WO2014156293A1 - 分析方法 - Google Patents

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英樹 木下
豊 鵜沼
格 近藤
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National Cancer Center Japan
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National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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    • G01N27/44778—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis on a common gel carrier, i.e. 2D gel electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to an analysis method.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2013-071753 filed in Japan on March 29, 2013, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • proteome analysis has been actively performed as a method for comprehensive analysis of proteins that directly support biological activities.
  • the proteome is a specific cell, organ, and the entire protein produced in the organ.
  • One of these techniques two-dimensional electrophoresis, has high resolution and can detect thousands of proteins at a time, and is therefore widely used as a method for separating biological samples such as proteins.
  • two-dimensional electrophoresis based on the physical properties of the protein, it is separated by isoelectric focusing and further separated in the molecular weight direction by SDS-PAGE.
  • Isoelectric focusing is a technique in which a voltage is applied to a gel and separation is performed based on the difference in isoelectric points of proteins.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in which electrophoresis is performed in a state where a protein is complexed with an anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS). Widely used.
  • Proteins are detected as spots in a polyacrylamide gel on a flat plate by two-dimensional electrophoresis.
  • a technique for identifying the protein of each protein spot there is a peptide mass fingerprint method. By using this method, it is possible to determine the type of each protein in the spot. In this method, the spot in the separated gel is transferred to the membrane, and the protein can be similarly identified in the spot in the membrane.
  • each protein spot is cut out in a gel state, and the plug-like gel is transferred to a chamber where the liquid buffer does not leak.
  • the protein in the gel is digested into peptides with a protein digestion enzyme such as trypsin.
  • mass analysis is performed on the peptide eluted from the gel using a mass spectrometer, and the mass spectrum of the peptide fragment predicted from the protein estimated in advance on the database and the pattern of the actually measured mass spectrum are obtained. Compare and identify pre-digested proteins.
  • Patent Document 1 As a method for cutting out a spot or band, there is known a method of cutting out using a cutting tool such as a razor or a knife, a pipette tip, or a device that automatically cuts with a cylindrical instrument (see Patent Document 1). In addition, a method of cutting out one block of a gel containing a protein separated by two-dimensional electrophoresis and digesting the protein in the gel into a peptide is also known (see Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 discloses a method of fractionating a protein separated by isoelectric focusing in a solution and a method of fractionating by eluting a protein separated by SDS-PAGE into a solution. These fractionated proteins are fractionated only by one physical property of the protein. Therefore, fractionation is based only on the actual molecular weight or isoelectric point.
  • the present invention has been made in consideration of such circumstances, and a target object separated by two-dimensional electrophoresis is increased using a mass analyzer while having a specific isoelectric point region and a molecular weight region.
  • One of the purposes is to detect with sensitivity.
  • One embodiment of the present invention includes a step of subjecting a target object to two-dimensional electrophoresis in an isoelectric point direction and a molecular weight direction substantially orthogonal to the isoelectric point direction, and a medium including the target object subjected to the two-dimensional electrophoresis
  • a target object separated by two-dimensional electrophoresis can be detected with high sensitivity using a mass analyzer while having a specific isoelectric point region and a molecular weight region.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a configuration of an isoelectric focusing device 10.
  • FIG. 4 is a perspective view of a part of the second-dimensional electrophoresis apparatus 30 and a cross-sectional view taken along the line AA. It is a figure which shows a mode that the IPG gel strip 1 was introduce
  • FIG. It is an example of the captured image which imaged the sample separation medium (gel) 37 after two-dimensional electrophoresis was performed.
  • FIG. 1 is an example of a flowchart showing a flow of an analysis method according to the first embodiment.
  • the analyst prepares an IPG (immobilized pH gradient gel) gel strip 1 (step S100).
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the external shape of the IPG gel strip 1.
  • the IPG gel strip 1 includes a sample-containing medium 2 for one-dimensional electrophoresis and a support 3 that supports the sample-containing medium 2.
  • the sample-containing medium 2 is a medium from which a sample (target object) is separated by isoelectric focusing.
  • the sample is a biological sample such as a protein.
  • one used as a first-dimensional gel for two-dimensional electrophoresis can be used, for example, gelled by a gelling agent selected from the group consisting of polyacrylamide, agarose, agar, and starch.
  • a gelling agent selected from the group consisting of polyacrylamide, agarose, agar, and starch.
  • An immobilized pH gradient (IPG) gel or the like is preferably used.
  • a plastic plate or film can be used as the support 3.
  • the sample contained in the sample-containing medium 2 is provided with the first color pigment.
  • the sample-containing medium 2 includes, for example, an isoelectric point marker in which a plurality of substances having known isoelectric points and having a low molecular weight are provided with a second color dye, and the isoelectric point is small.
  • a plurality of substances (peptides) having a known molecular weight are mixed with a molecular weight marker provided with a dye of the third color.
  • the peptides [7.3], [8.8], and [9.6] are mixed and applied. The significance of these will be described later.
  • the analyst may add a molecular weight marker to a portion that does not overlap the sample before performing the second-dimensional electrophoresis.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of the configuration of the isoelectric focusing device 10. As shown in FIG. 3, the isoelectric focusing device 10 has a rectangular parallelepiped shape, and an elongated rectangular electrophoresis chamber 11 is formed at the center.
  • a first electrode 12 that is in contact with the acidic side end of the sample-containing medium 2 is provided on one end side in the longitudinal direction of the electrophoresis chamber 11, and the basic side of the sample-containing medium 2 is provided on the other end side.
  • the 2nd electrode 13 which the edge part contacts is installed.
  • the first electrode 12 and the second electrode 13 are connected to a power source 14.
  • the voltage between the first electrode 12 and the second electrode 13 is controlled by the voltage control unit 17.
  • the voltage control unit 17 includes detection values of an ammeter 15 that measures the current flowing through the first electrode 12 and the second electrode 13 and a voltmeter 16 that measures the voltage between the first electrode 12 and the second electrode 13. Entered.
  • the isoelectric focusing device 10 includes a cover 18 for preventing the sample-containing medium 2 from being dried during electrophoresis.
  • the IPG gel strip 1 is placed in the electrophoresis chamber 11 using a transporting clip 20, and a voltage is applied to the first electrode 12 and the second electrode 13 that are in contact with the IPG gel strip 1. This is done by applying.
  • Isoelectric focusing is performed by, for example, protein-containing 8M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS (3-[(3-Cholamidopropylo) dimethylaminopropansulfonate), 20 mM dithiothreitol, 0.5% AmphorGolte strip After the swelling, the voltage is applied.
  • the voltage controller 17 converges the protein to the isoelectric point by gradually increasing the voltage.
  • the voltage controller 17 may be maintained at 200 V for 5 minutes, 200 V to 1000 V for 5 minutes, 1000 V for 5 minutes, 1000 V to 6000 V for 10 minutes, and 6000 V for 5 minutes. To raise.
  • isoelectric focusing the protein contained in the sample-containing medium 2 migrates in the longitudinal direction of the sample-containing medium 2 by a distance corresponding to each isoelectric point (pI).
  • FIG. 4 is a perspective view of a part of the second-dimensional electrophoresis apparatus 30 and a cross-sectional view taken along the line AA.
  • the second-dimensional electrophoresis apparatus 30 includes a cathode buffer solution tank 31 for second-dimensional electrophoresis into which a cathode 31A is introduced, an anode buffer solution tank 32 for second-dimensional electrophoresis into which an anode 32A is introduced, and an upper substrate 33.
  • a sample separation medium support plate 34 a sample loading section 35 into which the IPG gel strip 1 is introduced, and a sample separation section 36.
  • the sample separation unit 36 is filled with a sample separation medium (gel) 37 for separating the sample after the first-dimensional electrophoresis.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a state where the IPG gel strip 1 is introduced into the second-dimensional electrophoresis apparatus 30.
  • the IPG gel strip 1 is placed on the sample loading unit 35 with the sample-containing medium 2 facing downward in the drawing.
  • the cathode buffer solution tank 31 and the anode buffer solution tank 32 of the second-dimensional electrophoresis are filled with an electrophoresis buffer (a liquid reagent for conducting the gel and the electrode).
  • the second-dimensional electrophoresis apparatus 30 includes a power source 40 and a voltage control unit 43.
  • the voltage between the cathode 31A and the anode 32A is controlled by the voltage control unit 43.
  • the voltage controller 43 receives detection values of an ammeter 41 that measures the current flowing through the cathode 31A and the anode 32A and a voltmeter 42 that measures the voltage between the cathode 31A and the anode 32A.
  • the analyst Prior to performing the second-dimensional electrophoresis, the analyst analyzed the IPG gel strip 1 with, for example, 50 mM DTT, 500 mM Tris-HCl (pH 6.6), 4% SDS, 12.5% Glycerol, 0.005%. Deposit in an aqueous solution containing BPB for 5 minutes. Thereafter, the IPG gel strip 1 is placed on the sample loading unit 35, and for example, a desired voltage is applied at 20 mA between the cathode 31A and the anode 32A, and electrophoresis is performed for 30 minutes. Thereby, the protein migrated in the longitudinal direction of the IG gel strip 1 by isoelectric focusing can be migrated in the X direction in FIG.
  • FIG. 6 is an example of a captured image obtained by imaging the sample separation medium (gel) 37 after two-dimensional electrophoresis is performed.
  • a plurality of molecular weight markers 62 arranged in the vertical direction at the left end portion, and a plurality of isoelectric point markers 65 arranged in the left-right direction at the lower end portion (spots indicated by arrows in the drawing). Is visible to the analyst.
  • “69” is a dye that has not reacted with the sample and has a large charge.
  • “kDa” in FIG. 6 is a unit of kilodalton representing molecular weight.
  • the analyst detects the isoelectric point marker and the molecular weight marker (step S120), and cuts the gel using a razor or the like (step S130).
  • the analyst divides into a lattice shape (block shape) by a divided section along the isoelectric point direction (vertical direction in FIG. 6) and a divided section along the molecular weight direction (lateral direction in FIG. 6).
  • the razor blade may be made of, for example, a resin, ceramic, metal, or the like that is harder than the gel, and a blade that is as thin as possible so as not to generate a gel piece when the gel is cut.
  • FIG. 7A and 7B are diagrams showing the cut surface for cutting the gel 60 and the sample separation unit 36 after the block of the cut gel 60 is removed.
  • FIG. 7A shows the state immediately after the gel 60 is cut
  • FIG. 7B shows the state after the block is removed.
  • the gel 60 is cut at the longitudinal cutting position 63 and the lateral cutting position 64 so that the molecular weight marker 62 and the isoelectric point marker 65 are not cut. Further, when the gel is cut, a cutting mark 67 in the vertical direction and a cutting mark 68 in the horizontal direction remain by cutting with a blade having a blade length wider than the block. By comparing the cutting trace generated by this cutting with the position of the molecular weight marker and the isoelectric point marker, the molecular weight position and the isoelectric point position of the cut position can be calculated.
  • the analyst detects an isoelectric point marker and a molecular weight marker (step S140), and analyzes the sample for each block (step S150).
  • the analyst for example, reduces the gel cut into a block shape to about 1 mm 3 , transfers it to a container such as a microtube or microplate, and digests the protein in the gel.
  • the analyst adds 50 ⁇ L of 100% acetonitrile (CH 3 CN), 50 ⁇ L of 50 mM ammonium bicarbonate (NH 4 HCO 3 ), and is allowed to stand at room temperature for 15 minutes for destaining.
  • the analyst added 100 ⁇ L of 100% CH 3 CN and allowed to stand at room temperature for 10 minutes, then added 10 mM (DTT) and 50 mM (NH 4 HCO 3 ) and incubated at 60 ° C. for 10 minutes. Let stand for 20 minutes to reduce the protein.
  • the analyst performs alkylation by adding 30 ⁇ L of 50 mM iodoacetamide, 50 mM (NH 4 HCO 3 ) and allowing to stand at room temperature for 15 minutes.
  • the analyst added 40 ⁇ L of 50 mM (NH 4 HCO 3 ) and left at room temperature for 15 minutes, and then added 100 ⁇ L of 100% CH 3 CN and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Drain and leave under nitrogen for 10 minutes.
  • the analyst then adds 25 ⁇ l trypsin digest and incubates overnight at 30 ° C. to make the extracted peptide a sample for the mass spectrometer.
  • the digestive fluid may be endopeptidase and is not limited to trypsin.
  • the method of in-gel protein digestion is not limited to the said method.
  • MASCOT, X! Can be used to identify proteins from peptide data detected using a mass spectrometer. This is done using software that collates with databases such as Tandem, OMASASA, Android, etc.
  • the fragmentation treatment according to the present invention can be combined with a method for comparatively quantifying protein expression using MS-based proteomics.
  • proteins are labeled with different labeling compounds between samples and then mixed and subjected to two-dimensional electrophoresis.
  • the gel after two-dimensional electrophoresis is cut into blocks by this method and the peptides are extracted and analyzed with a mass spectrometer, the physical properties of the labeled proteins and peptides remain unchanged, but the mass or the tag molecules used for the labeling Since the mass is slightly different, each protein contained in each sample can be distinguished by the difference in mass even if analysis is performed at the same time, so that the difference in the amount of each protein can be compared.
  • Labeled compounds used for labeling include SILAC, 15 N, 18 O, TNT, iTRAQ, etc., and SILAC, 15 N are metabolic labels, which allow cells to absorb amino acids and nitrates labeled with stable isotopes. Thus, proteins newly synthesized in cells are labeled.
  • 18 O, TNT, and iTRAQ labels are chemical labels, and can be directly labeled by reacting the extracted protein or peptide with a stable isotope or a tag molecule containing a stable isotope in a test tube. Both the metabolically labeled sample and the directly labeled sample can be used in the present method.
  • FIG. 8 shows a method of displaying information obtained by combining a method of dividing a sample into blocks and a protein expression comparison using MS-based proteomics. Since many translated proteins are post-translationally modified, each protein is detected in multiple blocks when post-translational modification is performed.
  • SILAC stable isotope labeling using amino acids in cell culture
  • stable isotopes are labeled using different stable isotopes between samples. The points and molecular weights are almost the same and are detected in the same block, and their amounts can be compared with the MS peak amount (LC-MS spectrum in FIG. 8). Depending on these amounts, the difference can be clearly displayed by displaying the heat map in two dimensions as shown in FIG. In FIG. 8, if the protein is the same, the increase / decrease is expected to be the same in all detected compartments.
  • proteins were prepared from cells cultured in a medium containing natural L-Lycine hydrochloride (Light) and cells cultured in a medium supplemented with 13 C 6 -L-Lycine hydrochloride (Heavy).
  • the mass of the peptide obtained by dividing the gel into blocks and digesting the protein in the gel with trypsin is analyzed by a mass spectrometer.
  • the protein can be identified by MASCOT.
  • the number of blocks identified by post-translational modification of the protein spans multiple. It is possible to detect whether there is a difference in the translation amount of the protein between the samples to be compared and if there is a difference in post-translational modification, the difference is also detected for each block (FIG. 9).
  • the medium containing the sample subjected to two-dimensional electrophoresis is divided into a lattice shape by a divided section along the isoelectric point direction and a divided section along the molecular weight direction.
  • a target object separated by two-dimensional electrophoresis is detected with high sensitivity using a mass analyzer while having a specific isoelectric point region and a molecular weight region. be able to.
  • the analysis method according to the second embodiment will be described.
  • the isoelectric point and molecular weight of each divided block are grasped according to the reference display attached to the sample separation medium support plate. .
  • FIG. 10A to FIG. 10C are diagrams showing how the sample separation medium support plate 70 that can estimate the molecular weight and isoelectric point of the cutting position is used.
  • the sample separation medium support plate 70 is preliminarily drawn with a line (reference display) 73 such as a fluorescence that can be detected at the same time due to a difference in protein detection, such as a pen or laser processing machine. Yes.
  • the line 73 is printed with, for example, a fluorescent dye having the same wavelength as the marker described above.
  • FIG. 10B is a diagram illustrating a state where the gel is placed on the sample separation medium support plate 70.
  • the gel is cut on the line 73 and the gel block is moved to a chamber or the like.
  • molecular weight markers 74 and isoelectric point markers 76 that can be omitted are displayed for comparison.
  • FIG. 10C by comparing the positions of the molecular weight marker detected after the electrophoresis, the isoelectric point peptide marker, and the line 73, the accurate molecular weight and isoelectric point of the cleavage position can be grasped.
  • An example of the estimated molecular weight and isoelectric point of each block is shown in FIG.
  • a medium containing a sample subjected to two-dimensional electrophoresis is divided into a lattice shape along a dividing section along the isoelectric point direction and a dividing section along the molecular weight direction.
  • a target object separated by two-dimensional electrophoresis is detected with high sensitivity using a mass analyzer while having a specific isoelectric point region and a molecular weight region. be able to.
  • the present invention can be implemented in the following modes.
  • (Appendix 1) The step of subjecting the target object to two-dimensional electrophoresis in an isoelectric point direction and a molecular weight direction substantially orthogonal to the isoelectric point direction (step S110), and a medium containing the target object subjected to the two-dimensional electrophoresis, A step (step S120) of dividing the divided section along the isoelectric point direction and a divided section along the molecular weight direction into a lattice shape (step S120), and a step of comparing the target object between the divided media (step S130). And an analysis method (FIG. 1).
  • Appendix 3 The analysis method according to appendix 1, wherein a reference display (73) indicating a molecular weight and an isoelectric point is provided on a holding member (70) holding a medium containing the target object subjected to two-dimensional electrophoresis, An analysis method using a molecular weight and an isoelectric point grasped from the reference display in a step of comparing target objects.
  • Appendix 4 The analysis method according to any one of appendices 1 to 3, wherein the amount of the identified target object is compared in the step of comparing the target objects.
  • Appendix 5 The analysis method according to any one of appendices 1 to 4, wherein the target object is a protein, and the post-translational modification is performed by comparing the identified protein in the step of comparing the target object. Analytical method to compare the differences between the two.
  • Appendix 6 The analysis method according to any one of appendices 1 to 5, wherein the target object is a protein, and in the step of comparing the target object, the protein contained in the divided medium is extracted, An analysis method for identifying the extracted protein using a mass spectrometer.
  • Appendix 7 The analysis method according to any one of appendices 1 to 6, wherein the target object is a protein, and in the step of comparing the target object, the protein contained in the divided medium is converted into a proteolytic enzyme.
  • Appendix 8 The analysis method according to any one of appendices 1 to 7, wherein the target object is a mixture of protein samples labeled with different stable isotopes.
  • Appendix 9 The analysis method according to any one of appendices 1 to 7, wherein the target object is a protein, and in the step of comparing the target object, the protein contained in the fragmented medium is endopeptidase. Analytical method of cutting and comparing the amount of stable isotope protein different from protein identification using mass spectrometer.
  • the present invention is suitably used as a means for separating a biological sample such as a protein by electrophoresis, cutting out a sample separation medium containing the separated biological sample, and identifying or analyzing the sample in the separation medium by a mass spectrometer. can do.
  • Electrophoresis anode buffer tank 32A anode, 33 upper substrate, 34 sample separation medium support plate, 35 sample loading section, 36 sample separation section, 37 sample separation medium, 40 power supply, 41 current 42, Voltmeter, 43 Voltage controller, 60 Gel, 62 Molecular weight marker, 63 Vertical cutting position, 64 Horizontal cutting position, 65 Isoelectric point marker, 67 Vertical Cut trace, 68. Horizontal Direction of the cutting trace, 70 .. sample separating medium support plate, 73 .. line

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Abstract

　対象物体を、等電点方向と、該等電点方向に略直交する分子量方向とに二次元電気泳動させる工程と、前記二次元電気泳動させた対象物体を含む媒体を、前記等電点方向に沿った分断面と、前記分子量方向に沿った分断面とで格子状に分断する工程と、前記分断された媒体間で前記対象物体を比較する工程と、を含む分析方法。

Description

分析方法
　本発明は、分析方法に関する。
　本願は、２０１３年３月２９日に、日本に出願された特願２０１３－０７１７５３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生物活動を直接的に支えているタンパク質を網羅的に解析する手法として近年プロテオーム解析が盛んに行われている。プロテオームとは、特定の細胞、器官、及び臓器の中で生産されているタンパク質全体のことである。そのうちの一つの技術である二次元電気泳動法は、分解能が高く、一度で数千種類のタンパク質を検出できるために、タンパク質等の生体サンプルの分離方法として多用されている。二次元電気泳動では、タンパク質の物理的な性質に基づいて、等電点電気泳動で分離された後、さらにＳＤＳ―ＰＡＧＥにより分子量方向に分離される。等電点電気泳動は、ゲルに電圧を印加し、タンパク質の等電点の違いにより分離をおこなう手法である。また、ＳＤＳ―ＰＡＧＥによる分離では、陰イオン系界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とタンパク質が複合体を形成した状態で電気泳動を行うＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）が広く利用されている。
　二次元電気泳動によってタンパク質は平板上のポリアクリルアミドゲル内にスポットとして検出される。また、各タンパク質スポットのタンパク質を同定する技術として、ペプチドマスフィンガープリント法があり、この方法を用いる事でスポット内の各タンパク質の種類を決定することが可能である。この方法は、分離されたゲル中のスポットを膜に転写して、膜中のスポットでも同様にタンパク質を同定することができる。
　ペプチドマスフィンガープリント法では、各タンパク質のスポットをゲルの状態で切り出し、そのプラグ状のゲルを液体状のバッファが漏れないチャンバーに移す。次に、トリプシン処理バッファで置換を行った後に、トリプシン等のタンパク質消化酵素でゲル内のタンパク質をペプチドに消化する。そして、ゲルから溶出したペプチドに対して質量分析装置を用いて質量分析を行い、予めデータベース上などで推定されているタンパク質から予想されるペプチド断片の質量スペクトルと、実測された質量スペクトルのパターンを比較照合し、消化前のタンパク質を同定する。
　スポットまたはバンドの切り出し方法としては、剃刀やメス等の刃物やピペットチップ、また筒状の器具により自動でカットする装置等を用いて切り抜く方法が知られている（特許文献１参照）。また、二次元電気泳動で分離されたタンパク質を含むゲルの一ブロックを切り取って、ゲル中のタンパク質をペプチドに消化する方法も知られている（非特許文献１参照）。
　上記各方法は、分離された生体サンプルの一部分を解析する手法であるが、ゲルを複数に分画する方法も知られている。非特許文献２では、溶液中で等電点電気泳動によって分離したタンパク質を分画する方法やＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離したタンパク質を溶液中に溶出させることで分画する方法が開示されている。これらの分画されたタンパク質はタンパク質の一つの物理的性質によってのみ分画されている。そのため、実際の分子量または等電点にのみ基づいて分画される。
特開２００７－２０９３６０号公報
ＰＮＡＳ　ｖｏｌ．９７，ＮＯ．１７，１５　Ａｕｇ．２０００，９３９０－９３９５ Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ．４８０，　８　Ｄｅｃ．２０１１，　ｐ２５４
　しかしながら、非特許文献２に記載の方法では、分子量のみに基づく分画、或いは等電点のみに基づく分画が行われるため、タンパク質などの対象物体に関する十分な情報を得ることができない場合がある。すなわち、分子量のみに基づく分画では等電点シフト情報が含まれない為に、タンパク質翻訳後の修飾情報が曖昧となる。また、等電点のみに基づいて分画される場合には、プロセシングや糖鎖付加等による質量方向の変動が不明となる。非特許文献１記載の方法においても、１ブロックを切り取っているために、同様のタンパク質のプロセシングの情報を得ることができない。
　本発明は、このような事情を考慮してなされたものであり、２次元電気泳動により分離された対象物体を、特定の等電点領域と分子量領域を持ったまま質量分析器を用いて高感度で検出することを目的の１つとする。
　本発明の一態様は、対象物体を、等電点方向と、該等電点方向に略直交する分子量方向とに二次元電気泳動させる工程と、前記二次元電気泳動させた対象物体を含む媒体を、前記等電点方向に沿った分断面と、前記分子量方向に沿った分断面とで格子状に分断する工程と、前記分断された媒体間で前記対象物体を比較する工程と、を含む分析方法である。
　本発明の一態様によれば、２次元電気泳動により分離された対象物体を、特定の等電点領域と分子量領域を持ったまま質量分析器を用いて高感度で検出することができる。
第１実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートの一例である。 ＩＰＧゲルストリップ１の外観形状の一例を示す図である。 等電点電気泳動装置１０の構成の一例を示す図である。 二次元目電気泳動装置３０の一部についての斜視図、およびそのＡ―Ａ線における断面図である。 二次元目電気泳動装置３０にＩＰＧゲルストリップ１が導入された様子を示す図である。 二次元電気泳動が行われた後のサンプル分離媒体（ゲル）３７を撮像した撮像画像の一例である。 ゲルを切断する切断面を示す図である。 切断されたゲルのブロックが除去された後のサンプル分離部３６を示す図である。 ブロックにサンプルを分割する方法とＭＳベースプロテオミクスを用いたタンパク質発現比較を組み合わせて得られた情報を表示する方法を示す図である。 翻訳後修飾にある差異をブロック毎に検出する様子を示す図である。 切断位置の分子量と等電点を推定できるサンプル分離媒体支持板７０を示す図である。 切断位置の分子量と等電点を推定できるサンプル分離媒体支持板７０にサンプル分離媒体が設置された様子を示す図である。 切断位置の分子量と等電点を推定できるサンプル分離媒体支持板７０上のサンプル分離媒体からゲルブロックが切り取られた後を示す図である。 各ブロックの推定分子量と等電点の例を示す図である。
　以下、図面を参照し、本発明の分析方法の実施形態について説明する。
　＜第１実施形態＞
　図１は、第１実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートの一例である。まず、分析者は、ＩＰＧ（固定化pH勾配ゲル）ゲルストリップ１を用意する（ステップＳ１００）。図２は、ＩＰＧゲルストリップ１の外観形状の一例を示す図である。図２に示すように、ＩＰＧゲルストリップ１は、一次元電気泳動用のサンプル含有媒体２と、サンプル含有媒体２を支持する支持体３とを備える。サンプル含有媒体２は、等電点電気泳動によりサンプル（対象物体）が分離される媒体である。サンプルは、例えばタンパク質などの生体サンプルである。サンプル含有媒体２としては、二次元電気泳動の一次元目用ゲルとして用いられるものが利用でき、例えば、ポリアクリルアミド、アガロース、寒天、およびデンプンからなる群より選ばれるゲル化剤によりゲル化された固定化ｐＨ勾配（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｐＨ　ｇｒａｄｉｅｎｔ：　ＩＰＧ）ゲルなどが好適に用いられる。
支持体３としては、例えばプラスチック製の板やフィルムなどを用いることができる。
　サンプル含有媒体２に含まれるサンプルには、第１の色の色素が付与されている。また、サンプル含有媒体２には、例えば、等電点が既知の複数の物質であって、分子量が小さい物質に第２の色の色素が付与された等電点マーカーと、等電点が小さく分子量が既知の複数の物質（ペプチド）に第３の色の色素が付与された分子量マーカーが混入されている。分析者は、ｐＨ３－１０のＩＰＧゲルストリップ１に対して、例えば、ペプチドのスポットが略等間隔になるように、ｐＩ＝［４．０］，［５．０］，［６．２］，［７．３］，［８．８］，［９．６］のペプチドを混合してアプライする。これらの意義については、後述する。なお、分析者は、二次元目電気泳動を行う前に、分子量マーカーを、サンプルに重ならない部分に添加してもよい。
　図１に戻り、分析者は、ＩＰＧゲルストリップ１に対して二次元電気泳動を行う（ステップＳ１１０；Ｓ１１２～Ｓ１１６）。まず、分析者は、ＩＰＧゲルストリップ１を等電点電気泳動装置１０に導入し、一次元目の電気泳動（等電点電気泳動）を行う（ステップＳ１１２）。図３は、等電点電気泳動装置１０の構成の一例を示す図である。図３に示すように、等電点電気泳動用装置１０は、直方体形状を有し、中央部に細長い矩形状の電気泳動用チャンバー１１が形成されている。電気泳動用チャンバー１１の長手方向一端側には、サンプル含有媒体２の酸性側の端部が接触する第１電極１２が設置されており、他端側には、サンプル含有媒体２の塩基性側の端部が接触する第２電極１３が設置されている。第１電極１２と第２電極１３は、電源１４に接続される。
　第１電極１２と第２電極１３の間の電圧は、電圧制御部１７により制御される。電圧制御部１７には、第１電極１２および第２電極１３に流れる電流を測定する電流計１５と、第１電極１２と第２電極１３の間の電圧を測定する電圧計１６の検出値が入力される。また、等電点電気泳動用装置１０は、電気泳動中にサンプル含有媒体２の乾燥を防ぐ為のカバー１８を備える。
　等電点電気泳動は、ＩＰＧゲルストリップ１を搬送用のクリップ２０を用いて電気泳動用チャンバー１１内に載置し、ＩＰＧゲルストリップ１に当接する第１電極１２および第２電極１３に電圧を印加することにより行われる。等電点電気泳動は、例えば、タンパク質を含む８Ｍ　Ｕｒｅａ，２Ｍ　Ｔｈｉｏｕｒｅａ，４％　ＣＨＡＰＳ（３－［（３－Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ），２０ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．５％　Ａｍｐｈｏｌｙｔｅの膨潤液でＩＰＧストリップ１を膨潤させた後で、電圧を印加して行われる。電圧制御部１７は、徐々に電圧を上昇させることにより、タンパク質を等電点に収束させる。
例えば、電圧制御部１７は、例えば、２００Ｖで５分間維持、２００Ｖから１０００Ｖまで５分間で上昇、１０００Ｖで５分間維持、１０００Ｖから６０００Ｖまで１０分間で上昇、６０００Ｖで５分間維持といた流れで電圧を上昇させる。等電点電気泳動によって、サンプル含有媒体２に含まれるタンパク質が、サンプル含有媒体２の長手方向にそれぞれの等電点（ｐＩ）に応じた距離、泳動することになる。
　図１に戻り、分析者は、ＩＰＧゲルストリップ１を二次元目電気泳動装置３０に導入し、二次元目の電気泳動を行う（ステップＳ１１４）。図４は、二次元目電気泳動装置３０の一部についての斜視図、およびそのＡ―Ａ線における断面図である。二次元目電気泳動装置３０は、陰極３１Ａが導入される二次元目電気泳動の陰極緩衝液槽３１と、陽極３２Ａが導入される二次元目電気泳動の陽極緩衝液槽３２と、上部基板３３と、サンプル分離媒体支持板３４と、ＩＰＧゲルストリップ１が導入されるサンプルローディング部３５と、サンプル分離部３６とを備える。サンプル分離部３６には、一次元目の電気泳動が終了したサンプルを分離するためのサンプル分離媒体（ゲル）３７が充填される。
　図５は、二次元目電気泳動装置３０にＩＰＧゲルストリップ１が導入された様子を示す図である。図５に示すように、ＩＰＧゲルストリップ１は、サンプルローディング部３５に、サンプル含有媒体２を図中下向きにして載置される。この状態で、陰極緩衝液槽３１と二次元目電気泳動の陽極緩衝液槽３２には、泳動バッファ（ゲルと電極を導通させるための液体の試薬）が充填される。また、二次元目電気泳動装置３０は、電源４０と、電圧制御部４３とを備える。陰極３１Ａと陽極３２Ａの間の電圧は、電圧制御部４３によって制御される。電圧制御部４３には、陰極３１Ａおよび陽極３２Ａを流れる電流を測定する電流計４１と、陰極３１Ａと陽極３２Ａの間の電圧を測定する電圧計４２の検出値が入力される。
　二次元目電気泳動を行う前に、分析者は、ＩＰＧゲルストリップ１を、例えば、５０ｍＭ　ＤＴＴ、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　６．６）、４％　ＳＤＳ、１２．５％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．００５％　ＢＰＢを含む水溶液に５分間沈積させる。その後、サンプルローディング部３５にＩＰＧゲルストリップ１を載置し、例えば、陰極３１Ａと陽極３２Ａの間に所望の電圧を２０ｍＡで印加し、３０分間電気泳動を行う。これによって、等電点電気泳動によりＩＧゲルストリップ１の長手方向に泳動したタンパク質を、図５におけるＸ方向に泳動させることができる。
　図６は、二次元電気泳動が行われた後のサンプル分離媒体（ゲル）３７を撮像した撮像画像の一例である。図示するように、サンプル分離媒体３７上では、左端部において上下方向に並ぶ複数の分子量マーカー６２と、下端部において左右方向に並ぶ複数の等電点マーカー６５（図中の矢印が指し示すスポット）とが、分析者によって視認可能となっている。図中「６９」は、サンプルと未反応の色素であって電荷の大きい色素が溜まったものである。また、図６における「ｋＤａ」は、分子量を表す単位のキロダルトンである。
　図１に戻り、分析者は、等電点マーカーと分子量マーカーを検出し（ステップＳ１２０）、剃刀等を用いてゲルを分断する（ステップＳ１３０）。分析者は、等電点方向（図６における縦方向）に沿った分断面と、分子量方向（図６における横方向）に沿った分断面とで格子状（ブロック状）に分断する。剃刀の刃は、例えば、ゲルよりも硬質な樹脂、セラミック、金属等で出来ていても良く、ゲルを切断したときにゲル片を生じないように出来るだけ薄い刃が良い。
　図７Ａ及び図７Ｂは、ゲル６０を切断する切断面と、切断されたゲル６０のブロックが除去された後のサンプル分離部３６を示す図である。図７Ａは、ゲル６０が切断された直後を示しており、図７Ｂは、ブロックが除去された後の状態を示している。ゲル６０の切断は、分子量マーカー６２と等電点マーカー６５を切断しないように、縦方向の切断位置６３と横方向の切断位置６４で行う。また、ゲルの切断の際に、ブロックよりも広い刃長の刃で切断を行うことで、縦方向の切断跡６７と横方向の切断跡６８が残る。この切断によって生じた切断跡を分子量マーカーと等電点マーカーの位置と比較することにより、切断した位置の分子量位置と等電点位置を算出することができる。
　図１に戻り、分析者は、等電点マーカーと分子量マーカーを検出し（ステップＳ１４０）、サンプルをブロック毎に分析する（ステップＳ１５０）。分析者は、例えば、ブロック状に切断したゲルを１ｍｍ３程度にして、マイクロチューブやマイクロプレート等の容器に移し、ゲル内のタンパク質の消化を行う。次に、分析者は、５０μＬの１００％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、５０μＬの５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）を加えて室温で１５分間静置して脱染色する。次に、分析者は、１００μＬの１００％ＣＨ３ＣＮを添加して室温で１０分間静置し、１０ｍＭ（ＤＴＴ）、５０ｍＭ（ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加して６０℃で１０分間保温した後、２０分間静置してタンパク質を還元する。次に、分析者は、３０μＬの５０ｍＭヨードアセトアミド、５０ｍＭ（ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加して室温で１５分間静置してアルキル化を行なう。次に、分析者は、４０μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加して室温で１５分放置、さらに、１００μＬの１００％ＣＨ３ＣＮを添加して室温で３０分間静置した後、ウェル内の液を排出して窒素下で１０分間置く。次に、分析者は、トリプシン消化液２５μｌを加え、３０℃で一夜インキュベートして、抽出されたペプチドを質量分析器のサンプルとする。上記消化液はエンドペプチダーゼで良くて、トリプシンに限定されない。また、ゲル内タンパク質消化の方法は上記方法に限定されない。質量分析器を用いて検出したペプチドデータによりタンパク質を同定する方法としてはＭＡＳＣＯＴ、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ、ＯＭＡＳＳＡ、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ等のようなデータベースと照合するソフトウェアを用いて行う。
　なお、本発明に係る分断処理は、ＭＳベースプロテオミクスを用いてタンパク質の発現量を比較定量する方法と組み合わせる事ができる。先ず、タンパク質を試料間で異なる標識化合物で標識した後に混合し、２次元電気泳動を行う。２次元電気泳動後のゲルを本方法でブロックに切断してペプチドを抽出して質量分析器で分析すると、標識されたタンパク質およびペプチドの物性は変わらないがその質量または標識に用いたタグ分子の質量がわずかにことなるため同時に分析を行ってもその質量の差で各試料に含まれていた各タンパク質を区別できるため、各タンパク質の量の差を比較することができる。
　そのため比較したいタンパク質試料を混合して同時に分析を行うことで２次元電気泳動の差、ゲル内消化・ペプチドの溶出効率、液体クロマトグラフイーの溶出時間の差、および質量分析器の差のずれを最小にできる。標識で用いられる標識化合物には、ＳＩＬＡＣ、１５Ｎ、１８Ｏ、ＴＮＴ、ｉＴＲＡＱ等があり、ＳＩＬＡＣ、１５Ｎは代謝標識であり、安定同位体で標識されたアミノ酸や硝酸などを細胞に吸収させて細胞内で新規合成されるタンパク質を標識する。一方、１８Ｏ、ＴＮＴ、ｉＴＲＡＱ標識は化学標識であり、抽出したタンパク質またはペプチドを試験管内で安定同位体または安定同位体を含むタグ分子と反応させ直接標識できる。上記、代謝標識サンプルおよび直接標識サンプルともに本方法では使用することができる。
　ブロックにサンプルを分割する方法とＭＳベースプロテオミクスを用いたタンパク質発現比較を組み合わせて得られた情報を表示する方法を図８に示す。翻訳されたタンパク質の多くが翻訳後修飾されているために、各々のタンパク質は翻訳後修飾が行われていると複数のブロックで検出される。ＳＩＬＡＣ（stable　isotope　labeling　using　amino　acids　in　cell　culture；細胞培養液中のアミノ酸を用いた安定同位体ラベル）法では試料間で異なる安定同位体を用いてラベルを行っているために、それらの等電点と分子量はほぼ同じであり同じブロックに検出され、それらの量はＭＳピーク量で比較することができる（図８のＬＣ－ＭＳスペクトル）。それら量に応じて図８のように二次元上にヒートマップで表示する事によってその差異を明確に表示できる。図８において、同じタンパク質であれば、検出された全区画でその増減は同じ傾向になると予想される。
　具体的には、天然型のＬ－Ｌｙｓｉｎｅ塩酸塩（Ｌｉｇｈｔ）を含む培地で培養した細胞と１３Ｃ６－Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ塩酸塩（Ｈｅａｖｙ）を添加した培地で培養した細胞からタンパク質を調整して、等量でサンプルを混合した後、上記２次元電気泳動を行った後、ゲルをブロックで分割してトリプシンでゲル中のタンパク質をゲル内消化して得られたペプチドの質量を質量分析器により測定して、ＭＡＳＣＯＴによりタンパク質を同定できる。同じタンパク質であってもタンパク質の翻訳後修飾によって同定されてくるブロック数は複数にまたがる。比較するサンプル間でタンパク質の翻訳量に差があるかどうかの検出と、翻訳後修飾に差異があるとそれらの差もブロック毎で検出することが可能である（図９）。
　以上説明した第１実施形態の分析方法によれば、二次元電気泳動させたサンプルを含む媒体を、等電点方向に沿った分断面と、分子量方向に沿った分断面とで格子状に分断し、分断された媒体間でサンプルを比較するため、２次元電気泳動により分離された対象物体を、特定の等電点領域と分子量領域を持ったまま質量分析器を用いて高感度で検出することができる。
　また、第１実施形態の分析方法によれば、タンパク質混合液サンプルを細かく分画することで、低濃度タンパク質を検出し、タンパク質のプロセッシングや翻訳後修飾の差を比較でき、詳細に分画する事によってそれらの修飾位置の予測をすることができる。
　＜第２実施形態＞
　以下、第２実施形態に係る分析方法について説明する。第２実施形態に係る分析方法では、等電点マーカーや分子量マーカーを用いるのではなく、サンプル分離媒体支持板に付された基準表示に従って、分断された各ブロックの等電点と分子量を把握する。
　図１０Ａ～図１０Ｃは、切断位置の分子量と等電点を推定できるサンプル分離媒体支持板７０が用いられる様子を示す図である。図１０Ａに示すように、サンプル分離媒体支持板７０は予め切断位置をペンやレーザー加工機等の好ましくはタンパク質の検出の差異に同時に検出可能な蛍光等の線（基準表示）７３が描かれている。線７３は、例えば、前述したマーカーと同じ波長の蛍光色素で印字されている。図１０Ｂは、サンプル分離媒体支持板７０にゲルが設置された様子を示す図である。二次元目電気泳動を行った後、線７３上でゲルを切断して、ゲルブロックをチャンバー等に移動させる。図１０Ｂ、図１０Ｃにおいては、本来省略可能な分子量マーカー７４と等電点マーカー７６を、比較のために表示している。図１０Ｃに示すように、泳動後に検出された分子量マーカーと等電点ペプチドマーカーと線７３の位置を比較することによって、切断位置の正確な分子量と等電点を把握することができる。各ブロックの推定分子量と等電点の例を図１１に示す。
　以下、ブロック毎の分析については第１実施形態と同様であるため、説明を省略する。
以上説明した第２実施形態の分析方法によれば、二次元電気泳動させたサンプルを含む媒体を、等電点方向に沿った分断面と、分子量方向に沿った分断面とで格子状に分断し、分断された媒体間でサンプルを比較するため、２次元電気泳動により分離された対象物体を、特定の等電点領域と分子量領域を持ったまま質量分析器を用いて高感度で検出することができる。
　また、第２実施形態の分析方法によれば、タンパク質混合液サンプルを細かく分画することで、低濃度タンパク質を検出し、タンパク質のプロセッシングや翻訳後修飾の差を比較でき、詳細に分画する事によってそれらの修飾位置の予測をすることができる。
　以上、本発明を実施するための形態について実施形態を用いて説明したが、本発明はこうした実施形態に何等限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形及び置換を加えることができる。
　本発明は、以下の態様で実施することができる。
　（付記１）
　対象物体を、等電点方向と、該等電点方向に略直交する分子量方向とに二次元電気泳動させる工程（ステップＳ１１０）と、前記二次元電気泳動させた対象物体を含む媒体を、前記等電点方向に沿った分断面と、前記分子量方向に沿った分断面とで格子状に分断する工程（ステップＳ１２０）と、前記分断された媒体間で前記対象物体を比較する工程（ステップＳ１３０）と、を含む分析方法（図１）。
　（付記２）
　付記１記載の分析方法であって、前記二次元電気泳動が行われた状態で、基準となる複数の分子量および複数の等電点の位置に分析者によって視認可能なマーカー（６２、６５）が配置されるように、一次元目の電気泳動前および／または二次元目の電気泳動前に、既知の等電点と既知の分子量を持つマーカーを媒体に混入させる工程を更に含む、分析方法。
　（付記３）
　付記１記載の分析方法であって、前記二次元電気泳動させた対象物体を含む媒体を保持する保持部材（７０）に、分子量および等電点を示す基準表示（７３）がなされており、前記対象物体を比較する工程において、前記基準表示から把握される分子量および等電点を用いる、分析方法。
　（付記４）
　付記１から３のうちいずれか１記載の分析方法であって、前記対象物体を比較する工程において、同定された前記対象物体の量を比較する、分析方法。
　（付記５）
　付記１から４のうちいずれか１項記載の分析方法であって、前記対象物体は、タンパク質であり、記対象物体を比較する工程において、同定された前記タンパク質を比較することにより、翻訳後修飾の差を比較する、分析方法。
　（付記６）
　付記１から５のうちいずれか１項記載の分析方法であって、前記対象物体は、タンパク質であり、前記対象物体を比較する工程において、前記分断された媒体内に含まれるタンパク質を抽出し、質量分析装置を用いて前記抽出したタンパク質を同定する、分析方法。
　（付記７）
　付記１から６のうちいずれか１項記載の分析方法であって、前記対象物体は、タンパク質であり、前記対象物体を比較する工程において、前記分断された媒体内に含まれるタンパク質をタンパク質分解酵素で消化し、該消化した結果生じたペプチドを抽出し、質量分析装置を用いて前記抽出したタンパク質を同定する、分析方法。
　（付記８）
　付記１から７のうちいずれか１項記載の分析方法であって、前記対象物体は、異なる安定同位体で標識したタンパク質サンプルを混合したものである、分析方法。
　（付記９）
　付記１から７のうちいずれか１項記載の分析方法であって、前記対象物体は、タンパク質であり、前記対象物体を比較する工程において、前記分断された媒体内に含まれるタンパク質をエンドペプチダーゼで切断し、質量分析装置を用いてタンパク質の同定と異なる安定同位体タンパク質の量を比較する、分析方法。
　本発明は、タンパク質などの生体サンプルを電気泳動により分離し、分離した生体サンプルを含むサンプル分離媒体を切り出して分離媒体中のサンプルを質量分析装置によって同定したり解析したりする手段に好適に利用することができる。
１‥ＩＰＧゲルストリップ、２‥サンプル含有媒体、３‥支持体　、１０‥等電点電気泳動装置、１１‥電気泳動用チャンバー、１２‥第１電極、１３‥第２電極、１４‥電源、１５‥電流計、１６‥電圧計、１７‥電圧制御部、１８‥カバー、３０‥二次元目電気泳動装置、３１‥二次元目電気泳動の陰極緩衝液槽、３１Ａ‥陰極、３２‥二次元目電気泳動の陽極緩衝液槽、３２Ａ‥陽極、３３‥上部基板、３４‥サンプル分離媒体支持板、３５‥サンプルローディング部、３６‥サンプル分離部、３７‥サンプル分離媒体、４０‥電源、４１‥電流計、４２‥電圧計、４３‥電圧制御部、６０‥ゲル、６２‥分子量マーカー、６３‥縦方向の切断位置、６４‥横方向の切断位置、６５‥等電点マーカー、６７‥縦方向の切断跡、６８‥横方向の切断跡、７０‥サンプル分離媒体支持板、７３‥線

Claims (9)

  1. 　対象物体を、等電点方向と、該等電点方向に略直交する分子量方向とに二次元電気泳動させる工程と、
    　前記二次元電気泳動させた対象物体を含む媒体を、前記等電点方向に沿った分断面と、前記分子量方向に沿った分断面とで格子状に分断する工程と、
    　前記分断された媒体間で前記対象物体を比較する工程と、
    　を含む分析方法。
  2. 　請求項１記載の分析方法であって、
    　前記二次元電気泳動が行われた状態で、基準となる複数の分子量および複数の等電点の位置に分析者によって視認可能なマーカーが配置されるように、一次元目の電気泳動前および／または二次元目の電気泳動前に、既知の等電点と既知の分子量を持つマーカーを前記媒体に混入させる工程を更に含む、
    　分析方法。
  3. 　請求項１記載の分析方法であって、
    　前記二次元電気泳動させた対象物体を含む媒体を保持する保持部材に、分子量および等電点を示す基準表示がなされており、前記対象物体を比較する工程において、前記基準表示から把握される分子量および等電点を用いる、
    　分析方法。
  4. 　請求項１から３のうちいずれか１記載の分析方法であって、
    　前記対象物体を比較する工程において、同定された前記対象物体の量を比較する、
    　分析方法。
  5. 　請求項１から４のうちいずれか１項記載の分析方法であって、
    　前記対象物体は、タンパク質であり、
    　記対象物体を比較する工程において、同定された前記タンパク質を比較することにより、翻訳後修飾の差を比較する、
    　分析方法。
  6. 　請求項１から５のうちいずれか１項記載の分析方法であって、
    　前記対象物体は、タンパク質であり、
    　前記対象物体を比較する工程において、前記分断された媒体内に含まれるタンパク質を抽出し、質量分析装置を用いて前記抽出したタンパク質を同定する、
    　分析方法。
  7. 　請求項１から６のうちいずれか１項記載の分析方法であって、
    　前記対象物体は、タンパク質であり、
    　前記対象物体を比較する工程において、前記分断された媒体内に含まれるタンパク質をタンパク質分解酵素で消化し、該消化した結果生じたペプチドを抽出し、質量分析装置を用いて前記抽出したタンパク質を同定する、
    　分析方法。
  8. 　請求項１から７のうちいずれか１項記載の分析方法であって、
    　前記対象物体は、異なる安定同位体で標識したタンパク質サンプルを混合したものである、
    　分析方法。
  9. 　請求項１から７のうちいずれか１項記載の分析方法であって、
    　前記対象物体は、タンパク質であり、
    　前記対象物体を比較する工程において、前記分断された媒体内に含まれるタンパク質をエンドペプチダーゼで切断し、質量分析装置を用いてタンパク質の同定と異なる安定同位体タンパク質の量を比較する、
    　分析方法。
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