WO2014177746A1

WO2014177746A1 - Pronóstico de respuesta al tratamiento con anti-tnfalfa en pacientes de artritis reumatoide

Info

Publication number: WO2014177746A1
Application number: PCT/ES2014/070377
Authority: WO
Inventors: Sara Marsal Barril; Antoni JULIA CANO; Jesus TORNERO MOLINA
Original assignee: Fundació Hospital Universitari Vall D'hebron - Institut De Recerca
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2014-11-06
Also published as: ES2524164B1; JP2016525876A; EP2993238A1; CA2911353A1; ES2524164A1; US20160160279A1; AU2014261316A1; EP2993238A4

Abstract

La presente invención se refiere al uso del SNP rs3794271, y/o un SNP que se encuentre en desequilibrio total de ligamiento con el mismo, como marcador en la predicción de la respuesta al tratamiento con anti-TNF en un paciente con AR. La invención también se refiere a métodos para predecir la respuesta al tratamiento con anti-TNF, así como para decidir o recomendar un tratamiento para un paciente con AR basados en la determinación del genotipo para el rs3794271 y/o un SNP que se encuentre en desequilibrio total de ligamiento con el mismo.

Description

Pronóstico de respuesta al tratamiento con anti-TN Faifa en pacientes de artritis reumatoide La presente invención está relacionada con el campo de la reumatología, más concretamente con la respuesta de los pacientes que sufren de artritis reumatoide al tratamiento con inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La artritis reumatoide (de ahora en adelante, AR) es una enfermedad sistémica autoinmune, caracterizada por provocar inflamación crónica principalmente de las articulaciones, y que produce destrucción progresiva con distintos grados de deformidad e incapacidad funcional. En ocasiones, su comportamiento es extraarticular pudiendo afectar a diversos órganos y sistemas, como los ojos, pulmones y pleura, corazón y pericardio, piel o vasos sanguíneos. Aunque el trastorno es de causa desconocida, la autoinmunidad juega un papel primordial en que sea una enfermedad crónica y en la forma en la que progresa la enfermedad. La AR puede llegar a ser una enfermedad muy dolorosa e incapacitante.

Aproximadamente el 1 % de la población mundial está afectada por la AR, siendo las mujeres tres veces más propensas a la enfermedad que los hombres. Aunque puede aparecer a cualquier edad, la aparición de la enfermedad suele ocurrir entre los 40 y 50 años de edad.

Los inhibidores de factor de necrosis tumoral alfa (de ahora en adelante anti- TNFalfa), tales como etanercept, adalimumab, infliximab, se están utilizando con buenos resultados en el tratamiento de pacientes con AR. Estos fármacos detienen la progresión del proceso inflamatorio que perpetua la enfermedad, lo cual reduce la actividad de la enfermedad permitiendo la ganancia sustancial de calidad de vida del paciente.

Sin embargo, entre el 20% y el 40% de los pacientes con AR no responden al tratamiento con anti-TNFalfa, o bien no mantienen su respuesta positiva inicial. Estos pacientes que no responden al tratamiento con anti-TNFalfa podrían beneficiarse del tratamiento con otros fármacos como el tocilizumab, abatacept, o rituximab, cuyo mecanismo de acción difiere de los anti-TNFalfa. Es conocido que un tratamiento temprano y agresivo resulta crucial para la evolución positiva de los pacientes con AR, y es por ello que sería de gran ayuda poder predecir de antemano aquellos pacientes que no responden al tratamiento. El pronóstico temprano de respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa permitiría descartar dichos fármacos y aplicar una terapia alternativa, con el consiguiente beneficio para el paciente en términos de efectividad del tratamiento y evitando, a su vez, los efectos secundarios asociados a los anti-TNFalfas. Desde el punto de vista económico, y dado que los tratamientos para la AR son muy costosos, la optimización de la terapia de la AR conllevaría también un ahorro significativo del gasto sanitario.

Algunos estudios previos han identificado algunos marcadores de la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa. Por ejemplo, se han estudiado los

polimorfismos de la región promotora del gen que codifica para la propia citoquina TNFalfa, así como polimorfismos de los genes HLA-DR (complejo de compatibilidad mayor, clase II, DR), FCGR3 (receptor Fe gamma III) y IL1RN (antagonista de receptor de interleuquina 1 ). Pero los resultados obtenidos en cuanto a la capacidad de predicción de dichos polimorfismos son

contradictorios. Recientemente algunos estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han identificado asociaciones de ciertos polimorfismos genéticos con la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa (Liu C, et al,

"Genome-wide association sean identifies candidate polymorphisms associated with differential response to anti-TNF treatment in rheumatoid arthritis", Mol Med, 2008, vol. 14, pp. 575-81 ; Plant D et al, "Genome-wide association study of genetic predictors of anti-tumor necrosis factor treatment efficacy in rheumatoid arthritis identifies associations with polymorphisms at seven loci", Arthritis Rheum, 201 1 , vol. 63, pp. 645-53; Krintel SB, et al, "Investigaron of single nucleotide polymorphisms and biological pathways associated with response to TNFalpha inhibitors in patients with rheumatoid arthritis",

Pharmacogenet Genomics, vol. 22, pp. 577-89). Sin embargo, ninguno de los polimorfismos encontrados ha demostrado una capacidad predictiva lo suficientemente fiable. En definitiva, hasta el momento no se conocen marcadores que posean la fiabilidad y robustez suficientes para que resulten de utilidad en la práctica clínica. Por lo tanto, es deseable proporcionar marcadores de predicción de la respuesta al tratamiento con anti-TN Faifa que puedan ser usados en la práctica clínica y permitan identificar con elevada fiabilidad aquellos pacientes con respuesta negativa a los fármacos anti-TN Faifa.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado que el polimorfismo de nucleótido simple (de ahora en adelante, SNP) rs3794271 posee una muy elevada capacidad de predicción de respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa en pacientes con AR. Sorprendentemente, las investigaciones llevadas a cabo por los inventores demuestran que la asociación de dicho SNP con una respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa es significativa a nivel de genoma completo. Todos estos experimentos quedan plasmados en la sección experimental de la presente memoria. En base a estos resultados, se puede concluir que el SNP rs3794271 constituye un marcador muy potente para predecir la respuesta al tratamiento de la AR con estos fármacos. Así, un aspecto de la invención se refiere al uso del SNP rs3794271 como marcador en la predicción de la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa en un paciente con AR.

Los ejemplos más abajo demuestran que el SNP rs3794271 predice la respuesta al tratamiento de forma más precisa cuando el anti-TNFalfa es infliximab y etanercept. Por lo tanto, en una realización particular, la invención se refiere al uso del SNP rs3794271 como marcador en la predicción de la respuesta al tratamiento con infliximab y etanercept en un paciente con AR A diferencia de otros marcadores descritos en el estado de la técnica, el rs3794271 ha demostrado proporcionar una capacidad predictiva lo

suficientemente elevada como para poder ser utilizado como una herramienta de toma de decisiones en la práctica clínica, proporcionando una información muy valiosa a la hora de optimizar el tratamiento farmacológico para el paciente con AR. El término "polimorfismo de nucleótido simple", también denominado

"polimorfismo de un solo nucleótido" (o "SNP" por sus siglas en inglés), se entiende como una variación en la secuencia de ADN que afecta a una sola base (adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G)) de una secuencia del genoma. En ocasiones, sin embargo, en el estado de la técnica se considera que cambios de unos pocos nucleótidos, así como pequeñas inserciones y deleciones (indels), también pueden ser consideradas como SNP. Si la SNP se da con una frecuencia superior al 1 % en la población general se considera una vahante común mientras que si la frecuencia es inferior al 1 % se considera una vahante rara. En la presente invención, los términos "SNP" y "polimorfismo de nucleótido simple" se utilizan indistintamente e incluyen tanto los polimorfismos de un solo nucleótido como los que implican cambios en unos pocos

nucleótidos, pequeñas deleciones o inserciones.

El SNP rs3794271 se encuentra situado en el cuarto intrón del gen SLC01C1 en el cromosoma humano 12p12.2 (Secuencia de referencia NCBI del cromosoma: NC_000012.1 1 , fecha de publicación 31 de agosto de 2012) y define una variabilidad genética en la posición 20860093 de dicho cromosoma (según el ensamblado del genoma humano GRCh37/hg19, febrero 2009).

Dado que los seres humanos son diploides (es decir, que poseen dos juegos de cromosomas autosómicos en cada célula), un determinado polimorfismo está presente en los dos cromosomas, materno y paterno. Cada SNP tiene dos secuencias de una base alternativas llamadas "alelos". En relación con el SNP rs3794271 esto quiere decir que un individuo puede presentar la forma polimórfica G en los dos cromosomas, es decir, puede presentar dos alelos G para este SNP (individuo homocigoto G para ese SNP, o GG). Alternativamente el individuo podría presentar la forma alternativa A en los dos cromosomas en la posición del SNP, es decir, dos alelos A para el SNP (individuo homocigoto A, o AA), o bien puede tener un alelo de cada tipo (individuo heterocigoto, GA o AG).

Los inventores han encontrado que, en pacientes con AR, la presencia de G en la posición del SNP rs3794271 es indicativo de una mala respuesta al tratamiento con infliximab o etanercept. Según los resultados obtenidos por los inventores, los individuos heterocigotos G para este SNP tienen una alta predisposición a no responder al tratamiento con infliximab o etanercept. En el caso de los individuos homocigotos G para este SNP, esa predisposición a una mala respuesta es aún mayor. El genotipado del SNP rs3794271 permite, por lo tanto, predecir la respuesta de un paciente de AR al tratamiento con estos fármacos con una elevada precisión.

Así, otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente de AR al tratamiento con anti-TN Faifa que

comprende determinar, a partir de una muestra aislada del paciente, el genotipo para el SNP rs3794271 , donde la presencia de al menos un alelo G (en la posición del SNP rs3794271 ) es indicativo de mala respuesta al tratamiento. Este mismo aspecto se podría formular como un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente de AR al tratamiento con anti- TNFalfa que comprende determinar, a partir de una muestra aislada del paciente, el genotipo para el SNP rs3794271 , donde la presencia de dos alelos distintos de G en la posición del SNP rs3794271 es indicativo de buena respuesta al tratamiento. Dicho de otra manera, la presencia de la forma alternativa A en los dos alelos, es decir, la presencia de dos alelos A en la posición del SNP rs3794271 , indica predisposición a una buena respuesta al tratamiento.

En una realización particular, el método in vitro de la invención es para determinar la respuesta al tratamiento de un anti-TNFalfa seleccionado de entre infliximab o etanercept.

Otra realización particular contempla que la predisposición a una mala respuesta a infliximab o etanercept se asocia a la presencia de dos alelos G (en la posición del SNP rs3794271 ), es decir, la predisposición a una mala respuesta se asocia a los individuos homocigotos GG en la posición del SNP.

Por "mala respuesta" se entiende que el paciente no responde al tratamiento. Por "buena respuesta" se entiende que el paciente sí responde al tratamiento. La respuesta al tratamiento se puede determinar por medios conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, por medio de la respuesta EULAR (Fransen J et al, "The Disease Activity Score and the EULAR response criteria", Clin Exp Rheumatol, 2005, vol. 23 (Supl. 39)). La respuesta EULAR clasifica a los pacientes sometidos a terapia para el tratamiento de AR en buenos,

moderados o no respondedores. En los estudios clínicos, los pacientes con una buena o moderada respuesta han demostrado una mejoría significativa en la capacidad funcional y menor progresión del daño articular, mientras que en los pacientes no respondedores la actividad de la enfermedad no se reduce significativamente.

Los criterios de respuesta del EULAR aplican el DAS28 para sus

consideraciones. El índice DAS28 consiste en el recuento de 28 de las articulaciones dolorosas e inflamadas del paciente, la velocidad de

eritrosedimentación (VES) y, opcionalmente, la valoración global del paciente mediante una escala visual de 0 a 100. En una escala continua que va de 0 a 9,4, el nivel de actividad de la enfermedad según el DAS28 se interpreta como Bajo (DAS28 < 3,2), Moderado (3,2 < DAS28 < 5, 1 ), o Alto (DAS28 > 5,1 ). La respuesta del EULAR clasifica a los pacientes utilizando la magnitud de cambio en el DAS28 entre un punto basal y un punto final, y el nivel de actividad según el DAS28 alcanzado en el punto final. La reducción de 1 .2 (dos veces el error de medición) del DAS28 en un paciente individual se considera como un cambio significativo. Así, un paciente que tiene un cambio significativo

(reducción DAS28 > 1 ,2) y también alcanza un nivel de actividad Bajo (DAS28 punto final < 3,2), se clasifica como buen respondedor. Por el contrario, un paciente que no reduce el DAS28 en más de 0,6, sin importar cuál es el valor DAS28 final, siempre se considera un paciente no respondedor a la terapia. A su vez, los pacientes que reducen el DAS28 entre 0,6 y 1 ,2 pero su valor DAS28 final es mayor que 5,1 , también se consideran pacientes no

respondedores. El resto de pacientes, es decir, aquellos que no entran dentro de la clasificación de buenos respondedores ó no respondedores, tienen una respuesta intermedia y se categorizan como respondedores moderados. Así pues, con respecto al criterio EULAR, la predisposición una mala respuesta indica que el paciente es un no respondedor EULAR mientras que la

predisposición a una buena respuesta indica que el paciente es un

respondedor bueno o moderado EULAR. En una realización particular de la presente invención, la predisposición a una buena respuesta indica que el paciente es un respondedor bueno EULAR. El método de la presente invención proporciona una herramienta muy valiosa para el especialista médico a la hora de prescribir el tratamiento farmacológico más adecuado para el paciente con AR. El especialista podrá descartar el tratamiento con infliximab y etanercept en un paciente concreto clasificado como predispuesto a una mala respuesta en función del método de la invención y recomendar un tratamiento alternativo que tendrá mayores posibilidades de ser efectivo en ese paciente concreto. El paciente evitará así verse sometido a un tratamiento poco efectivo, con el consiguiente ahorro de un tiempo muy valioso para su recuperación y evitando los posibles efectos secundarios derivados del infliximab o el etanercept. Por otro lado, los pacientes que tengan predisposición a una buena respuesta según el método de la invención (es decir, aquellos que presenten dos alelos diferentes de G para el SNP

rs3794271 ), se beneficiarán de un tratamiento con infliximab o etanercept. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a un método para decidir o recomendar un tratamiento para un paciente con AR que comprende

determinar el genotipo para el SNP rs3794271 , donde si el paciente presenta al menos un alelo G en la posición del SNP rs3794271 , es decir, si el paciente presenta predisposición a una mala respuesta al tratamiento, se recomienda una terapia que excluya anti-TNFalfa. En una realización particular, los anti- TNFalfa a excluir a la hora de prescribir la terapia son infliximab y etanercept. En una realización particular, la terapia que excluya infliximab y etanercept se recomienda si el paciente presenta la forma polimórfica G en los dos alelos, es decir, si el paciente es homocigoto GG para el rs3794271 . En otra realización, si el paciente presenta dos alelos diferentes de G (generalmente dos alelos A) en la posición del rs3794271 , es decir, si el paciente tiene predisposición a una buena respuesta al tratamiento, se recomienda una terapia que incluya infliximab o etanercept. En una realización particular, el método para decidir o recomendar un tratamiento para un paciente con AR según la invención comprende, además, determinar variables clínicas del paciente y/o determinar otros marcadores biológicos. Está ampliamente aceptado que las variaciones genéticas nunca están aisladas en el genoma. Puesto que las SNPs forman parte de una cadena continua de DNA (i.e. cromosoma), van a existir otras variaciones cercanas en el cromosoma que se co-hereden con una frecuencia muy similar y, por tanto, contengan un nivel de información muy similar al del polimorfismo de interés. Estas variaciones cercanas altamente correlacionadas se conocen como bloques de desequilibrio de ligamiento. Estos bloques, que caracterizan todo el genoma humano y han sido caracterizados por el proyecto internacional HapMap, son regiones claramente delimitadas y diferenciadas del genoma y que presentan una baja probabilidad de recombinación. El SNP rs3794271 se encuentra en un bloque de desequilibrio de ligamiento, definido por la SEC ID NO: 1 , que se extiende desde el exón número 13 de la secuencia transcrita del gen PDE3A (Secuencia de referencia NCBI: NM_001244683, secuencia de Referencia NC_000012.1 1 , ensamblado primario GRCh37.p10, 30 Octubre 2012) hasta el sexto exón de la secuencia transcrita del gen SLC01C1

(Secuencia de referencia NCBI: NM_001 145945, Secuencia de Referencia NC_000012.1 1 , ensamblado primario GRCh37.p10, 30 Octubre 2012), incluyendo la región intergénica entre ambos genes. Dentro de esta región es posible encontrar SNPs que se encuentran en muy alto desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 , es decir, SNPs cuyos alelos tienen una

correlación muy significativa con los alelos de rs3794271 . El desequilibrio de ligamiento es una medida de la correlación de las frecuencias alélicas entre dos loci genéticos polimórficos ubicados en un mismo cromosoma. En la mayoría de las ocasiones el desequilibrio de ligamiento se extiende en distancias muy cortas, del orden de kilobases. La región definida por la SEC ID NO: 1 constituye un locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento con anti- TNFalfa (preferentemente infliximab o etanercept), ya que el experto en la materia entenderá que los SNPs que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 en esta región ofrecen la misma capacidad de predicción de respuesta al tratamiento que el rs3794271 . Por consiguiente, la presente invención también contempla el uso de un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 como marcador en la predicción de la respuesta al tratamiento con un anti-TNFalfa en un paciente con AR. En una realización particular el anti-TNFalfa es infliximab o etanercept. Asimismo, la invención contempla un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente de AR al tratamiento con un anti-TNFalfa que comprende determinar, a partir de una muestra aislada del paciente, el genotipo para un SNP que se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 , donde la presencia de al menos un alelo correlacionado con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de mala respuesta al tratamiento. Este mismo aspecto se podría formular como un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente de AR al tratamiento con anti-TNFalfa que comprende determinar, a partir de una muestra aislada del paciente, el genotipo para un SNP que se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 , donde la presencia de dos alelos no

correlacionados con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento. En una realización particular el anti-TNFalfa se selecciona de entre infliximab o etanercept.

Por "alelo correlacionado" se entiende el alelo (forma polimórfica) que se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el alelo G (la forma polimórfica G) en el rs3794271 (r² >50%). Esto quiere decir que el alelo G en el SNP rs3794271 y el alelo correlacionado con éste se heredan juntos con una probabilidad muy alta.

Preferentemente, el SNP en desequilibrio de ligamiento según la invención se encuentra en el locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento con infliximab o etanercept definido por la SEC ID NO: 1 .

En una realización particular de la invención el SNP en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 se selecciona del grupo que consiste en los SNPs definidos en la Tabla 3. En otra realización particular, el SNP en desequilibrio de ligamiento es un SNP que se encuentra en alto desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 . Se entiende por SNP en "alto desequilibrio de ligamiento" a aquellos SNPs cuyo coeficiente de desequilibrio de ligamiento en relación al rs3794271 es superior a 0,8 (ver Tabla 3).

La invención también contempla la combinación de SNPs que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 como marcadores en la predicción de la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa, preferentemente infliximab o etanercept, en un paciente con AR, así como un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente de AR al tratamiento según la invención que comprende determinar el genotipo de una combinación de SNPs que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 . En ciertas realizaciones, se combina el rs3794271 con al menos un SNP en desequilibrio de ligamiento con el mismo, preferentemente uno de los que se encuentra en el locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento con infliximab o etanercept definido por la SEC ID NO: 1 y que están reflejados en la Tabla 3. En otras realizaciones, los SNPs a combinar se seleccionan del grupo que consiste en rs10770707, rs1473993, rs10770704, rs10770702, rs959346, rs3751218, rs1 1045392, rs1 1045390, rs74406912, rs954866 y rs10770701 . En realizaciones particulares la combinación comprende el rs3794271 y el rs1 1045392.

La muestra necesaria para llevar a cabo el método de la invención puede ser cualquier tejido o fluido aislado del cuerpo del paciente, por ejemplo, sangre, suero, plasma, saliva, orina o pelo. En una realización particular de la invención la muestra es de sangre o saliva. En otra realización particular, la muestra aislada del paciente es una muestra de ADN. Sin embargo, el método de la presente invención no comprende el paso de extraer o proporcionar dicha muestra del paciente. En una realización particular, el paciente es de una población seleccionada del grupo que consiste en población caucásica, población asiática y población centroamericana.

El estado de la técnica proporciona diversos métodos para determinar el genotipo en una región determinada. Por ejemplo, en una realización particular, la determinación del genotipo comprende la amplificación de la región de la cadena de ácidos nucleicos en la que se encuentra el SNP, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El estado de la técnica comprende métodos para diseñar cebadores para llevar a cabo la amplificación de cualquier región deseada dentro de una cadena de ácidos nucleicos conocida. El diseño de cebadores puede hacerse de forma automática utilizando programas bioinformáticos que están a disposición del experto en la materia. En una realización particular, la determinación del genotipo comprende la secuenciación de toda o parte de la cadena de ácidos nucleicos de la muestra aislada. En otra realización, la determinación del genotipo comprende la hibridación de la cadena de ácidos nucleicos de la muestra con sondas específicas. Preferentemente la hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta especificidad.

En otra realización, la determinación del genotipo se lleva a cabo mediante una o varias técnicas de análisis de ADN seleccionadas del grupo que consiste en polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLPD), todas ellas técnicas de genotipado que son bien conocidas para el experto en la materia.

La determinación del genotipo puede requerir de varias de las técnicas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, la determinación del genotipo puede llevarse a cabo mediante amplificación e hibridación, o bien mediante amplificación y secuenciación, o bien mediante amplificación y RAPD. El experto en la materia determinará en cada caso cuál es la técnica más apropiada para determinar el genotipo. En otro aspecto la presente invención se refiere al uso de medios para determinar el genotipo para el SNP rs3794271 , y/o al menos un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo en un método in vitro según se ha descrito más arriba, para predecir la la respuesta de un paciente con AR al tratamiento con un anti-TNFalfa, preferentemente un anti-TNFalfa seleccionado de entre infliximab o etanercept. En una realización particular los medios son sondas de hibridación específicas para el SNP rs3794271 o para un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo. En otra realización particular los medios son cebadores específicos para amplificar la SEC ID NO: 1 o alguna región comprendida dentro de la SEC ID NO: 1 . En otra realización particular los medios son cebadores específicos para llevar a cabo la determinación del genotipo mediante RAPD.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un kit para predecir la respuesta al tratamiento con un anti-TNFalfa en un paciente con AR que comprende medios para determinar el genotipo para el SNP rs3794271 , y/o al menos un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo, e instrucciones para llevar a cabo dicha determinación y para la interpretación de los resultados, donde dichas instrucciones para la interpretación de resultados indican que la presencia al menos un alelo G para el SNP

rs3794271 y/o la presencia de al menos un alelo correlacionado con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de mala respuesta al tratamiento. Alternativamente o junto con lo anterior, las

instrucciones para la interpretación de resultados podrán indicar que la presencia de dos alelos distintos de G para el SNP rs3794271 y/o la presencia de dos alelos no correlacionados con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento. En una realización particular de este aspecto de la invención, el kit es para predecir la respuesta a un anti-TNFalfa seleccionado de entre infliximab o etanercept. En una realización particular, el kit comprende medios para determinar el genotipo para el SNP rs3794271 e instrucciones para llevar a cabo dicha determinación y para la interpretación de los resultados, donde dichas instrucciones para la interpretación de resultados indican que la presencia dos alelos G para el SNP rs3794271 es indicativo de mala respuesta al tratamiento.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso

"consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles

combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.

EJEMPLOS

Pacientes Un total de 315 pacientes de AR fueron incluidos en el presente estudio. Todos los pacientes fueron recogidos como parte del consorcio Immune-Mediated Inflammatory Disease Consortium (IMIDC). Los pacientes de AR fueron recogidos a partir de las consultas externas de los departamentos de reumatología de 12 Hospitales Universitarios españoles. Los criterios de selección fueron los siguientes: a) cumplir con los criterios de clasificación de la AR de 1987 del American College of Rheumatology b) edad superior a 18 años c) caucásicos europeos y nacidos en España d) que hubieran recibido una terapia anti-TNFalfa (infliximab, etanercept ó adalimumab) como su primer tratamiento biológico g) un valor DAS28 basal > 3,2. El consentimiento informado fue obtenido de todos los participantes y los protocolos fueron revisados y aprobados por los comités éticos institucionales locales. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la

Declaración de Helsinki. Definición de la Respuesta a Tratamiento

La respuesta a tratamiento anti-TNFalfa se midió mediante los cambios absoluto y relativo del DAS28, así como la respuesta EULAR. El DAS28 final fue medido a las 12 semanas de tratamiento. El cambio absoluto del DAS28 (ADAS28) se define como el cambio en DAS28 entre el tiempo basal y el tiempo final (DAS28basal - DAS28semana12); El EULAR divide la respuesta a anti-TNFalfa entre tres categorías: bueno, moderado y no respondedor.

Extracción de DNA, selección de SNPs y genotipado

El DNA genómico fue aislado de sangre venosa mediante el Chemagic

Magnetic Separation Module I (PerkinElmer). Un total de 4 SNPs fueron evaluados: i) rs10520789 a ~727 kb del extremo 5' del gen nuclear receptor subfamilia 2, grupo F, miebro 2 (NR2F2) (cromosoma 15q26.2), ¡i) rs1 1870477 a ~264 kb del extremo 3' del gen "mitogen-activated protein kinase kinase" 6 (MAP2K6) (cromosoma 17q24.3), iii) rs1539909 a -955 kb del extremo 3' del gen "cerebellin 2 precursor" (CBLN2) (cromosoma 18q22.3), iv) rs3794271 en el cuarto intrón del gen "solute carrier organic anión transporter family, member 1 C1 " (SLC01C1) (cromosoma 12p12.2).

El genotipado de las SNPs fue realizado mediante la plataforma de genotipado Taqman (Life Technologies). Los ensayos Taqman seleccionados fueron:

C_30397748_20 (rs10520789, NR2F2), C_32133788_10 (rs1 1870477,

MAP2K6), C 7536165_10 (rs1539909, CBLN2) y C_27502188_10

(rs3794271 , SLC01C1). Las condiciones de termociclado fueron: 50°C durante 2 min y 95°C durante 10 minutes, seguido por 40 ciclos de 92°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 min. Todas la lecturas de PCR y de punto final fueron realizadas mediante un ABI PRISM7900 HT sequence detection system (Life Technologies). El error de genotipado fue estimado mediante el genotipado por duplicado de un 10% de las muestras.

Análisis estadístico

Se utilizó la regresión lineal multivariante para testar la asociación del ADAS28 utilizando el DAS28 basal como covariable. El test alélico Chi-cuadrado se usó para testar la asociación con las respuestas EULAR. Se llevó a cabo la corrección del nivel de significación mediante el método de Bonferroni (alfa = 0,0124). Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el software R (http://cran.r-project.org/). Los cálculos de poder se realizaron mediante el software Quanto (v 1 .2.4, http://hydra.usc.edu/gxe/) y el método online Genetic Power Calculator (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/gpc/). Todas las SNP fueron analizadas para desviaciones del Equilibrio Hardy-Weinberg.

Para investigar el efecto de variables de confusión de la asociación genética observada con la respuesta EULAR, se utilizó un modelo de regresión lineal. Las variables evaluadas fueron edad al diagnóstico, edad de tratamiento con anti-TNFalfa, duración de la enfermedad, DAS28 basal, hábito tabáquico, género, número de erosiones, presencia de factor reumatoide (RF) y presencia de anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (anti-CCP). La presencia de un efecto específico de fármaco fue evaluado también mediante el ajuste de un modelo de regresión logístico incluyendo un término de interacción entre el genotipado de la SNP y el tipo de terapia anti-TNFalfa tal como está descrito en Plant et al (supra).

RESULTADOS

Usando una cohorte de 315 pacientes de AR, testamos 4 loci para respuesta anti-TNFalfa. La tasa de genotipado fue de >99% y el error de genotipado de 0%. Todas las 4 SNPs estaban en Equlibrio Hary-Weinberg (P>0,5). Las características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1 .

Tabla 1 . Características clínicas de los pacientes

Edad en diagnostico (años, media ±SD) 43 ± 12

No. Mujeres (%) 257(81 )

Duración de la enfermedad (meses, media ±SD) 1 1 ± 8

No. Anti-CCP positivos (%) 239(79)

DAS28 basal (media ±SD) 5,5 ± 1 , 1

No. RF positivo (%) 246(78)

No. Tratados con infliximab (%) 1 15(36)

No. Tratados con etanercept (%) 1 13(36)

No. Tratados con adalimumab (%) 87(28)

Tabaquismo (%)^a 78(25)

No. EULAR No respondedores¹⁵ (%) 77(24)

No. EULAR buenos respondedores" (%) 105(33)

No. EULAR respondedores moderados¹⁵ (%) 133(42) aFumadores actuales.

"Determinado en la semana 12 del tratamiento

En el análisis de respuestas EULAR buenos vs no respondedores se encontró una significación estadística muy alta entre la SNP rs3794271 con la respuesta a tratamiento (P = 1 .74E-5, OR (95% Cl) = 2,63 (1 ,68-4, 12). A su vez, añadiendo el grupo de respondedores anti-TNFalfa EULAR moderados al grupo de pacientes buenos respondedores, la asociación se mantuvo muy significativa (P = 2,69E-4, Odds Ratio (OR, 95%CI) = 1 ,98 (1 ,37-2,89)).

Ninguno de los otros marcadores testados mostró una asociación significativa incluso a niveles nominales (P < 0,05). Las frecuencias genotípicas de rs3794271 para las tres categorías EULAR y los valores ADAS28 promedios se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Frecuencias genotípicas de rs3794271 para las tres categorías EULAR y los valores ADAS28 promedios

Los resultados demuestran que la el SNP rs3794271 está asociado a la predicción de la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa. La capacidad del SNP es muy elevada para predecir aquellos pacientes que son malos respondedores según el criterio EULAR (a diferencia de los buenos

respondedores), y también para predecir aquellos pacientes que son malos respondedores según el criterio EULAR (diferenciándolos de los buenos y moderados).

En un análisis secundario, se evaluó la presente asociación genética después de controlar para diferentes variables de confusión. Para cualquier variable analizada como variable de confusión, el cambio en el coeficiente de regresión y la significación estadística fue despreciable. Este resultado confirma que la relación entre el SNP y la respuesta a anti-TNF es estable e independiente de cualquier variable clínica. También se testó para la presencia de interacción con cada una de las covariables clínicas mediante la inclusión de un término de interacción adicional al modelo de regresión lineal, pero ninguna resultó significativa. Este resultado confirma que la asociación de la SNP no

interacciona con ninguna otra variable clínica. Sin embargo, el análisis de efectos tratamiento-específicos permitió hallar una interacción significativa entre la presencia de adalimumab y la respuesta a anti-TNFalfa (P = 0,045). Mediante el test de Breslow-Day se testaron las diferencias de asociación entre los pacientes tratados con adalimumab contra los otros 2 tratamientos

(infliximab y etanercept) y se encontró una evidencia sugestiva de heterogeneidad (P = 0,078). Analizando cada tratamiento por separado, no se halló asociación de la SNP rs3794271 con la respuesta a tratamiento en pacientes tratados con adalimumab (P = 0,37), mientras que se obtuvo una sustancial evidencia de asociación para infliximab (P = 0,0046) y etanercept (P = 0.00028). Estos resultados indican que la capacidad del SNP rs3794271 para predecir la respuesta al tratamiento con anti-TN Faifa es más precisa cuando se refiere a los fármacos anti-TNFalfa infliximab y etanercept.

Adicionalmente, se llevó a cabo un metaanálisis para combinar la evidencia de asociación para el SNP rs3794271 con la respuesta a anti-TNFalfa en el presente estudio con la del estudio GWAS previo elaborado por Krintel et al (supra). El método de efectos-fijos implementado en el paquete de software "rmeta" fue utilizado para estimar el Odds Ratio (OR) promedio. Se utilizó la herramienta de software (METAL)

(http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/metal/index.html) para calcular el P- value combinado. En esta aproximación, los valores de significación se ponderan de acuerdo con el tamaño muestral de cada uno de los estudios. Los ORs se calcularon en base al alelo menor y al riesgo de ser un "No

respondendor" EULAR. La variación en el riesgo explicada por la SNP rs3794271 fue estimada en la muestra de replicación utilizando la aproximación propuesta por So HC et al, ("Evaluating the heritability explained by known susceptibility variants: a survey of ten complex diseases", Genet Epidemiol, 201 1 , vol. 35, pp. 310-7). Combinando la evidencia estadística del GWAS y el presente estudio de asociación, se encontró una asociación significativa a escala genómica para la SNP rs3794271 con la respuesta a anti-TNFalfa (P = 3,34E-10). El efecto sumario de combinar ambos estudios fue OR(95% Cl) = 2,91 (2,57-3,25).

Se evaluó la dosis alélica comparando el tamaño del efecto con 1 ó 2 copias del alelo menor (G). El tamaño del efecto para el genotipo heterocigoto fue significativo OR (95% Cl) = 3,0 (1 ,6-5,9). El tamaño del efecto para el genotipo homocigoto fue aún mayor OR (95% Cl) = 8,1 (3,3-19,7). Estos resultados indican que la asociación entre una mala respuesta al tratamiento con anti- TNFalfa para individuos heterocigotos con G en la posición del SNP rs3794271 es muy elevada, y que dicha asociación es aún mayor para los pacientes homocigotos GG. También se llevó a cabo un estudio de la región del genoma en la que se encuentra ubicado el rs3794271 . Este estudio reveló la existencia de dos picos de muy alta recombinación (regiones "hotspot") en el exón número 13 de la secuencia transcrita del gen PDE3A y en el sexto exón de la secuencia transcrita del gen SLC01C1 que delimitan un bloque de desequilibrio de ligamiento claramente diferenciado del resto del genoma. Este bloque, definido por la SEC ID NO: 1 , concentra SNPs que se encuentran en alto desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 . Estos resultados indican que el bloque de desequilibrio de ligamiento definido por la SEC ID NO: 1 constituye un locus de predisposición a la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa. La secuencia correspondiente al fragmento del gen PDE3A que se encuentra incluida en este locus de predisposición va desde la posición 1 hasta la posición 33662 de la SEC ID NO: 1. La secuencia correspondiente al fragmento del gen SLC01C1 que se encuentra incluida en este locus de predisposición va desde la posición 44910 de la secuencia número 1 hasta la posición 61065. La SEC ID NO: 1 contiene también la secuencia intergénica entre PDE3A y SLC01C1 (desde la posición 33663 hasta la posición 44909). El SNP rs3794271 ocupa la posición 56714 En la SEC ID NO: 1 .

La Tabla 3 incluye los SNPs del locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento (SEC ID NO: 1 ) que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 , así como el alelo menos frecuente (A1 ), el alelo más frecuente (A2) y el alelo correlacionado con la variante G (alelo de riesgo) para cada uno de ellos. El alelo de riesgo es la forma polimórfica en la posición de cada uno de los SNPs que se encuentra en desequilibrio de ligamiento con la forma G del SNP rs3794271 . Los alelos de riesgo, por lo tanto, proporcionan la misma información de cara a la predisposición a la respuesta al tratamiento.

Tabla 3. SNPs en desequilibrio de ligamiento con el rs3794271 en el locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento con infliximab o etanercept.

Posición

Posición en

en la Alelo de

Referencia cromosoma LD A1² A2² SEC ID riesgo²'³

12

NO: 1

2186 rs10841585 20805565 0,53 G A G

4269 rs10841586 20807648 0,57 A G A

7739 rs4451779 2081 1 1 18 0,60 T G T

13643 rs10743388 20817022 0,66 c G c

14099 rs10770689 20817478 0,60 T C T

15772 rs6487129 20819151 0,58 G A G

17061 rs10770691 20820440 0,58 C G C

17492 rs1 1045376 20820871 0,56 C T C

18105 rs1 1045378 20821484 0,57 T A T

24396 rs10770695 20827775 0,63 T C T

25316 rs12301364 20828695 0,61 A G A

26141 rs10841593 20829520 0,61 G A G

27013 rs151 131008 20830392 0,61 TTTTTC T TTTTTC

28335 rs1 1045385 20831714 0,62 T c T

29216 rs10770701 20832595 0,81 A G A

30640 rs954866 20834019 0,85 A G A

34206 rs3809209 20837585 0,74 C T C

34785 rs7305718 20838164 0,77 C T C

37058 rs74406912 20840437 0,85 GT G GT

37436 rs1 1045390 20840815 0,85 T C T

37460 rs1 1045392 20840839 0,84 T C T

37742 rs2203493 20841 121 0,75 A T A

38709 rs137927950 20842088 0,66 T TTC T

40201 rs2417861 20843580 0,77 c T C

45688 rs3751218 20849067 0,95 G A G

48707 rs959346 20852086 0,83 G A G

48942 rs10770702 20852321 0,83 T G T

50162 rs10743389 20853541 0,51 T C T

52382 rs10770704 20855761 0,83 T C T

52973 rs71939085 20856352 0,59 TTGA T TTGA

53200 rs10743390 20856579 0,58 T c T

53894 rs1 1392906 20857273 0,69 T TC T

53895 rs201855778 20857274 0,69 G GC G

54088 rs10770705 20857467 0,53 A C A

54097 rs10770706 20857476 0,69 G A G

54283 rs78690605 20857662 0,69 C CAGAT C Posición

Posición en

en la Alelo de

Referencia cromosoma LD A1² A2²

SEC ID riesgo²'³

12

NO: 1

54906 rs 10505868 20858285 0,69 C T C

56271 rs1473993 20859650 0,87 c T C

56605 rs3838816 20859984 0,54 AT A AT

56714 rs3794271 20860093 1 ,00 G A G

58072 rs10770707 20861451 0,99 A T A

LD = coeficiente de desequilibrio de ligamiento

² Más de 1 nucleótido implica que el SNP consiste en una inserción/deleción

³ Calculado para población caucásica

En definitiva, se encontraron evidencias contundentes de la asociación entre el locus definido por los genes PDE3A, SLC01C1, y su región intergénica, particularmente la región definida por la SEC ID NO: 1 con la respuesta al tratamiento con anti-TNFalfa en pacientes con AR. Según los resultados obtenidos, esta asociación es particularmente significativa para los fármacos infliximab y etanercept y para los pacientes homocigotos GG en la posición del SNP rs3794271 . El gen SLC01C1 es una proteína de membrana que pertenece a la familia de polipéptidos transportadores de anión orgánico OATP1. Este grupo de proteínas tiene una amplia especificidad de sustrato y ha demostrado jugar un papel importante en la absorción, distribución y excreción de fármacos, incluyendo metotrexato. Hasta el momento, la proteína codificada por

SLC01C1 se ha asociado principalmente al transporte de estradiol y hormona tiroidea. Sin embargo, el hecho de que este gen codifique para cuatro variantes transcritas diferentes incrementa la probabilidad de que posea más

funcionalidades. El gen PDE3A codifica para una fosfodiesterasa (PDE) que hidroliza

mensajeros secundarios importantes como adenosín monofosfato cíclico (cAMP) y guanosín monofosfato cíclico (cGMP). Las PDE de nucleótidos cíclicos han demostrado tener funciones inmunomoduladoras importantes y se han considerado por sí solas como dianas importantes en el manejo de enfermedades autoinmunes como la AR. Por ejemplo, La inhibición de PDE ha demostrado reducir la producción de TNF en monocitos estimulados por lipopolisacárido.

Claims

REIVINDICACIONES

Método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con artritis reumatoide (AR) al tratamiento con un inhibidor de factor de necrosis tumoral alfa (anti-TNFalfa) seleccionado de entre infliximab o etanercept que comprende determinar, a partir de una muestra aislada del paciente, el genotipo para el polimorfismo de nucleótido simple (SNP) rs3794271 , y/o al menos un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo, donde

i. La presencia de al menos un alelo G para el SNP rs3794271 es

indicativo de mala respuesta al tratamiento mientras que la presencia de dos alelos distintos de G para el SNP rs3794271 es indicativo de buena respuesta al tratamiento, y/o

¡i. La presencia de al menos un alelo correlacionado con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de mala respuesta al tratamiento mientras que la presencia de dos alelos no correlacionados con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento.

Método según la reivindicación 1 , donde la presencia de dos alelos G para el SNP rs3794271 es indicativo de predisposición a una mala respuesta al tratamiento.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde el genotipo se determina para el SNP rs3794271 .

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, donde la muestra aislada se selecciona del grupo que comprende plasma, sangre, suero y saliva.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, donde la

determinación del genotipo se lleva a cabo mediante una técnica de análisis de ADN seleccionada del grupo que consiste en secuenciación, hibridación, Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), Amplificación aleatona de ADN polimórfico (RAPD), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLPD), y combinaciones de las mismas.

Método para decidir o recomendar un tratamiento para un paciente con AR que comprende determinar el genotipo para el SNP rs3794271 , y/o un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo, según se define en las reivindicaciones 1 -5, donde si el paciente tiene predisposición a una mala respuesta al tratamiento se recomienda una terapia que excluya infliximab y etanercept.

7. Método para decidir o recomendar un tratamiento para un paciente con AR que comprende determinar el genotipo para el SNP rs3794271 , y/o un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo, según se define en las reivindicaciones 1 -5, donde si el paciente tiene predisposición a una buena respuesta al tratamiento se recomienda una terapia que incluya infliximab o etanercept.

8. Método según la reivindicación 6, donde se determina el genotipo para el SNP rs3794271 , según se define en las reivindicaciones 3-5 y si el paciente presenta al menos un alelo G se recomienda una terapia que excluya infliximab y etanercept.

9. Método según la reivindicación 6, donde se determina el genotipo para el SNP rs3794271 según se define en las reivindicaciones 3-5 y si el paciente presenta dos alelos distintos de G se recomienda una terapia que incluya infliximab o etanercept.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4, 5, 6 y 7, donde el SNP en desequilibrio de ligamiento se encuentra situado en el locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento definido por la SEC ID NO: 1 .

1 1 . Método según la reivindicación 10, donde el SNP en desequilibrio de ligamiento se selecciona del grupo que consiste en rs10841585, rs10841586, rs4451779, rs10743388, rs10770689, rs6487129, rs10770691 , rs1 1045376, rs1 1045378, rs10770695, rs12301364, rs10841593, rs151 131008, rs1 1045385, rs10770701 , rs954866, rs3809209, rs7305718, rs74406912, rs1 1045390, rs1 1045392, rs2203493, rs137927950, rs2417861 , rs3751218, rs959346, rs10770702, rs10743389, rs10770704, rs71939085, rs10743390, rs1 1392906, rs201855778, rs10770705, rs10770706, rs78690605, rs10505868, rs1473993, rs3838816 y rs10770707.

12. Método según la reivindicación 1 1 , donde el SNP en desequilibrio de ligamiento se selecciona del grupo que consiste en rs10770707, rs1473993, rs10770704, rs10770702, rs959346, rs3751218, rs1 1045392, rs1 1045390, rs74406912, rs10770701 y rs954866.

13. Uso del SNP rs3794271 , y/o un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo, como marcador en la predicción de la respuesta al tratamiento con un anti-TN Faifa seleccionado entre infliximab y etanercept en un paciente con AR.

14. Uso según la reivindicación 13, donde el SNP en desequilibrio de

ligamiento se encuentra situado en el locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento definido por la SEC ID NO: 1 .

15. Uso según la reivindicación 14, donde el SNP en desequilibrio de

ligamiento se selecciona del grupo que consiste en rs10841585, rs10841586, rs4451779, rs10743388, rs10770689, rs6487129, rs10770691 , rs1 1045376, rs1 1045378, rs10770695, rs12301364, rs10841593, rs151 131008, rs1 1045385, rs10770701 , rs954866, rs3809209, rs7305718, rs74406912, rs1 1045390, rs1 1045392, rs2203493, rs137927950, rs2417861 , rs3751218, rs959346, rs10770702, rs10743389, rs10770704, rs71939085, rs10743390, rs1 1392906, rs201855778, rs10770705, rs10770706, rs78690605, rs10505868, rs1473993, rs3838816 y rs10770707.

16. Uso según la reivindicación 15, donde el SNP en desequilibrio de

ligamiento se selecciona del grupo que consiste en rs10770707, rs1473993, rs10770704, rs10770702, rs959346, rs3751218, rs1 1045392, rs1 1045390, rs74406912, rs10770701 y rs954866.

17. Uso según la reivindicación 13, donde el marcador es el SNP

rs3794271 . 18. Kit para predecir la respuesta al tratamiento con un anti-TNFalfa

seleccionado de entre infliximab o etanercept en un paciente con artritis reumatoide que comprende medios para determinar el genotipo para el SNP rs3794271 , y/o al menos un SNP que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con el mismo, e instrucciones para llevar a cabo dicha determinación y para la interpretación de los resultados, donde dichas instrucciones para la interpretación de resultados indican que la presencia de al menos un alelo G para el SNP rs3794271 y/o la presencia de al menos un alelo correlacionado con el alelo G del rs3794271 para el SNP en desequilibrio de ligamiento es indicativo de mala respuesta al tratamiento mientras que la presencia de dos alelos distintos de G para el SNP rs3794271 y/o la presencia de dos alelos no correlacionados con el alelo G del rs3794271 para el SNP en

desequilibrio de ligamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento.

19. Kit según la reivindicación 18, donde el SNP en desequilibrio de

ligamiento se encuentra situado en el locus de predisposición a mala respuesta al tratamiento definido por la SEC ID NO: 1 . 20. Kit según la reivindicación 19, donde el SNP en desequilibrio de

ligamiento se selecciona del grupo que consiste en rs10841585, rs10841586, rs4451779, rs10743388, rs10770689, rs6487129, rs10770691 , rs1 1045376, rs1 1045378, rs10770695, rs12301364, rs10841593, rs151 131008, rs1 1045385, rs10770701 , rs954866, rs3809209, rs7305718, rs74406912, rs1 1045390, rs1 1045392, rs2203493, rs137927950, rs2417861 , rs3751218, rs959346,

rs10770702, rs10743389, rs10770704, rs71939085, rs10743390, rs1 1392906, rs201855778, rs10770705, rs10770706, rs78690605, rs10505868, rs1473993, rs3838816 y rs10770707.

21 . Kit según la reivindicación 20, donde el SNP en desequilibrio de ligamiento se selecciona del grupo que consiste en rs10770707, rs1473993, rs10770704, rs10770702, rs959346, rs3751218, rs1 1045392, rs1 1045390, rs74406912, rs10770701 y rs954866.

22. Kit según la reivindicación 18 donde los medios son para determinar el genotipo para el SNP rs3794271 y las instrucciones indican que la presencia de al menos un alelo G para el SNP rs3794271 es indicativo de mala respuesta al tratamiento, mientras que la presencia de dos alelos distintos de G para el SNP rs3794271 es indicativo de buena respuesta al tratamiento.