WO2014131925A1 - Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas - Google Patents

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Elena TOMAS HERRUZO
Ricardo Garcia Garcia
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/32—AC mode

Definitions

  • the present invention relates to a method of using a force microscope by frequency modulation, simultaneously exciting at least two modes of vibration of the micro lever, one of them being the main mode that allows monitoring the topography and being the other the secondary mode, characterized by a higher frequency than that of the main mode.
  • Fractional calculation is used to relate parameters measured directly with the microscope to the properties of the samples. Frequency shifts of excited modes and changes in excitation forces are used to quantify nanomechanical properties of a sample to be measured.
  • This method allows the calculation of various quantitative non-topographic properties of the materials, using dynamic vibration modes without hypothesis about the indentation of the tip of the micro lever in the sample to be analyzed. This method can be applied in real time during the measurement, or later to obtain the parameters directly measured in the sample.
  • the present bimodal method to quantify non-topographic properties in force microscopy finds application in the field of scientific research, by force microscopy, of all types of materials, organic and inorganic, the sample being immersed in a medium, liquid, gaseous, or in a vacuum.
  • a force microscope can operate in both static and dynamic modes.
  • One of the methods that can be used for the quantitative determination of properties are nanoindentation experiments, which are characterized by their slowness, high contact area and not controlling the applied force.
  • Static methods are based on the acquisition of force curves simultaneously with the acquisition of the topographic image (force volume). These methods work at low frequencies (1 -2 Hz) which implies that a complete map requires hours of acquisition. In addition, the lateral resolution of these maps is small.
  • the pulsed force method (A. Rosa-Zeiser, E. Weilandt, S. Hild and O. Marti. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation.
  • Measurement Science and Technology 8 (11), 1333 (1997)) oscillates the piezo that moves the sample vertically at frequencies between 100 Hz and 2 kHz, which allows the determination of mechanical properties more quickly, although the maximum force applied is relatively high (of tens of nN).
  • Bimodal force microscopy is a force microscopy method that operates by simultaneously exciting two modes of vibration of the micro lever (or cantilever, as is commonly known in the state of the art) of an atomic force microscope. These modes can be, in order of frequency from least to greatest, the first and the second, the first and the third or, in general, any two. This simultaneous excitation allows duplication of information channels.
  • Figure 1 shows the theoretical form of the first two flexural modes (1 and 2) of vibration of a rectangular micro lever that oscillates in air.
  • the frequency of the second mode is approximately 6 times higher than that of the first mode.
  • Figure 2 shows the vertical oscillation of a micro lever when the first two resonance modes are simultaneously excited, the amplitude of the second mode being much smaller than the amplitude of the first mode.
  • Figure 3 describes the operation of a force microscope under the excitation of two vibration modes operating in frequency modulation mode, which consists of the steps of simultaneously simultaneously exciting the fundamental vibration mode and a higher mode of vibration. The microscope's micro lever while the micro lever moves on the surface of the sample, and that establishes a series of conditions for each of the modes.
  • the change in the resonance frequency of the second mode Af 2 is directly related to the vinal of the strength of the first mode (S. Kawai, T. Glatzel, S. Koch, B. Such, A. Baratoff and E. Meyer. Systematic achievement of improved atomic-scale contrast via bimodal dynamic force microscopy. Physical Review Letters 103 (22) (2009)).
  • the vinal of mode n can be approximated by where k n , A ? , f n and Af n are, respectively, the force constant, the amplitude, the resonant frequency in the presence of a force and the displacement of the resonant frequency of mode n. In the case of the excitation to the first two modes, it is obtained
  • the excitation frequency is different from the resonant frequency and the vinal of mode n can be approximated by where f 0 ⁇ n is the resonant frequency of mode n in the absence of interaction forces.
  • the interaction force can be approximated based on several models where mechanical properties of the sample appear: the Hertz model (Intermolecular & Surface Forces, Jacob Israelachvili, 1985, Elsevier Academic Press), that of DMT (Amplitude Modulation AFM in Liquid, R : Garc ⁇ a ;; Wiley- VCH: Weinheim, Germany), Lennard Jones (Intermolecular and Surface Forcé, Israelachvili, JN, Elsevier Academic Press: London, 2005.), etc.
  • d is the instantaneous distance between the tip and the sample microlever and ao is a parameter normally worth intermolecular 0165 nm and the effective Young's modulus E Ef ⁇ is defined as:
  • the present invention relates to a bimodal method for quantifying non-topographic properties in force microscopy based on modulating in frequency and simultaneously at least two modes of vibration of the micro lever.
  • frequency shifts of excited modes and changes in excitation forces are used to quantify nanomechanical properties.
  • the present bimodal method for quantifying non-topographic properties in force microscopy comprises: a) placing on the head of a force microscope a micro lever with a tip at its end, which interacts with the sample, and which has at least two modes of vibration , a main mode and a secondary mode; have two elements, one to vibrate the micro lever and the other to move the micro lever on the sample or part of it; c) send the excitation signals generated by and add, by means of a signal adder, to the excitation unit associated with the microscope head of the microscope head; Calibrate the following parameters associated with the micro lever operation: force constant, k ⁇ ; quality factor, Q ⁇ ; inverse of the optical sensitivity of the photodiode, i, in each of the two modes of vibration; radius, R, of the tip of the micro lever; e) check the starting hypotheses, according to the following steps: e.1) check that the amplitude of vibration of the main mode of the micro lever is greater than the scale length of the interaction force.
  • e.2) check that the amplitude of vibration, of the secondary mode of the micro lever is much lower than the amplitude of vibration, of the main mode; e.3) fixing a plurality of feedback loops comprising: -a feedback loop of the amplitude, Ai, of the main vibration mode, where the amplitude of excitation of the micro lever is varied in said main mode, keeping said said constant amplitude, Ai;
  • phase, ⁇ - ⁇ of the main vibration mode, where the excitation frequency is varied, fi of the micro lever in said main mode, keeping the phase, ⁇ - ⁇ , constant at an equal value to ⁇ / 2;
  • phase, ⁇ 2 of the secondary vibration mode, where the excitation frequency, f 2 , of the micro lever in said secondary mode is varied, keeping the phase, ⁇ 2 , constant at an equal value to ⁇ / 2; -a feedback loop responsible for regulating the average distance between the tip of the micro lever and the sample and thus controlling topographic feedback.
  • f detect, by means of a system adapted to the effect, the deflection signal of the micro lever;
  • the tip system - microlever is placed on a heterogeneous sample for measuring various mechanical properties such as Young's Modulus effective, E and n, the viscosity, ⁇ , of the sample , or Hamaker's constant, H, from the inferred.
  • step (c) of the method in which the excitation signals are generated the micro lever is excited according to the aforementioned main mode and secondary mode of vibration.
  • the resulting signal that reaches the micro lever is expressed according to the following mathematical relationship: where F 0 ⁇ , f ⁇ are, respectively, the excitation signal, and the excitation frequency of the mode i that are transferred to the element that excites the vibration of the micro lever.
  • said signal is generated using the reference signal of a digital lock-in device comprised within a digital signal processor.
  • step (h) of the method in which the data shown in the parametric maps of sample properties are transformed the changes in the resonance frequencies of the main mode, ⁇ - ⁇ , and in the secondary mode, ⁇ 2 , to find the effective Young's Modulus, Eeff, of the sample and the indentation, ⁇ , depending on the position of the micro lever on the sample.
  • the data of change in the resonance frequency of the main mode, Afi, and change in the resonance frequency of the secondary mode, Af 2 are converted , by means of an analytical calculation, and simultaneously or after the acquisition of an image, in parametric maps that express the effective Young's Module, Eeff, and the indentation, ⁇ .
  • the interaction force is typically modeled according to the Hertz model and the effective Young's Module, E e ff, and the indentation, ⁇ , are calculated using the following system of equations:
  • step (h) of the method in which the data shown in the parametric maps of sample properties are transformed typically the changes in the resonance frequencies of the main mode, and the secondary mode, and the change in the excitation signal of the main mode to find the viscosity, ⁇ , the effective Young's Modulus, E e ff, of the sample, and the indentation, ⁇ , depending on the position of the micro lever on the sample.
  • a dissipative component that can be modeled as proportional to the rate of indentation is added to the Hertz conservative force model, in such a way that the total force of interaction is expressed by the following mathematical relationship: where ⁇ is an even function called generalized friction function, and is the rate of indentation in the sample.
  • function B is defined by the following mathematical expression: giving rise to an additional equation that allows the conversion of the images of ⁇ - ⁇ , ⁇ 2 and F 0 i into parametric maps of the Young effective module, Eeff, of the viscosity, ⁇ , and of the indentation, ⁇ , and making than the following system of three equations: f i E eff )
  • the microscope's micro lever operates in an attractive or non-contact regime, and the interaction force between the tip and the sample is modeled according to the following model Mathematician, known as Van der Waals model: where d is the distance between the tip and the sample.
  • the average distance between the tip and the sample is controlled, optionally, by maintaining a change in the frequency, ⁇ - ⁇ , fixed while the micro lever moves along the length and width of the sample.
  • the average distance between the tip and the sample can also be controlled by maintaining a fixed excitation force, F 0 i.
  • the fifth loop topographic feedback system is established in other parameters such as contact time, t c , or maximum force, F max , in pre-established values alternative to the change in resonance frequency, ⁇ - ⁇ , or dissipation, AF 0 i.
  • the contact time feedback, t c can be used to perform non-invasive measurements on soft materials.
  • the interaction forces between the tip and the sample are modeled by two parameters in addition to the separation between the tip and the sample, so that a new equation is obtained by exciting an additional mode of vibration, n, and registering as an additional channel, ⁇ ⁇ , to have three conservative observables, these being the frequency changes of each vibration mode, so that a system of three equations with three unknowns is obtained from which to extract the properties of the sample.
  • the parameters directly measured by the bimodal force microscope are understood as observable.
  • the interaction forces between the tip and the sample are modeled by two parameters in addition to the separation between the tip and the sample, so that the additional equation is registering the amplitude B m of a higher harmonic, m, in the way principal frequently m f -i, to have three observables that give rise to a system of three equations with three unknowns from which to extract the properties of the sample, where by a higher harmonic, B m , the integer mode means an integer multiple of the resonance frequency of said main mode, and where the three observables mentioned are: change of frequency of the main mode and the secondary mode, ⁇ - ⁇ , ⁇ 2 , and amplitude, B m , of the upper harmonic, m, AB 2 (d) I_ F (d) -
  • the interaction force model contains a dissipative component dependent on two parameters and the dissipation channel of the secondary vibration mode is further recorded to use the equation that relates the energy dissipated by The secondary mode with the semi-integral function ⁇ (d):
  • the measurement is performed by having the sample immersed in liquid.
  • Figure 1 Schematically shows the first two flexural modes of vibration (V1 and V2) according to which the micro-levers oscillate in the air standardized rectangular microscopes of forces in the state of the art.
  • Figure 2 Schematically shows the excitation and oscillation of a micro lever of a force microscope, when it is simultaneously excited according to its first two modes of vibration, and where the amplitude of vibration of the second mode is much smaller than the amplitude of vibration of the first mode.
  • Figure 3 Shows a scheme of the operation of a force microscope under the excitation of two vibration modes operating in frequency modulation mode.
  • Figure 4 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 5 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 6 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 7 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 8 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 9 Shows a comparative graph of the curves corresponding to the sem ⁇ -integral of the point-sample interaction force, in a numerically determined case b (17), and in another case obtained from the proposed method using the data in ⁇ (18).
  • Figure 10 Shows a comparative graph, of the curves corresponding to the semi-derivative of the point-sample interaction force, in a case determined numerically from the reconstructed force (19), and in another case obtained from the method proposed using the data in ⁇ 2 (20).
  • Figure 1 1 Shows four graphs that represent the results of the present method, determining: the effective Young's Modulus, E and ff (a), the indentation, ⁇ (b), the maximum force (c) and the contact time, t c (d).
  • Figure 12 It shows six graphs that represent the results of the present method, applied to the analysis of a sample of PLGA (co-glycolic polylactic acid, for its acronym in English), determining simultaneously: the topography (a), the maps of the Young's effective modulus, E e ff (b), viscosity, ⁇ (c), indentation, ⁇ (d), maximum force (e) and contact time, t c (f).
  • Figure 13 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 14 Shows a scheme of the method object of the present invention, according to an embodiment.
  • Figure 15 It shows three images, obtained during the microscopy analysis of forces of a sample of gold nano-particles of 5 nm on a silicon base, images corresponding to: a topographic map of the sample (a); a parametric map of the effective Young's Module, E e ff (b), and; a graph that represents Young's Module versus position (c).
  • the present invention relates to a method, hereinafter method of the invention, for using a force microscope (1) by frequency modulation (some of whose elements are illustrated schematically in Figure 3), simultaneously exciting two vibration modes of the micro lever (2) or "cantilever" of an atomic force (1) microscope (AFM), which comprises the following steps: a) placement of a micro lever (2) with a tip (3) at its end that interacts with the sample (4) that has several vibration modes; in this sense, figure 1 refers to a mode main, 1, and a secondary mode, 2, of micro-lever vibration
  • This method allows to calculate various quantitative properties of materials without making hypotheses about the indentation of the tip of the micro lever in the sample.
  • the micro lever can be excited in two vibration modes, but preferably it is excited according to the main and secondary vibration modes.
  • the tip system (3) - micro lever (2) is placed on a heterogeneous sample (4) that can have variable mechanical properties such as the effective Young's Modulus, E and ff, and the viscosity of the sample, ⁇ , or Hamaker's constant, H, from the inferred.
  • step (c) of the method the signal is generated using the reference signal of a digital lock-in that is within a digital signal processor.
  • step (d) of the method the radius, R, of the tip (3) is calibrated using a sample (4) of nanoparticles of known radius, where from the apparent measurement given by the microscope and, known the radius the radius, R, of the tip (3) is obtained from the nanoparticles.
  • the radius of the tip can also be obtained from other methods, such as Sergio Santos's method (Sergio Santos, Guang, Tewfik Souier, Karim Gadelrab, Matteo Chiesa, and Neil H. Thomson “A method to provide rapid in situ determination of tip radius in dynamic atomic forced microscopy "Review Science Instruments, 83, 043707 (2012)).
  • the method of the invention allows measuring certain properties that will depend on the interaction force model (Young's modulus, E, viscosity, ⁇ , indentation, ⁇ , maximum conservative force, F max , contact time, t c ) and, at the same time, determine if you work in the range of application of the model used. For this, at least two observables (quantities directly measured by the microscope) are recorded simultaneously and independently in real time. Numerical values are obtained through analytical formulas. All this maximizes the operating speed of the microscope (1) and avoids the convergence problems that iterative methods show.
  • the interaction force model Young's modulus, E, viscosity, ⁇ , indentation, ⁇ , maximum conservative force, F max , contact time, t c
  • the method of the invention makes use of at least two equations that analytically relate the physical and observable parameters.
  • the above equations will allow the determination of the effective Young's Module, Eeff, viscosity, ⁇ , and indentation, ⁇ , using dynamic modes of the force microscope. This allows the characterization of the surface properties of a sample (4), in a reproducible way and with a high lateral resolution in real time applying the formulas since they are analytical and they have no convergence problems that other iterative numerical methods have.
  • step (h) of the method changes in the resonance frequencies of the main mode and the secondary mode, ⁇ - ⁇ , ⁇ 2 are used , to determine the effective Young's Module, E and ff, of the sample (4) and the indentation, ⁇ , depending on the position of the micro lever (2).
  • the Hertz model is used, which makes it possible to convert the Afi and Af 2 data into maps of the effective Young Module, E and ff, and of the indentation, ⁇ , simultaneously and / or after the acquisition of the topographic image).
  • the method of the invention also has the advantage that a change in the working point, understood as the change in frequency that remains fixed when topographic feedback is maintained, produces changes in the indentation maps, the maximum force and the contact time, however, does not cause changes in the effective Young's Modulus, E e ff, viscosity, ⁇ , or in the topography measured in the sample (4).
  • the method provides the values of Young's Modulus, the indentation, ⁇ , the contact time, t c , and the maximum conservative force, F max , in function of the position of the micro lever (2).
  • step (h) another interaction force model is used, where the change in dissipation of the main mode, related to non-conservative forces, allows to determine the viscosity, ⁇ , of the sample (4).
  • a dissipative component that can be modeled as an even function (generalized friction function ⁇ ) multiplied by the rate of indentation is added to the Hertz interaction force model, so that the dissipative force, ⁇ ⁇ 5, is An odd function and total strength is:
  • the sem-derivative of the function B can be calculated analytically, giving rise to an additional equation that allows the conversion of the images of Afi, I2, and F01 into maps of the effective Young Module, E eff , the viscosity, ⁇ , and indentation, ⁇ .
  • E eff the effective Young Module
  • ⁇ the viscosity
  • ⁇ the viscosity
  • ⁇ the viscosity
  • ⁇ the viscosity
  • Figure 7 shows an embodiment of the invention to simultaneously obtain Young's Modulus, viscosity, indentation, contact time and maximum conservative force as a function of the position of the micro lever (2) on the sample (4). In a more preferred embodiment of the invention it is applied to the determination of Young's Modulus and viscosity in polymers and biological molecules.
  • Another preferred embodiment of the method of the invention takes place when the micro lever (2) operates in the attractive regime (no contact).
  • the interaction force can be modeled according to the Van der Waals model
  • Knowing the Hamaker constant is important to extract information from the inferred tip (3) - sample (4). It can be used to calculate adhesion forces and surface energies.
  • the relationship between the minimum distance and the frequency change of the first mode, the excitation force or the contact time (as can be seen although it is not limited to the case of formulas E.10 or E.1 1) can be used to set the feedback that controls the topography.
  • the determination of the semi-derivative and the semi-integral of the interaction force allows the determination of two parameters that control the destructive nature of the measurement, the maximum force and the contact time.
  • An application of the present invention is precisely the use of contact time feedback for non-invasive protein measurements.
  • the method is implemented to find properties of materials in which the interaction forces depend on two parameters that characterize the type of interaction in addition to the separation between the tip (3) and the sample ( 4) (as is the case with Lennard-Jones forces, DMT model forces). In this case an additional equation is necessary to calculate the rest of the parameters.
  • the additional equation is obtained by simultaneously exciting an additional mode of vibration n (and registering as additional channel ⁇ ⁇ ). In this way, there would be three conservative observables (change of frequency of the first, second and third mode) that give rise to a system of three equations with three unknowns from which the properties of the sample are extracted (4).
  • the additional equation is found by recording the amplitude B m of a higher harmonic, m, of the main mode with frequency mf-i, to have three observables that give rise to a system of three equations with three unknowns from which to extract the properties of the sample (4), where by a higher harmonic, B m , the main mode means an integer multiple of the resonant frequency of said main mode, and where the three observables mentioned are: frequency change of the main mode and the secondary mode, ⁇ - ⁇ , ⁇ 2 , and amplitude, B m , of the upper harmonic m.
  • the method is implemented to find dissipative force properties that depend on two parameters or to calculate the radius, R, of the tip (3) simultaneously with the viscosity calculation.
  • R radius
  • the method is implemented to find dissipative force properties that depend on two parameters or to calculate the radius, R, of the tip (3) simultaneously with the viscosity calculation.
  • the equation that exists for the energy dissipated by the main mode of vibration there is also an additional equation for energy dissipated by the upper mode of vibration in terms of the semi-integral function (d):
  • the method could be implemented in liquid, the operation is equivalent to that of the air, even better because the attractive forces are very shielded and normally there is only repulsive regime.
  • a sample (4) of PLGA poly (lactic-co-glycolic acid) is analyzed.
  • the radius, R, of the tip (3) was estimated at the end of the experiment, measuring a sample (4) of gold nanoparticles of known radius, obtaining a radius of 9.5 nm.
  • R radius of the tip (3)
  • the amplitude of the main mode is greater than the typical length of the force, and that the amplitude of the secondary mode is much smaller than that of the main mode, for which there is the semi-integral and semi-derived force numerically from the reconstructed force is compared with the semi-integral and semi-derivative that are found from the behavior of A, Af 2 with distance.
  • This invention can be applied to heterogeneous samples as seen in Figure 15, where on a sample of 5nm gold nanoparticles on silicon it is observed that the Young's modulus of the nanoparticle is of the order of 100-200 GPa.

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Abstract

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, basado en modular en frecuencia y de forma simultánea al menos dos modos de vibración de la micropalanca de un microscopio, que emplea los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerzas de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas.

Description

DESCRIPCIÓN
MÉTODO BIMODAL PARA CUANTIFICAR PROPIEDADES NO TOPOGRÁFICAS EN MICROSCOPÍA DE FUERZAS
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método de utilización de un microscopio de fuerzas mediante modulación de frecuencia, excitando simultáneamente al menos dos modos de vibración de la micropalanca, siendo uno de ellos el modo principal que permite seguir la topografía y siendo el otro el modo secundario, caracterizado por una frecuencia más elevada que la del modo principal. Se utiliza cálculo fraccional para relacionar parámetros medidos directamente con el microscopio con las propiedades de las muestras. Se emplean los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerzas de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas de una muestra a medir. Este método permite calcular diversas propiedades cuantitativas no topográficas de los materiales, utilizando para ello modos de vibración dinámicos sin hacer hipótesis acerca de la indentación de la punta de la micropalanca en la muestra a analizar. Este método puede aplicarse en tiempo real durante la medición, o posteriormente a la obtención de los parámetros directamente medidos en la muestra.
El presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas encuentra aplicación en el ámbito de la investigación científica, mediante microscopía de fuerzas, de todo tipo de materiales, orgánicos e inorgánicos, estando la muestra inmersa en un medio, líquido, gaseoso, o bien en el vacío. PROBLEMA TÉCNICO A RESOLVER Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La habilidad de la microscopía de fuerzas para la adquisición de imágenes de un amplio rango de materiales la han convertido en una de las técnicas relevantes para la caracterización de propiedades a escala nanométrica. Como consecuencia de su gran resolución (lateral y vertical), los microscopios de fuerza atómica (AFM, por las siglas en inglés de Microscopía de Fuerza Atómica). Se han introducido tanto en laboratorios de investigación como en departamentos de control de calidad en diversos sectores industriales (microelectrónica, polímeros).
Un microscopio de fuerzas puede operar tanto en modos estáticos como dinámicos. Uno de los métodos que pueden ser utilizados para la determinación cuantitativa de propiedades son los experimentos de nanoindentación, que se caracterizan por su lentitud, la elevada área de contacto y no controlar la fuerza aplicada. Los métodos estáticos están basados en la adquisición de curvas de fuerza de forma simultánea con la adquisición de la imagen topográfica (forcé volume). Estos métodos funcionan a frecuencias bajas (1 -2 Hz) lo cual implica que un mapa completo requiera tiempos de adquisición de horas. Además, la resolución lateral de estos mapas es pequeña. El método de la fuerza pulsada (A. Rosa-Zeiser, E. Weilandt, S. Hild y O. Marti. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning forcé microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology 8(11), 1333 (1997)) hace oscilar el piezoeléctrico que mueve la muestra en sentido vertical a frecuencias de entre 100 Hz y 2 kHz, lo que permite la determinación de propiedades mecánicas de forma más rápida, aunque la fuerza máxima aplicada es relativamente elevada (de decenas de nN).
La reciente invención descrita en el documento de patente US 20120131702 A1 , introduce mejoras en la electrónica que han permitido el desarrollo del método 'peak forcé tapping' capaz de extraer propiedades de forma robusta con indentaciones de al menos 2 nm y es capaz de establecer la máxima fuerza de interacción punta - muestra en el rango pN-nN. Es de notar que aunque el método ha sido verificado sobre multitud de materiales en aire y líquidos, no existen resultados significativos en cuanto a la cuantificación sobre imágenes con alta resolución lateral de nanopartículas o proteínas individuales. Los modos dinámicos tienen la ventaja de ser generalmente no invasivos y de incrementar la velocidad de adquisición, de tal forma que la información cuantitativa sea simultánea con la imagen de topografía. Además, y más importante, el hecho de operar a frecuencias cercanas de la de resonancia aumenta la sensibilidad del microscopio. Muchos observables, (término que se refiere a magnitudes directamente medidas en el microscopio) como la fase, los cambios de frecuencia o la amplitud de armónicos supenores, pueden ser relacionados con información composicional de la muestra. Sin embargo, la cuantificación de estas propiedades no es inmediata.
Se puede distinguir entre métodos basados en la obtención de la fuerza de interacción punta - muestra a partir de la deflexión, y métodos paramétricos. En los documentos de patente US 746583 B1 y US 7404314 B2, así como en el artículo: M. Stark, C. Móller, D. J. Müllery R. Guckenberger. From images to interactions: High-resolution phase imaging in tapping-mode atomic forcé microscopy. Biophysical Journal 80, 3009-3018 (2001), se introducen métodos que reconstruyen el comportamiento de la fuerza de interacción punta - muestra frente al tiempo, para cada píxel de la imagen obtenida mediante microscopía, métodos que permiten obtener el Módulo de Young efectivo, Eeff, y otras propiedades de la muestra a la vez que permiten observar si existen fuerzas que no han sido consideradas en el modelo que incrementan el error en la cuantificación. En particular, el método de Sahin (como en la patente US 7404314 B2) permite estimar el Módulo de Young efectivo, Eeff, tras una estimación de la indentación basada en la máxima resolución lateral obtenida en la imagen. Entre los métodos paramétricos destaca el trabajo de Raman (A. Raman, S. Trigueros, A. Cartagena, A. P. Z. Stevenson, M. Susilo, E. Nauman adn S. Antoranz Contera, Mapping nanomechanical properties of Uve cells using multi-harmonic atomic forcé microscopy , Nature Nanotechnology 6, 809-814 (2011)) que describe la relación entre el Módulo de Young y distintos componentes harmónicos de la oscilación.
Es de notar que para aumentar la precisión en la medida de propiedades mediante modos dinámicos se debe minimizar el número de hipótesis empleadas. La mayoría de los métodos anteriores efectúan ciertas hipótesis sobre la indentación, como suponer que el radio de contacto es equivalente a la resolución lateral obtenida en la imagen. El radio de contacto real se relaciona con la indentación y el radio de la punta a través de la fórmula re = V indentación^ Rpunta En general, un cambio en una propiedad física se manifiesta en un cambio en los observables y en un cambio en la distancia entre la punta y la muestra (debido a la realimentación topográfica). De esta forma, si se aumenta el número de ecuaciones que relacionan la fuerza y los observables, también se podrá determinar más propiedades de la muestra como la indentación de la punta de la micropalanca en la muestra.
La presente invención se basa en modos multifrecuencia de microscopía de fuerzas. Documentos pioneros a la presente invención pueden verse en los documentos de patente US 7958563 B2 y US 7921466 B2. La microscopía de fuerzas bimodal es un método de microscopía de fuerza que opera excitando simultáneamente dos modos de vibración de la micropalanca (o cantiléver, como es conocida comúnmente en el estado de la técnica) de un microscopio de fuerza atómica. Estos modos pueden ser, por orden de frecuencia de menor a mayor, el primero y el segundo, el primero y el tercero o, en general, dos cualesquiera. Esta excitación simultánea permite la duplicación de canales de información.
La Figura 1 muestra la forma teórica de los dos primeros modos flexurales (1 y 2) de vibración de una micropalanca rectangular que oscila en aire. La frecuencia del segundo modo es aproximadamente 6 veces mayor que la del primer modo. La Figura 2 muestra la oscilación vertical de una micropalanca cuando se excitan simultáneamente los dos primeros modos de resonancia, siendo la amplitud del segundo modo mucho menor que la amplitud del primer modo. La Figura 3 describe el funcionamiento de un microscopio de fuerzas bajo la excitación de dos modos de vibración operando en modo de modulación en frecuencia, que consta de los pasos de excitar de forma simultánea al menos el modo fundamental de vibración y un modo más alto de la micropalanca del microscopio mientras la micropalanca se desplaza sobre la superficie de la muestra, y que establece una serie de condiciones para cada uno de los modos. En las condiciones de funcionamiento del microscopio bimodal se satisfacen ciertas condiciones en el vinal de la fuerza de interacción ( ½s) y en la energía disipada (J. R. Lozano y R. García. Theory of multifrequency atomic forcé microscopy. Physical Review Letters 100(7), 0761024 (2008)., J. R. Lozano y R. García. Theory of phase spectroscopy in bimodal atomic forcé microscopy. Physical Review B 79, 0141104 (2009)).
Además, si la amplitud de vibración del segundo modo A2 es mucho menor que la amplitud de vibración del primer modo Ai (A2 « Ai) el cambio en la frecuencia de resonancia del segundo modo Af2 está relacionado directamente con el vinal de la fuerza del primer modo (S. Kawai, T. Glatzel, S. Koch, B. Such, A. Baratoff y E. Meyer. Systematic achievement of improved atomic-scale contrast via bimodal dynamic forcé microscopy. Physical Review Letters 103(22) (2009)).
Cuando la amplitud de vibración del primer modo Ai es mayor que la longitud típica de la fuerza, los cambios en la frecuencia de resonancia del primer y del segundo modo se relacionan directamente con la sem ¡-integral y sem ¡-derivada de la fuerza a través de cálculo fraccional (E T. Herruzo and R García, Theoretical study of the frequency shift in bimodal FM-AFM by fractional calculus, Beilstein J. of Nanotechnol. 3, 198-206 (2012)).
Cuando la semi-integral (l!/2F(d) y la semi-dehvada (Z)l/2F(d) de la fuerza de interacción pueden calcularse analíticamente se obtiene un sistema de dos ecuaciones del que se pueden extraer los valores de Módulo de Young efectivo, Eeff, y la indentación, δ, a través de las imágenes en tiempo real de Afi and Af2. Las definiciones de la semi-derivada y semi-integral corresponden a las formas de la derivada e integral fraccional de Liouville (desde un valor dado de la variable hasta infinito). (Fractional Calculus: An Introduction for Physicists, R. Herrmann, World Scientific Publishing, 2011).
Cuando la frecuencia de excitación es muy próxima a la frecuencia de resonancia (operación en ultra-alto vacío o aire), el vinal del modo n puede aproximarse por
Figure imgf000008_0001
donde kn, A?, fn y Afn son, respectivamente, la constante de fuerza, la amplitud, la frecuencia de resonancia en presencia de una fuerza y el desplazamiento de la frecuencia de resonancia del modo n. Para el caso de la excitación a los dos primeros modos se obtiene
Figure imgf000008_0002
De manera similar, operando en medio líquido, la frecuencia de excitación es diferente de la frecuencia de resonancia y el vinal del modo n puede aproximarse por
Figure imgf000008_0003
donde f0¡n es la frecuencia de resonancia del modo n en ausencia de fuerzas de interacción. La fuerza de interacción puede aproximarse en base a varios modelos donde aparecen propiedades mecánicas de la muestra: el modelo de Hertz (Intermolecular & Surface Forces, Jacob Israelachvili, 1985, Elsevier Academic Press), el de DMT (Amplitude Modulation AFM in Liquid, R: García,; Wiley- VCH: Weinheim, Germany), el de Lennard Jones (Intermolecular and Surface Forcé, Israelachvili, J. N., Elsevier Academic Press: London, 2005.), etc.
Por ejemplo, en el modelo de Hertz la fuerza conservativa de interacción viene dada por:
FHertÁd) =
Figure imgf000009_0001
donde d es la distancia instantánea entre la punta de la micropalanca y la muestra y ao es un parámetro intermolecular que normalmente vale 0.165 nm y el módulo de Young efectivo Eefí se define como:
Figure imgf000009_0002
siendo Ei y E2 los módulos de Young y vi y v2 los coeficientes de Poisson de la punta de la micropalanca y de la muestra respectivamente.
En el actual estado de la técnica, hasta ahora no se han podido obtener para diferentes modelos de fuerza de interacción, relaciones analíticas entre los observables producidos en este tipo de microscopía en tiempo real, y las propiedades mecánicas de la muestra. Todo ello maximizaría la velocidad de funcionamiento del microscopio y evitaría los problemas de convergencia que muestran los métodos iterativos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas basado en modular en frecuencia y de forma simultánea al menos dos modos de vibración de la micropalanca.
Según el método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, objeto de la presente invención, se emplean los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerzas de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas.
El presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas comprende: a) colocar en la cabeza de un microscopio de fuerzas una micropalanca con una punta en su extremo, que interactúa con la muestra, y que presenta al menos dos modos de vibración, un modo principal y un modo secundario; disponer de dos elementos, uno para hacer vibrar a la micropalanca y el otro para desplazar a la micropalanca sobre la muestra o parte de ella; c) enviar a la unidad de excitación asociada a la micropalanca de la cabeza del microscopio, las señales de excitación generadas por y sumar, mediante un sumador de señales, las mencionadas señales de excitación que hacen vibrar a la micropalanca; calibrar los siguientes parámetros asociados a la operación de micropalanca: constante de fuerzas, k¡; factor de calidad, Q¡; inversa de la sensibilidad óptica del fotodiodo, i, en cada uno de los dos modos de vibración; radio, R, de la punta de la micropalanca; e) comprobar las hipótesis de partida, según las siguientes etapas: e.1 ) comprobar que la amplitud de vibración del modo principal de la micropalanca es mayor que la longitud de escala de la fuerza de interacción. e.2) comprobar que la amplitud de vibración, del modo secundario de la micropalanca es muy inferior a la amplitud de vibración, del modo principal; e.3) fijar una pluralidad de bucles de realimentación que comprenden: -un bucle de realimentación de la amplitud, A-i, del modo principal de vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la micropalanca en dicho modo principal, manteniendo constante dicha amplitud, A-i;
-un bucle de realimentación de la amplitud, A2, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la micropalanca en dicho modo secundario, manteniendo constante dicha amplitud, A2;
-un bucle de realimentación, de fase, φ-ι, del modo principal de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, fi de la micropalanca en dicho modo principal, manteniendo constante la fase, φ-ι, en un valor igual a ττ/2;
-un bucle de realimentación, de fase, φ2, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, f2, de la micropalanca en dicho modo secundario, manteniendo constante la fase, φ2, en un valor igual a ττ/2; -un bucle de realimentación responsable de regular la distancia media entre la punta de la micropalanca y la muestra y controlar así la realimentación topográfica. f) detectar, mediante un sistema adaptado al efecto, la señal de deflexión de la micropalanca;
g) registrar, mediante una unidad de procesamiento provista de al menos dos canales de transferencia de información, las señales correspondientes a los modos de vibración, donde dicho registro puede realizarse simultáneamente o posteriormente a la adquisición de una imagen de microscopía;
h) transformar, mediante el empleo de fórmulas analíticas, los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra.
Según el método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas objeto de la presente invención, el sistema punta - micropalanca se sitúa sobre una muestra heterogénea para medir diversas propiedades mecánicas como el Módulo de Young efectivo, Een, la viscosidad, η, de la muestra, o la constante de Hamaker, H, de la inferíase.
Según el presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, en la etapa (c) del método en que se generan las señales de excitación, la micropalanca es excitada según los mencionados modo principal y modo secundario de vibración.
Según una realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, la señal resultante que llega a la micropalanca viene expresada según la siguiente relación matemática:
Figure imgf000012_0001
donde F0¡, f¡ son, respectivamente, la señal de excitación, y la frecuencia de excitación del modo i que son transferidas al elemento que excita la vibración de la micropalanca.
En una forma de realización, dicha señal se genera utilizando la señal de referencia de un dispositivo lock-in digital comprendido dentro de un procesador digital de señal.
Según una posible forma de realización, en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra, se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, Δί-ι, y del modo secundario, Δί2, para hallar el Módulo de Young efectivo, Eeff, de la muestra y la indentación, δ, en función de la posición de la micropalanca sobre la muestra.
Asimismo, típicamente, en el presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, los datos de cambio en la frecuencia de resonancia del modo principal, Afi, y cambio en la frecuencia de resonancia del modo secundario, Af2, se convierten, mediante un cálculo analítico, y simultáneamente o postenormente a la adquisición de una imagen, en mapas paramétricos que expresan el Módulo de Young efectivo, Eeff, y la indentación, δ. En el presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas, la fuerza de interacción se modela típicamente de acuerdo al modelo de Hertz y el Módulo de Young efectivo, Eeff, y la indentación, δ, se calculan mediante el siguiente sistema de ecuaciones:
Figure imgf000013_0001
(E.9) El tiempo de contacto, tc, entre la punta y la muestra se calcula, en una determinada realización del método objeto de la presente invención, mediante la siguiente expresión matemática: t„ = arceos 1
Figure imgf000014_0001
l *2/i 4 _ J (E.10) En una forma de realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, cuando la punta se encuentra a una distancia mínima de la muestra, se calcula la fuerza máxima conservativa de Hertz, Fmax, según la siguiente expresión matemática:
Figure imgf000014_0002
Adicionalmente, en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra, típicamente se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, y del modo secundario, y el cambio en la señal de excitación del modo principal para hallar la viscosidad, η, el Módulo de Young efectivo, Eeff, de la muestra, y la indentación, δ, en función de la posición de la micropalanca sobre la muestra.
Adicionalmente, en una forma de realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, objeto de la presente invención, se añade al modelo de la fuerza conservativa de Hertz una componente disipativa que puede modelarse como proporcional a la velocidad de indentación, de tal forma que la fuerza total de interacción se expresa mediante la siguiente relación matemática:
Figure imgf000014_0003
donde ΔΓ es una función par denominada función de rozamiento generalizado, y ¿ es la velocidad de indentación en la muestra.
La inclusión de la mencionada componente disipativa de la fuerza da lugar a una ecuación adicional para la energía disipada en términos de la semi-integral de una función, B(d), relacionada con la fuerza disipativa:
Figure imgf000015_0001
(E.13) donde la función B se define mediante la siguiente expresión matemática:
Figure imgf000015_0002
dando lugar a una ecuación adicional que permite la conversión de las imágenes de Δί-ι , Δί2 y F0i en mapas paramétricos del módulo de Young efectivo, Eeff, de la viscosidad, η, y de la indentación, δ, y haciendo que el siguiente sistema de tres ecuaciones: fi Eeff
Figure imgf000015_0003
)
Figure imgf000015_0004
(E.17) con tres incógnitas, Eeff, δ, η, se pueda expresar explícitamente, proporcionando además de las ecuaciones para el Módulo de Young efectivo, Eeff, y para la indentación, δ, una ecuación para la viscosidad, η, expresada de la siguiente manera:
„
Figure imgf000016_0001
Según una forma de realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, la micropalanca del microscopio opera en régimen atractivo o de no contacto, y la fuerza de interacción entre la punta y la muestra se modela de acuerdo al siguiente modelo matemático, conocido como modelo de Van der Waals:
Figure imgf000016_0002
donde d es la distancia entre la punta y la muestra.
Se calculan analíticamente la semi-derivada y la semi-integral de la fuerza de interacción del modelo de van der Waals, dando lugar a un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, que se puede expresar explícitamente, proporcionando relaciones para la constante de Hamaker, H, y la distancia mínima, dmin, entre punta y muestra:
Figure imgf000016_0003
La distancia media entre la punta y la muestra se controla, opcionalmente, manteniendo un cambio en la frecuencia, Δί-ι, fijo mientras la micropalanca se desplaza a lo largo y ancho de la muestra. La distancia media entre la punta y la muestra también puede controlarse manteniendo una fuerza de excitación, F0i, fija.
Según una realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, en la etapa e3) se establece el sistema de realimentación topográfico del quinto bucle en otros parámetros como el tiempo de contacto, tc, o la fuerza máxima, Fmax, en valores pre-establecidos alternativos al cambio de frecuencia de resonancia, Δί-ι, o disipación, AF0i.
La realimentación en tiempo de contacto, tc, se puede utilizar para efectuar medidas no invasivas en materiales blandos. Opcionalmente, las fuerzas de interacción entre la punta y la muestra se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que se añade una nueva ecuación que se obtiene al excitar un modo adicional de vibración, n, y registrando como canal adicional, Δίη, para tener tres observables conservativos, siendo éstos los cambios de frecuencia de cada modo de vibración, de manera que se obtiene un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra.
Se entiende por observables los parámetros medidos directamente por el microscopio de fuerzas bimodal. Alternativamente, las fuerzas de interacción entre la punta y la muestra se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que la ecuación adicional se halla registrando la amplitud Bm de un armónico superior, m, del modo principal con frecuencia mf-i, para tener tres observables que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra, donde por un armónico superior, Bm, del modo principal se entiende un múltiplo entero de la frecuencia de resonancia de dicho modo principal, y donde los tres observables mencionados son: cambio de frecuencia del modo principal y del modo secundario, Δί-ι, Δί2, y amplitud, Bm, del armónico superior, m, AB2(d) I_ F(d) -
3k y¡2nAl
(E.22) donde i3l2F(d) es la integral 3/2 de la fuerza de interacción y B2 es la amplitud del segundo armónico. En una realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas, el modelo de fuerza de interacción contiene una componente disipativa dependiente de dos parámetros y se registra de forma adicional el canal disipación del modo secundario de vibración para utilizar la ecuación que relaciona la energía disipada por el modo secundario con la semi-integral de la función Γ (d):
Figure imgf000018_0001
(E.23) dando lugar a una ecuación adicional que permite la transformación de las imágenes de Δί-ι , Δί2, F0i y F02 en observables que aparecen en un sistema de cuatro ecuaciones para hallar simultáneamente la viscosidad, η, y la histéresis de la energía superficial, AEaCih-
Según una forma de realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, objeto de la presente invención, la medida se realiza teniendo la muestra inmersa en líquido.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se entenderá mejor a la vista de las siguientes figuras que muestran diversas formas de realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas.
Figura 1 : Muestra de forma esquemática los dos primeros modos flexurales de vibración (V1 y V2) según los cuales oscilan en el aire las micropalancas rectangulares normalizadas de los microscopios de fuerzas en el estado de la técnica.
Figura 2: Muestra esquemáticamente la excitación y la oscilación de una micropalanca de un microscopio de fuerzas, cuando ésta es excitada simultáneamente según sus dos primeros modos de vibración, y donde la amplitud de vibración del segundo modo es mucho menor que la amplitud de vibración del primer modo.
Figura 3: Muestra un esquema del funcionamiento de un microscopio de fuerzas bajo la excitación de dos modos de vibración operando en modo de modulación de frecuencia.
Figura 4: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.
Figura 5: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización. Figura 6: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.
Figura 7: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.
Figura 8: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.
Figura 9: Muestra una gráfica comparativa, de las curvas correspondientes a la sem ¡-integral de la fuerza de interacción punta-muestra, en un caso determinada numéricamente b (17), y en otro caso obtenida a partir del método propuesto empleando los datos en Δίι(18). Figura 10: Muestra una gráfica comparativa, de las curvas correspondientes a la semi-derivada de la fuerza de interacción punta-muestra, en un caso determinada numéricamente a partir de la fuerza reconstruida (19), y en otro caso obtenida a partir del método propuesto empleando los datos en Δί2 (20). Figura 1 1 : Muestra cuatro gráficas que representan los resultados del presente método, determinándose: el Módulo de Young efectivo, Eeff (a), la indentación, δ (b), la fuerza máxima (c) y el tiempo de contacto, tc (d).
Figura 12: Muestra seis gráficas que representan los resultados del presente método, aplicado al análisis de una muestra de PLGA (ácido poli-láctico co- glicólico, por sus siglas en inglés), determinándose simultáneamente: la topografía (a), los mapas del Módulo de Young efectivo, Eeff (b), la viscosidad, η (c), la indentación, δ (d), la fuerza máxima (e) y el tiempo de contacto, tc (f).
Figura 13: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.
Figura 14: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.
Figura 15: Muestra tres imágenes, obtenidas durante el análisis de microscopía de fuerzas de una muestra de nano-partículas de oro de 5 nm sobre una base de silicio, imágenes correspondientes a: un mapa topográfico de la muestra (a); un mapa paramétrico del Módulo de Young efectivo, Eeff (b), y; una gráfica que representa el Módulo de Young frente a la posición (c).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE UNA FORMA DE REALIZACION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un método, en adelante método de la invención, para usar un microscopio (1 ) de fuerzas mediante modulación en frecuencia (algunos de cuyos elementos se ¡lustran a nivel esquemático en la figura 3), excitando simultáneamente dos modos de vibración de la micropalanca (2) o "cantiléver" de un microscopio de fuerza (1 ) atómica (AFM, por sus siglas en inglés), que comprende las siguientes etapas: a) colocación de una micropalanca (2) con una punta (3) en su extremo que interactúa con la muestra (4) que presenta varios modos de vibración; en este sentido, la figura 1 hace referencia a un modo principal, 1 , y a un modo secundario, 2, de vibración de la micropalanca
(2); b) disponer de dos elementos, uno para hacer vibrar (5) a la micropalanca (2) y el otro para desplazar (13) a la micropalanca (2) sobre la muestra (4) o parte de ella; c) generación de las señales de excitación (7, 8, 9, 10) y un sumador (6) de manera que la señal resultante que excita a la micropalanca (2) es:
FexM = F, + F2 = GlZl(t " + G2z2(t - /2) donde F0 G¡ y f¡ son, respectivamente, la fuerza de excitación, la ganancia y la frecuencia de excitación del modo / que son transferidas al elemento que excita la vibración de la micropalanca (5);
d) calibración de la constante de fuerzas k¡, del factor de calidad Q¡, de la inversa de la sensibilidad óptica del fotodiodo de cada uno de los modos /', y del radio, R, de la punta (3). e) comprobación de las hipótesis de partida que incluye las siguientes subetapas: o comprobación de que la amplitud de vibración del modo principal de la micropalanca (2), sea mayor que la longitud de escala de la fuerza de interacción, esto es, la longitud típica a la que una fuerza puede ser despreciada; o comprobación de que la amplitud de vibración del modo secundario de la micropalanca (2) es mucho menor que la amplitud de vibración del modo principal; o fijación de cinco bucles de realimentación (figura 3) incluyendo: cuatro bucles de realimentación sobre las amplitudes y fases de ambos modos donde dos bucles de realimentación (7 y 9) mantienen la amplitud del primer modo Ai constante variando la amplitud de excitación del mismo y la fase del primer modo φι igual a ττ/2 variando la frecuencia de excitación respectivamente y los otros dos bucles de realimentación (8, 10) que mantienen la amplitud del segundo modo A2 constante variando la amplitud de excitación del mismo y la fase del segundo modo φ2 igual a TT/2 variando la frecuencia de excitación f2 respectivamente, el quinto bucle de realimentación (1 1 ) es responsable de la regulación de la distancia media entre la punta de la micropalanca (2) y la muestra (4) que genera una imagen topográfica; f) detección de la señal de deflexión (14) de la micropalanca (2); g) registro de un mínimo de dos canales de información, durante o después de la adquisición de la imagen, mediante una unidad de procesamiento (15); h) transformación de la colección de datos elegidos entre en mapas de las propiedades de la muestra (4) mediante la unidad cuantitativa (16) descrita en la figura 4.
Este método permite calcular diversas propiedades cuantitativas de materiales sin hacer hipótesis acerca de la indentación de la punta de la micropalanca en la muestra.
La micropalanca puede ser excitada en dos modos de vibración, pero preferentemente es excitada según los modos principal y secundario de vibración.
En una realización preferente del método de la invención, en la etapa (a) del método, el sistema punta (3) - micropalanca (2) se sitúa sobre una muestra heterogénea (4) que puede presentar propiedades mecánicas variables tales como el Módulo de Young efectivo, Eeff, y la viscosidad de la muestra, η, o la constante de Hamaker, H, de la inferíase.
En la etapa (c) del método, la señal se genera utilizando la señal de referencia de un lock-in digital que hay dentro de un procesador digital de señal. En la etapa (d) del método, el radio, R, de la punta (3) se calibra utilizando una muestra (4) de nanopartículas de radio conocido, donde a partir de la medida aparente que da el microscopio y, conocido el radio de las nanopartículas se obtiene el radio, R, de la punta (3). El radio de la punta se puede obtener también a partir de otros métodos, como puede ser el método de Sergio Santos (Sergio Santos, L¡ Guang, Tewfik Souier, Karim Gadelrab, Matteo Chiesa, and Neil H. Thomson "A method to provide rapid in situ determination of tip radius in dynamic atomic forcé microscopy" Review Science Instruments, 83, 043707 (2012)).
El método de la invención permite medir ciertas propiedades que dependerán del modelo de fuerza de interacción (Módulo de Young, E, viscosidad, η, indentación, δ, fuerza máxima conservativa, Fmax, tiempo de contacto, tc) y, al mismo tiempo, determinar si se trabaja en el rango de aplicación del modelo utilizado. Para ello se graban al menos dos observables (magnitudes directamente medidas por el microscopio) de forma simultánea e independiente en tiempo real. Los valores numéricos se obtienen mediante fórmulas analíticas. Todo ello maximiza la velocidad de funcionamiento del microscopio (1 ) y evita los problemas de convergencia que muestran los métodos iterativos.
El método de la invención hace uso de al menos dos ecuaciones que relacionan analíticamente los parámetros físicos y los observables. Las ecuaciones anteriores permitirán la determinación del Módulo de Young efectivo, Eeff, la viscosidad, η, y la indentación, δ, utilizando modos dinámicos del microscopio de fuerzas. Esto permite la caracterización de las propiedades de la superficie de una muestra (4), de una forma reproducible y con una alta resolución lateral en tiempo real aplicando las fórmulas ya que son analíticas y no tienen problemas de convergencia que tienen otros métodos iterativos numéricos.
En una realización preferente del método de la invención que se ¡lustra en la Figura 4, en la etapa (h) del método, se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal y del modo secundario, Δί-ι , Δί2, para determinar el Módulo de Young efectivo, Eeff, de la muestra (4) y la indentación, δ, en función de la posición de la micropalanca (2). Para el cálculo analítico de la semi-derivada y de la semi-integral para la fuerza de interacción se utiliza el modelo de Hertz, que permite convertir los datos de Afi y Af2 en mapas del Módulo de Young efectivo, Eeff, y de la indentación, δ, de forma simultánea y/o posterior a la adquisición de la imagen topográfica). Finalmente, el sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas se puede despejar explícitamente:
Figure imgf000024_0001
δ =
(E.9) La última ecuación (E.9) representa una ventaja significativa con respecto a otros métodos que precisan realizar hipótesis sobre la indentación de la muestra (4).
El método de la invención presenta también la ventaja de que un cambio en el punto de trabajo, entendido como el cambio de frecuencia que se mantiene fija cuando se mantiene la realimentación topográfica, produce cambios en los mapas de la indentación, la fuerza máxima y el tiempo de contacto, no provoca sin embargo cambios en el Módulo de Young efectivo, Eeff, la viscosidad, η, ni en la topografía medidas en la muestra (4).
En una realización más preferida del método de la invención, partiendo de la indentación, δ, y del Módulo de Young efectivo, Eeff, se halla una expresión para el tiempo de contacto tc (esquema de la figura 5), a partir de los datos de Afi y Af2. tr =
Figure imgf000025_0001
En una realización más preferida (figura 6), partiendo de la indentación, δ, y del Módulo de Young efectivo, Eeff, cuando la punta se encuentra a una distancia mínima de la muestra, se halla una expresión la fuerza máxima conservativa, Fmax, a partir de los datos de A y Af2.
Figure imgf000025_0002
En el esquema del método de la invención que se ¡lustra en la Figura 6, el método proporciona los valores del Módulo de Young, la indentación, δ, el tiempo de contacto, tc, y la fuerza máxima conservativa, Fmax, en función de la posición de la micropalanca (2).
En otra realización preferente del método de la invención en la etapa (h) se utiliza otro modelo de fuerza de interacción, donde el cambio en la disipación del modo principal, relacionado con fuerzas no conservativas, permite determinar la viscosidad, η, de la muestra (4). Para ello se añade al modelo de la fuerza de interacción de Hertz una componente disipativa que puede modelarse como una función par (función de rozamiento generalizado ΔΓ) multiplicada por la velocidad de indentación, de tal forma que la fuerza disipativa, ΔΓ<5 , es una función impar y la fuerza total es:
F (d) = ¥cons + AY¿ = ^E*jR(5 f2 + 1^R5 δ
3 (E.12) donde η es la viscosidad, la inclusión de una fuerza disipativa da lugar a una ecuación adicional para la energía disipada en términos de la semi-integral de una función B(d) relacionada con la fuerza disipativa.
Figure imgf000026_0001
(Ε.13)
Β(χ) = 2 ΑΓ(χ)άχ
(E.14)
La sem ¡-derivada de la función B se puede calcular analíticamente, dando lugar a una ecuación adicional que permite la conversión de las imágenes de Afi , Í2, y F01 en mapas del Módulo de Young efectivo, Eeff, la viscosidad, η, y la indentación, δ. El sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas (Een, δ, η) se puede despejar explícitamente, proporcionando además de las ecuaciones para Eefí y δ una ecuación para la viscosidad:
Figure imgf000026_0002
(E.18) La Figura 7 muestra una realización del invento para obtener de forma simultánea el Módulo de Young, la viscosidad, la indentación, el tiempo de contacto y la fuerza máxima conservativa como función de la posición de la micropalanca (2) sobre la muestra (4). En una realización más preferente de la invención se aplica a la determinación del Módulo de Young y de la viscosidad en polímeros y moléculas biológicas.
Otra realización preferida del método de la invención tiene lugar cuando la micropalanca (2) opera en el régimen atractivo (no contacto). En este caso, la fuerza de interacción se puede modelar de acuerdo al modelo de Van der Waals,
T7 r^ - HR
(E.19) donde "H" es la constante de Hamaker y "d" la distancia mínima entre la punta (3) y la muestra (4). La sem ¡-derivada y la sem ¡-integral de la fuerza de Van der Waals se pueden calcular analíticamente, dando lugar a un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas que se puede despejar explícitamente, proporcionando relaciones para la constante de Hamaker y la distancia mínima entre la punta (3) y la muestra (4). La Figura 8 muestra una realización del invento para obtener de forma simultánea la constante de Hamaker y la distancia mínima sobre la muestra.
Figure imgf000027_0001
k2fAf2
(E.21 )
Conocer la constante de Hamaker es importante para extraer información de la inferíase punta (3) - muestra (4). Puede ser utilizada para calcular fuerzas de adhesión y energías superficiales.
La relación entre la distancia mínima y el cambio de frecuencia del primer modo, la fuerza de excitación o el tiempo de contacto (como puede verse aunque no se limita al caso de las fórmulas E.10 ó E.1 1 ) se puede utilizar para establecer la realimentación que controla la topografía. La determinación de la semi-derivada y la semi-integral de la fuerza de interacción permiten la determinación de dos parámetros que controlan el carácter destructivo de la medida, la fuerza máxima y el tiempo de contacto. Una aplicación del presente invento es precisamente la utilización de la realimentación en tiempo de contacto para efectuar medidas no invasiva de proteínas. En una realización particular del método de la invención, el método se implementa para hallar propiedades de materiales en los que las fuerzas de interacción dependen de dos parámetros que caracterizan el tipo de interacción además de la separación entre la punta (3) y la muestra (4) (como es el caso de las fuerzas de Lennard-Jones, fuerzas del modelo DMT). En este caso es necesaria una ecuación adicional para calcular el resto de parámetros.
En una realización más particular del método, la ecuación adicional se obtiene excitando de forma simultánea un modo adicional de vibración n (y registrando como canal adicional Δίη). De esta forma se tendrían tres observables conservativos (cambio de frecuencia del primer, segundo y tercer modo) que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que se extraen las propiedades de la muestra (4).
En otra realización más particular del método de la invención, la ecuación adicional se halla registrando la amplitud Bm de un armónico superior, m, del modo principal con frecuencia mf-i, para tener tres observables que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra (4), donde por un armónico superior, Bm, del modo principal se entiende un múltiplo entero de la frecuencia de resonancia de dicho modo principal, y donde los tres observables mencionados son: cambio de frecuencia del modo principal y del modo secundario, Δί-ι, Δί2, y amplitud, Bm, del armónico superior m.
Figure imgf000028_0001
I_3l2F(d)
donde es la integral 3/2 de la fuerza de interacción y B2 es la amplitud del segundo armónico.
En una realización particular del método de la invención, el método se implementa para hallar propiedades de fuerzas disipativas que dependen de dos parámetros o para calcular el radio, R, de la punta (3) de forma simultánea con el cálculo de la viscosidad. Además de la ecuación que existe para la energía disipada por el modo principal de vibración, también existe una ecuación adicional para la energía disipada por el modo superior de vibración en términos de la semi-integral de la función (d):
Figure imgf000029_0001
(E.23) Esto da lugar a una ecuación adicional que permite la transformación de las imágenes de Afi, Af2, F0i y F02 en observables que aparecen en un sistema de cuatro ecuaciones. De esta forma, si la componente disipativa de la fuerza incluye una fuerza de histéresis en la energía superficial además de la fuerza viscosa de Voigt, se pueden hallar de forma simultánea la viscosidad η y la histéresis en la energía superficial AEaCih.
El método se podría implementa en líquido, el funcionamiento es equivalente al del aire, incluso mejor porque las fuerzas atractivas están muy apantalladas y normalmente sólo hay régimen repulsivo.
Un ejemplo práctico de empleo de la siguiente invención, que se refiere al cálculo del Módulo de Young efectivo, Eeff, viscosidad, η, indentación, δ, fuerza máxima conservativa, Fmax, y tiempo de contacto en aire, tc, se describe a continuación, y se muestra en las figuras 9, 10, 1 1 y 12, utilizando la aproximación para la fuerza de interacción del modelo de Hertz.
En dicho ejemplo de aplicación, se analiza una muestra (4) de PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid). El radio, R, de la punta (3) fue estimado al finalizar el experimento, midiendo una muestra (4) de nanopartículas de oro de radio conocido, obteniéndose un radio de 9.5 nm. Al principio del experimento, se ha de comprobar que se opera bajo las hipótesis correctas: que la amplitud del modo principal es mayor que la longitud típica de la fuerza, y que la amplitud del modo secundano es mucho menor que la del modo principal. Para ello se halla la semi-integral y sem ¡-derivada de la fuerza de forma numérica a partir de la fuerza reconstruida y se compara con la semi-integral y semi-derivada que se hallan a partir del comportamiento de A , Af2 con la distancia.
Si ambas curvas coinciden (lo que se ¡lustra en las Figuras 9 y 10), el método es válido para calcular de forma precisa las propiedades del material. Para comprobar la indentación necesaria para medir un Módulo de Young efectivo y una viscosidad constante en la muestra (4) se convierten los datos de Afi, Af2 frente a distancia en curvas del Módulo de Young efectivo, Eeff, la indentación, δ, la fuerza máxima y el tiempo de contacto, tc, (Figura 1 1 ). Se observa que en este caso el Módulo de Young efectivo, Eeff, es constante a partir de una indentación, δ, de sólo 0.25 nm.
Este resultado es una mejora significativa con respecto a otros métodos tales como el método 'peak forcé tapping' para el que es necesario penetrar al menos 2 nm. Por último, se procede a registrar la imagen topográfica de forma simultánea a la obtención de los mapas de Módulo de Young efectivo, Eeff, viscosidad, η, indentación, δ, fuerza máxima conservativa y tiempo de contacto, tc. Durante la adquisición de la imagen, se varía el punto de trabajo de tal forma que las fuerzas aumentan. Se observa que en la mitad inferior de las imágenes que se muestran en la Figura 12 se ha cambiado el punto de trabajo de tal forma que la fuerza que la punta (3) de la micropalanca (2) aplica sobre la muestra (4) ha cambiado. Los mapas de la indentación, la fuerza máxima y el tiempo de contacto también muestran un aumento, mientras el Módulo de Young efectivo, la viscosidad y la topografía no muestran cambios.
Este invento puede ser aplicado sobre muestras heterogéneas como se ve en la figura 15, donde sobre una muestra de nanopartículas de oro de 5nm sobre silicio se observa que el módulo de Young de la nanopartícula es del orden de 100-200 GPa.
La presente invención no debe verse limitada por las formas de realización aquí descritas. Otras formas de realización que introduzcan pequeñas variaciones en el método aquí descrito, pueden ser realizadas por los expertos en la materia. En consecuencia, la presente invención queda definida por el siguiente juego de reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, basado en modular en frecuencia y de forma simultánea al menos dos modos de vibración de una micropalanca (2) de un microscopio de fuerzas (1 ), caracterizado por emplear los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerza de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas.
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende: a. colocar en la cabeza de un microscopio de fuerzas (1 ) una micropalanca (2) con una punta (3) en su extremo, que interactúa con la muestra (4), y que presenta al menos dos modos de vibración, un modo principal y un modo secundario; b. disponer de dos elementos, uno para hacer vibrar (5) a la micropalanca (2) y el otro para desplazar (13) a la micropalanca (2) sobre la muestra (4) o parte de ella; c. enviar a la unidad de excitación (5) asociada a la micropalanca (2) de la cabeza del microscopio (1 ), las señales de excitación generadas por (7, 8, 9, 10) y sumar, mediante un sumador de señales (6), las mencionadas señales de excitación que hacen vibrar a la micropalanca (2); d. calibrar los siguientes parámetros asociados a la operación de la micropalanca (2): constante de fuerzas, k¡; factor de calidad, Q¡; inversa de la sensibilidad óptica del fotodiodo, i, en cada uno de los dos modos de vibración; radio, R, de la punta (3) de la micropalanca (2); comprobar las hipótesis de partida, según las siguientes etapas: e.1 ) comprobar que la amplitud de vibración del modo principal de la micropalanca (2) es mayor que la longitud de escala de la fuerza de interacción. e.2) comprobar que la amplitud de vibración, del modo secundano de la micropalanca (2) es muy inferior a la amplitud de vibración, del modo principal; e.3) fijar una pluralidad de bucles de realimentación que
-un bucle de realimentación (7) de la amplitud, A-i, del modo principal de vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la micropalanca (2) en dicho modo principal, manteniendo constante dicha amplitud, A-i;
-un bucle de realimentación (8) de la amplitud, A2, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la micropalanca (2) en dicho modo secundario, manteniendo constante dicha amplitud, A2;
-un bucle de realimentación (9), de fase, φ-ι, del modo principal de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, fi de la micropalanca (2) en dicho modo principal, manteniendo constante la fase, φ-ι, en un valor igual a ττ/2;
-un bucle de realimentación (10), de fase, φ2, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, f2, de la micropalanca (2) en dicho modo secundario, manteniendo constante la fase, φ2, en un valor igual a ττ/2;
-un bucle de realimentación (1 1 ) responsable de regular la distancia media (12) entre la punta (3) de la micropalanca (2) y la muestra (4) y controlar así la realimentación topográfica (1 1 ). f) detectar, mediante un sistema (14) adaptado al efecto, la señal de deflexión de la micropalanca (2); g) registrar, mediante una unidad de procesamiento (15) provista de al menos dos canales de transferencia de información, las señales correspondientes a los modos de vibración, donde dicho registro puede realizarse simultáneamente o posteriormente a la adquisición de una imagen de microscopía; h) transformar, mediante el empleo de fórmulas analíticas, los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra (4).
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 2, caracterizado por que el sistema punta (3) - micropalanca (2) se sitúa sobre una muestra (4) heterogénea para medir diversas propiedades mecánicas como el Módulo de Young efectivo, Een, la viscosidad, η, de la muestra (5), o la constante de Hamaker, H, de la inferíase.
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por que en la etapa (c) del método en que se generan las señales de excitación, la micropalanca (2) es excitada según los mencionados modo principal y modo secundario de vibración. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 4, caracterizado por que la señal resultante que llega a la micropalanca (2) viene expresada según la siguiente relación matemática:
Figure imgf000035_0001
donde F0¡, f¡ son, respectivamente, la señal de excitación, y la frecuencia de excitación del modo i que son transferidas al elemento que excita la vibración de la micropalanca (2).
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 5, caracterizado por que la señal se genera utilizando la señal de referencia de un dispositivo lock-in digital comprendido dentro de un procesador digital de señal.
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por que en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra (4), se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, Δί-ι, y del modo secundario, Δί2, para hallar el Módulo de Young efectivo, Een, de la muestra (4) y la indentación, δ, en función de la posición de la micropalanca (2) sobre la muestra (4).
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 7, caracterizado por que los datos de cambio en la frecuencia de resonancia del modo principal, Afi, y cambio en la frecuencia de resonancia del modo secundario, Af2, se convierten, mediante un cálculo analítico, y simultáneamente o posteriormente a la adquisición de una imagen, en mapas paramétricos que expresan el Módulo de Young efectivo, Eeff, y la indentación, δ.
9. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas según la reivindicación 8, caracterizado por que la fuerza de interacción se modela de acuerdo al modelo de Hertz y el Módulo de Young efectivo, Eeff, y la indentación, δ, se calculan mediante el siguiente sistema de ecuaciones:
Figure imgf000036_0001
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 8, caracterizado por que el tiempo de contacto, tc, entre la punta (3) y la muestra (4) se calcula mediante la siguiente expresión matemática: t„ =
Figure imgf000036_0002
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 8, caracterizado por que cuando la punta (3) se encuentra a una distancia mínima de la muestra (4), se calcula la fuerza máxima conservativa de Hertz, Fmax, según la siguiente expresión matemática:
Figure imgf000036_0003
12. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 7, caracterizado por que en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra, se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, y del modo secundario, y el cambio en la señal de excitación del modo principal para hallar la viscosidad, η, el módulo de Young efectivo, Eeff, de la muestra (4) y la indentación, δ, en función de la posición de la micropalanca (2) sobre la muestra (4).
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según las reivindicaciones 8, 9 y 12, caracterizado por que se añade al modelo de la fuerza conservativa de Hertz una componente disipativa que puede modelarse como proporcional a la velocidad de indentación, de tal forma que la fuerza total de interacción se expresa mediante la siguiente relación matemática:
F {d) = ¥cons + Ará = ^E*jR(S)m + jRS δ
•3 (E.12) donde ΔΓ es una función par denominada función de rozamiento generalizado, y ¿ es la velocidad de indentación en la muestra (4); de manera que la inclusión de la mencionada componente disipativa de la fuerza da lugar a una ecuación adicional para la energía disipada en términos de la semi-integral de una función, B(d), relacionada con la fuerza disipativa:
Figure imgf000037_0001
(E.13) donde la función B se define mediante la siguiente expresión matemática:
Figure imgf000037_0002
(E.14) dando lugar a una ecuación adicional que permite la conversión de las imágenes de Δί-ι, Δί2 y F0i en mapas paramétricos del módulo de Young efectivo, Eeff, de la viscosidad, η, y de la indentación, δ, y haciendo que el sistema de tres ecuaciones:
Λ Eeff R5 )
Figure imgf000038_0001
(E.17) con tres incógnitas, Eeff, δ, η, se pueda expresar explícitamente, proporcionando además de las ecuaciones para el módulo de Young efectivo, Eeff, y para la indentación, δ, una ecuación para la viscosidad, η, expresada de la siguiente manera:
Figure imgf000038_0002
14. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por que la micropalanca (2) opera en régimen atractivo o de no contacto, y la fuerza de interacción entre la punta (3) y la muestra (4) se modela de acuerdo al siguiente modelo matemático, conocido como modelo de Van der Waals:
6d (E.19) donde d es la distancia entre la punta (3) y la muestra (4).
Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 14, caracterizado por que se calculan analíticamente la semi-derivada y la semi-integral de la fuerza de interacción del modelo de van der Waals, dando lugar a un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, que se puede expresar explícitamente, proporcionando relaciones para la constante de Hamaker, H, y la distancia mínima, dmin, entre punta (3) y muestra (4):
Figure imgf000039_0001
16. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 15, caracterizado por que la distancia media (12) entre la punta (3) y la muestra (4) se controla manteniendo un cambio en la frecuencia, Δί-ι , fijo mientras la micropalanca (2) se desplaza a lo largo y ancho de la muestra (4).
17. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 15, caracterizado por que la distancia media (12) entre la punta (3) y la muestra (4) se controla manteniendo una fuerza de excitación, F0i , fija. 18. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 2, caracterizado por que en la etapa e3) se establece el sistema de realimentación (1 1 ) topográfico del quinto bucle en otros parámetros como el tiempo de contacto, tc, o la fuerza máxima, Fmax, en valores pre-establecidos alternativas al cambio de frecuencia de resonancia, Δί-ι , o disipación, AF0i .
19. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 18, caracterizado por que se utiliza realimentación en tiempo de contacto, tc, para efectuar medidas no invasivas en materiales blandos. 20. Método bimodal para cuantificar propiedades, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que las fuerzas de interacción entre la punta (3) y la muestra (4) se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que se añade una nueva ecuación que se obtiene al excitar un modo adicional de vibración, n, y registrando como canal adicional, Δίη, para tener tres observables conservativos, siendo éstos los cambios de frecuencia de cada modo de vibración, de manera que se obtiene un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra, donde por observables se entiende los parámetros medidos directamente por el microscopio de fuerzas bimodal.
21 . Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que las fuerzas de interacción entre la punta (3) y la muestra (4) se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que la ecuación adicional se halla registrando la amplitud Bm de un armónico superior, m, del modo principal con frecuencia rrif-i, para tener tres observables que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra (4), donde por un armónico superior, Bm, del modo principal se entiende un múltiplo entero de la frecuencia de resonancia de dicho modo principal, y donde los tres observables mencionados son: cambio de frecuencia del modo principal y del modo secundario, Δί-ι, Δί2, y amplitud, Bm, del armónico su erior, m,
Figure imgf000040_0001
(E.22) donde i3l2F(d) es la integral 3/2 de la fuerza de interacción y B2 es la amplitud del segundo armónico.
22. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas según la reivindicación 13, caracterizado por que la fuerza de interacción contiene una componente disipativa dependiente de dos parámetros y se registra de forma adicional el canal disipación del modo secundano de vibración para utilizar la ecuación que relaciona la energía disipada por el modo secundario con la semi-integral de la función Γ (d):
Figure imgf000041_0001
(E.23) dando lugar a una ecuación adicional que permite la transformación de las imágenes de Δί-ι, Δί2, F0i y F02 en observables que aparecen en un sistema de cuatro ecuaciones para hallar simultáneamente la viscosidad, η, y la histéresis de la energía superficial, AEaCih-
23. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la medida se realiza teniendo la muestra inmersa en líquido.
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