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)). Reference.)
  • the active ingredient of the present invention may be administered by controlled release means or by a delivery device well known to those of ordinary skill in the art.
  • parenteral dosage forms of the compositions of the present invention may be administered to a patient via a variety of routes including, but not limited to, subcutaneous, intravenous (including bolus infusion), intramuscular and intraarterial routes.
  • parenteral dosage forms should preferably be sterile or sterile prior to administration to a patient, as they may bypass the patient's natural defenses against contaminants.
  • parenteral dosage forms include, but are not limited to, injectable solutions, dry products that can be readily dissolved or suspended in pharmaceutically acceptable vehicles for injection, injectable suspensions, and emulsions. .
  • ⁇ - carrier vehicles
  • USP distilled water for injection Sodium chloride injection, Ringer
  • Aqueous vehicles such as 10 injections, dextrose injections, dextrose and sodium chloride injections, lactated Ringer injections; Water-compromising vehicles such as ethyl alcohol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol; Non-aqueous vehicles such as corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzyl benzoate.
  • Topical and mucosal dosage forms of the present invention include, but are not limited to, sprays, aerosols, solutions, emulsions, suspensions, eye drops or other ophthalmic preparations, or other forms known to those of ordinary skill in the art to which this invention pertains. (Remingt Mi's Pharmaceutical Sciences, 16 th and 18 th eds., Mack Publishing East on PA (1980 &1990); and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th 0 ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985)). . Suitable dosage forms for treating oral mucosal tissue can be formulated as mouth washes or oral gels.
  • Suitable additives eg, carriers and excipients
  • other materials that can be used to provide the topical and mucosal dosage forms encompassed by the present invention are well known to those of ordinary skill in the art of pharmacy, and given 5
  • the appropriate composition or dosage form is determined by the particular tissue to be applied.
  • Typical additives for forming solutions, emulsions or gels are usually water, acetone, ethanol, ethylene glycol, propylene glycol, butane-1,3-diol, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, mineral oils and their traces.
  • Compound Including, but not limited to, non-toxic and pharmaceutically acceptable.
  • a moisturizer or humectant may also be added.
  • the effective amount of the virus of the present invention is sufficient to alleviate, improve, mitigate, ameliate, stabilize, inhibit the spread of the disease, slow or delay disease progression, or heal the disease. Dose required for time.
  • the effective amount may be an amount sufficient to achieve the effect of inhibiting angiogenesis.
  • the effective amount may vary depending on a number of factors such as the pharmacokinetic properties of the virus, the method of administration, age, the health and weight of the patient, the nature and extent of the disease state, the number of treatments and the recent form of treatment, for example the virulence and It may also depend on the titer. Those skilled in the art can adjust the appropriate amount based on the above factors.
  • the virus may initially be administered in an appropriate amount as needed depending on the clinical response of the patient.
  • the effective amount of virus can be determined empirically and can be determined according to the maximum amount of virus that can be safely administered and the minimum amount of virus that produces a desired result.
  • the appropriate dose level should be the minimum amount that can achieve the desired result.
  • the concentration of virus administered will vary depending on the characteristics of the target cell. In particular embodiments, less than about 10 9 plaque forming units (“pfu”) may be administered to a human patient. According to various embodiments, about 10 2 to about 10 13 pfu, about 10 2 to about 10 9 pfu, about 10 3 to about 10 8 pfu or about 10 4 to about 10 7 pfu may be administered in a single dose. An effective amount of virus may be administered repeatedly depending on the effectiveness of the initial treatment regimen. Generally, administration is administered periodically while all reactions are monitored. Those skilled in the art will readily appreciate that lower or higher doses may be administered than indicated above, depending on the schedule of administration and the route chosen. In addition, the present invention provides a health food for preventing and improving angiogenesis-related diseases containing riovirus as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of riovirus for use as a health food for preventing and improving angiogenesis-related diseases.
  • the angiogenesis-related diseases include cancer, hemangioma, hemangiofioma, arthritis, diabetic ret ionpathy, retinopathy of premature infants, neovascular glaucoma, corneal disease caused by neovascularization, macular degeneration, and macular degeneration.
  • the riovirus is a microfluidic chip model for vascular endothelial cell destruction by cancer cell lines .
  • the present invention will be described in detail by examples and production examples.
  • lyovirus for use in the present invention, wild-type lyoviruses were prepared and attenuated, and then obtained.
  • wild-type riovirus human type 3 was obtained from the American cell line bank (ATCC, VR-824). The lyovirus was first isolated from fecal diarrhea that caused diarrhea and was donated by Dr. Albert Sab in. To propagate wild type riovirus, BHK-21 cell line, HEK 293 or L929 cells were inoculated with the virus at a multiplicity of infection (MOD about 1 to 10) and incubated at 37 ° C. for 48 to 72 hours. , The cells were lysed by freezing and thawing, and then centrifuged to remove cell debris, and the titer of free lyovirus using L929 monolayer was used for plaque assay (Plaque).
  • MOD multiplicity of infection
  • a microfluidic chip model was prepared in which the breast cancer tumor cells grew and invaded the endothelial cell layer.
  • a microfluidic chip was manufactured by using a soft lithography process (poly-dimethyl siloxane, PDMS; product name: Silgard 184; Dow Cheminal, USA). After sterilizing the prepared microfluidic chip, the glass cover slide was bonded by plasma treatment (Femto Science, Korea) to form a closed microfluidic channel. After adhesion, type I collagen (BD Biosciences, USA) was injected into the formed microfluidic channel and filled, and MCC-7 spheroid, a breast cancer cell line, was inoculated into the microfluidic channel. The chip was placed vertically with the side of the wells facing the bottom to trap and incubated for 30 minutes at 4 ° C.
  • a soft lithography process poly-dimethyl siloxane, PDMS; product name: Silgard 184; Dow Cheminal, USA.
  • the microfluidic chip After confining the cancer globulars, the microfluidic chip is used to remove the collagen injected into the chip to form a vascular structure and to crosslink the collagen with an extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • the endothelial cells endothelial cells HMVEC Lonza, USA
  • the microfluidic channel to the cell incubator 1 Allow time to complete the manufacture of the microfluidic chip model.
  • the inhibitory effect of riovirus on cancer cell growth was confirmed in the prepared microfluidic chip model.
  • the microfluidic chip model prepared in Example ⁇ 2-1> was cultured by continuously administering the Rio virus obtained in Example 1 for 2 days at 2 ⁇ 10 7 PFU for 3 days, and then, The degree of destruction of the vascular endothelial cell layer was confirmed by microscopic observation.
  • PBS was continuously administered for 3 days in a microfluidic chip not treated with riovirus.
  • PBS or meovirus PBS or riovirus was administered to the chip, the flow rate was prevented, and the infection was effectively induced for 1 hour, and the flow rate was resumed and cultured.
  • FVB / NJ mice had 7,12-dimethylbenzo [ ⁇ ] anthracene (7,12-dimethylbenz [aknthracene (DMBA)) and porble—12-myristate-12. Skin cancer was induced with acetate (Phorbol-12-myr i state—13-acetate; TPA).
  • papilloma-induced mice were administered with riovirus to confirm the growth of papilloma tissue.
  • papilloma-derived FVB / NJ mice were divided into 10 experimental groups and 10 control groups, each was bred for 10 weeks for papilloma growth period, and grown and obtained in ⁇ Example 1>
  • riovirus was administered to the papilloma tissue of the experimental group for 3 consecutive days with ixi09pfu per tumor, the growth of the papilloma tissue was observed for about a month, and then the papilloma tissue was sacrificed.
  • riovirus was administered to the papilloma tissue of the experimental group for 3 consecutive days with ixi09pfu per tumor.
  • the neovascularization inhibitory effect of riovirus was confirmed by observing the back surface of the papilloma tissue.
  • the back side of the papilloma tissue of the experimental group and the control mouse from which the papilloma tissue was isolated at the expense of ⁇ Example 3> was observed to photograph the degree of neovascularization associated with the cancer tissue and compared with a photograph.
  • Reovirus 102 to 1013 pfu o
  • the ingredients were mixed and layered in an airtight cloth to prepare a powder.
  • Reovirus 102-1013 pfu corn starch: 100 mg
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • Reovirus 102-1013 pfu corn starch: 100 mg
  • the capsules were prepared by layering the gelatine capsules in accordance with a conventional method for producing capsules.
  • Reovirus 102 to 1013 pfu virus carrier cells (adult stem cells, blood cells, etc. Molecular Therapy. 2009 Vol 17: 1667-1676)

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Abstract

본 발명은 리오바이러스(reovirus)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 리오바이러스(reovirus)는 암세포주에 의한 혈관 내피세포의 파괴 마이크로 유체칩 모델에서 리오바이러스가 혈관내피세포의 세포조직층을 파괴하는 효과를 나타내며, 자연 발생하도록 유도된 종양에 대하여 유의적인 혈관 신생 억제효과를 나타내므로, 상기 리오바이러스는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 및 건강식품용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

[명세서】
【발명의 명칭]
리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 【기술분야】
본 발명은 리오바이러스 (reovirus)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물， 및 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품에 관한 것이다. 【배경기술】
야생형 종양파괴 바이러스 (wild type oncolytic virus)는 내재적으로 강력한 종양파괴능력을 가지는 바이러스로 (Roberts et al. , 2006； Liu et al . , 2007； Bluming et al. , 1971)， 일부 야생형 종양파괴 바이러스는 세포 내 항ᅳ바이러스 면역이 결핍 또는 약화된 암세포를 특이적으로 감염 및 증식함을 통해 종양 세포의 파괴를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al. , 2010； Parato et al.， 2005) .
야생형 종양파괴 바이러스를 이용한 암 치료의 연구는 기존의 치료 유전자를 바이러스 내에 삽입하여 치료유전자의 발현에 의한 종양살상 효과를 목표로 하는 유전자 치료 (gene therapy)와 구별되며， 자연 감염된 여러 종류의 바이러스로 인한 자연적 암의 치료는 오래전부터 보고되고 있으나， 본격적으로 야생형 종양파괴 바이러스에 의한 종양 특이적 살상 기작에 관한 연구가 진행되고 있는 대표적인 예로는 oncolyticbiotech사에서 임상 3상의 적용에까지 이른 야생형 리오바이러스 (Reovirus)를 이용한 암 치료 연구가 있다.
야생형 종양파괴 바이러스를 이용한 암 치료의 연구는 자연계에 이미 존재하는 바이러스를 사용하기 때문에 우수한 안전성을 가져 임상 적용이 빠르게 진행된다는 장점올 가진다. 또한 암세포만을 선택적으로 증식 및 세포사멸을 유도하므로, 최근 다양한 종류의 야생형 종양살상 바이러스를 이용한 전임상 및 임상연구가 활발하게 진행되고 있다 (Roberts et al. , 2006) . 현재 한국을 포함하여 미국， 유럽 등에서 10여 개가 넘는 다양한 항암 바이러스가 임상시험중에 있다. 리오바이러스는 2011년 현재 3개국 (미국, 영국， 벨기에)에서 임상 3상이 진행 중이며, 그 외에도 Wellstat Biologies사에서 가금류 바이러스의 일종인 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus)를 이용한 임상 1상의 적용을 마쳤고， 콕사키 바이러스 (Coxsackie virus)(Viralytics사) 및 폭스바이러스 (Poxvirus)의 일종인 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus) (Generex 및 Genelux사)는 임상 2상의 적용을 마친 상태이다. 특히， 상기 바이러스의 대부분은 임상적용시험에서 심각한 독성이 확인되지 않았으며， 최대허용용량 (maximum tolerated dose; MTD)이 설정되지 않아, 높은 수준의 안정성을 보인다 (Roberts et al., 2006； Liu et al . , 2007)., 따라서, 항암 바이러스를 임상에서 광범위하게 사용하기 위해서는 항암 바이러스의 면역능 증가에 대웅하여 면역학적 방어를 최소화할 수 있는 제형 연구, 기존 항암제 등과의 병용 요법 연구， 안정성 연구 등이 필수적으로 진행되어야 한다. 리오바이러스 (Respiratory Enteric Orphan Virus! Reovirus)는 전체 게놈이 10 개의 이중 -가닥 RNA 단편으로 구성되는 비 -외피 바이러스로ᅳ 일반적인 환경에 편재하며 (ubiquitous), 면역 기능을 가지는 숙주에서 증상을 보이지 않는 무증후성 바이러스이다. 사람에게 감염성이 약하여 감염 부위는 상부 호흡기 및 위장관에 국한되는 것으로 알려져 있다 (Tylerᅳ 2001).
리오바이러스는 특정 타입의 형질 변환된 세포에 감염되었을 때， 강력한 세포파괴 (cytocidal) 활성을 나타내는 것으로 오래전부터 알려져 있어 (Duncan et al, 1978； Hashiro et al , 1977)， 이를 활용하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 야생형 리오바이러스에 감염된 건강한 숙주에서는 증상이 나타나지 않으나， 숙주의 면역체계가 손상된 경우 위험도가 증가하게 되므로， 암 환자와 같은 환자에서 리오바이러스의 임상적 가능성이 제한될 수 있다. 그러나， 리오바이러스의 종양파괴 활성에 대한 연구가 계속 되면서 종양을 유발하는 Ras-신호전달 경로를 포함하는 세포가 실험실 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 리오바이러스 (3형 Dearing 주) 감염에 민감한 것이 보고되면서 (Coffey et al， 1998； Strong et al, 1998； Norman et al , 2004) , 면역 체계 손상의 제한을 가지지 않는 암 환자를 대상으로 하는 리오바이러스 요법이 현재 임상에서 사용되고 있다 (Norman etal, 2005) . 신생혈관의 유도현상은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로, 정상적인 발생， 즉 태아의 발생 (embryonic development), 생식주기 (female reproductive cycle)(D. M. Noden , Am. Rev. Respir . Dis. 140， 1097-1103(1989)), 성장 그리고 상처 치유 시 필수적일 뿐 아니라， 각종 암， 관절염, 당뇨병성 망막증， 죽상경화증 등의 질병과도 깊은 관련을 맺고 있다 (O'Brien, E. R. et al. , AM. J. Pathol. 145， 883-894(1994)). 특히 악성종양으로 발전하는 과정 중의 하나인 암의 전이 시 생혈관 유도현상은 필수적인 과정으로 여겨진다.
따라서, 신생 혈관의 형성을 억제함을 통해 암의 성장 기전을 밝히고， 암의 조기진단， 예방 및 치료에 사용할 수 있을 뿐만 아니라， 관련 질병인 류마티스성 관절염， 만성염증， 당뇨병성 망막증， 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 수 있으므로， 지속적인 연구 및 개발이 계속되고 있으며 (W.Auerbach et al .， Pharnac . Ther . , 61， 265-311(1994)), 몇 가지의 억제제는 활성검증을 위해 임상 시험이 진행 중에 있다 (R. Bicknel et al.， TiPS, 16， 57(1995)).
FVB/NJ 쥐는 다른 마우스종에 비해 화학물질에 의해 유도돠는 피부암의 발생율이 현저하게 높은 것으로 알려져 있다. FVB/NJ 쥐에 7,12-디메틸벤조 [ α]안트라센 (7,12-dimethylbenz[ a]anthracene; DMBA) 100 및 포르볼 -12-미리스테이트 -13-아세테이트 (Phorbol -12-myr i st at e_13— acetate； TPA) 5 //g을 피부에 처리하였을 때 마우스당 11.8개의 유두종 (papillomas)이 생성되었고， 상기 유두종이 악성종양인 편평상피암 (Squamous Cell Carcinomas; sec)로 악성화되는 비율이 다른 마우스 종에 비해 현저히 높은 것으로 보고되어 있다 1" 10 61 3 14:11， 2353-2358) . 이에， 본 발명자들은 새로운 혈관신생 억제 활성을 갖는 바이러스를 찾기 위해 노력한 결과， 암세포주에 의한 혈관 내피세포의 파괴 마이크로 유체칩 모델에서 리오바이러스가 혈관내피세포의 세포조직층을 파괴하는 효과를 나타내며， 화학물질을 이용하여 마우스의 피부에 자연 발생하도록 유도된 종양에 대하여， 리오바이러스의 현저한 혈관 신생 억제효과를 확인함으로써， 상기 리오바이러스를 혈관신생 억제용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제]
본 발명의 목적은 리오바이러스 (reovirus)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물， 및 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적올 달성하기 위하여， 본 발명은 리오바이러스 (reovirus)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 혈관신생 억제용 외래 유전자를 추가적으로 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 리오바이러스과에 속하는 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 혈관신생 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 리오바이러스과에 속하는 리오바이러스의 용도를 제공한다 .
아울러， 본 발명은 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 리오바이러스의 용도를 제공한다 .
[유리한 효과]
본 발명은 리오바이러스 (reovirus)는 자연 발생하도록 유도된 종양에 대하여， 유의적인 혈관 신생 억제효과를 나타내므로， 혈관신생 억제용 약학적 조성물 및 건강식품용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1 및 도 2는 유방암 세포주인 MCF7가 자라면서 혈관내피세포층 (Vascular endothelial cell layer)을 파괴 (Invasion)하는 마이크로 유체칩 모델에서, 리오바이러스에 의한 암세포주 생장 억제 및 혈관내피세포 조직층 파괴 효과를 나타내는 도이다.
도 3은 FVB/NJ 마우스에 포르볼 -12-미리스테이트 -13-아세테이트 (Phor bo 1-12— myri stat e-13-acet ate； TPA)를 도포하여 6 주 후 유도된 유두종 (Papilloma) 조직을 나타내는 도이다. 도 4는 FVB/NJ 마우스에 TPA를 도포하여 10 주 후 성장한 유두종 조직을 나타내는 도이다.
도 5은 리오바이러스 (reovirus)에 의한 유두종 생장 억제를 나타내는 도이다.
도 6는 리오바이러스에 의한 혈관 형성 억제를 나타내는 도이다. 도 6A는 대조군의 유두종 조직을 나타내며， 도 6B는 대조군의 유두종 조직 후면의 혈관 형성을 나타낸다. 도 6C는 실함군의 유두종 조직을 나타내몌 도 6D는 실험군의 유두종 조직 후면의 혈관 형성을 나타낸다. 화살표는 유두종 조직 및 연계된 혈관을 지시한다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 리오바이러스 (reovirus)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 리오바이러스과에 속하는 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단채를 포함하는 혈관신생 억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 혈관신생 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 리오바이러스과에 속하는 리오바이러스의 용도를 제공한다.
상기 리오바이러스는 야생형 (wild type) 바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 리오바이러스는 임의의 리오바이러스로부터 유도될 수 있으며 , 다양한 소스로부터 수득될 수 있는 리오바이러스과 (Reoviridea family)의 구성원인 것이 바람직하고， 혈청 타입 l(Lang), 타입 2( Jones) 또는 타입 3(Dealing 및 Aneny) 리오바이러스인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한， 상기 리오바이러스는 인간을 제외한 영장류 (챔팬지， 고릴라， 짧은 꼬리 원숭이， 원숭이 등)， 설치류 (생쥐, 쥐， 게리빌스쥐， 햄스터， 토끼， 기나아피그 등)， 개， 고양이， 일반 가축 (소， 말， 돼지， 염소)을 포함하는 기타 포유류 종의 세포에 대해 향성 (tropism)을 나타내는 하나 또는 그 이상의 리오바이러스로 부터 유도될 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것이 바람직하고,상기 질환은 암， 혈관종， 혈관섬유종， 관절염， 당뇨병성 망막증 (diabetic ret ionpathy), 조숙아의 망막증， 신생혈관성 녹내장， 신생혈관에 의한 각막질환， 퇴화반 /황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성， 익상편， 망막변성， 후수정체 섬유증식증， 과립성 결막염， 건선ᅵ 모세관 확장증， 화농성 육아종， 건선， 지루성 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환인 것이 바람직하며, 상기 암은 간암， 위암， 결장암， 유방암， 폐암, 비소세포성폐암， 골암， 췌장암， 피부암， 두부 또는 경부암， 피부 또는 안구 내 혹색종， 자궁경부암， 난소암， 대장암， 소장암， 직장암 ,항문부근암，나팔관암종，자궁내막암종，자궁경부암종，질암종，음문암종， 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암， 소장암， 임파선암， 방광암， 담낭암， 내분비선암， 갑상선암， 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종， 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 방광암，신장 또는 수뇨관 암， 신장세포 암종， 신장골반 암종， 중추신경계 (CNS; central nervous system)종양, 1차 CNS 림프종， 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 리오바이러스는 추가적으로 외래 유전자 (heterologous gene)를 리오바이러스 유전자 내 복제필요 유전자부위 (essential region) 또는 복제불필요 유전자부위 (non-essential region)에 포함할 수 있다. 상기 외래 유전자 (heterologous gene)라는 용어는 바이러스 게놈 (viral genome)에서 발견되지 않는 어떤 유전자를 받아들인다는 의미이다. 외래유전자는 야생형 유전자의 대립형질 변이체 (allelic variant)이거나 돌연변이 유전자일 수 있다. 외래유전자는 생체 내 조건의 세포에서 전기 외래유전자를 발현하게 하는 조절서열 (control sequence)에 작동 가능하도톡 연결되는 것이 바람직하다. 따라서， 본 발명의 바이러스는 외래유전자가 발현될 수 있는 생체 내 조건의 세포에 외래유전자 /유전자들을 전달하도록 사용될 수 있다.
상기 외래 유전자는 항-혈관신생 유전자， 종양 억제인자 유전자， 항원성 유전자， 세포독성 유전자， 세포증식억제 (cytostatic) 유전자， 자살 유전자， 항-혈관및 면역 -조절 유전자인 것이 바람직하다.
상기 "항 -혈관신생 유전자' '는 그 발현에 의해 항-혈관신생 인자의 세포외 분비가 야기되는 뉴클레오티드 서열이다. 항-혈관신생 인자로는 안지오스타틴 (angiostatin), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 태반 성장 인자 (P1GF)의 억제제， 예를 들면， 가용성 VEGFRl(sFLT-l)[PNAS(USA), 95， 8795-8800 (1998)], 엔도스타틴 및 아포리포단백질 (a)크링글 (kr ingle) 영역 (LK8)이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 "종양 억제인자 유전자 "는 표적 세포에서 그의 발현이 종양 표현형을 억제하고 /하거나 세포자멸 (apoptosis)을 유도할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 종양 억제인자 유전자의 예로는 p53-유전자， APC-유전자， DPC-4/Smad4유전자， BRCA-1 유전자， BRCA-2유전자， WT-1유전자， 망막아세포종 유전자 [Lee et al..Nature, 329, 642 (1987)], MMAC-1 유전자, 선종성 용종증 코일 단백질 (미국 특허 제 5,783,666 호), DCC( deleted in colorectal cancer, 결장암에서 결실된) 유전자， 醒 SC-2유전자， 염색체 3p21.3 상에 위치한 비인후암 억제인자 유전자 [Cheng et al.， Proc. Nat. Acad. Sci., 95 3042-3047 (1998)], MTS1유전자， CDK4유전자， NF-1 유전자， NF-2유전자， VHL 유전자 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 "항원성 유전자"는 표적 세포에서 그의 발현이 면역 시스템에 의해 인지될 수 있는 세포 표면 항원 단백질의 생성올 야기하는 뉴클레오티드 서열이다ᅳ 상기 항원성 유전자의 예로는， 암태아성 항원 (CEA), CD3, CD133, CD44 및 p53(국제 특허 공개 TO94/02167호)이 포함된다. 면역 시스템에 의한 용이한 인지를 위해， 항원성 유전자는腿 C I형 항원과 결합될 수 있다.
상기 "세포독성 유전자 "는 세포에서 발현될 때 독성 효과를 나타내는 뉴클레오티드 서열이다. 세포독성 유전자의 예로는 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (exotoxin), 리신 독소， 디프테리아 독소 등을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
상기 "세포증식억제 유전자 "는 세포에서 발현될 때 세포 주기 정지를 유도하는 뉴클레오티드 서열이다. 세포증식억제 유전자는 p21, 망막아세포종 유전자， E2F-Rb 융합 단백질, 사이클린-의존성 키나제 억제제를 암호화하는 유전자 (예를 들면, P16, pl5, pl8 및 pl9), 성장 정지 특이성 호메오박스 (homeobox)유전자 (국제 특허 공개 W097/16459호 및 W096/30385호) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 "자살 유전자' '는 세포에서 발현될 때 세포자멸을 통해 세포 사멸을 유도하는 뉴클레오티드이다. 자살 유전자는 단순 포진 (herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나제， 수두 티미딘 키나제， 사이토신 디아미나제， 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제， 베타 -락타나제， 카복시펩티다제 G2, 사이토크롬 P450-2B1, 니트 로리덕타제， 베타—글루쿠로니다제， TRAIL TNF 관련 세포자멸 -유도 리간드) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 "면역 -조절 유전자 "는 세포에서 발현될 때 체액 및 세포성 면역 반응을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 면역 -조절 유전자는 CD16, CTLA-4, IL24, GM-CSF 등을 암호화하는 유전자가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 리오바이러스는 바이러스 운반용 세포 (Virus carrier cells: Molecular Therapy. 2009 Vol 17 :1667-1676 에 탑재될 수 있으며， 이를 통해 생체 내에서 치료효과를 더욱 상승시킬 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 시험관 내 (In vitro)에서 리오바이러스의 혈관 생성 저해 효과를 확인하기 위해， 유방암 세포주인 MCF7가 자라면서 혈관내피세포층 (Vascular endothelial cell layer)을 파괴 (Invasion)하는 마이크로 유체칩 모델을 제조하고， 리오바이러스를 감염시켜 배양한 결과, 리오바이러스가 혈관내피세포층이 거의 사라지면서 MCF7 세포주의 생장 역시 억제하는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2 참조).
또한， 본 발명자들은 생체 내 (In vivo)에서 리오바이러스의 혈관 생성 저해 효과를 확인하기 위해， FVB/NJ 마우스에 7，12-디메틸벤조[ (1 ]안트라센(7，12—(1^ 1 11 112[ 01 ]3^^^61½； DMBA) 및 포르볼 -12-미리스테이트 -13-아세테이트 (Phorbol-12-myr i state_13— acetate； TPA)로 유두종 (papilloma)을 유도하고 (도 3 및 도 4 참조)， 리오바이러스를 동물실험용으로 정제한 다음， 유두종 성장 억제능을 확인하기 위하여 유두종이 유도된 마우스에서 리오바이러스를 투여하여 유두종 조직의 성장을 확인한 결과， 리오바이러스를 투여한 경우， 대조군에 비교하였을 때 유두종의 성장에는 큰 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 5 참조).
또한， 리오바이러스의 신생혈관 형성 억제능을 확인하기 위하여， 유두종 조직의 뒷면을 관찰하여 신생혈관 형성을 확인한 결과, 리오바이러스를 투여한 경우， 대조군에 비해 혈관의 형성이 유의적으로 감소 또는 둔화되는 것을 확인하였다 (도 6 참조).
따라서， 본 발명의 리오바이러스는 암세포주에 의한 혈관 내피세포의 파괴 마이크로 유체칩 모델에서 리오바이러스가 혈관내피세포의 세포조직층을 파괴하는 효과를 나타내며, 자연 발생하도록 유도된 종양에 대하여 유의적인 혈관 신생 억제효과를 나타내므로， 혈관신생 억제용 약학적 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 투여 형태는 경구， 점막 (예를 들어， 비강， 설하， 질， 버칼， 또는 직장)， 비경구적 (예를 들어, 피하， 정맥, 블루스 주입, 근육내 또는 동맥내)， 국소 (예를 들어， 눈)， 경피 (transdermal) 또는 피부통과 (transcutaneous) 방식 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 형태의 예는 정제; 캐프릿 (caplets); 부드러운 탄성 젤라틴 갑셀과 같은 캅셀제 ; 캐세트 (cachets); 트로키 ; 로젠즈 ( lozenges)； 분산제; 좌제; 파우더; 에어로솔 (예를 들어， 비강 스프레이 또는 인홀러); 겔; 현탁제제 (예를 들어， 수상 또는 비 -수상 액상현탁제제， 수중유형 유제, 또는 유중수형 액상 유제) 용액제 및 엘릭실제를 포함하는 환자에게 경구 또는 점막 투여하기에 알맞은 액상 투여 제형; 환자에게 주사 투여하기에 알맞은 액상 투여 제형 ; 국소 투여하기에 적당한 아이 드랍 (eye drop)또는 다른 안과 제게; 및 환자에게 주사 투여하기에 적당한 액상 투여 형태를 제공하기 위하여 재구성될 수 있는 멸균 고상제제 (예를 들어, 결정형 또는 무정형 고체)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 투여 형태의 종류, 모양， 및 타입은 일반적으로 그들의 사용에 따라 매우 다양하다. 예를 들어, 질환의 급성 치료를 위해 사용된 투여 형태는 동일한 질환의 만성 치료를 위해 사용되는 투여 형태보다 많은 양의 활성 성분을 포함할 수 있다. 또한， 비경구적 투여 형태는 동일 질환을 치료하기 위해 사용된 경구 투여 형태보다 더 적은 양의 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 투여 형태 및 방식들은 매우 다양하며， 이는 본 발명이 속한 분야에 있어 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다 (Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. ,Mack Publishing, East on PA (1990) 참조.) '
본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 투여를 위해 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어， 경구 액상 또는 에어로솔 투여 형태의 사용에 적합한 부형제는 물， 글리콜， 오일, 알코올， 향료 성분， 보존제， 및 착색 성분을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 경구 투여 형태 (예를 들어， 파우더， 정제， 캅셀제 및 캐플릿)에서 사용하기에 알맞은 부형제의 예는 전분， 설탕， 미결정 셀를로오스, 부형제， 과립화제， 활택제， 결합제 및 붕해제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 투여의 편리함 때문에， 정제 및 캅셀제는 가장 유용한 경구 투여 유닛 형태이고， 이 경우 고형 부형제가 적용된다. 바람직하게는 정제는 표준 수상 또는 비수상 (nonaqueous) 기술을 이용하여 코팅될 수 있다. 본 발명의 경구 투여 형태에서 사용될 수 있는 부형제의 예는 결합제， 충진제， 붕해제， 및 활택제흩 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적 조성물 및 투여 형태에서의 사용에 적당한 결합제는 옥수수 전분， 감자 전분， 또는 다른 전분, 젤라틴, 아카시아와 같은 천연 및 합성 검류， 소디움 알지네이트， 알지닉 산, 다른 알지네이트, 분말 트라가칸트 (powdered tragacanth),구아검 (guar gum), 셀를로오스 및 그의 유도체 (예를 들어， 에틸 셀를로오스， 셀를로오스 아세테이트， 카복시메틸 셀를로오스 칼슘， 소디움 카복시메틸 셀를로오스)， 폴리비닐 파이로리돈, 메틸셀를로오스， 프리-젤라틴화 전분， 하이드록시프로필 메틸 셀롤로로스， (예를 들어， Nos.2208, 2906, 2910)， 미결정 셀롤로오스， 및 그들의 흔합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 붕해제는 정제가 수성 환경에 노출되었을때 붕해되도록 하기 위하여 사용된다. 너무 많은 붕해제를 포함한 정제는 보관 중에 붕해될 수 있는 반면， 너무 적게 포함한 정제는 바람직한 조건 하에서 바람직한 속도로 붕해되지 않는다. 따라서 활성 성분의 방출을 조절하는데 나쁘지 않도록 너무 많지도 너무 적지도 않은 충분한 붕해제의 양이 본 발명의 고형 경구 투여 형태를 형성하기 위해 사용되어야 한다. 사용된 붕해제의 양은 제제의 타입에 따라 다양하고， 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 쉽게 판단할 수 있다. 통상 약 0.5 내지 약 15 중량 퍼센트와 붕해제， 바람직하게는 약 1내지 약 5중량 퍼센트의 붕해제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 활택제는 칼슘 스테아레이트， 마그네슘 스테아레이트， 미네랄 오일， 경 (light) 미네랄 오일， 글리세린， 소르비를， 만니를， 폴리에틸렌 글리콜， 다른 글리콜， 스테아릭 산， 소디움 라우릴 설페이트， 탈크， 수소화 식물유 (예를 들어, 땅콩 유， 면실 유 해바라기 유， 참깨 유， 올리브 유， 옥수수유, 및 콩 유)， 진크 스테아레이트， 에틸 올레에이트， 에틸 라우레에이트， 아가 및 그들의 흔합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 활성 성분이 분해하는 속도를 줄일 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 상기 화합물은 안정화제, 아스코르벽 산과 같은 항산화제， pH 완충제， 또는 염 완충제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 경구 투여를 위해 정제 (예를 들에 츄어블정)，캐플릿 (caplet),캅셀， 및 액제 (예를 들어，가향된 (flavored)시럽)와 같은 별개의 투여 형태로 존재할 수 있다. 그러한 투여 형태는 미리 정해진 양의 활성 성분을 포함하고， 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 약학 방법에 의해 제조될 수'있다 (Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. , Mack Publishing,Easton PA (1990) 참조.)
본 발명의 활성 성분은 조절 방출 수단에 의해서 또는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 전달 장치에 의해서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 일반적인 비경구 투여 형태는 환자에게 피하， 정맥 (볼루스 주입을 포함)， 근육 내 및 동맥 내 경로를 포함하는 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며 이제 한정되지 않는다. 상기 투여에 의해 일반적으로 오염원에 대한 환자의 자연적 방어를 우회할 수 있기 때문에, 비경구적 투여 형태는 바람직하게는 멸균 또는 환자에게 투여 전에 멸균될 수 있어야 한다. 비경구적 투여 형태의 예는 주사용 용액， 주사를 위한 약학적으로 허용 가능한 운반체 (vehicle)로 용이하게 용해 또는 현탁될 수 5 있는 건조 프로덕트， 주사용 현탁액， 및 유제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 비경구적 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적당한
■ -- 운반체 (vehicle)은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 USP 주사용 증류수; 소디움 클로라이드 주사액， 링거
10 주사액， 덱스트로스 주사액， 덱스트로스 및 소디움 클로라이드 주사액， 락테이티드 링거 주사액과 같은 수성 비히클; 에틸 알코을， 폴리에틸렌 글리콜， 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 물-흔화성 비히클; 옥수수 유, 면실 유， 땅콩 유， 참깨 유,에틸 올레에이트， 이소프로필 미리스테이트， 및 벤질 벤조에이트와 같은 비 -수상 비히클을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
15 본 발명의 국소 및 점막 투여 형태는 스프레이， 에어로솔， 용액， 유제， 서스펜션， 아이 드랍 또는 다른 안과 제제， 또는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다른 형태를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다 (RemingtMi' s Pharmaceutical Sciences, 16th and 18theds .， Mack Publishing East on PA (1980 & 1990)； 및 Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th 0 ed. , Lea & Febiger, Philadelphia (1985) 참조). 구강 내 점막 조직을 치료하기 위해 적당한 투여 형태는 양치질 약 (mouth wash) 또는 경구 겔제로 제제화 될 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 국소 및 점막 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적당한 첨가제 (예를 들어， 운반체 및 부형제)및 다른 물질들은 약학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고， 5 주어진 약학적 조성물 또는 투여 형태가 적용될 특정 조직에 의해 결정된다. 통상 용액， 유제 _또는 겔제를 형성 하기 위한 전형적인 첨가제는 물， 아세톤， 에탄올， 에틸렌 글리콜， 프로필렌 글리콜， 부탄 -1,3-디올， 이소프로필 미리스테이트， 이소프로필 팔미테이트, 미네랄 오일 및 이들의 흔합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며， 이들은 비-독성이고 약학적으로 허용 가능하다. 또한 가습제 (moisturizer) 또는 습윤제 (humect ant)가 더 첨가될 수 있다. 상기 부가적 성분의 예는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th eds. Mack Publishing, East on PA (1980 & 1990) 참조). 본 발명의 바이러스의 유효량은 질병을 완화 (alleviate), 향상 (improve) , 경감 (mitigate), 개선 (ameliorate) , 안정화， 질병의 확산 억제， 질병의 진행을 늦추거나 지연， 질병을 치유하기 위해 충분한 시간 동안 요구되는 용량이다. 예를 들어， 유효량은 혈관신생을 억제시키는 효과를 달성하기에 충분한 양이 될 수 있다.
상기 유효량은 바이러스의 약동학적 특성， 투여 방법， 연령， 환자의 건강상태 및 체중， 질병 상태의 특성 및 범위， 치료 횟수 및 최근의 치료 형태와 같은 수많은 인자에 의해 달라질 수 있으며 , 가령 바이러스의 병독성 및 역가에 따라서도 달라질 수 있다. 당업자라면 상기 인자에 기초하여 적정량을 조절할 수 있다. 바이러스는 처음에 환자의 임상적 반응에 의존해 필요에 따라 적정량으로 투여될 수 있다. 바이러스의 유효량은 경험적으로 결정할 수 있으며 안전하게 투여될 수 있는 바이러스의 최대량 및 바람직한 결과를 유발하는 바이러스의 최소량에 따라 결정할 수 있다.
바이러스를 전신에 투여할 때 , 질병 부위에 바이러스를 주입함으로써 실현되는 것과 유사한 임상적 효과를 유발하기 위해， 상당히 높은 용량의 바이러스 투여가 요구될 수 있다. 그러나， 적당한 용량 레벨은 바람직한 결과를 실현할 수 있는 최소량이 되어야 한다.
투여되는 바이러스의 농도는 표적이 되는 세포의 특징에 따라 달라질 것이다. 구체적으로 실시예로, 약 109플라그 형성 단위 ( "pfu" ) 미만의 양이 인간 환자에게 투여 될 수 있다. 다양한 실시예에 따르면， 약 102내지 약 1013 pfu, 약 102내지 약 109pfu, 약 103 내지 약 108 pfu 또는 약 104 내지 약 107 pfu를 단일 용량으로 투여할 수 있다. 유효량의 바이러스는 최초 치료 요법의 효과에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 일반적으로 투여는 모든 반웅을 모니터링하는 동안 주기적으로 투여된다. 당업자라면 투여 스케줄 및 선택된 경로에 따라 상기 표시된 것보다 낮거나 높은 용량이 투여될 수 있음을 용이하게 파악할 수 있다. 아을러， 본 발명은 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 리오바이러스의 용도를 제공한다.
상기 혈관신생 관련질환은 암， 혈관종， 혈관섬유종， 관절염， 당뇨병성 망막증 (diabetic ret ionpathy) , 조숙아의 망막증， 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반 /황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성， 익상편， 망막변성， 후수정체 섬유증식증， 과립성 결막염， 건선， 모세관 확장증， 화농성 육아종， 건선, 지루성 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터: 선택되는 어느 하나 이상의 질환인 것이 바람직하며， 상기 암은 간암， 위암， 결장암, 유방암， 폐암， 비소세포성폐암， 골암， 췌장암， 피부암， 두부 또는 경부암， 피부 또는 안구 내 혹색종， 자궁경부암， 난소암， 대장암， 소장암， 직장암，항문부근암，나팔관암종，자궁내막암종，자궁경부암종，질암종，음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암， 소장암， 임파선암， 방광암, 담낭암， 내분비선암， 갑상선암， 부갑상선암， 부신암, 연조직 육종， 요도암， 음경암， 전립선암,만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종，방광암，신장 또는 수뇨관 암， 신장세포 암종， 신장골반 암종， 중추신경계 (CNS; central nervous system)종양， 1차 CNS 림프종， 척수 종양， 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 리오바이러스는 암세포주에 의한 혈관 내피세포의 파괴 마이크로 유체칩 모델에서 리오바이러스가 혈관내피세포의 세포조직층을 파괴하는. 효과를 나타내며， 자연 발생하도록 유도된 종양에 대하여 유의적인 혈관 신생 억제효과를 나타내므로， 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하가 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>야생형 및 약독화된 리오바이러스 (reovirus)의 증식 및 수득
본 발명에서 사용할 리오바이러스를 준비하기 위하여， 야생형 리오바이러스를 제조 및 약독화 (attenuation)한 후， 수득하였다.
구체적으로， 야생형 리오바이러스 인간 타입 3(Dealing)를 미국세포주은행 (american type culture collection; ATCC, VR-824)에서 입수하였다. 상기 리오바이러스의 1955 년경에 설사를 일으키는 어린이의 분변에서 최초 분리되어 Albert Sab in 박사에 의해 기증되었다. 야생형 리오바이러스를 증식하기 위해 BHK-21 세포주， HEK 293 또는 L929 세포에 감염다중도 (Multiplicity of infection; MOD 약 1 내지 10로 바이러스를 접종하여 48내지 72시간 동안 37°C에서 배양하였다. 그런 다음， 상기 세포를 동결융해 (Freezing and Thawing)하여 파쇄한 후， 원심분리하여 세포 파괴물 (cell debris)을 제거하고， 유리된 리오바이러스의 역가를 L929 단분자막 (mono layer)를 이용해 용균반검사 (Plaque assay)법을 사용하여 확인하여 영하 80°C에 보관하면서 사용하였다. 수득한 야생형 리오바이러스를 약독화하기 위해 HT108 세포에 접종하였으며， 야생형 리오바이러스의 증식 및 수득과 동일한 방법으로 약독화된 리오바이러스를 증식 및 수득하였다 (Kim Met al, Oncogene 26 :4124-34, 2007; Kim M et al . , British Journal of Cancer . 104， 290-299, 2011).
그 결과， 100 내지 1000 pfu/세포의 역가를 가지는 야생형 및 약독화된 리오바이러스 시료를 수득하였다. <실시예 2>시험관 내 (In vitro)에서 리오바이러스의 혈관신생 억제효과 확인 <2-1>마이크로 유체칩 모델와 제조
리오바이러스가 나타내는 혈관신생 억제효과를 시험관 내 수준에서 확인하기 위하여， 유방암 종양세포가 자라면서 내피세포층을 침범 (Invasion)하는 마이크로 유체칩 모델을 제조하였다.
구체적으로， 폴리디메틸실록산 (poly-dimethyl siloxane, PDMS; 제품명: Silgard 184； Dow Cheminal사, 미국)소프트 리소그래피 과정 (soft lithography process)를 이용하여 미세유동 칩 (microf luidic chip)을 제조하였다. 제조한 미세유동 칩을 멸균한 후， 유리 커버슬라이드를 플라즈마 처리 (plasma treatment; Femto Science, 한국)하여 접착함으로써 덮힌 (closed) 미세유동 채널을 형성하였다. 접착 후， 제 1형 콜라겐 (Type I collagen; BD Biosciences , 미국)을 형성된 미세유동 채널로 주입하여 채우고， 유방암 세포주인 MCF-7 구형상체 (spheroid)를 미세유동 채널에 접종한 다음， 암 구형상체를 가두기 (trap)위해서 웰의 측면 (side)를 바닥으로 향하도록 수직적으로 칩을 세워 4°C에서 30 분 동안 배양하였다. 암 구형상체를 가둔 후， 칩 내에 주입했던 콜라겐을 제거하여 (aspirated) 혈관 구조 (vascular structure)을 형성하고， 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)으로 콜라겐을 가교화 (crosslink)하기 위해서 미세유동 칩을 세포 배양기에 두었다. 그런 다음， 내피세포 (endothelial cell)인 HMVEC Lonza사， 미국)을 미세유동 채널에 2X106 세포 의 세포밀도로 접종하여 1 시간 동안 배양하고， 혈관 구조를 구성하기 위해 상기 미세유동 채널을 세포 배양기에 1 시간 동안 두어， 마이크로 유체칩 모델의 제조를 완성하였다. <2-2>마이크로 유체칩 모델에서 리오바이러스의 혈관신생 억제 효과 확인
리오바이러스가 나타내는 혈관신생 억제효과를 시험관 내 수준에서 확인하기 위하여， 제조된 마이크로 유체칩 모델에서 리오바이러스에 의한 암세포 생장 억제효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 마이크로 유체칩 모델에 상기 <실시예 1〉에서 수득한 리오바이러스를 2X107 PFU 씩 3 일 동안 연속투여하여 배양하고, 4일 째에 리오바이러스에 의한 혈관내피세포층의 파괴정도를 현미경 관찰을 통해 확인하였다. 음성 대조군으로는， 리오바이러스를 투여하지 않은 마이크로 유체칩에 PBS를 3 일 동안 연속투여하였다. PBS 또는 뫼오바이러스의 투여시에는 PBS 또는 리오바이러스를 칩에 투여한 후， 유속을 막아 1 시간 동안 효율적으로 감염이 일어나도록 유도한 후， 유속을 재개하여 배양하였다.
그 결과， 도 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이 음성 대조군에서는 MCF7 세포주가 자가 혈관 내피세포층을 침범하여 이를 파괴하는 것을 확인한 반면， 리오바이러스 투여 후 3 일째 (후감염 2 일째) 또는 4 일째 (후감염 3 일째)의 경우， 리오바이러스가 혈관내피세포층이 거의 사라지면서 MCF7 세포주의 생장 역시 억제함으로써， 본 발명의 리오바이러스가 종양의 억제 뿐만 아니라 혈관 생성을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2).
<실시예 3> 생체 내 (In vivo)에서 리오바이러스의 혈관신생 억제효과 확인 <3-1>화학물질을 이용한종양의 유도
화학물질을 이용하여 마우스에서 종양을 유도하기 위하여, FVB/NJ 마우스에 7，12-디메틸벤조 [ α]안트라센 (7,12-dimethylbenz[ aknthracene; DMBA) 및 포르블—12-미리스테이트 -13-아세테이트 (Phorbol -12-myr i state— 13-acetate； TPA)로 피부암을 유도하였다.
구체적으로， 7주령의 수컷 FVB/NJ마우스 20마리를 구입하여 등의 털을 제거한 후, 제모로 인한 염증반응이 유도되는지 확인하기 위하여 2 일 동안 관찰하였다. 그런 다음， 일 주일 이내에 25 /g의 DMBA를 FVB/NJ마우스 등에 2 회 도포하고， 일 주일에 2 회씩 최대 10 주 동안 TPA를 도포하여 유두종 (Papilloma)을 유발하였다.
그 결과， 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이 TPA 도포 6 주 후부터 유두종이 유도되었으며 (도 3)， TPA 도포 10 주 후에는 모든 마우스에서 골고루 유두종이 생성된 것을 확인하였다 (도 4).
<실시예 3> 리오바이러스의 유두종 성장 억제능 확인
리오바이러스의 유두종 성장 억제능을 확인하기 위하여 유두종이 유도된 마우스에서 리오바이러스를 투여하여 유두종 조직의 성장을 확인하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 2>에서 유두종을 유도한 FVB/NJ 마우스 20 마리를 10 마리씩 실험군 및 대조군으로 나누고， 유두종 성장기간을 위해 10 주간 사육하였고， 상기 <실시예 1〉에서 증식 및 수득한 리오바이러스를 실험군의 유두종 조직에 3일 연속으로 종양 당 ixi09pfu씩 투여한 후， 약 한 달 동안 유두종 조직의 성장을 관찰한 다음， 희생하여 유두종 조직을 분리하였다. 리오바이러스의 유두종 성장 억제능을 비교하기 위하여,
, 대조군에는 리오바이러스를 투여하지 않고 실험군과 동일한 환경에서 유두종 조직의 성장을 관찰한 후， 회생하여 유두종 조직을 분리하여 실험군과 비교하였다.
- 그 결과， 도 5에서 나타난 바와 같이 리오바이러스를 투여한 경우， 대조군에 비교하였을 때 유두종의 성장에는 큰 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 5). <실시예 4> 리오바이러스의 신생혈관 형성 억제능 확인
리오바이러스의 신생혈관 형성 억제능을 확인하기 위하여， 유두종 조직의 뒷면을 관찰하여 신생혈관 형성을 확인하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 3>에서 희생하여 유두종 조직을 분리한 실험군 및 대조군 마우스의 유두종 조직의 후면을 관찰하여 암 조직과 연계된 신생혈관의 생성 정도를 촬영하여 사진으로 비교하였다.
그 결과， 도 6에서 나타난 바와 같이 리오바이러스를 투여한 경우, 대조군에 비해 혈관의 형성이 유의적으로 감소 또는 둔화되는 것을 확인하였으며 (도 6)， 이를 통해 리오바이러스가 종양의 생장에는 영향이 없으나 신생혈관 형성은 현저하게 감소시켜， 악성 종양의 파괴보다는 신생혈관 억제에,대한 유의적인 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<제조예 1>산제의 제조
리오바이러스 (reovirus): 102 내지 1013 pfu o
ΤΓ당: g
상기워 성분을 흔합하고 기밀포에 층진하여 산제를 제조하였다.
<제조예 2>정제의 제조
리오바이러스 (reovirus): 102 내지 1013 pfu 옥수수전분: 100 mg
유당: 100 mg
스테아린산 마그네슘: 2 mg
상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제조예 3>캡술제의 제조
리오바이러스 (reovirus): 102 내지 1013 pfu 옥수수전분: 100 mg
유당: 100 mg
스테아린산 마그네슘: 2 mg
상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡술에 층전하여 캡슐제를 제조하였다.
〈제제예 4>주사제의 제조
리오바이러스 (reovirus): 102 내지 1013 pfu 바이러스운반용 세포 (성체줄기세포， 혈액세포등 Molecular Therapy. 2009 Vol 17:1667-1676) Na2HP0412H20: 26 nig 증류수: 2974 nig 상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 제조방법에 따라서 주사제를 제조하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
리오바이러스과 (reoviridae)에 속하는 리오바이러스 (reovirus)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 꺅학적 조성물.
[청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 리오바이러스는 야생형 (wild type) 바이러스인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 라오바이러스는 혈청 타입 (Serotype) 1， 2， 또는 3을 포함하는 타입 l(Lang), 타입 2(Jones) 또는 타입 3(Dearing 및 Abney) 야생형 리오바이러스 및 약독화 리오바이러스인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
[청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 질환은 암， 혈관종， 혈관섬유종， 관절염， 당뇨병성 망막증 (diabetic retionpathy) , 조숙아의 망막증， 신생혈관성 녹내장， 신생혈관에 의한 각막질환， 퇴화반 /황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성， 익상편， 망막변성， 후수정체 섬유증식증， 과립성 결막염， 건선， 모세관 확장증， 화농성 육아종， 건선， 지루성 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 암은 간암, 위암， 결장암， 유방암， 폐암, 비소세포성폐암， '골암， 췌장암, 피부암， 두부 또는 경부암， 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁경부암， 난소암, 대장암, 소장암， 직장암, 항문부근암, 나팔관암종ᅳ 자궁내막암종， 자궁경부암종， 질암종, 음문암종， 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암， 소장암， 임파선암, 방광암， 담낭암， 내분비선암， 갑상선암， 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종，요도암，음경암，전립선암， 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 방광암， 신장 또는 수뇨관 암， 신장세포 암종， 신장골반 암종, 중추신경계 (CNS; central nervous system)종양， 1차 CNS림프종，척수 종양， 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 7】
제 1항에 있어서， 상기 리오바이러스는 혈관신생 억제용 외래 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 신생혈관 억제용 외래 유전자는 리오바이러스 유전자 내 복제필요 유전자부위 (essential region) 또는 복제불필요 유전자부위 (non-essential region)에 삽입되어 혈관신생 억제 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 9]
제 7항에 있어서， 상기 혈관신생 억제용 외래 유전자는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 가용성 VEGF 수용체， 안지오스타틴， 엔도스타틴 및 아포리포 단백질 (a) 크링글 영역 (LK8)을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 10】
제 1항에 있어서, 상기 리오바이러스는 바이러스 운반용 세포 (Virus. carrier cells)에 탑재되어 생체내에서 치료효과가 상승되는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
【청구항 11】
리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련질환 예방 및 개선용 건강식품.
【청구항 12】
리오바이러스과에 속하는 리오바이러스를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법. 【청구항 13】
혈관신생 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 리오바이러스과에 속하는 리오바이러스의 용도.
【청구항 13】 ,
혈관신생 관'련질환 예방 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 리오바이러스의 용도.
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