ES2500040B1

ES2500040B1 - Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas

Info

Publication number: ES2500040B1
Application number: ES201330281A
Authority: ES
Inventors: Elena TOMAS HERRUZO; Ricardo Garcia Garcia
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2015-10-13
Anticipated expiration: 2033-02-28
Also published as: ES2500040A1; WO2014131925A1

Abstract

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, basado en modular en frecuencia y de forma simultánea al menos dos modos de vibración de la micropalanca de un microscopio, que emplea los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerzas de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas.

Description

MÉTODO BIMODAL PARA CUANTIFICAR PROPIEDADES NO TOPOGRÁFICAS EN MICROSCopiA DE FUERZAS

OBJETO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a un método de utilización de un microscopio de fuerzas mediante modulación de frecuencia, excitando simultáneamente al menos dos modos de vibración de la micropalanca, siendo uno de ellos el modo principal que permite seguir la topografía y siendo el otro el modo secundario, caracterizado por una frecuencia más elevada que la del modo principal. Se utiliza cálculo fraccional para relacionar parámetros medidos directamente con el microscopio con las propiedades de las muestras. Se emplean los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerzas de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas de una muestra a medir.

Este método permite calcular diversas propiedades cuantitativas no topográficas de los materiales, utilizando para ello modos de vibración dinámicos sin hacer hipótesis acerca de la indentación de la punta de la micropalanca en la muestra a analizar. Este método puede aplicarse en tiempo real durante la medición, o posteriormente a la obtención de los parámetros directamente medidos en la muestra.

El presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopia de fuerzas encuentra aplicación en el ámbito de la investigación científica, mediante microscopía de fuerzas, de todo tipo de materiales, orgánicos e inorgánicos, estando la muestra inmersa en un medio, liquido, gaseoso, o bien en el vacio.

PROBLEMA TÉCNICO A RESOLVER Y ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La habilidad de la microscopía de fuerzas para la adquisición de imágenes de un amplio rango de materiales la han convertido en una de las técnicas relevantes para la caracterización de propiedades a escala nanométrica. Como consecuencia de su gran resolución (lateral y vertical), los microscopios de fuerza atómica (AFM, por las siglas en inglés de Microscopia de Fuerza Alómica). Se han inlroducido lanlo en laboralorios de investigación como en departamentos de control de calidad en diversos sectores industriales (microelectrónica, polimeros).

Un microscopio de fuerzas puede operar tanto en modos estáticos como dinámicos. Uno de los métodos que pueden ser utilizados para la determinación cuantitativa de propiedades son los experimentos de nanoindentación, que se caracterizan por su lentitud, la elevada área de contacto y no controlar la fuerza aplicada. Los métodos estáticos están basados en la adquisición de curvas de fuerza de forma simultánea con la adquisición de la imagen topográfica (force volume). Estos métodos funcionan a frecuencias bajas (1-2 Hz) lo cual implica que un mapa completo requiera tiempos de adquisición de horas. Además, la resolución lateral de estos mapas es pequeña. El método de la fuerza pulsada (A. RosaZeiser, E. Weilandt, S. Hild y O. Marti. The simultaneous measurement of elastie, eleetrostatie and adhesive properties by seanning force mieroseopy: pu/sed-foree mode operation. Measurement Science and Technology 8(11), 1333 (1997)) hace oscilar el piezoeléctrico que mueve la muestra en sentido vertical a frecuencias de entre 100 Hz y 2 kHz, lo que permite la determinación de propiedades mecánicas de forma más rápida, aunque la fuerza máxima aplicada es relativamente elevada (de decenas de nN).

La reciente invención descrita en el documento de patente US 20120131702 A1 , introduce

mejoras en la electrónica que han permitido el desarrollo del método 'peak force tapping' capaz de extraer propiedades de forma robusta con indentaciones de al menos 2 nm y es capaz de establecer la máxima fuerza de interacción punta -muestra en el rango pN-nN. Es de notar que aunque el método ha sido verificado sobre multitud de materiales en aire y líquidos, no existen resultados significativos en cuanto a la cuantificación sobre imágenes con alta resolución lateral de nanopartículas o proteínas individuales.

Los modos dinámicos tienen la ventaja de ser generalmente no invasivos y de incrementar la velocidad de adquisición, de tal forma que la información cuantitativa sea simultánea con la imagen de topografía. Además, y más importante, el hecho de operar a frecuencias cercanas de la de resonancia aumenta la sensibilidad del microscopio. Muchos observables, (término que se refiere a magnitudes directamente medidas en el microscopio) como la fase, los cambios de frecuencia o la amplitud de armónicos superiores, pueden ser relacionados con información composicional de la muestra. Sin embargo, la cuantificación de estas propiedades no es inmediata.

Se puede distinguir entre métodos basados en la obtención de la fuerza de interacción punta -muestra a partir de la deflexión, y métodos paramétricos. En los documentos de patente US 746583 81 Y US 7404314 82, asi como en el articulo: M. Stark, C. Moller, D. J. Müller y

R. Guekenberger. From images to interaetions: High-resolution phase imaging in tappingmode atomic force mieroscopy. Biophysieal Journal 80, 3009-3018 (2001 J, se introducen

métodos que reconstruyen el comportamiento de la fuerza de interacción punta -muestra frente al tiempo, para cada pixel de la imagen obtenida mediante microscopía, métodos que permiten obtener el Módulo de Young efectivo, E eft. y otras propiedades de la muestra a la vez que permiten observar si existen fuerzas que no han sido consideradas en el modelo que incrementan el error en la cuantificación. En particular, el método de Sahin (como en la patente US 7404314 82) permite estimar el Módulo de Young efectivo. E". tras una estimación de la indentación basada en la máxima resolución lateral obtenida en la imagen. Entre los métodos paramétricos destaca el trabajo de Raman (A. Raman, S. Trigueros, A. Cartagena, A. P. Z. Stevenson, M. Susilo, E. Nauman adn S. Antoranz Contera, Mapping nanomechanical properties of Uve cells using mu/ti-harmonic atomic force microscopy , Nature Nanotechnology 6, 809-814 (2011» que describe la relación entre el Módulo de Young y distintos componentes harmónicos de la oscilación.

Es de notar que para aumentar la precisión en la medida de propiedades mediante modos dinámicos se debe minimizar el número de hipótesis empleadas. La mayoría de los métodos anteriores efectúan ciertas hipótesis sobre la indentación, como suponer que el radio de contacto es equivalente a la resolución lateral obtenida en la imagen. El radio de contacto real se relaciona con la indentación y el radio de la punta a través de la fórmula

re = .Jindentación.jRpunta

En general, un cambio en una propiedad física se manifiesta en un cambio en los observables y en un cambio en la distancia entre la punta y la muestra (debido a la realimentación topográfica). De esta forma, si se aumenta el número de ecuaciones que relacionan la fuerza y los observables, también se podrá determinar más propiedades de la muestra como la indentación de la punta de la micropalanca en la muestra.

La presente invención se basa en modos multifrecuencia de microscopía de fuerzas. Documentos pioneros a la presente invención pueden verse en los documentos de patente US 7958563 82 Y US 7921466 82. La microscopía de fuerzas bimodal es un método de microscopía de fuerza que opera excitando simultáneamente dos modos de vibración de la micropalanca (o cantiléver, como es conocida comúnmente en el estado de la técnica) de un microscopio de fuerza atómica. Estos modos pueden ser, por orden de frecuencia de menor a mayor, el primero y el segundo, el primero y el tercero 0, en general, dos cualesquiera. Esta excitación simultánea permite la duplicación de canales de información.

La Figura 1 muestra la forma teórica de los dos primeros modos flexurales (1 y 2) de vibración de una micropalanca rectangular que oscila en aire. La frecuencia del segundo modo es aproximadamente 6 veces mayor que la del primer modo. La Figura 2 muestra la oscilación vertical de una micropalanca cuando se excitan simultáneamente los dos primeros modos de resonancia, siendo la amplitud del segundo modo mucho menor que la amplitud del primer modo. La Figura 3 describe el funcionamiento de un microscopio de fuerzas bajo la excitación de dos modos de vibración operando en modo de modulación en frecuencia, que consta de los pasos de excitar de forma simultánea al menos el modo fundamental de vibración y un modo más alto de la micropalanca del microscopio mientras la micropalanca se desplaza sobre la superficie de la muestra, y que establece una serie de condiciones para cada uno de los modos.

En las condiciones de funcionamiento del microscopio bimodal se satisfacen ciertas condiciones en el virial de la fuerza de interacción (Vrs) y en la energía disipada (J. R. Lozano y R. Garcia. Theory of multifrequency atomic force microscopy. Physical Review Letters 100(7), 0761024 (2008)., J. R. Lozano y R. Garcia. Theory ofphase spectroscopy in bimodal atomic force microscopy. Physical Review B 79, 0141104 (2009)).

Además, si la amplitud de vibración del segundo modo A2 es mucho menor que la amplitud de vibración del primer modo Al (A 2 « A,) el cambio en la frecuencia de resonancia del segundo modo .tJ.f2 está relacionado directamente con el virial de la fuerza del primer modo

(S. Kawai, T. Glatzel, S. Koch, B. Such, A. Baratoff y E. Meyer. Systematic achievement of improved atomic-scale contrast via bimodal dynamic force microscopy. Physical Review Letters 103(22) (2009)).

Cuando la amplitud de vibración del primer modo A, es mayor que la longitud típica de la fuerza , los cambios en la frecuencia de resonancia del primer y del segundo modo se relacionan directamente con la semi-integral y semi-derivada de la fuerza a través de cálculo fraccional (E T. Herruzo and R Garcia, Theoretical study of the frequency shift in bimodal FM-AFM by fractional calculus, Beilstein J. ofNanotechnol. 3, 198-206 (2012)).

Cuando la semi-integral (1.~/2F(d) y la semi-derivada (02/2F (d) de la fuerza de interacción pueden calcularse analíticamente se obtiene un sistema de dos ecuaciones del que se pueden extraer los valores de MÓdulo de Young efectivo, Eeff, Y la indentación, Ó, a través de las imágenes en tiempo real de .tJ.f1 and tJf1. Las definiciones de la semi-derivada y semiintegral corresponden a las formas de la derivada e integral fraccional de Liouville (desde un valor dado de la variable hasta infinito). (Fractional Calculus: An Introduction for Physicists,

R. Herrmann, World Scientific Publishing, 2011 J.

Cuando la frecuencia de excitación es muy próxima a la frecuencia de resonancia (operación en ultra-alto vacío o aire), el virial del modo n puede aproximarse por

v = -k A' 1:1[,

/s." It" [

(E.1 )

"

donde k". An, fn y ¡jfn son, respectivamente, la constante de fuerza, la amplitud, la frecuencia

5 de resonancia en presencia de una fuerza y el desplazamiento de la frecuencia de resonancia del modo n. Para el caso de la excitación a los dos primeros modos se obtiene

l:1[, (d) = /, 1''' F (d)k,J2nA,)

(E.2)

1:1j, (d) = ¡; D~2F(d) -2k2~2nA,

(E.3)

De manera similar, operando en medio líquido, la frecuencia de excitación es diferente de la

10 frecuencia de resonancia y el virial del modo n puede aproximarse por

v = k"A,; (1_ [, _2[N " )

IS." 2 /, /,'

O,n O,n

(E .4)

donde fo.n es la frecuencia de resonancia del modo n en ausencia de fuerzas de interacción.

La fuerza de interacción puede aproximarse en base a varios modelos donde aparecen propiedades mecánicas de la muestra: el módelo de Hertz (Intermolecular & Surface

15 Forces, Jacob Israelachvili, 1985, Elsevier Academic Press), el de DMT (Amplitude Modulation AFM in Liquid, R: García,; Wiley-VCH: Weinheim, Germany), el de Lennard Jones (lntermo/ecu/ar and Surface Force, Israelachvili, J. N., Elsevier Academic Press: London, 2005.), elc.

Por ejemplo, en el modelo de Hertz la fuerza conservativa de interacción viene dada por:

donde d es la distancia instantánea entre la punta de la micropalanca y la muestra y ao es un

parámetro intermolecular que normalmente vale 0.165 nm y el módulo de Young efectivo Es" se define como:

l _v2 l_v2

_---'-' + 2

E'ff E, E,

(E.6)

siendo El y E2 10s módulos de Young y Vj y v2 10s coeficientes de Poisson de la punta de la

micropalanca y de la muestra respectivamente.

En el actual estado de la técnica, hasta ahora no se han podido obtener para diferentes modelos de fuerza de interacción, relaciones analíticas entre los observables producidos en este tipo de microscopía en tiempo real, y las propiedades mecánicas de la muestra. Todo ello maximizaría la velocidad de funcionamiento del microscopio y evitaría los problemas de convergencia que muestran los métodos iterativos.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a un método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopia de fuerzas basado en modular en frecuencia y de forma simultánea al menos dos modos de vibración de la micropalanca.

Según el método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de

fuerzas, objeto de la presente invención, se emplean los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerzas de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas.

El presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas comprende:

a) colocar en la cabeza de un microscopio de fuerzas una micropalanca con una punta en su extremo, que interactúa con la muestra, y que presenta al menos dos modos de vibración, un modo principal y un modo secundario;

b) disponer de dos elementos, uno para hacer vibrar a la micropalanca y el otro para desplazar a la micropalanca sobre la muestra o parte de ella;

c) enviar a la unidad de excitación asociada a la micropalanca de la cabeza del microscopio, las señales de excitación generadas por y sumar, mediante un

sumador de señales, las mencionadas señales de excitación que hacen vibrar

a la micropalanca;

d): calibrar los siguientes parámetros asociados a la operación de la

micropalanca:

5: constante de fuerzas, k¡ ;

factor de calidad, Q¡;

inversa de la sensibilidad óptica del fotodiodo, i, en cada uno de los

dos modos de vibración;

radio, R, de la punta de la micropalanca;

10: e) comprobar las hipótesis de partida, según las siguientes etapas:

e.1) comprobar que la amplitud de vibración del modo principal de la

micropalanca es mayor que la longitud de escala de la fuerza de

interacción.

e.2) comprobar que la amplitud de vibración, del modo secundario de la

15: micropalanca es muy inferior a la amplitud de vibración, del modo

principal;

e.3) fijar una pluralidad de bucles de realimentación que comprenden:

-un bucle de realimentación de la amplitud, A" del modo principal de

vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la

20: micropalanca en dicho modo principal, manteniendo constante dicha

amplitud, A, ;

-un bucle de realimentación de la amplitud, A2, del modo secundario de

vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la

micropalanca en dicho modo secundario, manteniendo constante

25: dicha amplitud, A2;

-un bucle de realimentación, de fase, CIl" del modo principal de

vibración , donde se hace variar la frecuencia de excitación, f, de la

micropalanca en dicho modo principal, manteniendo constante la fase,

Q)" en un valor igual a rr/2;

-: un bucle de realimentación, de fase, CIl2, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, h, de la micropalanca en dicho modo secundario, manteniendo constante la fase, <P2, en un valor igual a rr/2;

-: un bucle de realimentación responsable de regular la distancia media entre la punta de la micropalanca y la muestra y controlar así la realimentación topográfica.

f) detectar, mediante un sistema adaptado al efecto, la señal de deflexión de la micropalanca;

g) registrar, mediante una unidad de procesamiento provista de al menos dos canales de transferencia de información, las señales correspondientes a los modos de vibración, donde dicho registro puede realizarse simultáneamente o posteriormente a la adquisición de una imagen de microscopía;

h) transformar, mediante el empleo de fórmulas analíticas, los datos mostrados en los mapas para métricos de propiedades de la muestra.

Según el método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas objeto de la presente invención, el sistema punta -micropalanca se sitúa sobre una muestra heterogénea para medir diversas propiedades mecánicas como el Módulo de Young efectivo, Eeff, la viscosidad, f] , de la muestra, o la constante de Hamaker, H, de la interfase.

Según el presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, en la etapa (c) del método en que se generan las señales de excitación, la micropalanca es excitada según los mencionados modo principal y modo secundario de vibración.

Según una realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, la señal resultante que llega a la micropalanca viene expresada según la siguiente relación matemática:

4 4

F= (1) = F" z,(I--f.) +F"z, (1 --3 1,) 3 (E.?)

donde Foj• ti son, respectivamente, la señal de excitación, y la frecuencia de excitación del

modo i que son transferidas al elemento que excita la vibración de la micropalanca.

En una forma de realización, dicha señal se genera utilizando la señal de referencia de un dispositivo lock-in digital comprendido dentro de un procesador digital de señal.

5 Según una posible forma de realización, en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra, se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, .ó.k y del modo secundario, llfz. para hallar el Módulo de Young efectivo, Eeff, de la muestra y la indentación, Ó, en función de la posición de la micropalanca sobre la muestra.

10 Asimismo, típicamente, en el presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopia de fuerzas, los datos de cambio en la frecuencia de resonancia del modo principal, 1Jf1, y cambio en la frecuencia de resonancia del modo secundario, 1Jfz,

se convierten, mediante un cálculo analítico, y simultáneamente o posteriormente a la adquisición de una imagen, en mapas paramétricos que expresan el Módulo de Young 15 efectivo, Eeft. yla indentación, a.

En el presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas, la fuerza de interacción se modela típicamente de acuerdo al modelo de Hertz y el Módulo de Young efectivo, Eeft. Yla indentación, a, se calculan mediante el siguiente sistema de ecuaciones:

(E.8)

J = A, k, J, 6!, k2!, 6J,

20 (E .9)

El tiempo de contacto, le, entre la punta y la muestra se calcula, en una determinada realización del método objeto de la presente invención, mediante la siguiente expresión matemática:

I =_I-arccos(I-~J=_I-arccos(l-kJ2 tl.¡;J

' "f. A, "f. k,f. ój, (E .1 0)

En una forma de realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, cuando la punta se encuentra a una distancia mínima de la muestra, se calcula la fuerza máxima conservativa de Hertz, FmaK• según la siguiente expresión matemática:

5 (E.11 )

Adicionalmente, en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas para métricos de propiedades de la muestra, típicamente se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, y del modo secundario, y el cambio en la señal de excitación del modo principal para hallar la viscosidad, r]. el Módulo de Young

10 efectivo, EaH• de la muestra, y la indentación, Ó, en función de la posición de la micropalanca sobre la muestra.

Adicionalmente, en una forma de realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, objeto de la presente invención, se añade al modelo de la fuerza conservativa de Hertz una componente disipativa que puede

15 modelarse como proporcional a la velocidad de indentación, de tal forma que la fuerza total de interacción se expresa mediante la siguiente relación matemática:

donde bor es una función par denominada función de rozamiento generalizado, y 8 es la velocidad de indentación en la muestra.

20 La inclusión de la mencionada componente disipativa de la fuerza da lugar a una ecuación adicional para la energia disipada en términos de la semi-integral de una función, B(d), relacionada con la fuerza disipativa:

tlF (d) = F (tl/'(d) + J2iQ,/, 1"' B(d» )

01 01 /, k A3/2

, , ,

(E.1 3)

donde la función B se define mediante la siguiente expresión matemática: "

B(x) ~ 2f8r(X)d<

(E.14)

dando lugar a una ecuación adicional que permite la conversión de las imágenes de f1f" f1h Y F01 en mapas paramélricos del módulo de Young efectivo, E eft. de la viscosidad, fl, y de la indentación, 5, y haciendo que el siguiente sistema de tres ecuaciones:

J, E .JnRO'

6J,(d) = 1 ~

k~2nA3 2

1 1 (E.15)

8F (d) ~ F (Ó.!.(d) + J2iiQ,!. l1W15' J

01 01!. k A3/ 2 2

, , ,

(E .17)

con tres incógnitas, Eeff, 5, 11, se pueda expresar explícitamente, proporcionando además de

10 las ecuaciones para el Módulo de Young efectivo, Eeff• Y para la indentación, é, una ecuación para la viscosidad, fl. expresada de la siguiente manera:

.,fi k; 4f22 (1lJ; J;Fo, -!1FoJ; 2) JlrA, R kl fJ/Q, 4f;2F

ol (E.18)

Según una forma de realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, la micropalanca del microscopio opera en

15 régimen atractivo o de no contacto, y la fuerza de interacción entre la punta y la muestra se modela de acuerdo al siguiente modelo matemático, conocido como modelo de Van der Waals:

(E.19)

donde d es la distancia entre la punta y la muestra.

Se calculan analíticamente la semi-derivada y la semi-integral de la fuerza de interacción del

modelo de van der Waals, dando lugar a un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, que se puede expresar explícitamente, proporcionando relaciones para la constante de Hamaker, H, y la distancia mínima, dmin, entre punta y muestra:

5 (E.20)

3A, k,j,t;j, 4 k, f t;f,

(E.21 )

La distancia media entre la punta y la muestra se controla, opcionalmente, manteniendo un cambio en la frecuencia, .ó.f1. fijo mientras la micropalanca se desplaza a lo largo y ancho de la muestra.

10 La distancia media entre la punta y la muestra también puede controlarse manteniendo una fuerza de excitación , FOl. fija .

Según una realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, en la etapa e3) se establece el sistema de realimentación topográfico del quinto bucle en otros parámetros como el tiempo de contacto, te, o la fuerza

15 máxima, Fmax, en valores pre-establecidos alternativos al cambio de frecuencia de resonancia,6k o disipación, 6.F01 .

La realimentación en tiempo de contacto, te, se puede utilizar para efectuar medidas no invasivas en materiales blandos.

Opcionalmente, las fuerzas de interacción entre la punta y la muestra se modelan mediante

20 dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que se añade una nueva ecuación que se obtiene al excitar un modo adicional de vibración, n, y registrando como canal adicional, 6fn, para tener tres observables conservativos, siendo éstos los cambios de frecuencia de cada modo de vibración, de manera que se obtiene un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la

25 muestra.

Se entiende por observables los parámetros medidos directamente por el microscopio de fuerzas bimodal.

Alternativamente, las fuerzas de interacción entre la punta y la muestra se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que la ecuación adicional se halla registrando la amplitud Bm de un armónico superior, m, del modo principal con frecuencia m¡" para tener tres observables que dan lugar a un sistema

5 de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra, donde por un armónico superior, Bm. del modo principal se entiende un múltiplo entero de la frecuencia de resonancia de dicho modo principal, y donde los tres observables mencionados son: cambio de frecuencia del modo principal y del modo secundario, llf1 • .6..f2, Y amplitud, Bm. del armónico superior, m,

tlB,(d) = 2 ( / "'F(d) __1 1'" F(d)) -3k ~2"A, A,

10 (E.22)

donde 1! /2 F (d) es la integral 3/2 de la fuerza de interacción y 82 es la amplitud del segundo

armónico.

En una realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas, el

15 modelo de fuerza de interacción contiene una componente disipativa dependiente de dos parámetros y se registra de forma adicional el canal disipación del modo secundario de vibración para utilizar la ecuación que relaciona la energía disipada por el modo secundario con la semi-integral de la función r (d):

t;F: (dl = F: [ t;j,(d l + ,J2;Q, j , ' "'t;r(dl)

02 02 /2 k fA:"

(E.23)

20 dando lugar a una ecuación adicional que permite la transformación de las imágenes de b.f1, b.h, F01 y F02 en observables que aparecen en un sistema de cuatro ecuaciones para hallar simultáneamente la viscosidad, r¡, y la histéresis de la energía superficial, b.Eadh•

Según una forma de realización del método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, objeto de la presente invención, la medida se

25 realiza teniendo la muestra inmersa en líquido.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se entenderá mejor a la vista de las siguientes figuras que muestran diversas formas de realización del presente método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas.

Figura 1: Muestra de forma esquemática los dos primeros modos f1exurales de vibración (V1 Y V2) según los cuales oscilan en el aire las micropalancas rectangulares normalizadas de los microscopios de fuerzas en el estado de la técnica. Figura 2: Muestra esquemáticamente la excitación y la oscilación de una micropalanca de un microscopio de fuerzas, cuando ésta es excitada simultáneamente según sus dos primeros modos de vibración, y donde la amplitud de vibración del segundo modo es mucho menor que la amplitud de vibración del primer modo.

Figura 3: Muestra un esquema del funcionamiento de un microscopio de fuerzas bajo la excitación de dos modos de vibración operando en modo de modulación de frecuencia.

Figura 4: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización .

Figura 5: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización .

Figura 6: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización .

Figura 7: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.

Figura 8: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización .

Figura 9: Muestra una gráfica comparati va, de las curvas correspondientes a la semi-integral de la fuerza de interacción punta-muestra, en un caso determinada numéricamente b (17), Y en otro caso obtenida a partir del método propuesto empleando los datos en .ó.f1(18).

Figura 10: Muestra una gráfica comparativa , de las curvas correspondientes a la semiderivada de la fuerza de interacción punta-muestra, en un caso determinada numéricamente a partir de la fuerza reconstruida (19), yen otro caso obtenida a partir del método propuesto empleando los datos en .ó.f2 (20).

Figura 11 : Muestra cuatro gráficas que representan los resultados del presente método, determinándose: el Módulo de Young efectivo, Eeff(a), la indentación, c5 (b), la fuerza máxima

(e) y el tiempo de contacto, lo (d).

Figura 12: Muestra seis gráficas que representan los resultados del presente método, aplicado al análisis de una muestra de PLGA (ácido poli-láctico co-glicólico, por sus siglas en inglés), determinándose simultáneamente: la topografía (a), los mapas del Módulo de Young efectivo, E eff (b), la viscosidad , rJ (e), la indentación, 5 (d), la fuerza máxima (e) y el tiempo de contacto, lo (1).

Figura 13: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.

Figura 14: Muestra un esquema del método objeto de la presente invención, según una forma de realización.

Figura 15: Muestra tres imágenes, obtenidas durante el análisis de microscopía de fuerzas de una muestra de nano-partículas de oro de 5 nm sobre una base de silicio, imágenes correspondientes a: un mapa topográfico de la muestra (a); un mapa paramétrico del Módulo de Young efectivo, Eeff (b), y; una gráfica que representa el Módulo de Young frente a la posición (e).

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE UNA FORMA DE REALlZACION DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a un método, en adelante método de la invención, para usar un microscopio (1) de fuerzas mediante modulación en frecuencia (algunos de cuyos elementos se ilustran a nivel esquemático en la figura 3), excitando simultáneamente dos modos de vibración de la micropalanca (2) o "cantiléver" de un microscopio de fuerza (1) atómica (AFM, por sus siglas en inglés), que comprende las siguientes etapas:

a) colocación de una micropalanca (2) con una punta (3) en su extremo que interactúa con la muestra (4) que presenta varios modos de vibración; en este sentido, la figura 1 hace referencia a un modo principal, 1, Ya un modo secundario, 2, de vibración de la micropalanca (2);

b) disponer de dos elementos, uno para hacer vibrar (5) a la micropalanca (2) y el otro para desplazar (13) a la micropalanca (2) sobre la muestra (4) o parte de ella;

e) generación de las señales de excitación (7, 8, 9, 10) Y un sumador (6) de manera que la señal resultante que excita a la micropalanca (2) es:

4 4

Fu, (I ) = F, + F, = G,Z,(I --1; ) +G,Z,(I --3 J, )3 (E.7)

donde FOI, G¡ Y f; son, respectivamente, la fuerza de excitación, la ganancia y la frecuencia de excitación del modo i que son transferidas al elemento que excita la

vibración de la micropalanca (5);

d) calibración de la constante de fuerzas k¡, del factor de calidad Q¡. de la inversa de la sensibilidad óptica del fatediado de cada uno de los modos i, y del radio, R, de la punta (3).

e) comprobación de las hipótesis de partida que incluye las siguientes subetapas:

: o comprobación de que la amplitud de vibración del modo principal de la micropalanca (2), sea mayor que la longitud de escala de la fuerza de interacción, esto es, la longitud típica a la que una fuerza puede ser despreciada;

: o comprobación de que la amplitud de vibración del modo secundario de la micropalanca (2) es mucho menor que la amplitud de vibración del modo principal;

: o fijación de cinco bucles de realimentación (figura 3) incluyendo: cuatro bucles de realimentación sobre las amplitudes y fases de ambos modos donde dos bucles de realimentación (7 y 9) mantienen la amplitud del primer modo Al constante variando la amplitud de excitación del mismo y la fase del primer modo CfJI igual a rr/2 variando la frecuencia de excitación f1 respectivamente y los otros dos bucles de realimentación (8, 10) que mantienen la amplitud del segundo modo A2 constante variando la amplitud de excitación del mismo y la fase del segundo modo </>2 igual a TT/2 variando la frecuencia de excitación '2 respectivamente, el quinto bucle de realimentación (1 1) es responsable de la regulación de la distancia media entre la punta

de la micropalanca (2) y la muestra (4) que genera una imagen

topográfica ;

f) detección de la señal de deflexión (14) de la micropalanca (2);

g) registro de un mínimo de dos canales de información, durante o después de la adquisición de la imagen, mediante una unidad de procesamiento (15);

h) transformación de la colección de datos elegidos entre en mapas de las propiedades de la muestra (4) mediante la unidad cuantitativa (16) descrita en la figura 4.

Este método permite calcular diversas propiedades cuantitativas de materiales sin hacer hipótesis acerca de la indentación de la punta de la micropalanca en la muestra.

La micropalanca puede ser excitada en dos modos de vibración, pero preferentemente es excitada según los modos principal y secundario de vibración .

En una realización preferente del método de la invención, en la etapa (a) del método, el sistema punta (3) -micropalanca (2) se sitúa sobre una muestra heterogénea (4) que puede presentar propiedades mecánicas variables tales como el Módulo de Young efectivo, Eeff, Y la viscosidad de la muestra, '1, o la constante de Hamaker, H, de la interfase.

En la etapa (e) del método, la señal se genera utilizando la señal de referencia de un lock-in digital que hay dentro de un procesador digital de señal.

En la etapa (d) del método, el radio, R, de la punta (3) se calibra utilizando una muestra (4) de nanoparticulas de radio conocido, donde a partir de la medida aparente que da el microscopio y, conocido el radio de las nanopartículas se obtiene el radio, R, de la punta (3). El radio de la punta se puede obtener también a partir de otros métodos, como puede ser el método de Sergio Santos (Sergio Santos, Li Guang, Tewfik Souier, Karim Gadelrab, Matteo Chiesa, and Neil H. Thomson "A method to provide rapid in situ determination of tip radius in dynamic atomic force microscopy" Review Science Instruments, 83, 043707

(2012».

El método de la invención permite medir ciertas propiedades que dependerán del modelo de fuerza de interacción (Módulo de Young, E, viscosidad, '1. indentación, 15, fuerza máxima conservativa. Fmax, tiempo de contacto, I:c) y, al mismo tiempo, determinar si se trabaja en el rango de aplicación del modelo utilizado. Para ello se graban al menos dos observables (magnitudes directamente medidas por el microscopio) de forma simultánea e independiente en tiempo real. Los valores numéricos se obtienen mediante fórmulas analíticas. Todo ello maximiza la velocidad de funcionamiento del microscopio (1) Y evita los problemas de convergencia que muestran los métodos iterativos.

El método de la invención hace uso de al menos dos ecuaciones que relacionan

5 analíticamente los parámetros físicos y los observables. Las ecuaciones anteriores permitirán la determinación del Módulo de Young efectivo, E eft. la viscosidad, r¡, y la indentación, 5, utilizando modos dinámicos del microscopio de fuerzas. Esto permite la caracterización de las propiedades de la superficie de una muestra (4), de una forma reproducible y con una alta resolución lateral en tiempo real aplicando las fórmulas ya que

10 son analíticas y no tienen problemas de convergencia que tienen otros métodos iterativos numéricos.

En una realización preferente del método de la invención que se ilustra en la Figura 4, en la etapa (h) del método, se utílizan los cambios en las frecuencías de resonancía del modo principal y del modo secundario, 6.f1, 6.f2, para determinar el Módulo de Young efectivo, Eeff, 15 de la muestra (4) y la indentación, 15, en función de la posición de la micropalanca (2). Para el cálculo analítico de la semi-derivada y de la semi-integral para la fuerza de interacción se utiliza el modelo de Hertz, que permite convertir los datos de LJf, y LJf2 en mapas del Módulo de Young efectivo, Eeff, Y de la indentación, 15, de forma simultánea y/o posterior a la adquisición de la imagen topográfica). Finalmente, el sistema de dos ecuaciones con dos

20 incógnitas se puede despejar explícitamente:

úi kU; /::,./,' ~A, R k,/,' /::"1;

(E.8)

0 = A,kJ, /::,.};

k,}; N,

(E.9)

La última ecuación (E.9) representa una ventaja significativa con respecto a otros métodos que precisan realizar hipótesis sobre la indentación de la muestra (4).

25 El método de la invención presenta también la ventaja de que un cambio en el punto de trabajo, entendido como el cambio de frecuencia que se mantiene fija cuando se mantiene la realimentación topográfica, produce cambios en los mapas de la indentación, la fuerza máxima y el tiempo de contacto, no provoca sin embargo cambios en el Módulo de Young efectivo, Eeff, la viscosidad, r¡ , ni en la topografía medidas en la muestra (4).

En una realización más preferida del método de la invención, partiendo de la indentación, é, y del Módulo de Young efectivo, Eeff• se halla una expresión para el tiempo de contacto te (esquema de la figura 5), a partir de los datos de IJ.f, y IJ.f2_

te = _1-arceos [1 -~J= _1-arceos [1-kJ2 6¡; J

"1 A, " I k,j, ój,

(E. 10)

5 En una realización más preferida (figura 6), partiendo de la indentación, 15, y del Módulo de Young efectivo, Eeff • cuando la punta se encuentra a una distancia mínima de la muestra, se halla una expresión la fuerza máxima conservativa, Fmax• a partir de los datos de tJ.f, y IJ.f2_

(E.11 )

En el esquema del método de la invención que se ilustra en la Figura 6, el método 10 proporciona los valores del Módulo de Young, la indentación, 15, el tiempo de contacto, te, y la fuerza máxima conservativa, Fmax, en función de la posición de la micropalanca (2).

En otra realización preferente del método de la invención en la etapa (h) se utiliza otro modelo de fuerza de interacción, donde el cambio en la disipación del modo principal, relacionado con fuerzas no conservativas, permite determinar la viscosidad, r], de la muestra

15 (4). Para ello se añade al modelo de la fuerza de interacción de Hertz una componente disipativa que puede modelarse como una función par (función de rozamiento generalizado IIr) multiplicada por la velocidad de indentaci6n, de tal forma que la fuerza disipativa, IIrJ , es una función impar y la fuerza total es:

(E .12)

20 donde 11 es la viscosidad, la inclusión de una fuerza disipativa da lugar a una ecuación adicional para la energia disipada en términos de la semi-integral de una función B(d) relacionada con la fuerza disipativa.

lJ.F: (d) = F: ( lJ.j, (d ) + & Q,j, f '" B(d))

01 01 j, k A3/2

, , ,

(E.13)

•

B(x) = 2Jór(x)dx

(E.14 )

La semi-derivada de la función B se puede calcular analíticamente, dando lugar a una ecuación adicional que permite la conversión de las imágenes de 1Jf, , Ilf2• Y Fo! en mapas del Módulo de Young efectivo, E eft. la viscosidad, 11, y la indentación, Ó. El sistema de tres

5 ecuaciones con tres incógnitas (Eaff• (5 , rj) se puede despejar explícitamente, proporcionando además de las ecuaciones para Eaff y ó una ecuación para la viscosidad:

ó¡'2 (ól. 1.FOl -M OlI.2 )

1)=

(E. 18)

La Figura 7 muestra una realización del invento para obtener de forma simultánea el Módulo de Young, la viscosidad, la indentación, el tiempo de contacto y la fuerza máxima

10 conservativa como función de la posición de la micropalanca (2) sobre la muestra (4). En una realización más preferente de la invención se aplica a la determinación del Módulo de Young y de la viscosidad en poli meros y moléculas biológicas.

Otra realización preferida del método de la invención tiene lugar cuando la micropalanca (2) opera en el régimen atractivo (no contacto). En este caso, la fuerza de interacción se puede 15 modelar de acuerdo al modelo de Van der Waals,

HR

FVdW (d) =---,

6d

(E.19)

donde "H" es la constante de Hamaker y "d" la distancia mínima entre la punta (3) y la muestra (4). La semi·derivada y la semHntegral de la fuerza de Van der Waals se pueden calcular analíticamente, dando lugar a un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas que

20 se puede despejar explícitamente, proporcionando relaciones para la constante de Hamaker y la distancia mínima entre la punta (3) y la muestra (4). La Figura 8 muestra una realización del invento para obtener de forma simultánea la constante de Hamaker y la distancia mínima sobre la muestra,

H = -9 2~k, ó/, ( k,J, ó/, )3/2

Ji 3

2 R /, k,/, ó/,

(E.20)

3 Al kJ,l"f.. 4 k,!t,j,

(E.21 )

Conocer la constante de Hamaker es importante para extraer información de la interfase punta (3) -muestra (4). Puede ser utilizada para calcular fuerzas de adhesión y energías superficiales.

La relación entre la distancia mínima y el cambio de frecuencia del primer modo, la fuerza de excitación o el tiempo de contacto (como puede verse aunque no se limita al caso de las fórmulas E.10 Ó E.11) se puede utilizar para establecer la realimentación que controla la topografía. La determinación de la semi-derivada y la semi-integral de la fuerza de interacción permiten la determinación de dos parámetros que controlan el carácter destructivo de la medida , la fuerza máxima y el tiempo de contacto. Una aplicación del

presente invento es precisamente la utilización de la realimentación en tiempo de contacto para efectuar medidas no invasiva de proteínas.

En una realización particular del método de la invención, el método se implementa para hallar propiedades de materiales en los que las fuerzas de interacción dependen de dos parámetros que caracterizan el tipo de interacción además de la separación entre la punta

(3) y la muestra (4) (como es el caso de las fuerzas de Lennard-Jones, fuerzas del modelo DMT). En este caso es necesaria una ecuación adicional para calcular el resto de parámetros.

En una realización más particular del método, la ecuación adicional se obtiene excitando de forma simultánea un modo adicional de vibración n (y registrando como canal adicional .D.fn) . De esta forma se tendrían tres observables conservativos (cambio de frecuencia del primer, segundo y tercer modo) que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que se extraen las propiedades de la muestra (4).

En otra realización más particular del método de la invención, la ecuación adicional se halla registrando la amplitud Bm de un armónico superior, m, del modo principal con frecuencia mk para tener tres observables que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra (4), donde por un armónico superior, Bm, del modo principal se entiende un múltiplo entero de la frecuencia de resonancia de dicho modo principal, y donde los tres observables mencionados son: cambio de frecuencia del modo principal y del modo secundario, .óh .ó-h, Y amplitud, Bm. del armónico superior, m.

l!J3,(d) 2 1

(f~'F(d)-_f:"F(d» )

3k J2JrA1 Al

(E.22)

donde J!'2 F(d) es la integral 3/2 de la fuerza de interacción y B2 es la amplitud del segundo armónico.

En una realización particular del método de la invención, el método se implementa para hallar propiedades de fuerzas disipativas que dependen de dos parámetros o para calcular

10 el radio, R, de la punta (3) de forma simultánea con el cálculo de la viscosidad. Además de la ecuación que existe para la energía disipada por el modo principal de vibración, también existe una ecuación adicional para la energía disipada por el modo superior de vibración en términos de la semi-integral de la función í(d):

(E.23)

15 Esto da lugar a una ecuación adicional que permite la transformación de las imágenes de Ilf1, Ilf2, F01 YF02 en observables que aparecen en un sistema de cuatro ecuaciones. De esta forma, si la componente disipativa de la fuerza incluye una fuerza de histéresis en la energía superficial además de la fuerza viscosa de Voigt, se pueden hallar de forma simultánea la viscosidad r¡ y la histéresis en la energía superficial .ó.Eadh.

20 El método se podría implementa en líquido, el funcionamiento es equivalente al del aire, incluso mejor porque las fuerzas atractivas están muy apantalladas y normalmente sólo hay régimen repulsivo.

Un ejemplo práctico de empleo de la siguiente invención, que se refiere al cálculo del Módulo de Young efectivo, Eeff. viscosidad, 1'], indentación, 15, fuerza máxima conservativa,

25 Fmax, y tiempo de contacto en aire, te, se describe a continuación, y se muestra en las figuras 9, 10, 11 Y 12, utilizando la aproximación para la fuerza de interacción del módelo de Hertz.

En dicho ejemplo de aplicación, se analiza una muestra (4) de PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid). El radio, R, de la punta (3) fue estimado al finalizar el experimento, midiendo una muestra (4) de nanopartículas de oro de radio conocido, obteniéndose un radio de 9.5 nm. Al principio del experimento, se ha de comprobar que se opera bajo las hipótesis correctas: que la amplitud del modo principal es mayor que la longitud típica de la fuerza, y que la amplitud del modo secundario es mucho menor que la del modo principal . Para ello se halla la semi-integral y semi-derivada de la fuerza de forma numérica a partir de la fuerza reconstruida y se compara con la semi-integral y semi-derivada que se hallan a partir del comportamiento de fJ.f, , fJ.f2 con la distancia.

Si ambas curvas coinciden (lo que se ilustra en las Figuras 9 y 10), el método es válido para calcular de forma precisa las propiedades del material. Para comprobar la indentación necesaria para medir un Módulo de Young efectivo y una viscosidad constante en la muestra (4) se convierten los datos de ¡MI. 11f2frente a distancia en curvas del Módulo de Young efectivo, Eeff• la indentación, 15, la fuerza máxima y el tiempo de contacto, te, (Figura 11). Se observa que en este caso el Módulo de Young efectivo, Eeff, es constante a partir de una indentación, 15, de sólo 0.25 nm.

Este resultado es una mejora significativa con respecto a otros métodos tales como el método 'peak force tapping' para el que es necesario penetrar al menos 2 nm. Por último, se procede a registrar la imagen topográfica de forma simultánea a la obtención de los mapas de Módulo de Young efectivo, Eeff, viscosidad, r) , indentación, 15, fuerza máxima conservativa y tiempo de contacto, f:c. Durante la adquisición de la imagen, se varía el punto de trabajo de tal forma que las fuerzas aumentan. Se observa que en la mitad inferior de las imágenes que se muestran en la Figura 12 se ha cambiado el punto de trabajo de tal forma que la fuerza que la punta (3) de la micropalanca (2) aplica sobre la muestra (4) ha cambiado. Los mapas de la indentación, la fuerza máxima y el tiempo de contacto también muestran un aumento, mientras el Módulo de Young efectivo, la viscosidad y la topografía no muestran cambios.

Este invento puede ser aplicado sobre muestras heterogéneas como se ve en la figura 15, donde sobre una muestra de nanopartículas de oro de 5nm sobre silicio se observa que el módulo de Young de la nanopartícula es del orden de 100-200 GPa.

La presente invención no debe verse limitada por las formas de realización aquí descritas. Otras formas de realización que introduzcan pequeñas variaciones en el método aquí descrito, pueden ser realizadas por los expertos en la materia.

En consecuencia, la presente invención queda definida por el siguiente juego de reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, basado en modular en frecuencia y de forma simultánea al menos dos modos de vibración de una micropalanca (2) de un microscopio de fuerzas (1), caracterizado por emplear los desplazamientos de frecuencia de los modos excitados y los cambios en la fuerza de excitación para cuantificar propiedades nanomecánicas.
2.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende:

a.

colocar en la cabeza de un microscopio de fuerzas (1) una micropalanca (2) con una punta (3) en su extremo, que interactúa con la muestra (4), y que presenta al menos dos modos de vibración, un modo principal y un modo secundario;

b.

disponer de dos elementos, uno para hacer vibrar (5) a la micropalanca (2) y el otro para desplazar (13) a la micropalanca (2) sobre la muestra (4) o parte de el la:

c.

enviar a la unidad de excitación (5) asociada a la micropalanca (2) de la cabeza del microscopio (1), las señales de excitación generadas por (7, 8, 9, 10) Y sumar, mediante un sumador de señales (6), las mencionadas señales de excitación que hacen vibrar a la micropalanca (2);

d.

calibrar los siguientes parámetros asociados a la operación de la micropalanca (2):

constante de fuerzas, k;;

factor de calidad, Q ¡;

inversa de la sensibilidad óptica del fotodiodo, i, en cada uno de los dos modos de vibración;

radio, R, de la punta (3) de la micropalanca (2);

e) comprobar las hipótesis de partida. según las siguientes etapas:
6.1) comprobar que la amplitud de vibración del modo principal de la micropalanca (2) es mayor que la longitud de escala de la fuerza de interacción.

e.2) comprobar que la amplitud de vibración, del modo secundario de la micropalanca (2) es muy inferior a la amplitud de vibración, del modo principal;

e.3) fijar una pluralidad de bucles de realimentación que comprenden:

-

un bucle de realimentación (7) de la amplitud, A1• del modo principal de vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la micropalanca (2) en dicho modo principal, manteniendo constante dicha amplitud, A1;

-

un bucle de realimentación (8) de la amplitud, Az, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la amplitud de excitación de la micropalanca (2) en dicho modo secundario, manteniendo constante dicha amplitud, A2;

-

un bucle de realimentación (9), de fase, q¡" del modo principal de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, f1 de la micropalanca (2) en dicho modo principal, manteniendo constante la fase, <P1, en un valor igual a TT/2;

-

un bucle de realimentación (10), de fase, <P2, del modo secundario de vibración, donde se hace variar la frecuencia de excitación, h, de la micropalanca (2) en dicho modo secundario, manteniendo constante la fase, <P2, en un valor igual a TT/2;

-

un bucle de realimentación (11) responsable de regular la distancia media (12) entre la punta (3) de la micropalanca (2) y la muestra (4) y controlar asi la realimentación topográfica (11).

f) detectar, mediante un sistema (14) adaptado al efecto, la señal de deflexión de la micropalanca (2);

g) registrar, mediante una unidad de procesamiento (15) provista de al menos dos canales de transferencia de información, las señales correspondientes a los modos de vibración, donde dicho registro puede realizarse simultáneamente o posteriormente a la adquisición de una imagen de microscopía;

h) transformar, mediante el empleo de fórmulas analíticas, los datos mostrados en los mapas para métricos de propiedades de la muestra (4).
3.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 2, caracterizado por que el sistema punta (3) -micropalanca (2) se sitúa sobre una muestra (4) heterogénea para medir diversas propiedades mecánicas como el Módulo de Young efectivo, EaH• la viscosidad, 11, de la muestra (5), o la constante de Hamaker, H, de la interfase.
4.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por que en la etapa (c) del método en que se generan las señales de excitación , la micropalanca (2) es excitada según los mencionados modo principal y modo secundario de vibración.
5.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas

según la reivindicación 4, caracterizado por que la señal resultante que llega a la micropalanca (2) viene expresada según la siguiente relación matemática:

(E.?)

donde FOi, fi son, respectivamente, la señal de excitación, y la frecuencia de excitación del modo i que son transferidas al elemento que excita la vibración de la micropalanca (2).
6.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 5, caracterizado por que la señal se genera utilizando la señal de referencia de un dispositivo lock-in digital comprendido dentro de un procesador digital de señal.
7.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por que en la etapa (h) del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de propiedades de la muestra (4), se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del modo principal, 6.f1• y del modo secundario, 6.f2• para hallar el Módulo de Young

efectivo, EeH• de la muestra (4) Y la indentación, é, en función de la posición de la

micropalanca (2) sobre la muestra (4).
8.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas

según la reivindicación 7, caracterizado por que los datos de cambio en la frecuencia

5

de resonancia del modo principal, 1J.f1• y cambio en la frecuencia de resonancia del

modo secundario, 1J.f2> se convierten, mediante un cálcu lo analítico, y simultáneamente o

posteriormente a la adquisición de una imagen, en mapas paramétricos que expresan el

Módulo de Young efectivo, Eeff, Y la indentación, 15 .
9.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas según la reivindicación 8,

10

caracterizado por que la fuerza de interacción se modela de acuerdo al modelo de

Hertz y el Módulo de Young efectivo, Eeff, y la indentación, 5, se calculan mediante el

siguiente sistema de ecuaciones:

E = 2J2 k; j, /',./,' off W kJ,' /',.j,

(E.8)

(j = A, kJ, /',.j,

k,j, /',.f, (E.9)

15

10. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas

según la reivindicación 8, caracterizado por que el tiempo de contacto, te, entre la punta

(3) y la muestra (4) se calcula mediante la siguiente expresión matemática:

I =arccos 1--=arccos 1---"I ( 8J I ( k,J, I!.1.J , "1. A, "1. k,1. I!.j, (E.10)
11.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topograficas en microscopía de fuerzas

20

según la reivindicación 8, caracterizado por que cuando la punta (3) se encuentra a

una distancia mínima de la muestra (4), se calcula la fuerza máxima conservativa de

Hertz, Fmax, según la siguiente expresión matemática:

(E. 11 )

28
12.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas

según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 Y 7, caracterizado por que en la etapa (h)

del método en que se transforman los datos mostrados en los mapas paramétricos de

propiedades de la muestra, se utilizan los cambios en las frecuencias de resonancia del

5

modo principal , y del modo secundario, y el cambio en la señal de excitación del modo

principal para hallar la viscosidad, r¡, el módulo de Young efectivo, Eeff, de la muestra (4)

y la indentación, Ó, en función de la posición de la micropalanca (2 ) sobre la muestra

(4).
13.

Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas

10

según las reivindicaciones 8, 9 Y 12, caracterizado por que se añade al modelo de la

fuerza conservativa de Hertz una componente disipativa que puede modelarse como

proporcional a la velocidad de indentación, de tal forma que la fuerza total de interacción

se expresa mediante la siguiente relación matemática:

15

donde Ó.r es una función par denominada función de rozamiento generalizado, y 8 es

la velocidad de indentación en la muestra (4);

de manera que la inclusión de la mencionada componente disipativa de la fuerza da

lugar a una ecuación adicional para la energía disipada en términos de la semi-integral

de una función, B(d), relacionada con la fuerza disipativa:

20

!1F (d) = F ( !1J, Cd) + J2ñQ,J, / ''' BCd )]1)1 1)1 J, k A3/2 -, , ,

(E .13)

donde la función B se define mediante la siguiente expresión matemática:

•

B(x ) =2f!1r(x)dx

(E .14)

29

dando lugar a una ecuación adicional que permite la conversión de las imágenes de 6.k 6.f2 Y F01 en mapas paramétricos del módulo de Young efectivo, Eaf!. de la viscosidad, r,. y de la indentación, (5 , y haciendo que el sistema de tres ecuaciones:

!!.F (d) = F [!!.j, (d) + J2iéQ,j, ry'¡;¡¡¡S' J

01 01 j, k A3/2 2

, , ,

(E. 17)

con tres incógnitas, Eaf!. 5, 11, se pueda expresar explícitamente, proporcionando además de las ecuaciones para el módulo de Young efectivo, Eaf" Y para la indentación,
15. una ecuación para la viscosidad, r], expresada de la siguiente manera:

12 k; 41/ (41; /¡Fo, -!1F01¡;2) JTrAIR k, fJz2 Q, 4!;2Fol

10 (E. 18)
14. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por que la micropalanca

(2) opera en régimen atractivo o de no contacto, y la fuerza de interacción entre la punta

(3) y la muestra (4) se modela de acuerdo al siguiente modelo matemático, conocido 15 como modelo de Van der Waals:

(E .19) donde d es la distancia entre la punta (3) y la muestra (4).
15. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 14, caracterizado por que se calculan analíticamente la semi· derivada y la semi·integral de la fuerza de interacción del modelo de van der Waals, dando lugar a un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, que se puede expresar explícitamente, proporcionando relaciones para la constante de Hamaker, H, y la distancia mínima, dmin, entre punta (3) y muestra (4):

(E.20)

3A, k,j,!;j,

4 k,j!;f,

(E.21 )

5 16. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopia de fuerzas según la reivindicación 15, caracterizado por que la distancia media (12) entre la punta

(3) y la muestra (4) se controla manteniendo un cambio en la frecuencia, 6.f1• fijo mientras la micrapalanca (2) se desplaza a lo largo y ancho de la muestra (4).
17. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas 10 según la reivindicación 15, caracterizado por que la distancia media (12) entre la punta

(3) y la muestra (4) se controla manteniendo una fuerza de excitación , F01 , fija.
18. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 2, caracterizado por que en la etapa e3) se establece el sistema de realimentación (11) topográfico del quinto bucle en otros parámetros como el tiempo 15 de contacto, te, o la fuerza máxima, Fma x, en valores pre-establecidos alternativas al

cambio de frecuencia de resonancia, .ó.f1, o disipación, .ó.F01 .
19. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según la reivindicación 18, caracterizado por que se utiliza realimentación en tiempo de contacto, te, para efectuar medidas no invasivas en materiales blandos.

20 20. Método bimodal para cuantificar propiedades, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que las fuerzas de interacción entre la punta (3) y la muestra (4) se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que se añade una nueva ecuación que se obtiene al excitar un modo adicional de vibración, n, y registrando como canal adicional, .ó.fn, para tener tres

25 observables conservativos, siendo éstos los cambios de frecuencia de cada modo de

vibración , de manera que se obtiene un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas

del que extraer las propiedades de la muestra, donde por observables se entiende los parámetros medidos directamente por el microscopio de fuerzas bimodal.
21. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que las fuerzas de interacción entre la punta (3) y la muestra (4) se modelan mediante dos parámetros además de la separación entre la punta y la muestra, de manera que la ecuación

5 adicional se halla registrando la amplitud Bm de un armónico superior, m, del modo principal con frecuencia m il. para tener tres observables que dan lugar a un sistema de tres ecuaciones con tres incógnitas del que extraer las propiedades de la muestra (4), donde por un armónico superior, Bm. del modo principal se entiende un múltiplo entero de la frecuencia de resonancia de dicho modo principal, y donde los tres observables

10 mencionados son: cambio de frecuencia del modo principal y del modo secundario, bof1, flfz, Y amplitud, Bm, del armónico superior, m,

!J.B, (d) = 2 (J~' F (d) -+r:"F(d» )

3k J 21CA, ' (E.22)

donde 1~'2 F(d) es la integral 3/2 de la fuerza de interacción y 8z es la amplitud del segundo armónico.

15 22 . Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas según la reivindicación 13, caracterizado por que la fuerza de interacción contiene una componente disipativa dependiente de dos parámetros y se registra de forma adicional el canal disipación del modo secundario de vibración para utilizar la ecuación que relaciona la energía disipada por el modo secundario con la semi~integral de la función r (d):

I!.F.,(d)= F" (I!.f,(d) + &Q,f, I~"tll'(d)J

!, k,JA,

20 (E.23)

dando lugar a una ecuación adicional que permite la transformación de las imágenes de flf" bofz, F01 y Foz en observables que aparecen en un sistema de cuatro ecuaciones para hallar simultáneamente la viscosidad, r" y la histéresis de la energía superficial, flEadh .

25 23. Método bimodal para cuantificar propiedades no topográficas en microscopía de fuerzas según cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la medida se realiza teniendo la muestra inmersa en líquido.