WO2014126207A1 - 試料中の有機酸の検出方法 - Google Patents

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彰 本多
照雄 宮▲崎▼
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Ajinomoto Co Inc
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting organic acids such as 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyisobutyric acid in a sample with high sensitivity.
  • 3-Hydroxybutyric acid is the most stable ketone body in serum and is synthesized in the liver during starvation and undernutrition. For this reason, 3-HB is useful as a biomarker for evaluating fatty acid catabolism in the liver.
  • an enzyme spectrophotometric method for detecting NADH after adding NAD and D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase is used (see, for example, Non-Patent Document 1 or 2).
  • these methods have a problem of low detection sensitivity of 3-HB in serum.
  • 3HB is enzymatically converted to acetoacetic acid (AA), then derivatized with p-nitrobenzenediazonium fluoroboric acid, and this derivative is detected by high-sensitivity HPLC (high-performance liquid) that is detected by spectrophotometry or ultraviolet light.
  • HPLC high-performance liquid
  • a method for quantification by a chromatography assay has been reported (for example, see Non-Patent Document 3 or 4).
  • a method for directly detecting 3-HB a method for detecting by derivatization after gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) (for example, see Non-Patent Document 5 or 6), or a method without derivatization.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • LC-MS / MS liquid chromatography-tandem mass spectrometry
  • ESI electrospray ionization
  • BCAA branched chain amino acids
  • BCAA is a branched chain ⁇ -keto acid (from valine to ⁇ -ketoisovaleric acid) by BCAT (BCAA aminotransferase) and BCKDH complex (branched ⁇ -keto acid dehydrogenase complex) in mitochondria.
  • BCAT BCAA aminotransferase
  • BCKDH complex branched ⁇ -keto acid dehydrogenase complex
  • 3-HIB is expected to be used as an index reflecting the amino acid catabolism state in skeletal muscle, that is, as a BCAA catabolism marker in skeletal muscle.
  • a method that can detect a trace amount of 3-HIB in a biological sample with sufficient sensitivity has not been reported so far.
  • LC-MS / MS method LC-N-ESI-MS / MS
  • ESI electrospray ionization
  • a method for example, see Non-Patent Document 7
  • the method has low sensitivity, for example, a large amount of serum is required to detect 3-HIB in serum.
  • 3-HB in blood is detected by the GC-MS method, it has been reported that 3-HIB could not be separated from 3-HB by chromatography (for example, non-patent literature). 8).
  • 3-hydroxyisovaleric acid 3-HMB
  • leucine is metabolized in the mitochondria via KIC to the CoA form (isovaleryl CoA), but about 5 to 10% of KIC passes through the mitochondrial membrane, and in the cytoplasm, 3-fold by KIC-dioxygenase.
  • the effects of 3-HMB include protein synthesis promotion by mTOR pathway, protein degradation inhibition by inhibition of ubiquitin / proteasome pathway, and muscle synthesis by promotion of cholesterol synthesis by hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) converted from HMB-CoA. Sheath stabilization is known.
  • 3-HMB is expected to be used as a marker for synthesis of liver protein (albumin etc.) derived from BCAA and skeletal muscle hypertrophy.
  • 3-HMB is used as a supplement for the purpose of enhancing muscles, in order to study the blood dynamics when 3-HMB is ingested, the blood 3
  • -HMB concentration was measured by LC-N-ESI-MS / MS without derivatization (see, for example, Non-Patent Document 10).
  • HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography
  • the detection limit is 0.4 ⁇ M, and 3-HMB in a biological sample (blood, saliva, etc.) is in a smaller amount than 3-HB or 3-HMB, so a method for detecting with higher sensitivity is required (for example, refer nonpatent literature 11.).
  • 2-hydroxybutyric acid (2-HB) is an organic acid similar in structure to 3-HB and the like.
  • 2-HB ⁇ -ketobutyric acid, which is a metabolite of threonine and methionine, is produced as a by-product of the catabolism reaction by 2-DHB dehydrogenase ( ⁇ -HBDH), which is an NADH-dependent LDH or LDH isozyme.
  • ⁇ -HBDH 2-DHB dehydrogenase
  • ⁇ -ketobutyric acid is metabolized to propionyl CoA, which is a precursor of succinyl CoA
  • the increase in 2-HB is due to increased catabolism of ⁇ -ketobutyric acid by LDH or ⁇ -HBDH, or from ⁇ -ketobutyric acid to propionyl-CoA.
  • ⁇ -ketobutyric acid is also associated with the production of glutathione because cysteine, which is a precursor amino acid of glutathione, which is a powerful antioxidant, is also produced as a by-product when metabolized from cystathione.
  • the present invention is highly sensitive to organic acids, particularly organic acids such as 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB that can be expected to be used as biomarkers contained in biological samples.
  • the purpose is to provide a method of detecting well.
  • a method for detecting an organic acid in a sample according to the present invention is a method for detecting an organic acid in a sample.
  • the organic acid in a sample is represented by the following general formulas (1) -1 to (1) -3: (In the formula (1) -1 to 3, one of R 1 and R 2 represents a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the other represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms).
  • Derivatives are synthesized by ester linkage with a derivatization reagent represented by any of the above, and the derivatives are detected by an electrospray ionization LC-MS / MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry) method in positive ion mode. It is characterized by.
  • the derivatization reagent is composed of 2-pyridinemethanol, 1-piperidineethanol, and 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine. It is preferable that it is 1 or more types selected from a group.
  • the organic acid is represented by the following general formula (2) (in the formula (2), R 3 is a group having 2 to 6 carbon atoms). It is preferably an organic acid represented by a hydroxyalkyl group.
  • the organic acid is 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, 3-hydroxyisovaleric acid, and 2-hydroxybutyric acid. It is preferable that it is 1 or more types selected from the group which consists of.
  • the sample is preferably a biological sample.
  • the sample is preferably serum, tears, saliva, or urine.
  • the method for evaluating the likelihood of developing cirrhosis according to the present invention is selected from the group consisting of 3-hydroxyisobutyric acid, 3-hydroxyisovaleric acid, and 2-hydroxybutyric acid in a biological sample collected from a subject.
  • One or more organic acids detected by the method for detecting an organic acid in the sample of [1] or [2], and measuring the concentration of the organic acid in the biological sample; and the quantifying step Comparing the organic acid concentration obtained in step 1 with a preset threshold and evaluating the possibility of developing cirrhosis in the subject, wherein the biological sample is serum or saliva To do.
  • the method for evaluating the possibility of developing hepatic encephalopathy includes the step of [1] or [2], wherein 3-hydroxyisobutyric acid in a biological sample collected from a subject who has developed cirrhosis is used.
  • the biological sample collects the quantitative step of detecting the organic acid in the sample and measuring the 3-hydroxyisobutyric acid concentration in the biological sample, and the 3-hydroxyisobutyric acid concentration obtained in the quantitative step. Comparing with the 3-hydroxyisobutyric acid concentration in the biological sample collected from the subject before the determined time point, and evaluating the possibility of developing hepatic encephalopathy in the subject, It is serum or saliva.
  • the biomarker of hepatic encephalopathy or the onset possibility thereof according to the present invention is characterized by comprising 3-hydroxyisobutyric acid.
  • the method for evaluating an energy supply source according to the present invention comprises at least one organic substance selected from the group consisting of 3-hydroxyisobutyric acid and 3-hydroxybutyric acid in a biological sample collected from a subject during exercise.
  • the method for monitoring an energy supply source according to the present invention includes 3-hydroxyisolation in a plurality of biological samples collected from a subject over time from immediately before the start of exercise to after a lapse of a certain period after the end of exercise.
  • One or more organic acids selected from the group consisting of butyric acid and 3-hydroxybutyric acid are detected by the organic acid detection method in the sample of [1] or [2], respectively, and the organic acid in each biological sample is detected.
  • the monitoring process for examining the time-dependent change of the organic acid concentration by measuring the acid concentration, and the time-dependent change of the organic acid concentration obtained in the monitoring process energy during or after exercise in the subject
  • An evaluation step for evaluating a supply source wherein the organic acid concentration in the biological sample is used as a marker of an energy supply source, and the biological sample is serum or saliva. It is characterized by that.
  • the method for detecting an organic acid in a sample according to the present invention is a method of derivatizing an organic acid such as 3-HIB, 3-HB, 3-HMB, 2-HB and the like and detecting it by LC-P-ESI-MS / MS It is possible to directly detect the organic acid to be detected in the sample.
  • the detection sensitivity is much higher than the detection method by conventional enzyme spectrophotometry and LC-MS / MS, so that not only serum but also organic acids such as tears and saliva are used. It can be expected to be useful for organic acid detection from a biological sample having a relatively low content.
  • FIG. 3 shows a typical P-ESI MS spectrum of 3-HB (2 PM-3-HB) derivatized with 2-pyridinemethanol.
  • Example 1 it is the figure which showed the total ion chromatogram (upper stage) and the MS chromatogram (lower stage) of the sample containing only 3-HB derivatized with 2-pyridinemethanol. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 2A.
  • Example 1 it is the figure which showed the total ion chromatogram (upper part) and the MS chromatogram (lower part) of the sample containing only 3-HIB derivatized with 2-pyridinemethanol. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 2C.
  • Example 1 it is the figure which showed the product ion chromatogram when using m / z 196 of the sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 2-pyridinemethanol as a precursor ion. It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 2E.
  • Example 2 it is the figure which showed the total ion chromatogram (upper part) and MS chromatogram (lower part) of the sample containing only 3-HB derivatized with 1-piperidine ethanol. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 3A.
  • Example 2 it is the figure which showed the total ion chromatogram (upper part) and MS chromatogram (lower part) of the sample containing only 3-HIB derivatized with 1-piperidine ethanol. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 3C.
  • Example 2 it is the figure which showed the product ion chromatogram when using m / z 216 of the sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 1-piperidine ethanol as a precursor ion. It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 3E.
  • Example 3 the figure which showed the total ion chromatogram (upper part) and MS chromatogram (lower part) of the sample containing only 3-HB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine. is there. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 4A.
  • Example 3 the figure which shows the total ion chromatogram (upper part) and MS chromatogram (lower part) of the sample containing only 3-HIB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine. is there. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 4C.
  • Example 3 a product ion chromatogram when m / z 216 of a sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine is used as a precursor ion is shown.
  • FIG. It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 4E.
  • Comparative Example 1 the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of a sample containing only 3-HB derivatized with 3-pyridinemethanol are shown. It is the figure which showed MS spectrum of FIG. 5A.
  • comparative example 1 it is the figure which shows the total ion chromatogram (upper part) and the MS chromatogram (lower part) of the sample containing only 3-HIB derivatized with 3-pyridinemethanol. It is the figure which showed the MS spectrum of FIG. 5C.
  • Comparative Example 1 a product ion chromatogram of a sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 3-pyridinemethanol when m / z 196 is used as a precursor ion is shown. It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 5E.
  • Comparative Example 2 it is a diagram showing a product ion chromatogram when m / z 204 of a sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 2-diethylaminoethanol is used as a precursor ion. It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 6E.
  • Comparative Example 3 the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of a sample containing only 3-HB derivatized with 3-hydroxy-1-methylpiperidine are shown. It is the figure which showed MS spectrum of FIG. 7A.
  • Comparative Example 3 the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of a sample containing only 3-HIB derivatized with 3-hydroxy-1-methylpiperidine are shown. It is the figure which showed MS spectrum of FIG. 7C.
  • Comparative Example 3 it is a diagram showing a product ion chromatogram when m / z 202 of a sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 3-hydroxy-1-methylpiperidine is used as a precursor ion. . It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 7E.
  • Comparative Example 4 it is a diagram showing a product ion chromatogram when m / z 196 of a sample containing 3-HB and 3-HIB derivatized with 4-pyridinemethanol is used as a precursor ion. It is the figure which showed the MS / MS spectrum of the 3-HIB peak of FIG. 8E.
  • FIG. 6 shows a typical SRM chromatogram of 3-HB (2 PM-3-HB) derivatized with 2-pyridinemethanol and [ 13 C 4 ] isotopes in Example 4.
  • Example 5 it is the figure which showed the result of having measured the 3-HB density
  • Example 8 the total ion chromatogram (top) of a sample containing 3-HMB and 2-HB derivatized with 2-pyridinemethanol, and the product ion chromatogram when m / z 196 is used as a precursor ion
  • FIG. 4 is a diagram showing a product ion chromatogram (lower stage) when m / z 210 is a precursor ion.
  • FIG. 11B is a diagram showing an MS spectrum (2-HB 2PM ester derivative) in the middle product ion chromatogram of FIG. 11A. It is the figure which showed MS spectrum (2-PM ester derivative of 3-HMB) of the product ion chromatogram of the lower stage of FIG. 11A.
  • Example 9 2-pyridine derivatized with methanol 3-HB and 3-HIB and 3-HMB and total ion chromatogram of a sample containing 2-HB and 3-HB- 13 C 4 (1 stage) , Product ion chromatogram when m / z 196 is used as a precursor ion (second stage), product ion chromatogram when m / z 200 is used as a precursor ion (third stage), and m / z 210 as a precursor ion
  • FIG. 6 is a diagram showing a product ion chromatogram (fourth stage). In Example 10, it is the figure which showed the measurement result of the 3-HB density
  • Example 10 it is the figure which showed the measurement result of 3-HB density
  • Example 11 it is the figure which showed the result of having investigated the correlation of the serum concentration of 3-HB and the concentration in saliva (fluid).
  • Example 11 it is the figure which showed the result of having investigated the correlation of the serum concentration of 3-HIB, and the concentration in saliva (fluid).
  • Example 11 it is the figure which showed the result of having investigated the correlation of the density
  • Example 12 it is the figure which showed the test subject's exercise
  • Example 12 it is the figure which showed the time-dependent change of the density
  • Example 12 it is the figure which showed the time-dependent change of the amount of urine excretion per unit time (micromol / h) in each test
  • Example 12 it is the figure which showed the time-dependent change of the density
  • Example 13 it is the figure which showed the measurement result of the 3-HIB density
  • Example 13 it is the figure which showed the measurement result of the 3-HIB density
  • change in serum 3-HIB concentration upper
  • change in serum albumin concentration middle
  • change in serum 3-HIB concentration over time upper stage
  • change in serum albumin concentration over time (middle stage)
  • the method for detecting an organic acid in a sample according to the present invention is a method for detecting an organic acid in a sample, Derivatives are synthesized by ester linkage with a derivatizing reagent represented by any of the following general formulas (1) -1 to (1) -3, and the derivatives are detected by LC-P-ESI-MS / MS method It is characterized by doing.
  • esterifying with a derivatizing reagent represented by any one of the following general formulas (1) -1 to 3 the ionization efficiency of organic acids by P-ESI is improved, and the detection sensitivity by LC-MS / MS is remarkable. To improve.
  • R 1 and R 2 each represents a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the other represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. That is, when R 1 is a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 2 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and R 2 is a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • An organic acid can be efficiently ionized by using a compound having a 6- or 5-membered heterocycle containing a nitrogen atom and having a hydroxyl group linked with an alkyl group in the vicinity of the nitrogen atom as a derivatization reagent. Furthermore, since the retention time of LC of the obtained derivative (esterified product) is relatively long, it can be clearly separated from the reagent used for derivatization.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be a linear alkyl group or a branched alkyl group. Specifically, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, i-butyl group, s-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl Groups and the like.
  • R 1 or R 2 in the general formulas (1) -1 to 3 is preferably a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, or an i-propyl group.
  • the hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be a group in which one hydrogen atom in a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is substituted with a hydroxyl group.
  • a group in which one hydrogen atom in the branched chain alkyl group is substituted with a hydroxyl group may be used. Specific examples include 2-hydroxyethyl group, 3-hydroxypropyl group, 4-hydroxybutyl group, 5-hydroxypentyl group, 6-hydroxyhexyl group and the like.
  • the derivatization reagent represented by the general formula (1) includes at least one selected from the group consisting of 2-pyridinemethanol, 1-piperidineethanol, and 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine. Preferably there is.
  • organic acids having similar structures such as 3-HIB, 3-HB, 3-HMB and 2-HB can be separated well by LC. As a result, both of them can be detected simultaneously (detection by one LC-P-ESI-MS / MS for one sample).
  • the retention time is slow, and the influence of the peak by the derivatization reagent on the derivatized organic acid ester peak to be detected is small. Methanol is particularly preferred.
  • the LC-P-ESI-MS / MS method can be performed by a conventional method except that the compound represented by the general formula (1) is used as a derivatization reagent.
  • HPLC and MS in LC-MS / MS can be performed in the same manner as known conditions for detecting a carboxylic acid ester or under appropriately modified conditions.
  • the detection method according to the present invention only one type of organic acid may be detected in one LC-P-ESI-MS / MS, or two or more types of organic acid may be detected simultaneously.
  • the organic acid to be detected in the detection method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having a carboxyl group, and the detection method is applicable to detection of many organic acids having a carboxyl group. it can.
  • the detection method according to the present invention is preferably used for detection and quantification of organic acids which are intermediate metabolites such as glycolysis, TCA cycle, and fatty acid synthesis. Especially, it is preferable that the detection method concerning this invention is used for the detection of the organic acid represented by following General formula (2).
  • R 3 represents a hydroxyalkyl group having 2 to 6 carbon atoms.
  • the hydroxyalkyl group having 2 to 6 carbon atoms may be a branched hydroxyalkyl group or a linear hydroxyalkyl group.
  • Examples of the hydroxyalkyl group include 2-hydroxyethyl group, 3-hydroxypropyl group, 2-hydroxypropyl group, 4-hydroxybutyl group, 2-hydroxybutyl group, 2- (hydroxymethyl) propyl group, 2- Examples thereof include a hydroxypentyl group, 3-hydroxy-2, 2-dimethylpropyl group, 3-hydroxypentyl group, 5-hydroxypentyl group, 6-hydroxyhexyl group, 2-hydroxyhexyl group and the like.
  • R 3 is preferably a hydroxyalkyl group having 2 to 3 carbon atoms.
  • the organic acid represented by the general formula (2) is preferably at least one selected from the group consisting of 3-HIB, 3-HB, 3-HMB, and 2-HB. More preferably, HB and 3-HIB or 3-HIB, 3-HB and 3-HMB are detected simultaneously.
  • 3-HB is a marker for fatty acid catabolism in the liver
  • 3-HIB and 3-HMB can be BCAA catabolism markers in skeletal muscle. That is, the detection method according to the present invention can simultaneously detect a fatty acid catabolism marker in the liver and a BCAA catabolism marker in skeletal muscle.
  • the organic acid to be detected is quantitatively detected based on a calibration curve created using an organic acid with a known concentration. can do.
  • the sample used in the detection method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a sample containing an organic acid.
  • biological samples, lakes, seas, rivers, soils, etc. Examples include samples collected from nature, cultured cells, cultures of microorganisms such as yeast and bacteria, and the like. Since the detection method according to the present invention is very sensitive, it is generally preferable to perform on a sample that contains only a very small amount of organic acid or a sample that contains a very small amount of organic acid. More preferably.
  • the biological sample may be a sample collected from a living body, and is preferably collected from an animal such as a human, a mouse, or a rat.
  • tissue extract such as a tissue piece collected from the tissue.
  • An extract such as a tissue piece can be prepared by homogenizing a tissue piece or the like by a conventional method.
  • the sample used in the detection method according to the present invention is preferably serum, tears, saliva, or urine.
  • the detection sensitivity when 3-HIB is detected by the detection method according to the present invention is 100 times or more compared with the case where detection is performed by LC-N-ESI-MS / MS without conventional derivatization. . Further, the sensitivity is 10 times or more higher than when a derivative obtained by derivatizing 3-HIB with HCl-butanol is detected by positive ESI-LC-MS / MS. For this reason, the detection method according to the present invention can be used for simultaneous determination of 3-HIB and 3-HB, and for 3-HIB and 3-HB in 5 ⁇ L or less of serum, 5 ⁇ L or less of saliva, tears, or cell culture solution. Simultaneous determination of HB, 3-HMB and 2-HB is possible.
  • the detection method according to the present invention can be used to make non-invasive treatment using saliva and tear fluid as a measurement sample.
  • BCAA catabolism in skeletal muscle can be more directly evaluated by detecting 3-HIB by the detection method according to the present invention. That is, the detection method according to the present invention is also useful as a new clinical test for evaluating BCAA catabolism in skeletal muscle.
  • the 3-HIB concentration in serum, tears, saliva and the like can also be used as an index (biomarker) for predicting the effect by administering the BCAA preparation.
  • the degree of catabolism of BCAA in skeletal muscle is, for example, cirrhosis, hepatic encephalopathy, myositis, steroid myopathy, heart failure, bad epidemic due to use of anticancer agents, rhabdomyolysis, disuse muscle atrophy, Blood albumin levels in patients suffering from diseases such as hyperthyroidism, chronic fatigue syndrome, sarcopenia (aging muscle weakening phenomenon), mitochondrial fatty acid oxidation disorders, dialysis patients, surgically invasive patients, elderly people, etc. Or an indicator (biomarker) of malnutrition or muscle protein degradation for a person whose blood BCAA concentration is low or may be low.
  • 3-HIB concentrations in serum, tears, saliva, etc. can be used as an indicator of nutritional status
  • 3-HIB concentrations in biological samples can be used, for example, for drug discovery screening, particularly for the treatment of various diseases described above. It is expected to be used as a marker showing the pharmacological effect of drug candidates and as a marker for toxicity evaluation in the safety test of active ingredients.
  • 3-HIB concentration, 3-HB concentration, and 3-HMB concentration in serum or saliva are the energy source balance of liver and skeletal muscle during or after exercise (dependency of energy metabolism tissue and nutrient supply) Can be an index (biomarker) for evaluating If the 3-HB concentration or 3-HIB concentration in serum or saliva has not changed much since resting during or after exercise, it can be evaluated that sugar is used as an energy supply source.
  • 3-HIB concentration in serum or saliva is preferable to 3-HIB, and 3-HIB concentration in saliva is more preferable than 3-HMB .
  • a biomarker for evaluating the energy production state by different tissues and different nutrient sources in the liver and skeletal muscle during or after exercise it is necessary to measure both 3-HIB concentration and 3-HB concentration.
  • 3-HIB and / or 3-HB in saliva or serum from saliva or blood collected from a subject during exercise is detected by the detection method according to the present invention, and 3-HIB concentration and / or Alternatively, the energy source during exercise in the subject can be evaluated by measuring the 3-HB concentration and comparing the concentration with a predetermined threshold value set in advance.
  • the threshold is preferably set for each subject, but is set based on the results of measuring 3-HIB concentration and the like after performing an exercise that is expected to have the same amount of exercise load for many subjects. Also good.
  • blood or saliva is sampled from a subject over time between immediately before the start of exercise and after a lapse of a certain period after the end of exercise, and the 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration in each sample is recorded.
  • the 3-HIB concentration and / or the 3-HB concentration in blood or saliva can be monitored (change over time). Based on the 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration change over time obtained as a result of monitoring, the energy source during exercise in the subject can be evaluated.
  • blood or saliva is collected as a sample from the subject at rest in advance, and the 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration in each sample is determined. It is preferable to measure by the detection method according to the present invention and use the obtained measurement value as a reference for evaluation of the energy supply source during exercise.
  • overwork state In such an overwork state, by measuring the concentration of 3-HB and 3-HIB in serum or saliva, the energy supply balance by catabolism derived from fatty acid catabolism of liver and BCAA catabolism derived from skeletal muscle protein, Since the degree of dependence can be evaluated, it can be an indicator of overwork status. For example, 3-HIB concentration and 3-HB concentration at rest (normal state) when not exercising, and 3-HIB concentration and 3-HB in saliva or serum after exercise that does not cause overwork The concentration is measured by the detection method according to the present invention, and from these measured values, the 3-HIB concentration and 3-HB concentration in the overwork state and the 3-HIB concentration and 3-HB in the non-overwork state are determined.
  • a threshold for dividing the density is set in advance.
  • the detection method according to the present invention 3 -Assess the energy source balance in the subject by measuring the HIB and 3-HB concentrations and comparing the concentrations to a preset overwork threshold. Specifically, if the subject's 3-HIB concentration and 3-HB concentration are lower than the overwork threshold, the subject's exercise load is appropriate, and the subject is likely not overworked, When the 3-HIB concentration of the subject is equal to or higher than the overwork threshold, it can be evaluated that the subject's exercise load is excessive and the subject is likely to be overworked.
  • the overwork threshold is preferably set for each subject, but it is set from the results of measuring 3-HIB concentration or 3-HB concentration after performing exercise to such an extent that many healthy subjects do not overwork. Also good. Collecting saliva or blood over time from an exercising subject and measuring and monitoring 3-HIB and 3-HB concentrations over time, thereby ending exercise before a dangerous overwork condition You can also.
  • the sample collection from the subject does not necessarily have to be during exercise, and the results obtained from the sample taken at rest of the subject who is performing a long-term exercise program or training are the same as those before the exercise program or before training.
  • it can also be used for evaluation of the overwork state. That is, by monitoring the 3-HIB concentration and 3-HB concentration during exercise or long-term by the method according to the present invention, an appropriate amount of exercise can be evaluated and an overwork state can be prevented.
  • 3-HIB concentration monitoring and 3-HB concentration monitoring are, for example, the treatment of BCAA preparations and the start of nutrition therapy for the prevention of skeletal muscle atrophy and the improvement of undernutrition for patients with cirrhosis and undernutrition or bedridden conditions. It can be used to determine whether or not there is a need and to determine their treatment.
  • the detection method according to the present invention by measuring the concentration of 3-HIB or 3-HB by the detection method according to the present invention, the energy source-dependent balance (energy metabolism state) of lipids and amino acids in the liver and skeletal muscles is measured in the field of sports medicine. It is also possible to monitor using saliva or tears as well as blood. Furthermore, in the area of weight management and beauty by anti-aging and dieting, saliva or tears are analyzed by the detection method according to the present invention, and the concentration of 3-HIB or 3-HB is measured, so that sugar, amino acid, fatty acid It is also possible to effectively manage nutrition, exercise, and physical condition while evaluating the metabolic state. Furthermore, the detection method according to the present invention can also be used for evaluation of nutrition and intake effects when supplements and nutrient drinks containing nutrients such as BCAA are ingested.
  • 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB can be used as biomarkers for cirrhosis.
  • a threshold value for separating a cirrhosis patient from a healthy person is set in advance, and the concentrations of 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB in the body fluid of the subject are measured by the detection method according to the present invention. The possibility of developing cirrhosis can be evaluated by comparing the concentration with a predetermined threshold value.
  • the concentration of 3-HIB or the like in the body fluid of the subject is equal to or higher than a predetermined threshold
  • the subject is highly likely to develop cirrhosis.
  • the threshold value for separating a cirrhosis patient from a healthy person can be set experimentally.
  • the detection method according to the present invention is applied to a body fluid collected from a population known not to develop cirrhosis and a body fluid collected from a population known to develop cirrhosis.
  • the concentration can be set as appropriate by measuring the concentration of 3-HIB and the like in these body fluids and comparing the measured values of both groups.
  • the threshold value for separating the cirrhosis patient group from the healthy subject group can be 18 ⁇ M, preferably 20 ⁇ M, more preferably 24 ⁇ M.
  • 3-HIB or 3-HMB is preferable, and since the difference between the cirrhosis patient group and the healthy group is clearer, 3-HIB in saliva or 3-HMB in saliva is more preferable.
  • liver cirrhosis progresses and the urea cycle, which is one of the liver functions, decreases, ammonia is metabolized to glutamine and alanine in a compensatory manner in the skeletal muscle and detoxified.
  • glutamic acid generated as a by-product in the process of BCAA being catabolized in skeletal muscle to be branched chain ⁇ -keto acid by BCAT is used for ammonia detoxification. Therefore, it is necessary to increase catabolism of skeletal muscle BCAA during ammonia detoxification that compensates for skeletal muscle at the time of cirrhosis, resulting in an increase in 3-HIB concentration in body fluids.
  • encephalopathy is likely to be induced if ammonia detoxification is insufficient and the concentration of ammonia in body fluids increases. Therefore, in addition to the decrease in the ammonia detoxification ability in the liver of cirrhotic patients, a decrease in the ability to compensate for ammonia detoxification through skeletal muscle BCAA catabolism is considered to cause hepatic encephalopathy.
  • 3-HIB can be used as a biomarker for hepatic encephalopathy or its onset, and can provide useful information for its prevention and early treatment.
  • a protein-restricted diet is recommended, or BCAA intake is recommended even if encephalopathy has not been manifested. It may be possible to prevent the development of hepatic encephalopathy by making recommendations.
  • a biological sample collected from a subject who has developed cirrhosis, in particular, 3-HIB concentration in serum or saliva is measured by the detection method according to the present invention, and the obtained 3-HIB concentration is measured with the biological sample.
  • the possibility of developing hepatic encephalopathy can be evaluated.
  • the 3-HIB concentration obtained is significantly lower than the 3-HIB concentration of a previously collected biological sample, or as a result of monitoring, the 3-HIB concentration of a previously collected biological sample When the tendency to become lower than this continues for a certain degree, it is evaluated that the subject is highly likely to develop hepatic encephalopathy.
  • Whether the 3-HIB concentration in cirrhosis patients is lowered can also be evaluated using a threshold value that separates cirrhosis patients from healthy individuals.
  • the 3-HIB concentration in a biological sample collected from a subject who has developed cirrhosis, particularly serum or saliva, is measured by the detection method according to the present invention, and the obtained 3-HIB concentration is The possibility of developing hepatic encephalopathy can be evaluated by comparing with a predetermined threshold value (for example, the threshold value that separates the cirrhosis patient from the healthy person).
  • a predetermined threshold value for example, the threshold value that separates the cirrhosis patient from the healthy person.
  • the subject develops hepatic encephalopathy when the 3-HIB concentration of the subject is below a predetermined threshold or when the state of being below the predetermined threshold continues to some extent. It can be evaluated that there is a high possibility of doing.
  • a living body having a very small content of 3-HIB such as saliva or tears
  • sample collection such as blood collection and special collection devices (needle, syringe, blood collection tube, noncoagulant) Samples can be collected regardless of location, time, and sampler. In this case, there is no need to go to hospital or hospitalization, and it is possible to collect samples by the patient at home.
  • measurement with a saliva sample is also effective for children who do not like blood collection, elderly people, and patients who cannot collect blood for religious reasons.
  • 3-HMB can be used as a marker for protein synthesis and skeletal muscle hypertrophy in BCAA-derived liver and skeletal muscle
  • 2-HB is a marker for early insulin resistance and glucose intolerance. is there.
  • the concentrations of 3-HIB and 3-HB in biological samples such as saliva and blood are unlikely to decrease even when left at room temperature for a long time. Therefore, even when it is difficult to immediately refrigerate / freeze a biological sample collected from a subject, 3-HIB and 3-HB can function as stable and excellent biomarkers. For this reason, even when the location for collecting the biological sample from the subject and the test location for detecting an organic acid such as 3-HIB in the biological sample are separated, such as in a health checkup, for example. By using the detection method according to the present invention, the concentrations of 3-HIB and 3-HB can be accurately measured.
  • reagents used in the following examples and the like are as follows.
  • D-3-HB, L-3-HB, and 3-HIB sodium salts were manufactured by Sigma-Aldrich Chemical.
  • DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt was manufactured by Taiyo Nippon Sanso Co., Ltd.
  • 2-pyridinemethanol, 2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride, 1-piperidineethanol, 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine, 3-pyridinemethanol, 2-diethylaminoethanol, 3-hydroxy- 1-methylpiperidine and 4-pyridinemethanol were manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., and 4-dimethylaminopyridine was manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • a 3-HB dehydrogenase manufactured by Roche Diagnostics was used.
  • Serum was collected from blood collected from healthy individuals and stored at ⁇ 20 ° C. until the time of use for measurement. Serum (10 [mu] L), placed in a 1.5mL centrifuge plastic tube, further acetonitrile / water (1/19 containing DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt of 769pmol (100ng) as an internal standard, volume ratio ) After the solution (100 ⁇ L) was added and stirred for 1 minute, it was centrifuged at 2000 ⁇ g for 1 minute. The supernatant was put in a water / acetonitrile (1/19, volume ratio) solution and subjected to deproteinization treatment, and then the liquid phase was recovered and evaporated to dryness at 80 ° C. under nitrogen gas blowing.
  • 3-HB-free serum was prepared by adding normal serum (10 ⁇ L) to 150 mM Tris-HCl (pH 8.6) supplemented with 1.8 mM NAD and 0.075 U 3-hydroxybutyrate dehydrogenase at 37 ° C. For 30 minutes.
  • reaction solution prepared by adding the 2PM derivatization mixed reagent (50 ⁇ L) prepared immediately before to a dried sample containing an organic acid was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Subsequently, n-hexane (1 mL) was added to the reaction solution and stirred for 30 seconds, followed by centrifugation at 700 ⁇ g for 1 minute, and the collected supernatant was evaporated at 80 ° C. under nitrogen gas blowing. The residue was redissolved in a 1% by volume formic acid aqueous solution (150 ⁇ L), centrifuged again at 7000 ⁇ g for 1 minute, and the collected supernatant was subjected to ESI-LC-MS / MS as a measurement sample.
  • the LC-MS / MS system is a triple quadrupole mass spectrometer TSQ Vantage (manufactured by Thermo Fisher Scientific) equipped with a HESI-II probe and Prominence Ultra Fast Liquid Chromatography (UFLC) system (manufactured by Shimadzu Corporation). . Separation in chromatography was performed at 40 ° C. using a Hypersil GOLD aQ column (2.1 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the mobile phase was allowed to flow for 5 minutes at a flow rate of 300 ⁇ L / min as acetonitrile / water (1/19, volume ratio) containing 0.2% by volume of formic acid. After 5 minutes, the mobile phase was changed to acetonitrile containing 0.2% by volume of formic acid and allowed to flow for 7 minutes at a flow rate of 300 ⁇ L / min.
  • General MS / MS conditions are as follows: Spray voltage: 3000V Nebulizer temperature: 450 ° C, Sheath gas (nitrogen) pressure: 50 psi, Auxiliary gas (nitrogen) flow rate: 15 arbitrary units, Ion transfer capillary temperature: 220 ° C. Impact gas (argon) pressure: 1.0 mTorr, Collision energy: 15V Ion polarity: positive mode.
  • FIG. 1B shows a typical P-ESI MS spectrum of 3-HB (2 PM-3-HB) derivatized with 2-pyridinemethanol.
  • [M + H] + ions are found at m / z 196 as the base peak.
  • FIG. 1A product ion MS spectrum (FIG. 1A) when m / z 196 is used as a precursor ion, a fragment ion of [C 5 H 4 NCH 2 OH + H] + is seen at m / z 110 as the most prominent peak.
  • SRM is performed using m / z 196 ⁇ m / z 110 for detection of 2 PM-3-HB, and m / z 200 ⁇ m / z 110 for detection of [ 13 C 4 ] isotope (internal standard). It was performed using.
  • ⁇ Create calibration curve> For the preparation of the calibration curve, a sample stock solution (200 ng / ⁇ L) in which D-3-HB sodium salt was dissolved in acetonitrile / water (1/19, volume ratio) was further added to acetonitrile / water (1/19). D-3-HB sodium standard solution (1 to 200 ng / 100 ⁇ L) having a known concentration prepared by appropriately diluting using a volume ratio). Each standard solution as an internal standard, were added DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt (100 ng), after the mixture was evaporated to dryness and the obtained by the derivatization (esterification with derivatives) , Measured by ESI-LC-MS / MS. To examine the matrix effect of the calibration curve, 3-HB-free serum was added as a blank matrix to each standard solution.
  • Example 1 3-HB and 3-HIB derivatized with 2-pyridinemethanol were detected by LC-P-ESI-MS / MS. Specifically, a sample solution in which only D-3-HB sodium salt (standard, 1 ⁇ g) was dissolved in acetonitrile / water (1/19, volume ratio) (100 ⁇ L), D-3-HIB sodium salt (standard) Sample solution in which only 1 ⁇ g) is dissolved, and a sample solution in which D-3-HB sodium salt (standard, 1 ⁇ g) and D-3-HIB sodium salt (standard, 1 ⁇ g) are dissolved, Each was evaporated to dryness and then derivatized (esterified with a derivative) with the mixed reagent for 2PM derivatization.
  • FIG. 2 shows the results of detection of 3-HB and 3-HIB derivatized with 2-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 2A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 2B shows the MS spectrum of FIG. 2A
  • FIG. 2C shows the derivatized 3 -Total ion chromatogram (top) and MS chromatogram (bottom) of a sample containing only HIB
  • Fig. 2D contains the MS spectrum of Fig. 2C
  • Fig. 2E contains derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • a product ion chromatogram when m / z 196 of the sample is used as a precursor ion is shown in FIG. 2F, and an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 2E is shown. *
  • Example 2 3-HB and 3-HIB derivatized with 1-piperidineethanol were detected by LC-P-ESI-MS / MS.
  • a derivatization reagent instead of the mixed reagent for 2PM derivatization, 2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride (67 mg), 4-dimethylaminopyridine (20 mg), pyridine (900 ⁇ L), and Derivatization was performed in the same manner as in Example 1 except that a mixed reagent for 1PE derivatization composed of 1-piperidineethanol (100 ⁇ L) was used, and measurement was performed by LC-P-ESI-MS / MS.
  • FIG. 3 shows the results of detection of 3-HB and 3-HIB derivatized with 1-piperidineethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 3A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 3B shows the MS spectrum of FIG. 3A
  • FIG. 3C shows the derivatized 3 -Total ion chromatogram (top) and MS chromatogram (bottom) of a sample containing only HIB
  • Fig. 3D contains the MS spectrum of Fig. 3C
  • Fig. 3E contains derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • FIG. 3F shows a product ion chromatogram when m / z 216 of the sample is used as a precursor ion
  • FIG. 3F shows an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 3E.
  • Example 3 3-HB and 3-HIB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine were detected by LC-P-ESI-MS / MS.
  • a derivatization reagent instead of the mixed reagent for 2PM derivatization, 2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride (67 mg), 4-dimethylaminopyridine (20 mg), pyridine (900 ⁇ L), and Derivatization was performed in the same manner as in Example 1 except that a mixed reagent for 1PE derivatization consisting of 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine (100 ⁇ L) was used, and LC-P-ESI-MS / MS It was measured.
  • FIG. 4 shows the results of detecting 3-HB and 3-HIB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 4A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of a sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 4B shows the MS spectrum of FIG. 4A
  • FIG. 4C shows the derivatized 3 -The total ion chromatogram (top) and MS chromatogram (bottom) of the sample containing only HIB
  • Fig. 4D contains the MS spectrum of Fig. 4C
  • Fig. 4E contains derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • FIG. 4F shows a product ion chromatogram when m / z 216 of the sample is used as a precursor ion
  • FIG. 4F shows an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 4E.
  • FIG. 5 shows the results of detection of 3-HB and 3-HIB derivatized with 3-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 5A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 5B shows the MS spectrum of FIG. 5A
  • FIG. 5C shows the derivatized 3 -Total ion chromatogram (top) and MS chromatogram (bottom) of a sample containing only HIB
  • Fig. 5D contains the MS spectrum of Fig. 5C
  • Fig. 5E contains derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • a product ion chromatogram when m / z 196 of the sample is used as a precursor ion is shown in FIG. 5F, and an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 5E is shown. *
  • FIG. 6 shows the results of detecting 3-HB and 3-HIB derivatized with 2-diethylaminoethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 6A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 6B shows the MS spectrum of FIG. 6A
  • FIG. 6C shows the derivatized 3 -Total ion chromatogram (top) and MS chromatogram (bottom) of a sample containing only HIB
  • Fig. 6D shows the MS spectrum of Fig. 6C
  • Fig. 6E contains derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • a product ion chromatogram when m / z 204 of the sample is used as a precursor ion is shown in FIG. 6F, and an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 6E is shown. *
  • FIG. 7 shows the results of detection of 3-HB and 3-HIB derivatized with 3-hydroxy-1-methylpiperidine by LC-P-ESI-MS / MS.
  • FIG. 7A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 7B shows the MS spectrum of FIG. 7A
  • Fig. 7D includes the MS spectrum of Fig. 7C
  • Fig. 7E includes derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • a product ion chromatogram when m / z 202 of the sample is used as a precursor ion is shown in FIG. 7F, and an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 7E is shown. *
  • FIG. 8 shows the results of detection of 3-HB and 3-HIB derivatized with 4-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 8A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of a sample containing only derivatized 3-HB
  • FIG. 8B shows the MS spectrum of FIG. 8A
  • FIG. 8C shows the derivatized 3 -Total ion chromatogram (top) and MS chromatogram (bottom) of a sample containing only HIB
  • Fig. 8D contains the MS spectrum of Fig. 8C
  • Fig. 8E contains derivatized 3-HB and 3-HIB.
  • a product ion chromatogram when m / z 196 of the sample is used as a precursor ion is shown in FIG. 8F, and an MS / MS spectrum of the 3-HIB peak in FIG. 8E is shown.
  • Example 4 A sample obtained by adding DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt as an internal standard to 10 ⁇ L of serum collected from a healthy person was derivatized with 2-pyridinemethanol in the same manner as in Example 1, and LC-P-ESI -Measured by MS / MS.
  • FIG. 9 shows a typical SRM chromatogram of 3-HB (2 PM-3-HB) and [ 13 C 4 ] isotopes derivatized with 2-pyridinemethanol. From the chromatogram, the peak area ratio of 2 PM-3-HB to the [ 13 C 4 ] isotope was calculated, and the ratio was applied to a calibration curve to determine the 3-HB concentration in serum.
  • Example 5 In the same manner as in Example 4, serum 3-HB concentration collected from healthy male subjects every 2-3 hours was measured. The measurement results are shown in FIG. In the figure, the black arrow indicates the time spent eating, and the shaded portion indicates sleep time. As a result, it was found that 3-HB in 10 ⁇ L of serum can be detected by the detection method according to the present invention. It was also found that 3-HB in serum tended to decrease with food intake, and that 3-HB concentration in serum was controlled by food intake.
  • Example 6 The accuracy and accuracy of the detection method according to the present invention were examined using serum collected from healthy individuals as a sample. Specifically, a sample obtained by adding DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt as an internal standard to 10 ⁇ L of serum collected from a healthy person was derivatized with 2-pyridinemethanol in the same manner as in Example 1, Measured by LC-P-ESI-MS / MS. The reproducibility was measured by LC-P-ESI-MS / MS for each of four types of samples (samples A to D). The measurement results are shown in Table 1. The measurement results were analyzed by one-way ANOVA. At that time, the analysis error was divided into two causes: sample preparation and SRM measurement.
  • Example 7 The sensitivity of 2 PM-3-HB measured by LC-P-ESI-MS / MS was compared with the sensitivity measured by LC-N-ESI-MS / MS. Specifically, a dilution series with a known concentration of 2 PM-3-HB solution was measured by LC-P-ESI-MS / MS (SRM), and the minimum concentration at which 2 PM-3-HB was detected (minimum detection sensitivity) ). Similarly, a dilution series with a known concentration of the 3-HB solution was measured by LC-N-ESI-MS / MS (SRM) to examine the minimum detection sensitivity. Each measurement sample was added with 3-HB-free serum as a blank matrix.
  • Example 8 3-HMB and 2-HB derivatized with 2-pyridinemethanol were detected by LC-P-ESI-MS / MS. Specifically, D-3-HMB sodium salt (standard, 1 ⁇ g) and D-2-HB sodium salt (standard, 1 ⁇ g) were dissolved in acetonitrile / water (1/19, volume ratio) (100 ⁇ L). The prepared sample solution was prepared, evaporated and dried, and then derivatized (esterified with a derivative) using the mixed reagent for 2PM derivatization.
  • FIG. 11 shows the results of detection of 3-HMB and 2-HB derivatized with 2-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • FIG. 11A shows a total ion chromatogram of the sample containing derivatized 3-HMB and 2-HB (upper stage), a product ion chromatogram when using m / z 196 as a precursor ion (middle stage), and m / z.
  • Product ion chromatograms (lower row) when 210 is used as a precursor ion are respectively shown.
  • 11B shows the MS spectrum of the middle product ion chromatogram of FIG. 11A
  • FIG. 11C shows the MS spectrum of the lower product ion chromatogram of FIG. 11A.
  • FIG. 12 shows the results of detection of 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB derivatized with 2-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS.
  • 12 shows the total ion chromatogram of the sample, the product ion chromatogram when m / z 196 is used as the precursor ion in the second stage from the top, and m / z 200 as the precursor ion in the third stage from the top.
  • the product ion chromatogram when m / z 210 is used as the precursor ion is shown at the bottom, respectively.
  • Example 10 The stability of 3-HIB and 3-HB in serum and saliva when serum and saliva collected from a subject were allowed to stand at room temperature for a certain time was examined.
  • ⁇ Saliva> Saliva collected (fluid) from one healthy person into one tube was dispensed into six tubes. One of the 6 tubes was stored frozen at ⁇ 20 ° C. immediately after collection. The remaining five were each allowed to stand at room temperature for 1, 2, 4, 6, or 24 hours and then stored at ⁇ 20 ° C. The frozen saliva sample was naturally thawed at room temperature during analysis. After mixing using a vortex mixer, centrifugation (3000 rpm, 15 minutes) was performed to decompose the viscous protein (mucin), which was precipitated together with meals contained in saliva, and the supernatant was used for analysis.
  • mucin viscous protein
  • Example 11 The correlation between the concentrations of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB in serum and saliva (fluid) collected from the subjects was examined. Specifically, serum and saliva were collected from 3 healthy individuals (subjects ⁇ , ⁇ , and ⁇ ), 5 samples each, and the concentrations of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB were determined. Measured and examined the correlation between serum concentration and saliva concentration. The concentrations of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB in serum and saliva were measured in the same manner as in Example 10. The measurement result of 3-HB concentration is shown in FIG. 15A, the measurement result of 3-HIB concentration is shown in FIG. 15B, and the measurement result of 2-HB concentration is shown in FIG. 15C. As a result, it was confirmed that the saliva concentration correlated with the serum concentration in any of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB.
  • Example 12 The 3-HIB and 3-HB concentrations in serum, saliva, and urine before and after running exercise were measured, and changes over time were observed. Specifically, a subject (a healthy male person) collected urine for 24 hours from 11:00 am on the previous day to 11:00 am on the day of running exercise, and then jogged for 60 minutes (traveling distance: about 9 km, speed: about 6.7) Min / km), and the time until the lapse of 24 hours (12:00 noon on the day following the running day) was set as the experiment period. The subjects took lunch and dinner the previous day, lunch and dinner on the day of running exercise, and breakfast the next day from 11:00 am the previous day until the end of the experiment period. FIG. 16 shows the exercise and meal status of the subject, and blood, saliva, and urine collection time points. The 60-minute jogging performed was an exercise with a slightly higher load than the exercise performed on a daily basis for the subject.
  • FIGS. 17 shows changes over time in the concentrations of 3-HIB and 3-HB in serum.
  • FIG. 18 shows the change over time of urinary excretion per unit time ([urinary excretion] / [elapsed time from previous collection]) ( ⁇ mol / h) at each collection time of 3-HIB and 3-HB. Each is shown.
  • FIG. 19 shows changes over time in the concentrations of 3-HIB and 3-HB in saliva.
  • the lower diagram in FIG. 19 is a diagram showing the measurement results during the upper running exercise with the vertical axis scale enlarged.
  • the concentration of 3-HIB increases in both serum and saliva due to running exercise, and after a certain amount of time has elapsed since the end of exercise, the concentration decreases rapidly and returns to the normal state before exercise.
  • Skeletal muscle BCAA catabolism does not persist after exercise compared to during exercise, and normal individuals may not undergo catabolism of BCAA or free BCAA derived from skeletal muscle protein degradation only by performing transient exercise. confirmed.
  • the 3-HIB concentration in saliva hardly fluctuated from 30 minutes after the end of exercise to the end of the experiment period, and was hardly affected by meals and the like.
  • the serum 3-HIB concentration decreased to a normal state at 1 hour after the end of exercise, but slightly increased at 4 hours after the end of exercise. Since 2.25 hours after the end of exercise, food was consumed, the increase in serum 3-HIB concentration at the end of 4 hours after the end of exercise may have been slightly affected by the diet. It was.
  • the 3-HB and 3-HIB concentrations in serum and saliva are increased by exercise, and these are simultaneously evaluated as liver fatty acid catabolism (fat burning) markers and skeletal muscle BCAA catabolism markers by exercise.
  • the concentration of 3-HIB in saliva during running exercise does not change much from the start of exercise (normal state) until 15 minutes after the start of exercise, but then tends to increase gradually.
  • the salivary 3-HB concentration during running exercise does not change much from the exercise start point (normal state) until 35 minutes after the start of exercise, but then increases more rapidly than the 3-HIB concentration A trend was observed.
  • Sugar is preferentially used as an energy source during exercise, but fat and amino acids are used as energy sources as exercise time and intensity increase. From these results, increases in 3-HB concentration and 3-HIB concentration indicate that fats and amino acids were used as energy sources instead of sugar, and when both increased, the dependence on energy production Is considered to indicate the point of transition from sugar metabolism to lipid and amino acid metabolism.
  • FIG. 18 shows urinary 3-HB excretion and 3-HIB excretion per unit time before and after exercise. Unlike serum and saliva, urinary 3-HB excretion and 3-HIB excretion were not increased by exercise, and urinary 3-HIB excretion tended to decrease (1 hour after exercise) ). The urinary 3-HB excretion thereafter tended to increase until 3 hours of exercise and then once decreased, but then tended to increase again until 12.5 hours of exercise. Urinary 3-HIB excretion increased up to 9.5 hours of exercise while repeating slight increases and decreases. Neither urinary 3-HB or 3-HIB excretion was associated with changes in serum or saliva concentrations, but it was presumed that reabsorption in the kidney tissue had an effect. When using urine as a sample, considering the necessity of correction with urine or animal urine as needed, or creatinine As a result, it was found that evaluation with serum or saliva is preferable to urinary excretion.
  • Example 13 Blood and saliva were collected from 15 healthy subjects and 20 cirrhosis patients, and 3-HIB and 3-HMB concentrations in serum and saliva were measured and compared.
  • the 3-HIB concentration and 3-HMB concentration in serum and saliva were measured in the same manner as in Example 10.
  • the measurement results of 3-HIB and 3-HMB concentrations in serum are shown in FIG. 20A
  • the measurement results of 3-HIB and 3-HMB concentrations in saliva are shown in FIG. 20B.
  • the 3-HIB and 3-HMB concentrations in the cirrhosis patient group tended to be higher than those in the healthy group, indicating that these are useful as cirrhosis markers. It was done.
  • 3-HIB and 3-HMB concentrations in saliva were significantly higher in the cirrhosis patient group than in the healthy group.
  • Example 14 Blood was collected from 48 healthy subjects and 32 cirrhosis patients, and the 3-HIB concentration in serum was measured in the same manner as in Example 10. As a result, the average value of serum 3-HIB was 12.6 ⁇ 0.7 ⁇ M for healthy subjects and 27.7 ⁇ 3.6 ⁇ M for cirrhosis patients.
  • Example 15 Blood was collected twice from a patient with hepatic encephalopathy (male) over time, and the 3-HIB concentration in serum was measured in the same manner as in Example 10. Table 4 shows the measurement results. As a result, the 3-HIB concentration in the serum of patients with hepatic encephalopathy was much lower than the average value (12.6 ⁇ M) of healthy subjects.
  • Example 16 Blood was collected over time from cirrhosis patient A (female) with relatively mild cirrhosis and cirrhosis patient B (female) with relatively severe cirrhosis. Serum 3-HIB ( ⁇ M) and albumin ( g / dL) and ammonia concentration ( ⁇ g / dL) were measured. Albumin and ammonia were usually measured by a standard method commonly used in clinical examinations. The albumin concentration was measured by BCG method using the obtained patient serum using albumin HR-II (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the ammonia concentration was measured using Fuji Dry Chem slide NH3-WII (Fuji Film Co., Ltd.) and using Fuji Dry Chem biochemical analyzer.
  • the 3-HIB concentration in serum was measured in the same manner as in Example 10.
  • the albumin concentration in serum was measured as one of the liver function (liver protein synthesis ability) markers.
  • Serum ammonia concentration was measured as a hepatic encephalopathy marker or to know the ammonia clearance status. Both patients were administered the BCAA agent for a certain period during the measurement period.
  • FIG. 21 shows the measurement results of cirrhosis patient A
  • FIG. 22 shows the measurement results of cirrhosis patient B.
  • the upper graph is a graph showing the change in serum 3-HIB concentration over time
  • the middle graph is the graph showing the change in serum albumin concentration over time
  • the lower graph is the serum ammonia concentration. It is the graph which showed change with time.
  • BCAA indicates the BCAA administration period.
  • the serum albumin concentration is higher than the reference value (3.8 g / dL) and the cirrhosis patient A has a relatively mild symptom of cirrhosis
  • the serum 3-HIB concentration varies, but cirrhosis.
  • the serum ammonia concentration was lower than the upper limit of the reference value (86 ⁇ g / dL), and the risk of developing hepatic encephalopathy was I was able to evaluate that it was not so high.
  • the detection method according to the present invention can be used in fields such as clinical tests because organic acids useful as biomarkers such as 3-HIB and 3-HB can be detected with high sensitivity and quantitative.

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Abstract

試料中の有機酸、特に、バイオマーカーとしての利用が期待できる３－ＨＢや３－ＨＩＢ等の有機酸を、高感度に精度よく検出する方法を提供する。すなわち、有機酸を検出する方法であって、試料中の有機酸を下記一般式（１）－１～（１）－３（式（１）－１～３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１～６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表す。）のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）法により検出することを特徴とする、試料中の有機酸の検出方法を提供する。

Description

試料中の有機酸の検出方法
　本発明は、試料中の３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシイソ酪酸等の有機酸を高感度に検出するための方法に関する。
　本願は、２０１３年２月１５日に、日本に出願された特願２０１３－２８１６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　３－ヒドロキシ酪酸（３－ＨＢ）は、血清中で最も安定的なケトン体であり、飢餓や低栄養状態時に肝臓で合成される。このため、３－ＨＢは、肝臓での脂肪酸異化を評価するバイオマーカーとして有用である。３－ＨＢの定量には、ＮＡＤとＤ－３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを添加した後にＮＡＤＨを検出する酵素分光光度法が使用されている（例えば、非特許文献１又は２参照。）。しかしながら、血清中には様々な酵素が存在しており、ＮＡＤＨの産生が阻害され得るため、これらの方法は、血清中の３－ＨＢの検出感度が低いという問題がある。その他にもＮＡＤＨの定量方法としては、３ＨＢをアセト酢酸（ＡＡ）に酵素変換した後にｐ－ニトロベンゼンジアゾニウムフルオロホウ酸で誘導体化し、この誘導体を、分光光度又は紫外線により検出する高感度ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）アッセイにより定量する方法が報告されている（例えば、非特許文献３又は４参照。）。また、３－ＨＢを直接検出する方法としては、誘導体化後にガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）法により検出する方法（例えば、非特許文献５又は６参照。）や、誘導体化せずに、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）法（ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献７参照。）も報告されているが、これらの方法の検出感度は、酵素分光光度法と同様に低い。
　一方で、消化器疾患患者において、代謝・消化・吸収能低下あるいは栄養過多状態により、栄養代謝異常が生じる。多くの消化器疾患では、糖・脂質代謝異常がみられるため、エネルギー供給源としてアミノ酸の重要性が高い。特に分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ：バリン、ロイシン、イソロイシン）は、飢餓や低栄養状態、長時間運動や代謝疾患時に、糖質・脂質に代わって骨格筋のミトコンドリア内で異化され、エネルギー源となる。骨格筋で異化されたＢＣＡＡは、アセチルＣｏＡやスクシニルＣｏＡに代謝される。ＢＣＡＡは、ミトコンドリア内で共通の酵素反応によって、ミトコンドリア膜を通過できないＣｏＡが結合される。具体的には、ＢＣＡＡは、ミトコンドリア内でＢＣＡＴ（ＢＣＡＡアミノ基転移酵素）とＢＣＫＤＨ　ｃｏｍｐｌｅｘ（分岐鎖αケト酸脱水素酵素複合体）によって、分岐鎖αケト酸（バリンからα－ケトイソ吉草酸へ、ロイシンからα－ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）へ、イソロイシンからα－ケト－β－メチル吉草酸へ）を経て、ＣｏＡ体（α－ケトイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡへ、ＫＩＣからイソバレリルＣｏＡへ、α－ケト－β－メチル吉草酸からα－メチルブチリルＣｏＡへ）に代謝される。ＢＣＡＡの異化過程では、ＣｏＡの結合が必須であるが、バリンのみは、異化経路の途中で、特異的酵素反応によってＣｏＡが一旦外され、中間代謝産物の３－ヒドロキシイソ酪酸（３－ＨＩＢ）ができる。ＣｏＡが結合していない３－ＨＩＢは、分子量が小さいためミトコンドリア膜を通過し、一部が細胞外へ漏出する。実際に、飢餓状態や肝硬変患者では、骨格筋の萎縮と共に血清３－ＨＩＢ濃度が上昇する。
　このことから、３－ＨＩＢは骨格筋におけるアミノ酸異化状態を反映する指標、すなわち骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーとしての利用が期待される。しかしながら、生体試料中の微量の３－ＨＩＢを充分な感度で検出できる方法は、現在までには報告されていない。例えば、３－ＨＩＢを直接検出する方法としては、誘導体化せずに、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法（ＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献７参照。）が報告されているが、当該方法は感度が低いため、例えば血清中の３－ＨＩＢを検出するためには多量の血清を必要とする。また、ＧＣ－ＭＳ法により、血液中の３－ＨＢを検出した場合には、３－ＨＩＢは３－ＨＢとはクロマトグラフィーによっては分離できなかったことが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。
　３－ＨＢや３－ＨＩＢ以外の有機酸の検出方法としては、マロン酸をジ－（１－メチル－３－ピペリジニル）マロン酸に誘導体化した後、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献９参照。）が報告されている。当該方法では、マロン酸にアミン残基を導入してマロン酸エステルとすることにより、イオン化が促進され、検出感度が顕著に増大した。
　また、ＢＣＡＡの１つであるロイシンの代謝産物として、３－ヒドロキシイソ吉草酸（３－ＨＭＢ）が挙げられる。ロイシンは、他のＢＣＡＡと同様にミトコンドリア内でＫＩＣを経てＣｏＡ体（イソバレリルＣｏＡ）に代謝されるが、ＫＩＣの５～１０％程度がミトコンドリア膜を通過し、細胞質内においてＫＩＣ－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅによって３－ＨＭＢに代謝される。３－ＨＭＢの作用としては、ｍＴＯＲ経路により蛋白合成促進、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制による蛋白質分解抑制、ＨＭＢ－ＣｏＡから変換されたヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）によるコレステロール合成促進による筋鞘安定化等が知られている。これらの作用により、３－ＨＭＢは、ＢＣＡＡ由来の肝臓蛋白（アルブミン等）合成マーカーや骨格筋肥大のマーカーとしての利用が期待される。実際に、３－ＨＭＢは筋肉増強効果を目的としたサプリメントとして利用されていることから、３－ＨＭＢを摂取した場合の血中動態を検討するため、３－ＨＭＢ摂取後のラットの血中３－ＨＭＢ濃度を、誘導体化せずにＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって測定したことが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。また、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）－ＭＳ／ＭＳにより、３－ＨＢと３－ＨＭＢを誘導体化せずに同時測定する方法も報告されているが、当該測定方法では、３－ＨＭＢの検出限界は０．４μＭであり、生体試料中（血液や唾液など）の３－ＨＭＢは、３－ＨＢや３－ＨＭＢより微量であるため、より高感度に検出する方法が求められている（例えば、非特許文献１１参照。）。
　また、３－ＨＢ等と構造類似の有機酸として、２－ヒドロキシ酪酸（２－ＨＢ）がある。２－ＨＢは、スレオニンとメチオニンの代謝産物であるαケト酪酸が、ＮＡＤＨ依存性のＬＤＨやＬＤＨのアイソザイムである２－ＨＢ脱水素酵素（α－ＨＢＤＨ）による異化反応の副産物として生成される。また、αケト酪酸は、スクシニルＣｏＡの前駆体であるプロピオニルＣｏＡに代謝されることから、２－ＨＢの上昇は、ＬＤＨやα－ＨＢＤＨによるαケト酪酸の異化亢進か、αケト酪酸からプロピオニルＣｏＡへの代謝不全によって生じる。さらに、αケト酪酸は、強力な抗酸化物質であるグルタチオンの前駆体アミノ酸であるシステインがシスタチオンより代謝される際の副産物としても産生されるため、グルタチオンの生成とも関連している。２－ＨＢは、非糖尿病者のインスリン抵抗性やグルコース不耐性を予測する早期マーカーとして利用できるとの報告がある（例えば、非特許文献１２参照。）。これは、インスリン抵抗性やグルコース不耐性発症には、肝臓での脂質過酸化や酸化ストレスが関与しており、肝臓でのグルタチオン生成亢進や脂質過酸化に伴うＮＡＤＨやＮＡＤ＋の増加によるものと考えられる。この検討では、ＵＨＰＬＣ－ＭＳやＨＩＬＩＣ－ＭＳ／ＭＳ装置にて、血清中や全血中の２－ＨＢを測定しているが、血清中の濃度（１μｇ／ｍＬ＝約９．６μＭ以上）より微量な生体試料（唾液など）での測定は、これまで検討されていない（例えば、非特許文献１１及び非特許文献２参照。）。
ウィリアムソン（Williamson）、他２名、バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）、１９６２年、第８２巻、第９０ページ。 ローン（Laun）、他６名、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メディシン（Clinical and Experimental Medicine）、２００１年、第１巻、第２０１ページ。 ヤマト（Yamato）、他４名、バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリティン（BIOLOGICAL and PHARMACEUTICAL BULLETIN）、２００３年、第２６巻、第３９７ページ。 ヤマト（Yamato）、他８名、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、２００９年、第３８４巻、第１９５ページ。 ヘイル（Heil）、他９名、バイオメディカル・サイエンシズ・アンド・アプリケーションズ（Biomedical Sciences and Applications）、２０００年、第３７９巻、第３１３ページ。 ハッサン（Hassan）、他１名、ジャーナル・オブ・アナリティカル・トキシコロジー（Journal of Analytical Toxicology）、２００９年、第３３巻、第５０２ページ。 サニー（Sunny）、他９名、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィロソフィー－エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism）、２０１０年、第２９８巻、第Ｅ１２２６ページ。 デ・ロジェール（Des Rosiers）、他６名、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、１９８８年、第１７３巻、第９６ページ。 ホンダ（Honda）、他７名、ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ（Journal of Lipid Research）、２００９年、第５０巻、第２１２４ページ。 デスパンデ（Deshpande）、他６名、バイオメディカル・クロマトグラフィー（Biomedical Chromatography）、２０１３年、第２７巻、第１４２～１４７ページ。 ソレンセン（Sorensen）、他６名、クリニカル・バイオケミストリー（Clinical Biochemistry）、２０１３年、第４６巻、第１８７７～１８８３ページ。 ガル（Gall）、他１１名、プロス・ワン（PLoS One）、２０１０年、第５巻、第ｅ１０８８３ページ。 シイナ（Shiina）、他２名、ケミストリー・レターズ（Chemistry Letters）、２００２年、第３１巻、第２８６ページ。 タグチ（Taguchi）、「Introduction to Quality Engineering: Designing Quality into Products and Process」、１９８６年、アジア生産性機構発行。
　本発明は、有機酸、特に、生体試料中に含まれているバイオマーカーとしての利用が期待できる３－ＨＢや３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、２－ＨＢ等の有機酸を、高感度に精度よく検出する方法の提供を目的とする。
　すなわち、本発明は、下記［１］～［６］の試料中の有機酸の検出方法、下記［７］、［８］、［１０］の評価方法、下記［１１］のモニタリング方法、及び下記［９］のバイオマーカーを提供するものである。
［１］　本発明に係る試料中の有機酸の検出方法は、試料中の有機酸を検出する方法であって、試料中の有機酸を下記一般式（１）－１～（１）－３（式（１）－１～３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１～６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表す。）のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）法により検出することを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［２］　前記［１］の試料中の有機酸の検出方法においては、前記誘導体化試薬が２－ピリジンメタノール、１－ピペリジンエタノール、及び２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［３］　前記［１］又は［２］の試料中の有機酸の検出方法においては、前記有機酸が下記一般式（２）（式（２）中、Ｒ３は、炭素数２～６のヒドロキシアルキル基を表す。）で表される有機酸であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［４］　前記［１］又は［２］の試料中の有機酸の検出方法においては、前記有機酸が３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、及び２－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［５］　前記［１］～［４］のいずれかの試料中の有機酸の検出方法においては、前記試料が生体試料であることが好ましい。
［６］　前記［１］～［４］のいずれかの試料中の有機酸の検出方法においては、前記試料は、血清、涙液、唾液、又は尿であることが好ましい。
［７］　本発明に係る肝硬変発症可能性の評価方法は、被検者から採取した生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、及び２－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上の有機酸を、前記［１］又は［２］の試料中の有機酸の検出方法により検出し、当該生体試料中の当該有機酸の濃度を測定する定量工程と、前記定量工程において得られた有機酸濃度を、予め設定された閾値と比較し、前記被験者における肝硬変発症の可能性を評価する評価工程と、を有し、前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする。
［８］　本発明に係る肝性脳症発症可能性の評価方法は、肝硬変を発症している被検者から採取した生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸を、前記［１］又は［２］の試料中の有機酸の検出方法により検出し、当該生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸濃度を測定する定量工程と、前記定量工程において得られた３－ヒドロキシイソ酪酸濃度を、前記生体試料が採取された時点以前に前記被験者から採取された生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸濃度と比較し、前記被験者における肝性脳症発症の可能性を評価する評価工程と、を有し、前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする。
［９］　本発明に係る肝性脳症又はその発症可能性のバイオマーカーは、３－ヒドロキシイソ酪酸からなることを特徴とする。
［１０］　本発明に係るエネルギー供給源の評価方法は、運動中の被検者から採取した生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸及び３－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上の有機酸を、前記［１］又は［２］の試料中の有機酸の検出方法により検出し、当該生体試料中の前記有機酸濃度を測定する定量工程と、前記定量工程において得られた前記有機酸濃度を、予め設定された閾値、又は前記被験者から運動前に採取された生体試料中の前記有機酸濃度と比較し、前記被験者における運動中又は運動後のエネルギー供給源を評価する評価工程と、を有し、前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする。
［１１］　本発明に係るエネルギー供給源のモニタリング方法は、運動開始直前から運動終了後一定期間経過後までの間に経時的に被検者から採取された複数の生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸及び３－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上の有機酸を、前記［１］又は［２］の試料中の有機酸の検出方法によりそれぞれ検出し、各生体試料中の前記有機酸濃度を測定することにより、前記有機酸濃度の経時的変化を調べるモニタリング工程と、前記モニタリング工程において得られた前記有機酸濃度の経時的変化に基づき、前記被験者における運動中又は運動後のエネルギー供給源を評価する評価工程と、を有し、前記生体試料中の前記有機酸濃度をエネルギー供給源のマーカーとし、かつ前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする。
　本発明に係る試料中の有機酸の検出方法は、３－ＨＩＢや３－ＨＢ、３－ＨＭＢ、２－ＨＢ等の有機酸を誘導体化してＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって検出する方法であり、試料中の検出対象たる有機酸を直接検出することができる。また、特定の誘導体化試薬を用いることにより、従来の酵素分光光度法やＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる検出方法よりも非常に検出感度が高いため、血清のみならず、涙液や唾液等の有機酸含有量が比較的低い生体試料からの有機酸検出にも有用であることが期待できる。
２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ（２ＰＭ－３－ＨＢ）の典型的なＰ－ＥＳＩ　ＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例１において、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図２ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例１において、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図２ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例１において、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図２Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例２において、１－ピペリジンエタノールで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図３ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例２において、１－ピペリジンエタノールで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図３ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例２において、１－ピペリジンエタノールで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図３Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例３において、２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図４ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例３において、２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図４ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例３において、２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図４Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例１において、３－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図５ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例１において、３－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図５ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例１において、３－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図５Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例２において、２－ジエチルアミノエタノールで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図６ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例２において、２－ジエチルアミノエタノールで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図６ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例２において、２－ジエチルアミノエタノールで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２０４を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図６Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例３において、３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジンで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図７ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例３において、３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジンで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図７ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例３において、３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジンで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２０２を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図７Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例４において、４－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図８ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例４において、４－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図８ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 比較例４において、４－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図８Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 実施例４において、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ（２ＰＭ－３－ＨＢ）と［１３Ｃ４］同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した図である。 実施例５において、男性健常者から２時間おきに採取した血清中の３－ＨＢ濃度を測定した結果を示した図である。 実施例８において、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＭＢと２－ＨＢを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）と、ｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（中段）と、ｍ／ｚ　２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（下段）を示した図である。 図１１Ａの中段のプロダクトイオンクロマトグラムのＭＳスペクトラム（２－ＨＢの２ＰＭエステル誘導体）を示した図である。 図１１Ａの下段のプロダクトイオンクロマトグラムのＭＳスペクトラム（３－ＨＭＢの２ＰＭエステル誘導体）を示した図である。 実施例９において、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢと３－ＨＭＢと２－ＨＢと３－ＨＢ－１３Ｃ４を含む試料の総イオンクロマトグラム（１段目）、ｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（２段目）、ｍ／ｚ　２００を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（３段目）、ｍ／ｚ　２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（４段目）を示した図である。 実施例１０において、採血後室温で放置された血清中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度の測定結果を示した図である。 実施例１０において、採取後室温で放置された唾液中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度の測定結果を示した図である。 実施例１１において、３－ＨＢの血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。 実施例１１において、３－ＨＩＢの血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。 実施例１１において、２－ＨＢの血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。 実施例１２において、被験者の運動と食事状況、及び血液、唾液、尿の採取時点を示した図である。 実施例１２において、被験者の血清中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度の経時的変化を示した図である。 実施例１２において、被験者の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの各採取時点における単位時間当たり尿排泄量（μｍｏｌ／ｈ）の経時的変化を示した図である。 実施例１２において、被験者の唾液中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度の経時的変化を示した図である。 実施例１３において、肝硬変患者群と健常者群の血清中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度の測定結果を示した図である。 実施例１３において、肝硬変患者群と健常者群の唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度の測定結果を示した図である。 実施例１６において、肝硬変の症状が比較的軽い肝硬変患者Ａの血清中３－ＨＩＢ濃度の経時的変化（上段）と血清中アルブミン濃度の経時的変化（中段）と血清中アンモニア濃度の経時的変化（下段）を示した図である。 実施例１６において、肝硬変の症状が比較的重い肝硬変患者Ｂの血清中３－ＨＩＢ濃度の経時的変化（上段）と血清中アルブミン濃度の経時的変化（中段）と血清中アンモニア濃度の経時的変化（下段）を示した図である。
　本発明に係る試料中の有機酸の検出方法（以下、「本発明に係る検出方法」ということがある。）は、試料中の有機酸を検出する方法であって、試料中の有機酸を下記一般式（１）－１～（１）－３のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体をＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ法により検出することを特徴とする。下記一般式（１）－１～３のいずれかで表される誘導体化試薬によってエステル化することにより、有機酸のＰ－ＥＳＩによるイオン化効率が改善され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる検出感度が顕著に向上する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　一般式（１）－１～３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１～６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表す。つまり、Ｒ１が炭素数１～６のヒドロキシアルキル基の場合、Ｒ２が水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１～６のヒドロキシアルキル基の場合、Ｒ１が水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である。窒素原子を含む６員又は５員のヘテロ環を有し、当該窒素原子付近にアルキル基で連結された水酸基が存在する化合物を誘導体化試薬として用いることにより、有機酸を効率よくイオン化することができ、さらに得られた誘導体（エステル化体）のＬＣの保持時間は比較的長いため、誘導体化に使用した試薬と明確に分離することができる。
　炭素数１～６のアルキル基としては、直鎖状のアルキル基であってもよく、分岐鎖状のアルキル基であってもよい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－へキシル基等が挙げられる。一般式（１）－１～３中のＲ１又はＲ２としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、又はｉ－プロピル基が好ましい。
　炭素数１～６のヒドロキシアルキル基としては、炭素数１～６の直鎖状のアルキル基中の１個の水素原子が水酸基に置換されている基であってもよく、炭素数１～６の分岐鎖状のアルキル基中の１個の水素原子が水酸基に置換されている基であってもよい。具体的には、２－ヒドロキシエチル基、３－ヒドロキシプロピル基、４－ヒドロキシブチル基、５－ヒドロキシペンチル基、６－ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。
　一般式（１）で表される誘導体化試薬としては、２－ピリジンメタノール、１－ピペリジンエタノール、及び２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。これらの化合物によってカルボキシル基をエステル化することにより、３－ＨＩＢと３－ＨＢと３－ＨＭＢと２－ＨＢのように構造類似の有機酸同士を、ＬＣにより良好に分離することが可能となり、ひいては、両者の同時検出（一の試料に対する１回のＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる検出）が可能となる。一般式（１）で表される誘導体化試薬としては、中でも、リテンションタイムが遅く、誘導体化された検出対象の有機酸エステルのピークに対する誘導体化試薬によるピークの影響が小さいことから、２－ピリジンメタノールが特に好ましい。
　本発明に係る検出方法において、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ法は、誘導体化試薬として前記一般式（１）で表される化合物を用いる以外は、常法により行うことができる。具体的には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにおけるＨＰＬＣやＭＳは、カルボン酸エステルを検出するための公知の条件と同様に、又は適宜改変した条件で行うことができる。
　本発明に係る検出方法では、１回のＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにおいて、１種類の有機酸のみを検出してもよく、２種類以上の有機酸を同時に検出してもよい。本発明に係る検出方法において検出対象とされる有機酸としては、カルボキシル基を有する化合物であれば特に限定されるものではなく、当該検出方法は、カルボキシル基を有する多くの有機酸の検出に適用できる。本発明に係る検出方法は、解糖系、ＴＣＡサイクル、脂肪酸合成系等の中間代謝物たる有機酸の検出や定量に用いられることが好ましい。中でも、本発明に係る検出方法は、下記一般式（２）で表される有機酸の検出に用いられることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　一般式（２）中、Ｒ３は、炭素数２～６のヒドロキシアルキル基を表す。炭素数２～６のヒドロキシアルキル基としては、分岐鎖状のヒドロキシアルキル基であってもよく、直鎖状のヒドロキシアルキル基であってもよい。当該ヒドロキシアルキル基としては、例えば、２－ヒドロキシエチル基、３－ヒドロキシプロピル基、２－ヒドロキシプロピル基、４－ヒドロキシブチル基、２－ヒドロキシブチル基、２－（ ヒドロキシメチル）プロピル基、２－ヒドロキシペンチル基、３－ヒドロキシ－２、２－ジメチルプロピル基、３－ヒドロキシペンチル基、５－ヒドロキシペンチル基、６－ヒドロキシヘキシル基、２－ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。
　一般式（２）で表される有機酸としては、Ｒ３が、炭素数２～３のヒドロキシアルキル基であることが好ましい。特に、一般式（２）で表される有機酸としては、３－ＨＩＢ、３－ＨＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢからなる群より選択される１種以上であることが好ましく、３－ＨＢと３－ＨＩＢ、又は３－ＨＩＢと３－ＨＢと３－ＨＭＢを同時に検出することがより好ましい。前述のように、３－ＨＢは肝臓での脂肪酸異化のマーカーであり、３－ＨＩＢ及び３－ＨＭＢは骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーとなり得る。つまり、本発明に係る検出方法により、肝臓での脂肪酸異化のマーカーと骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーを同時に検出することができる。
　本発明に係る検出方法では、他のＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用した検出方法と同様に、検出対象たる有機酸を、濃度既知の有機酸を用いて作成した検量線に基づいて定量的に検出することができる。検量線作成時には、より定量性を高めるために、濃度既知の有機酸の希釈系列の全てに、一定量の安定同位体を添加しておくことも好ましい。
　本発明に係る検出方法に供される試料としては、有機酸が含まれている試料であれば特に限定されるものではなく、具体的には、生体試料、湖沼や海、河川、土壌等の自然界から採取された試料、培養細胞や酵母、細菌等の微生物の培養物等が挙げられる。本発明に係る検出方法は、非常に高感度であることから、一般的に有機酸が極微量しか含まれていない試料や、そもそも微量にした試料に対して行うことが好ましく、生体試料に対して行うことがより好ましい。生体試料としては、生体から採取された試料であればよく、ヒトやマウス、ラット等の動物から採取されたものであることが好ましい。また、血液、血漿、血清、涙液、唾液、脳脊髄液、腹水、胸水、関節液、骨髄液、胆汁、尿、鼻汁、乳汁、汗、精液等であってもよく、骨格筋や肝臓等の組織から採取された組織片等の抽出物（組織抽出物）であってもよい。組織片等の抽出物は、組織片等を常法によりホモジナイズすることにより調製することができる。本発明に係る検出方法に供される試料としては、血清、涙液、唾液、又は尿であることが好ましい。
　また、生体試料中の有機酸の検出においては、従来の分析方法では、感度が不十分なためにより多くの生体試料を必要としたり、含有量が少なすぎてそもそも検出不可能な場合が多い。これに対して、本発明に係る検出方法は、非常に検出感度が高いため、従来よりも少量の生体試料から目的の有機酸を検出することができる。また、従来は含有量が極微量であるために検出ができなかった生体試料中の有機酸をも検出し得る。
　例えば、３－ＨＩＢを本発明に係る検出方法により検出した場合の検出感度は、従来の誘導体化せずにＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで検出した場合と比べて、１００倍以上である。また、３－ＨＩＢをＨＣｌ－ブタノールを用いて誘導体化した誘導体をポジティブＥＳＩ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより検出した場合と比べても、１０倍以上高感度である。このため、本発明に係る検出方法は、５μＬ以下の血清のほか、５μＬ以下の唾液、涙液、又は細胞培養液でも、３－ＨＩＢと３－ＨＢの同時定量や、３－ＨＩＢと３－ＨＢと３－ＨＭＢと２－ＨＢの同時定量が可能である。
　唾液と涙液中の３－ＨＩＢと３－ＨＢの濃度は、血清中濃度と高い相関が認められることから、本発明に係る検出方法を用いることにより、唾液や涙液を測定試料として非侵襲的に、肝臓での脂肪酸異化と骨格筋でのＢＣＡＡ異化の評価が可能である。
　これまで、骨格筋におけるＢＣＡＡの異化を把握する血清マーカーはなく、臨床的には血液中のＢＣＡＡ濃度の定量及び芳香族アミノ酸との比（Ｆｉｓｃｈｅｒ比）、又は血清アルブミン値による間接的な方法によって推測するのみであった。これに対して、３－ＨＩＢを本発明に係る検出方法によって検出することにより、骨格筋におけるＢＣＡＡ異化をより直接的に評価できる。つまり、本発明に係る検出方法は、骨格筋におけるＢＣＡＡ異化を評価するための新しい臨床検査としても有用である。その他にも、血清や涙液、唾液等中の３－ＨＩＢ濃度は、ＢＣＡＡ製剤を投与することによる効果予測の指標（バイオマーカー）として使用することもできる。
　なお、骨格筋におけるＢＣＡＡの異化の程度は、例えば、肝硬変、肝性脳症、筋炎、ステロイド筋症、心不全、抗がん剤の使用による悪疫質、横紋筋融解症、廃用性筋萎縮、甲状腺機能亢進症、慢性疲労症候群、サルコペニア（加齢性筋肉減弱現象）、ミトコンドリア脂肪酸酸化異常症等の疾患に罹患している患者、透析患者、手術侵襲患者、高齢者等の、血中アルブミン濃度や血中ＢＣＡＡ濃度が低下している若しくは低下しているおそれのある者についての、低栄養や筋蛋白分解の指標（バイオマーカー）とすることができる。また、マラソンやトライアスロン等の筋蛋白質異化が亢進しやすいアスリートについての低栄養や筋蛋白分解の指標とすることもできる。また、血清や涙液、唾液等中の３－ＨＩＢ濃度は栄養状態の指標とすることができるため、生体試料中の３－ＨＩＢ濃度は、例えば、創薬スクリーニング、特に前述の各種疾患に対する治療剤候補の薬理効果を示すマーカーとして、また有効成分の安全性試験における毒性評価のマーカーとしても使用することが期待される。
　運動によるエネルギー消費増加に伴い、肝臓での脂肪酸異化が亢進し、体液（血、唾液）中の３－ＨＢ量が増加する。また、骨格筋のＢＣＡＡ異化が亢進している状態では、３－ＨＩＢ量及び３－ＨＭＢ量が増加する。このため、血清又は唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度、３－ＨＭＢ濃度は、運動中又は運動後における肝臓と骨格筋のエネルギー供給源バランス（エネルギー代謝組織と供給栄養素の依存度）を評価する指標（バイオマーカー）となり得る。運動中又は運動後に、血清又は唾液中の３－ＨＢ濃度や３－ＨＩＢ濃度が、安静時からさほど変化がない場合には、糖がエネルギー供給源として使用されていると評価できる。運動中又は運動後に、血清又は唾液中の３－ＨＢ濃度や３－ＨＩＢ濃度が安静時よりも有意に上昇した場合には、肝臓での脂肪酸異化又は骨格筋におけるＢＣＡＡ異化によりエネルギーが産生されていると評価できる。運動中や飢餓時などを含め、エネルギー産生亢進時の栄養源は、通常、糖に次いで、脂質、遊離アミノ酸、そして蛋白質由来のアミノ酸となる。したがって、運動中の血中では、３－ＨＢ濃度上昇に次いで、３－ＨＩＢ濃度の上昇が出現することとなる。しかし、血中３－ＨＩＢ濃度上昇の出現が早期の場合、脂質よるエネルギー産生が低下していることを示しており、脂質栄養不足又は肝機能の低下が原因として考えられる。また、運動後、栄養補給しても３－ＨＩＢ濃度の上昇が持続する場合は、骨格筋蛋白質の異化によるエネルギー産生が生じている可能性が考えられる。運動中又は運動後の骨格筋ＢＣＡＡのエネルギー供給源としての利用を評価するバイオマーカーとしては、３－ＨＭＢよりも、血清又は唾液中３－ＨＩＢ濃度が好ましく、唾液中３－ＨＩＢ濃度がより好ましい。運動中又は運動後の肝臓と骨格筋での異なる組織と異なる栄養源によるエネルギー産生状態を評価するバイオマーカーとしては、３－ＨＩＢ濃度と３－ＨＢ濃度の両方を測定する必要がある。
　具体的には、運動中の被検者から採取した唾液又は血液から唾液中又は血清中の３－ＨＩＢ及び／又は３－ＨＢを本発明に係る検出方法により検出して３－ＨＩＢ濃度及び／又は３－ＨＢ濃度を測定し、当該濃度を予め設定された所定の閾値と比較することにより、当該被験者における運動時のエネルギー供給源を評価することができる。当該閾値は、被験者ごとに設定することが好ましいが、多数の被験者について運動負荷量が同程度となることが期待される運動を行った後の３－ＨＩＢ濃度等を測定した結果から設定してもよい。
　また、運動開始直前から運動終了後一定期間経過後までの間に経時的に被検者から血液又は唾液をサンプルとして採取し、各サンプル中の３－ＨＩＢ濃度及び／又は３－ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定することにより、血液又は唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び／又は３－ＨＢ濃度をモニタリングする（経時的変化を調べる）ことができる。モニタリングの結果得られた３－ＨＩＢ濃度及び／又は３－ＨＢ濃度の経時的変化に基づいて、当該被験者における運動時のエネルギー供給源を評価することができる。なお、運動開始直前が安静時（平常状態）ではない場合には、予め、安静時の被験者から血液又は唾液をサンプルとして採取し、各サンプル中の３－ＨＩＢ濃度及び／又は３－ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定しておき、得られた測定値を運動時のエネルギー供給源の評価の参考にすることが好ましい。
　過度の運動に加え、休養と栄養が不十分であると、相対的運動負荷量が過大となる、いわゆるオーバーワーク状態となる。飢餓時などの低栄養状態では、肝臓での脂肪酸異化によって得られるケトン体産生亢進と、骨格筋での蛋白質分解によって得られるＢＣＡＡ異化亢進によるエネルギー産生が活性化するため、血清又は唾液中の３－ＨＢ濃度と３－ＨＩＢ濃度が上昇する。特に、持久性競技者や減量や食事制限を行っているスポーツ選手や愛好家は、糖消費後のエネルギー源となる脂質貯蔵量が少ないため、骨格筋のアミノ酸をエネルギー源としての利用依存度が高くなる。その様な骨格筋アミノ酸の利用度の増加や持続により、筋蛋白質分解が亢進し、骨格筋萎縮等の症状を伴う全身のエネルギー代謝不全状態が生じる。この様な場合の多くは、いわゆるオーバーワーク状態に陥っている。この様なオーバーワーク状態では、血清又は唾液中の３－ＨＢ濃度と３－ＨＩＢ濃度測定を行うことにより、肝臓の脂肪酸異化由来のケトン体と骨格筋蛋白由来のＢＣＡＡ異化によるエネルギー供給源バランス、依存度を評価できることから、オーバーワーク状態の指標ともなり得る。例えば、運動をしていない安静時（平常状態）における３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度と、オーバーワークとならない程度の運動を行った後の唾液又は血清中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度とを本発明に係る検出方法によって測定しておき、これらの測定値から、オーバーワーク状態における３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度と、オーバーワークではない状態における３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度とを分ける閾値（オーバーワーク閾値）を予め設定しておく。オーバーワークが引き起こされる様な過度な繰り返しの運動後の被検者から採取した唾液又は血液から唾液中又は血清中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法により検出して３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度を測定し、当該濃度を予め設定されたオーバーワーク閾値と比較することにより、当該被験者におけるエネルギー供給源バランスを評価する。具体的には、当該被験者の３－ＨＩＢ濃度と３－ＨＢ濃度がオーバーワーク閾値よりも低い場合には、当該被験者の運動負荷量は適正であり、被験者はオーバーワークではない可能性が高く、当該被験者の３－ＨＩＢ濃度がオーバーワーク閾値以上である場合には、当該被験者の運動負荷量は過大であって、当該被験者はオーバーワークである可能性が高い、と評価できる。また、当該被験者の３－ＨＢ濃度のみが閾値以上である場合には、当該被験者がエネルギー不足状態であっても、当該被験者はまだオーバーワークに至っていない可能性が高い、と評価できる。当該オーバーワーク閾値は、被験者ごとに設定することが好ましいが、多数の健常者についてオーバーワークとならない程度の運動を行った後の３－ＨＩＢ濃度又は３－ＨＢ濃度を測定した結果から設定してもよい。運動中の被験者から経時的に唾液又は血液を採取し、３－ＨＩＢ濃度と３－ＨＢ濃度を経時的に測定してモニタリングすることにより、危険なオーバーワーク状態となる前に運動を終了させることもできる。この場合、被験者からの試料採取は必ずしも運動中である必要はなく、長期の運動プログラムやトレーニングを行っている被験者の安静時から採取した試料から得られる結果を、運動プログラム前やトレーニング前の同一被験者から採取した試料から得られた結果と比較することにより、オーバーワーク状態の評価に用いることもできる。すなわち、本発明に係る方法によって運動中あるいは長期的な３－ＨＩＢ濃度と３－ＨＢ濃度をモニタリングすることにより、適正な運動量を評価し、オーバーワーク状態を予防することができる。
　また、例えば、本発明に係る検出方法によって、一の個体から経時的に採取された生体試料（血清、涙液、唾液等）中の３－ＨＩＢや３－ＨＢの濃度測定することにより、骨格筋のＢＣＡＡ異化や肝臓における脂肪酸異化の状態をモニタリングすることもできる。３－ＨＩＢ濃度モニタリングや３－ＨＢ濃度モニタリングは、例えば、肝硬変患者、低栄養状態や寝たきり状態の患者に対する、骨格筋萎縮予防、低栄養状態改善を目的としたＢＣＡＡ製剤投与や栄養療法の開始の必要性の有無の判断やそれらの治療の判定に利用可能である。例えば、３－ＨＢ濃度に変化がみられないのにも関わらず、３－ＨＩＢ濃度のみ上昇傾向がみられる場合には、肝機能の低下による肝臓での低エネルギー産生能を、骨格筋蛋白異化によるアミノ酸由来のエネルギー産生で代償する低栄養状態である可能性が高いと評価できる。
　その他にも、本発明に係る検出方法によって３－ＨＩＢや３－ＨＢの濃度を測定することにより、スポーツ医学領域において、肝臓と骨格筋における脂質とアミノ酸のエネルギー源依存バランス（エネルギー代謝状態）を、血液はもちろんのこと、唾液又は涙液等を用いてもモニターすることも可能となる。さらに、アンチエイジングやダイエットによる体重管理や美容の領域において、本発明に係る検出方法によって唾液又は涙液を分析して３－ＨＩＢや３－ＨＢの濃度を測定することにより、糖、アミノ酸、脂肪酸の代謝状態を評価しながら、効果的に栄養・運動・体調管理を行うことも可能となる。さらに、本発明に係る検出方法は、ＢＣＡＡ等の栄養素が含まれるサプリメントや栄養ドリンクを摂取した際の栄養・摂取効果などの評価にも利用できる。
　また、健常者群よりも肝硬変患者群の方が、体液中の３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢの濃度が高い傾向にある。そこで、３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢは、肝硬変のバイオマーカーとして利用できる。具体的には、予め肝硬変患者と健常者とを分ける閾値を設定し、被検者の体液中の３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢの濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、当該濃度を所定の閾値と比較することにより、肝硬変発症可能性を評価することができる。具体的には、被検者の体液中、特に血清又は唾液中の３－ＨＩＢ等の濃度が所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が肝硬変を発症している可能性が高いと評価することができる。肝硬変患者と健常者とを分ける閾値は、実験的に設定することができる。例えば、肝硬変を発症していないことが分かっている集団から採取された体液と、肝硬変を発症していることが分かっている集団から採取された体液とに対して、本発明に係る検出方法を行ってこれらの体液中の３－ＨＩＢ等の濃度を測定し、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。例えば、血清中の３－ＨＩＢ濃度の場合、肝硬変患者群と健常者群を分ける閾値としては、１８μＭ、好ましくは２０μＭ、さらに好ましくは２４μＭとすることができる。肝硬変のバイオマーカーとしては、３－ＨＩＢ又は３－ＨＭＢが好ましく、肝硬変患者群と健常者群の差がよりはっきりしていることから、唾液中の３－ＨＩＢ又は唾液中の３－ＨＭＢがより好ましい。
　肝硬変が進行し、肝機能の一つである尿素回路が低下すると、アンモニアは骨格筋で代償的にグルタミンやアラニンに代謝されて無毒化される。その際に、ＢＣＡＡが骨格筋でＢＣＡＴにより分岐鎖α－ケト酸に異化される過程で副産物として生じるグルタミン酸が、アンモニア解毒に用いられている。そのため、肝硬変時に骨格筋で代償するアンモニア解毒の際にも骨格筋ＢＣＡＡ異化の亢進が必要であり、結果として、体液中の３－ＨＩＢ濃度は上昇する。アンモニア解毒が不十分で、体液中のアンモニア濃度が高くなると、脳症が誘発されやすくなると考えられている。したがって、肝硬変患者の肝臓でのアンモニア解毒能の低下に加え、骨格筋ＢＣＡＡ異化を介したアンモニア解毒代償能の低下が生じると、肝性脳症をきたすものと考えられる。この様な理由で、３－ＨＩＢは、肝性脳症又はその発症可能性のバイオマーカーとして利用でき、その予防や早期治療のために有用な情報を提供することができる。例えば、３－ＨＩＢ濃度から肝性脳症を発症するリスクが高いと評価された肝硬変患者に対しては、脳症が顕在化していない場合であっても蛋白制限食を推奨したり、ＢＣＡＡの摂取を推奨したりすることにより、肝性脳症の発症を予防し得る可能性がある。
　例えば、肝硬変患者から経時的に採取した体液（血清、涙液、唾液等）中の３－ＨＩＢ濃度をモニタリングした場合に、３－ＨＩＢ濃度が低下傾向にある場合には、当該肝硬変患者が肝性脳症を発症する可能性が高い。そこで、肝硬変を発症している被検者から採取した生体試料、特に血清又は唾液中の３－ＨＩＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、得られた３－ＨＩＢ濃度を、当該生体試料が採取された時点以前に前記被験者から採取された生体試料中の３－ＨＩＢ濃度と比較することにより、肝性脳症発症可能性を評価できる。具体的には、得られた３－ＨＩＢ濃度が、以前に採取された生体試料の３－ＨＩＢ濃度よりも有意に低い場合や、モニタリングの結果、以前に採取された生体試料の３－ＨＩＢ濃度よりも低くなる傾向がある程度継続している場合には、当該被検者が肝性脳症を発症する可能性が高いと評価する。
　肝硬変患者における３－ＨＩＢ濃度が低下しているか否かは、肝硬変患者と健常者とを分ける閾値を用いても評価することができる。具体的には、肝硬変を発症している被検者から採取した生体試料、特に血清又は唾液中の３－ＨＩＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、得られた３－ＨＩＢ濃度を、所定の閾値（例えば、前記の肝硬変患者と健常者とを分ける閾値）と比較することにより、肝性脳症発症可能性を評価することができる。具体的には、被検者の３－ＨＩＢ濃度が所定の閾値未満であった場合や、所定の閾値未満である状態がある程度継続している場合に、前記被検者が肝性脳症を発症する可能性が高いと評価することができる。
　本発明に係る検出方法を用いることにより、３－ＨＩＢ等の含有量が比較的高い血液等の生体試料以外にも、唾液又は涙液等の３－ＨＩＢ等の含有量が極微量である生体試料を用いてモニターすることも可能となる。特に、非侵襲的に採取される涙液、唾液等を試料とすることにより、医療有資格者に限られる採血などの試料採取や特別な採取器具（針、注射筒、採血管、非凝固薬など）を必要とすることなく、場所、時間、採取者を問わずに試料の採取が可能となる。この場合には、通院や入院の必要がなく、在宅で患者本人による試料の採取も可能である。また、採血を好まない子供もしくは高齢者や宗教上の理由で採血が出来ない患者に対しても、唾液試料での測定は有効である。
　３－ＨＭＢは、ＢＣＡＡ由来の肝臓や骨格筋における蛋白合成のマーカーや骨格筋肥大のマーカーとして利用可能であり、また、２－ＨＢは、早期インスリン抵抗性のマーカーや、グルコース不耐性のマーカーである。本発明に係る検出方法を用いることにより、血液や唾液等を用いて、これらのバイオマーカーを感度よく検出することができる。
　なお、後記実施例１０に示すように、唾液や血液等の生体試料中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢは、長時間室温で放置した場合でも、濃度が低下し難い。このため、被験者から採取された生体試料を直ちに冷蔵・冷凍保存することが困難な場合であっても、３－ＨＩＢ及び３－ＨＢは安定した優れたバイオマーカーとして機能し得る。このため、例えば健康診断等のように、被験者から生体試料を採取する場所と、当該生体試料中の３－ＨＩＢ等の有機酸を検出するための試験場所とが離れている場合であっても、本発明に係る検出方法を用いることにより、３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度を精度よく測定することができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試薬類＞
　以下の実施例等で用いた試薬は次の通りである。Ｄ－３－ＨＢ、Ｌ－３－ＨＢ、及び３－ＨＩＢナトリウム塩は、シグマアルドリッチケミカル社製のものを用いた。ＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩は、太陽日酸社製のものを用いた。２－ピリジンメタノール、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物、１－ピペリジンエタノール、２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジン、３－ピリジンメタノール、２－ジエチルアミノエタノール、３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジン、及び４－ピリジンメタノールは、東京化成工業社製のものを、４－ジメチルアミノピリジンは和光純薬社製のものを用いた。３－ＨＢデヒドロゲナーゼは、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のものを用いた。
＜血清試料の調製＞
　健常人から採取した血液から血清を回収し、測定に使用する時点まで－２０℃で保存したものを用いた。血清（１０μＬ）を、１．５ｍＬの遠心分離用プラスチックチューブにいれ、さらに内部標準として７６９ｐｍｏｌ（１００ｎｇ）のＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩を含むアセトニトリル／水（１／１９、容量比）溶液（１００μＬ）を添加して１分間撹拌した後、２０００×ｇで１分間遠心分離処理した。上清を、水／アセトニトリル（１／１９、容量比）溶液に入れ、脱蛋白処理をした後、液相を回収して８０℃、窒素ガス吹き付け下でエバポレートして乾燥させた。
＜３－ＨＢ－フリー血清の調製＞
　３－ＨＢ－フリー血清は、正常な血清（１０μＬ）を１．８ｍＭのＮＡＤと０．０７５Ｕの３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを添加した１５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）に添加して、３７℃で３０分間インキュベートすることにより調製した。
＜２－ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応＞
　２－ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応は、シイナらによるカルボキシエステルの合成方法（非特許文献１３参照。）を改良して行った。具体的には、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２－ピリジンメタノール（１００μＬ）からなる２ＰＭ誘導体化用混合試薬を用いた。まず、直前に調製した前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬（５０μＬ）を、有機酸を含む乾燥させたサンプルに加えた反応溶液を、室温で３０分間静置した。次いで、当該反応液にｎ－ヘキサン（１ｍＬ）を加えて３０秒間撹拌した後、７００×ｇで１分間遠心分離処理し、回収した上清を、８０℃、窒素ガス吹き付け下でエバポレートした。残留物を１容量％のギ酸水溶液（１５０μＬ）に再溶解させ、再度７０００×ｇで１分間遠心分離処理し、回収した上清を、測定試料としてＥＳＩ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供した。
＜ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ＞
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムは、ＨＥＳＩ－IIプローブとＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　Ｕｌｔｒａ　Ｆａｓｔ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＦＬＣ）システム（島津製作所製）を備えたトリプル四重極型質量分析計ＴＳＱ　Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。クロマトグラフィーにおける分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＧＯＬＤ　ａＱカラム（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４０℃で行った。はじめに、移動相を０．２容量％のギ酸を含むアセトニトリル／水（１／１９、容量比）として流速３００μＬ／分で５分間流した。５分後に、移動相を０．２容量％のギ酸を含むアセトニトリルに変更し、流速３００μＬ／分で７分間流した。一般的なＭＳ／ＭＳ条件は、以下の通りである；
スプレー電圧：３０００Ｖ、
噴霧器温度：４５０℃、
シースガス（窒素）圧：５０ｐｓｉ、
補助ガス（窒素）流量：１５任意単位、
イオントランスファーキャピラリー温度：２２０℃、
衝突ガス（アルゴン）圧：１．０ｍＴｏｒｒ、
衝突エネルギー：１５Ｖ、
イオン極性：正モード。
　図１Ｂに、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ（２ＰＭ－３－ＨＢ）の典型的なＰ－ＥＳＩ　ＭＳスペクトラムを示す。２ＰＭ－３－ＨＢは、［Ｍ＋Ｈ］＋イオンがベースピークとしてｍ／ｚ　１９６にみられる。このｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンＭＳスペクトラム（図１Ａ）では、［Ｃ５Ｈ４ＮＣＨ２ＯＨ＋Ｈ］＋のフラグメントイオンが最も突出したピークとしてｍ／ｚ　１１０にみられる。ＳＲＭは、２ＰＭ－３－ＨＢの検出にはｍ／ｚ　１９６→ｍ／ｚ　１１０を用いて行い、［１３Ｃ４］同位体（内部標準）の検出にはｍ／ｚ　２００→ｍ／ｚ　１１０を用いて行った。
＜キャリブレーションカーブの作成＞
　キャリブレーションカーブの作成には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）にＤ－３－ＨＢナトリウム塩を溶解させた標品保存溶液（２００ｎｇ／μＬ）を、さらにアセトニトリル／水（１／１９、容量比）を用いて適宜希釈することにより調製した濃度既知のＤ－３－ＨＢナトリウム標準溶液（１～２００ｎｇ／１００μＬ）を用いた。各標準溶液には、内部標準として、ＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩（１００ｎｇ）を添加し、混合物をエバポレートして乾燥させた後に、誘導体化（誘導体によるエステル化）をしたものを、ＥＳＩ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。キャリブレーションカーブのマトリックス効果を調べるために、各標準溶液にブランクマトリックスとして、３－ＨＢ－フリー血清を添加した。
＜ＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ＞
　３－ＨＢのＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは、誘導体化を行わずに、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムと同じものを用いて実施した。クロマトグラフィーにおける分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＧＯＬＤ　ａＱカラム（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４０℃で行った。移動相は、０．１容量％のギ酸を含むメタノール／水（１／９、容量比）を流速２００μＬ／分で流した。一般的なＭＳ／ＭＳ条件は、以下の通りである；
スプレー電圧：２５００Ｖ、
噴霧器温度：４５０℃、
シースガス（窒素）圧：５０ｐｓｉ、
補助ガス（窒素）流量：１５任意単位、
イオントランスファーキャピラリー温度：２２０℃、
衝突ガス（アルゴン）圧：１．０ｍＴｏｒｒ、
衝突エネルギー：１５Ｖ、
イオン極性：負モード、
３－ＨＢのＳＲＭ（選択反応モニタリング）：ｍ／ｚ　１０３　→　ｍ／ｚ　５９、
［１３Ｃ４］のＳＲＭ：ｍ／ｚ　１０７　→　ｍ／ｚ　６１。
＜統計処理＞
　以下の実施例等における数値は、平均±ＳＤ（標準偏差）である。キャリブレーションカーブの直線性は単回帰分析により分析した。再現性は、一元配置分散分析法（ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）（ＪＭＰソフトウェア、ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）により分析した。推定値±９５％信頼限界を、精度指標として得た（非特許文献１４参照。）。値を算出するために、ＪＭＰソフトウェアを用いた再現性試験においては、直交回帰分析を行った。異なるグループ間の差の統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　ｔ－ｔｅｓｔにより評価した。全ての分析では、Ｐ＜０．０５で有意差ありとした。
［実施例１］　
　２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）にＤ－３－ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）のみを溶解させた試料溶液、Ｄ－３－ＨＩＢナトリウム塩（標品、１μｇ）のみを溶解させた試料溶液、及びＤ－３－ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）とＤ－３－ＨＩＢナトリウム塩（標品、１μｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、それぞれをエバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ－３－ＨＢナトリウム塩、Ｄ－３－ＨＩＢナトリウム塩それぞれ１ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図２に示す。図２Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図２Ｂに前記図２ＡのＭＳスペクトラムを、図２Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図２Ｄに前記図２ＣのＭＳスペクトラムを、図２Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図２Ｆに前記図２Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。　
　この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、ＬＣの保持時間が遅いため、カラムから最初に出てくる誘導体化試薬等（例えば、４－ジメチルアミノピリジンなど）の３－ＨＢの誘導体や３－ＨＩＢの誘導体のピークに対する影響は非常に小さかった。つまり、これらの結果から、２－ピリジンメタノールで誘導体化することにより、３－ＨＢや３－ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。
［実施例２］　
　１－ピペリジンエタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び１－ピペリジンエタノール（１００μＬ）からなる１ＰＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　図３に、１－ピペリジンエタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を示す。図３Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図３Ｂに前記図３ＡのＭＳスペクトラムを、図３Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図３Ｄに前記図３ＣのＭＳスペクトラムを、図３Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図３Ｆに前記図３Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。　
　この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体のいずれのピークも、プロダクトイオンクロマトグラムにおけるＳ／Ｎが良好であり、感度が特に良好であった。つまり、これらの結果から、１－ピリジンエタノールで誘導体化することにより、３－ＨＢや３－ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。
［実施例３］　
　２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジン（１００μＬ）からなる１ＰＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図４に示す。図４Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図４Ｂに前記図４ＡのＭＳスペクトラムを、図４Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図４Ｄに前記図４ＣのＭＳスペクトラムを、図４Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図４Ｆに前記図４Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。　
　この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体のいずれのピークも、プロダクトイオンクロマトグラムにおけるＳ／Ｎが良好であり、感度が特に良好であった。つまり、これらの結果から、２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンで誘導体化することにより、３－ＨＢや３－ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。
［比較例１］
　３－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び３－ピリジンメタノール（１００μＬ）からなる３ＰＭ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　３－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図５に示す。図５Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図５Ｂに前記図５ＡのＭＳスペクトラムを、図５Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図５Ｄに前記図５ＣのＭＳスペクトラムを、図５Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図５Ｆに前記図５Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。　
　この結果、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれも検出することができたが、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が不良であった。また、ＬＣの保持時間が３ＰＭ誘導体化用混合試薬中の４－ジメチルアミノピリジンと重なった。特に３－ＨＢの３－ピリジンメタノール誘導体は、４－ジメチルアミノピリジンによるマトリックス効果により感度が極端に悪くなった。
［比較例２］
　２－ジエチルアミノエタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２－ジエチルアミノエタノール（１００μＬ）からなる２ＤＥＡＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　２－ジエチルアミノエタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図６に示す。図６Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図６Ｂに前記図６ＡのＭＳスペクトラムを、図６Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図６Ｄに前記図６ＣのＭＳスペクトラムを、図６Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２０４を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図６Ｆに前記図６Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。　
　この結果、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれも検出することができたが、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が不良であった。また、ＬＣの保持時間が２ＤＥＡＥ誘導体化用混合試薬中の４－ジメチルアミノピリジンと重なった。特に３－ＨＩＢの２－ジエチルアミノエタノール誘導体は、４－ジメチルアミノピリジンによるマトリックス効果により感度が極端に悪くなった。さらに、６．５分付近に、２－ジエチルアミノエタノールの試薬由来と思われる巨大なブロードのピークが出現した。
［比較例３］
　３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジンで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジン（１００μＬ）からなる３Ｈ１ＭＰ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジンで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図７に示す。図７Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図７Ｂに前記図７ＡのＭＳスペクトラムを、図７Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図７Ｄに前記図７ＣのＭＳスペクトラムを、図７Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　２０２を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図７Ｆに前記図７Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。　
　この結果、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれもピークが３本ずつ検出された。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が不良であった。また、ＬＣの保持時間が３Ｈ１ＭＰ誘導体化用混合試薬中の４－ジメチルアミノピリジンと重なった。さらに、７分付近に、３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジンの試薬由来と思われる巨大なブロードのピークが出現した。
［比較例４］
　４－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び４－ピリジンメタノール（１００μＬ）からなる３Ｈ１ＭＰ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　４－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ及び３－ＨＩＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図８に示す。図８Ａに誘導体化された３－ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図８Ｂに前記図８ＡのＭＳスペクトラムを、図８Ｃに誘導体化された３－ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図８Ｄに前記図８ＣのＭＳスペクトラムを、図８Ｅに誘導体化された３－ＨＢと３－ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図８Ｆに前記図８Ｅの３－ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。
　この結果、３－ＨＢと３－ＨＩＢの誘導体はいずれも検出することができたが、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体の分離が不良であった。また、ＬＣの保持時間が３Ｈ１ＭＰ誘導体化用混合試薬中の４－ジメチルアミノピリジンと重なった。
［実施例４］
　健常者から採取された１０μＬの血清に内部標準としてＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩を添加した試料を、実施例１と同様にして２－ピリジンメタノールで誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。図９に、２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ（２ＰＭ－３－ＨＢ）と［１３Ｃ４］同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した。当該クロマトグラムより、２ＰＭ－３－ＨＢの［１３Ｃ４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて血清中の３－ＨＢ濃度を決定した。当該クロマトグラム中の２ＰＭ－３－ＨＢのピークは５．１ｐｍｏｌ（７６μＭ）に相当した。クロマトグラムＡの４．５３分に見られたピークは、２ＰＭ－３ＨＩＢ標品との比較から、３－ＨＩＢの２ＰＭエステル誘導体であると同定された。
［実施例５］
　実施例４と同様にして、男性健常者から２～３時間おきに採取した血清中の３－ＨＢ濃度を測定した。測定結果を図１０に示す。図中、黒矢印は、食事をとった時間を示し、網掛け部分は睡眠時間を示す。この結果、本発明に係る検出方法により、１０μＬの血清中の３－ＨＢを検出できることがわかった。また、血清中の３－ＨＢは、食事の摂取により低下する傾向があることがわかり、血清中の３－ＨＢ濃度は、食事摂取によってコントロールされていることもわかった。
［実施例６］
　健常者から採取された血清を試料として、本発明に係る検出方法の精度と確度を調べた。具体的には、健常者から採取された１０μＬの血清に内部標準としてＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩を添加した試料を、実施例１と同様にして２－ピリジンメタノールで誘導体化し、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　再現性は、４種のサンプル（サンプルＡ～Ｄ）をそれぞれ３回ずつＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。測定結果を表１に示す。測定結果は、ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡにより分析したが、その際、分析誤差は、サンプル調製とＳＲＭ測定の２つの原因に分けた。表２に示すように、サンプル調製時の誤差は、測定間誤差よりも有意に大きくなかったため、分散は、サンプル調製によるものではないと考えられた。試料間又は試料内における分散の試験間変動計数は、それぞれ、２．２％又は１．２％だった。なお、表２中、「Ｓ」は偏差平方和を、「ｆ」は自由度を、「Ｖ」は不偏分散を、「Ｆ０」は分散比（［Ｖサンプル調製］／［Ｖ誤差］）の観測値を、「Ｆ（３、８、α）」は自由度３、８、有意水準αの時のＦ値を、それぞれ意味する。この結果、２００ｐｍｏｌという微量の３－ＨＢを検出できたことから、当該検出方法が感度に優れていることがわかった。また、４種のいずれのサンプルにおいても、測定間のばらつきが非常に小さく、かつ２００ｐｍｏｌという微量の３－ＨＢを検出できたことから、当該検出方法が精度に優れていることもわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　添加回収試験は、１０μＬの血清サンプル（ｎ＝２）に既知量の３－ＨＢ（１５８．７、又は３１７．５、又は４７６．２ｐｍｏｌ）を入れた。脱蛋白処理と誘導化反応を行った後、各サンプルにつき３回ＳＲＭで測定した。表３に示すように、３－ＨＢの既知添加量の回収率は、９３．７～９８．２％の範囲内にあり、平均は９６．７％だった。加えて、１０μＬの血清を添加しなかった場合の内在性の３－ＨＢ量は、直交回帰分析により算出された３－ＨＢの推定量の９５％信頼限界の範囲内であった。なお、表３中、「ａ」が付された数値は表１から得られた値であり、「回収率（％）ｂ」は下記式で表される値であり、「推定量±９５％信頼限界ｃ」は直交回帰分析により算出された値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例７］
　２ＰＭ－３－ＨＢのＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる測定感度を、ＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる測定感度と比較した。
　具体的には、２ＰＭ－３－ＨＢ溶液の濃度既知の希釈系列について、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（ＳＲＭ）により測定し、２ＰＭ－３－ＨＢが検出された最小濃度（最小検出感度）を調べた。同様に、３－ＨＢ溶液の濃度既知の希釈系列について、ＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（ＳＲＭ）により測定し、最小検出感度を調べた。なお、各測定試料には、ブランクマトリックスとして３－ＨＢ－フリー血清を添加した。
　この結果、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより、オンカラム注入量が６．０ｆｍｏｌの２ＰＭ－３－ＨＢをも検出することができた（Ｓ／Ｎ＝３）。これに対して、ＬＣ－Ｎ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳでは、オンカラム注入量が４８１ｆｍｏｌの３－ＨＢまでしか検出できなかった（Ｓ／Ｎ＝３）。
［実施例８］　
　２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＭＢ及び２－ＨＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）に、Ｄ－３－ＨＭＢナトリウム塩（標品、１μｇ）とＤ－２－ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、エバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（２０μＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ－３－ＨＭＢナトリウム塩、Ｄ－２－ＨＢナトリウム塩それぞれ５０ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＭＢ及び２－ＨＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図１１に示す。図１１Ａに誘導体化された３－ＨＭＢと２－ＨＢを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）と、ｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（中段）と、ｍ／ｚ　２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（下段）を、それぞれ示す。また、図１１Ｂに前記図１１Ａの中段のプロダクトイオンクロマトグラムのＭＳスペクトラムを、図１１Ｃに前記図１１Ａの下段のプロダクトイオンクロマトグラムのＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。
　この結果、測定に供した試料には５０ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３－ＨＭＢ及び２－ＨＢの誘導体はいずれも同時にスペクトル解析することができた。
　また、３－ＨＭＢ及び２－ＨＢの２ＰＭエステル誘導体を各１００ｐｇ又は１０ｐｇ含有する試料を用いて、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより同様にして測定したところ、どちらの試料を測定した場合でも、３－ＨＭＢ及び２－ＨＢの誘導体はいずれも同時にスペクトル解析することができた（図示せず。）。
これらの結果から、２－ピリジンメタノールで誘導体化することにより、構造類似の３－ＨＭＢ及び２－ＨＢを、１０ｐｇという極微量しか含まれていない場合であっても精度よく高感度に同時検出できることがわかった。
［実施例９］　
　２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ、３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）に、Ｄ－３－ＨＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ－３－ＨＩＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ－３－ＨＭＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ－２－ＨＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩（標品、８０ｎｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、エバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ－３－ＨＢナトリウム塩、Ｄ－３－ＨＩＢナトリウム塩、Ｄ－３－ＨＭＢナトリウム塩、Ｄ－２－ＨＢナトリウム塩がそれぞれ３ｎｇ相当、ＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩が８ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　２－ピリジンメタノールで誘導体化された３－ＨＢ、３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢを、ＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図１２に示す。図１２の上段に試料の総イオンクロマトグラムを、上から２段目にｍ／ｚ　１９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、上から３段目にｍ／ｚ　２００を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、最下段にｍ／ｚ　２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、それぞれ示す。
　この結果、測定に供した試料には３ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３－ＨＢ、３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢの２ＰＭエステル誘導体は、いずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３－ＨＢの誘導体と３－ＨＩＢの誘導体と３－ＨＭＢの誘導体と２－ＨＢの誘導体の分離が良好であった。つまり、これらの結果から、２－ピリジンメタノールで誘導体化することにより、構造類似の３－ＨＢ、３－ＨＩＢ、３－ＨＭＢ、及び２－ＨＢを、精度よく高感度に同時検出できることがわかった。
［実施例１０］
　被検者から採取された血清と唾液を一定時間室温放置した場合における、血清中と唾液中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの安定性を検討した。
＜血清＞
　健常者から６本の採血管に血液を採取した。６本の採血管のうちの１本については、採血後速やかに遠心分離処理を行い、回収した血清を－２０℃で凍結保存した。残りの５本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、又は２４時間放置した後、遠心分離処理を行い、回収した血清を－２０℃で保存した。
　－２０℃で保存後の各血清中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度を、内部標準としてＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩を用い、誘導体化試薬として２－ピリジンメタノールを用いて、実施例４と同様にしてＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ－３－ＨＢの［１３Ｃ４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、血清中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度を決定した。測定結果を図１３に示す。この結果、血清中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度は、採血後室温で放置される時間が６時間に至るまで減少するが、その後２４時間まで変化はなかった。
＜唾液＞
　健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を６本のチューブに分注した。６本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに－２０℃で凍結保存した。残りの５本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、又は２４時間放置した後、－２０℃で保存した。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を分析に用いた。
　－２０℃で保存後の各唾液中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度を、内部標準としてＤＬ－３－ＨＢ－１３Ｃ４ナトリウム塩を用い、誘導体化試薬として２－ピリジンメタノールを用いて、実施例４と同様にしてＬＣ－Ｐ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ－３－ＨＢの［１３Ｃ４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、唾液中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度を決定した。測定結果を図１４に示す。この結果、唾液中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度は、採取後室温で放置される時間にかかわらず、ほぼ安定していた。
［実施例１１］
　被検者から採取された血清と唾液（流涎）中における、３－ＨＩＢ、３－ＨＢ、及び２－ＨＢの濃度の相関性を調べた。具体的には、健常人３名（被検者α、β、γ）から、各５サンプルずつ、血清及び唾液を採取し、これらの３－ＨＩＢ、３－ＨＢ、及び２－ＨＢの濃度を測定し、血清中濃度と唾液中濃度の相関性を調べた。血清中及び唾液中の３－ＨＩＢ、３－ＨＢ、及び２－ＨＢの濃度は、実施例１０と同様にして測定した。３－ＨＢ濃度の測定結果を図１５Ａに、３－ＨＩＢ濃度の測定結果を図１５Ｂに、２－ＨＢ濃度の測定結果を図１５Ｃに、それぞれ示す。この結果、３－ＨＩＢ、３－ＨＢ、及び２－ＨＢのいずれにおいても、唾液中濃度は、血清中濃度と相関することが確認された。
［実施例１２］
　走運動前後の血清中、唾液中、及び尿中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度を測定し、経時的変化を観察した。
　具体的には、被験者（男性健常者）に、前日の午前１１時から走運動当日の午前１１時までの２４時間蓄尿した後、６０分間ジョギング（走行距離：約９ｋｍ、速度：約６．７分／ｋｍ）し、その後２４時間経過時点（走運動日の翌日の昼１２時）までを実験期間とした。被験者は、前日の午前１１時から実験期間終了時点までの間、前日の昼食及び夕食、走運動当日の昼食及び夕食、翌日の朝食を摂取した。被験者の運動と食事状況、及び血液、唾液、尿の採取時点を図１６に示す。なお、実施した６０分間ジョギングは、当該被験者にとって日常的に行っている運動よりもやや負荷の高い運動であった。
　血清中、唾液中、及び尿中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＢ濃度は、実施例１０と同様にして測定した。採取された各サンプル中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの測定結果を図１７～１９に示す。図１７は、血清中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度の経時的変化を示す。図１８は、３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの各採取時点における単位時間当たり尿排泄量（［尿排泄量］／［前回採取時からの経過時間］）（μｍｏｌ／ｈ）の経時的変化を、それぞれ示す。図１９は、唾液中の３－ＨＩＢ及び３－ＨＢの濃度の経時的変化を示す。図１９の下段の図は、上段の走運動中の測定結果を、縦軸スケールを拡大して示した図である。
　この結果、本発明に係る検出方法により、被験者から採取された血清、唾液、尿のいずれにおいても、３－ＨＩＢと３－ＨＢの両方を検出できることが確認された。
　３－ＨＢは、走運動により、血清中と唾液中のいずれにおいても濃度は上昇したが、血清中３－ＨＢ濃度は、走運動後もそのまま上昇しており、唾液中３－ＨＢ濃度は、走運動直後は低下したものの、その後再び上昇した（図１７及び図１９上段）。これらの結果から、運動によって上昇する血清中の３－ＨＢ濃度と同様に、唾液中の３－ＨＢ濃度も運動により上昇する事が確認された。また、運動後は、血清中と唾液中ともに、３－ＨＢ濃度は、食事を摂取するまで上昇し続けることから、運動後の肝脂肪酸異化（脂肪の燃焼）を、血液と唾液の両試料にてモニターできることも確認できた。
　一方で、３－ＨＩＢは、血清中と唾液中のいずれにおいても、走運動により濃度が上昇し、運動終了後ある程度時間が経過すると速やかに濃度は低下し、運動前の平常状態にまで戻ることが確認された（図１７及び図１９上段）。運動中に比べて運動後は、骨格筋ＢＣＡＡ異化反応は持続せず、健常人では、一過性の運動を行ったのみでは、骨格筋蛋白質分解由来ＢＣＡＡ又は遊離ＢＣＡＡの異化は生じないことが確認された。特に唾液中３－ＨＩＢ濃度は、運動終了後３０分経過時点から実験期間終了時点までの間、ほとんど変動せず、食事等の影響を受けにくいことがわかった。これに対して、血清中３－ＨＩＢ濃度は、運動終了後１時間経過時点では平常状態にまで低下したものの、運動終了後４時間経過時点ではやや上昇していた。運動終了後２．２５時間経過時点で食事を摂取しているため、この運動終了後４時間経過時点での血清中３－ＨＩＢ濃度の上昇は、わずかながら食事の影響を受けた可能性が考えられた。
　これらの結果から、血清中と唾液中の３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度は、運動により上昇することから、運動による肝脂肪酸異化（脂肪燃焼）マーカー及び骨格筋ＢＣＡＡ異化マーカーとしてこれらを同時に評価が可能であり、運動時又は運動後の組織別（肝と骨格筋）のエネルギー代謝状態（ひいては、エネルギー供給源のバランス）を評価するマーカーとして有用であること、食事等の影響を受けにくいことから、３－ＨＩＢについては、血清中濃度よりも唾液中濃度のほうがマーカーとして好ましいこと、がわかった。
　図１９下段に示すように、走運動中の唾液中３－ＨＩＢ濃度は、運動開始から１５分経過時点までは、運動開始時点（平常状態）からあまり変化がないが、その後ゆるやかに上昇する傾向が観察された。走運動中の唾液中３－ＨＢ濃度は、運動開始から３５分経過時点までは運動開始時点（平常状態）からあまり変化がないが、その後は３－ＨＩＢ濃度と比較してより急激に上昇する傾向が観察された。運動時のエネルギー源として、まずは糖が優先的に利用されるが、運動時間や強度が増すにつれ、脂肪やアミノ酸がエネルギー源として利用される。これらの結果から、３－ＨＢ濃度及び３－ＨＩＢ濃度の上昇は、糖の代わりに脂肪やアミノ酸がエネルギー源として利用された事を示しており、両者が上昇した時点は、エネルギー産生の依存度が糖代謝から脂質、アミノ酸代謝へ移行したポイントを示していると考えられる。また、近年、運動早期から、糖や脂質に加え、アミノ酸もエネルギー源として利用されていると示唆されているが、３－ＨＢよりも３－ＨＩＢの方が早期に上昇し始める結果は、アミノ酸代謝も運動早期から活性化されることを示していると考えられる。本実施例では、唾液中の３－ＨＩＢ濃度は、走運動終了後速やかに定常状態にまで低下したが、運動負荷が過大となりすぎた場合、いわゆるオーバーワーク状態には、運動終了後にも定常状態にまで戻りにくくなると推察される。
　図１８に、運動前後の単位時間当たりの尿中３－ＨＢ排泄量及び３－ＨＩＢ排泄量を示す。血清や唾液とは異なり、運動によって、尿中３－ＨＢ排泄量及び３－ＨＩＢ排泄量の増加はみられず、尿中３－ＨＩＢ排泄量は、寧ろ低下傾向にあった（運動１時間後）。尿中３－ＨＢ排泄量は、その後、運動３時間まで増加傾向にあり、その後一旦減少したが、運動１２．５時間まで再度増加傾向にあった。尿中３－ＨIＢ排泄量は、多少の増減を繰り返しながら、運動９．５時間まで増加した。尿中３－ＨＢと３－ＨＩＢ排泄量ともに、血清や唾液のそれぞれの濃度変化との関連はみられず、腎臓組織における再吸収が影響した結果と推測された。尿を試料とする場合、随時尿か畜尿か、又はクレアチニン等での補正の必要を考慮すると、３－ＨＢと３－ＨＩＢともに、運動時、運動後の組織別エネルギー代謝状態を評価するマーカーとしては、尿中排泄量より、血清や唾液での評価が好ましいことがわかった。
［実施例１３］
　健常者１５名と肝硬変患者２０名から血液及び唾液を採取し、血清中と唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度を測定し、比較した。血清中と唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度は、実施例１０と同様にして測定した。
　血清中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度の測定結果を図２０Ａに、唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度の測定結果を図２０Ｂに、それぞれ示す。この結果、唾液中と血清中のいずれにおいても、肝硬変患者群の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度は、健常者群よりも高い傾向が観察され、これらが肝硬変マーカーとして有用であることが示された。特に唾液中の３－ＨＩＢ濃度及び３－ＨＭＢ濃度は、肝硬変患者群のほうが健常者群よりも有意に高かった。
［実施例１４］
　健常者４８名と肝硬変患者３２名から血液を採取し、実施例１０と同様にして血清中の３－ＨＩＢ濃度を測定した。この結果、血清中３－ＨＩＢ濃度は、健常者の平均値が１２．６±０．７μＭであり、肝硬変患者の平均値が２７．７±３．６μＭであった。
［実施例１５］
　肝性脳症患者（男性）から経時的に２回血液を採取し、実施例１０と同様にして血清中の３－ＨＩＢ濃度を測定した。測定結果を表４に示す。この結果、肝性脳症患者の血清中の３－ＨＩＢ濃度は、健常者の平均値（１２．６μＭ）よりもはるかに低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実施例１６］
　肝硬変の症状が比較的軽い肝硬変患者Ａ（女性）と肝硬変の症状が比較的重い肝硬変患者Ｂ（女性）から経時的に血液を採取し、血清中の３－ＨＩＢ濃度（μＭ）、アルブミン濃度（ｇ／ｄＬ）、及びアンモニア濃度（μｇ／ｄＬ）を測定した。アルブミンとアンモニアの測定は、通常、臨床検査で常用されている規定法によって測定した。アルブミン濃度の測定は、得られた患者血清をアルブミンＨＲ－ＩＩ（和光純薬社製）を用いて、ＢＣＧ法により測定した。アンモニア濃度は、富士ドライケムスライド　ＮＨ３－ＷII（富士フィルム社製）を用いて、富士ドライケム生化学分析装置を用いて測定した。血清中の３－ＨＩＢ濃度は、実施例１０と同様にして測定した。血清中のアルブミン濃度は、肝機能（肝蛋白合成能）マーカーの１つとして測定した。血清中のアンモニア濃度は、肝性脳症マーカーとして、又はアンモニアクレアランス状態を知るために測定した。なお、両患者には、測定期間中の一定期間、ＢＣＡＡ剤を投与した。図２１に肝硬変患者Ａの測定結果を、図２２に肝硬変患者Ｂの測定結果を、それぞれ示す。図２１及び２２中、上段は血清中の３－ＨＩＢ濃度の経時的変化を示したグラフであり、中段は血清中アルブミン濃度の経時的変化を示したグラフであり、下段は血清中アンモニア濃度の経時的変化を示したグラフである。図２１の上段中、「ＢＣＡＡ」は、ＢＣＡＡ投与期間を示す。
　図２１に示すように、血清中アルブミン濃度が基準値（３．８ｇ／ｄＬ）よりも高く、肝硬変の症状が比較的軽い肝硬変患者Ａの血清中３－ＨＩＢ濃度は、変動があるものの、肝硬変患者の平均値よりも高い傾向にあり、特にＢＣＡＡ剤投与期間中には高くなったが、血清中アンモニア濃度は、基準値上限値（８６μｇ／ｄＬ）よりも低く、肝性脳症発症のリスクはさほど高くないと評価できた。
　一方で、血清中アルブミン濃度が基準値よりも低い傾向にあり、肝硬変の症状が比較的重い肝硬変患者Ｂでは、図２２に示すように、血清中３－ＨＩＢ濃度が肝硬変患者の平均値よりも低い傾向にあり、血清中のアンモニア濃度も基準値上限値を超える場合があった。また、その後にＢＣＡＡ剤を投与すると、血清中３－ＨＩＢ濃度が高くなると同時に、血清中のアンモニア濃度は低下する傾向が観察された（図示せず。）。このように、肝硬変患者において、血清中３－ＨＩＢ濃度が低くなると、血清中アンモニア濃度が高くなる傾向にあり、血清中３－ＨＩＢ濃度が高くなると、血清中アンモニア濃度が低くなる傾向にあることから、体液中の３－ＨＩＢ濃度が、肝硬変患者の肝性脳症のマーカーとなり得ることが示された。
　本発明に係る検出方法は、３－ＨＩＢや３－ＨＢ等のバイオマーカーとして有用な有機酸を、高感度かつ定量的に検出できることから、臨床検査等の分野で利用が可能である。

Claims (11)

  1. 　試料中の有機酸を検出する方法であって、
    　試料中の有機酸を下記一般式（１）－１～（１）－３
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）－１～３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１～６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表す。）
    のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）法により検出することを特徴とする、試料中の有機酸の検出方法。
  2. 　前記誘導体化試薬が２－ピリジンメタノール、１－ピペリジンエタノール、及び２－（２－ヒドロキシエチル）－１－メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の試料中の有機酸の検出方法。
  3. 　前記有機酸が下記一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（２）中、Ｒ３は、炭素数２～６のヒドロキシアルキル基を表す。）
    で表される有機酸である、請求項１又は２に記載の試料中の有機酸の検出方法。
  4. 　前記有機酸が３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、及び２－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上である、請求項１又は２に記載の試料中の有機酸の検出方法。
  5. 　前記試料が生体試料である、請求項１～４のいずれか一項に記載の試料中の有機酸の検出方法。
  6. 　前記試料は、血清、涙液、唾液、又は尿である、請求項１～４のいずれか一項に記載の試料中の有機酸の検出方法。
  7. 　被検者から採取した生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、及び２－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上の有機酸を、請求項１又は２に記載の試料中の有機酸の検出方法により検出し、前記生体試料中の前記有機酸の濃度を測定する定量工程と、
    　前記定量工程において得られた有機酸濃度を、予め設定された閾値、又は前記生体試料が採取された時点以前に前記被験者から採取された生体試料中の前記有機酸濃度と比較し、前記被験者における肝硬変発症の可能性を評価する評価工程と、
    を有し、
    　前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする、肝硬変発症可能性の評価方法。
  8. 　肝硬変を発症している被検者から採取した生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸を、請求項１又は２に記載の試料中の有機酸の検出方法により検出し、当該生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸濃度を測定する定量工程と、
    　前記定量工程において得られた３－ヒドロキシイソ酪酸濃度を、予め設定された閾値、又は前記生体試料が採取された時点以前に前記被験者から採取された生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸濃度と比較し、前記被験者における肝性脳症発症の可能性を評価する評価工程と、
    を有し、
    　前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする、肝性脳症発症可能性の評価方法。
  9. 　３－ヒドロキシイソ酪酸からなることを特徴とする、肝性脳症又はその発症可能性のバイオマーカー。
  10. 　運動中の被検者から採取した生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸及び３－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上の有機酸を、請求項１又は２に記載の試料中の有機酸の検出方法により検出し、当該生体試料中の前記有機酸濃度を測定する定量工程と、
    　前記定量工程において得られた前記有機酸濃度を、予め設定された閾値、又は前記被験者から運動前に採取された生体試料中の前記有機酸濃度と比較し、前記被験者における運動中又は運動後のエネルギー供給源を評価する評価工程と、
    を有し、
    　前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする、エネルギー供給源の評価方法。
  11. 　運動開始直前から運動終了後一定期間経過後までの間に経時的に被検者から採取された複数の生体試料中の３－ヒドロキシイソ酪酸及び３－ヒドロキシ酪酸からなる群より選択される１種以上の有機酸を、請求項１又は２に記載の試料中の有機酸の検出方法によりそれぞれ検出し、各生体試料中の前記有機酸濃度を測定することにより、前記有機酸濃度の経時的変化を調べるモニタリング工程と、
    　前記モニタリング工程において得られた前記有機酸濃度の経時的変化に基づき、前記被験者における運動中又は運動後のエネルギー供給源を評価する評価工程と、
    を有し、
    　前記生体試料中の前記有機酸濃度をエネルギー供給源のマーカーとし、かつ前記生体試料が血清又は唾液であることを特徴とする、エネルギー供給源のモニタリング方法。
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