WO2014117238A1 - Extratos e frações de musa paradisiaca l. e seus usos - Google Patents

Extratos e frações de musa paradisiaca l. e seus usos Download PDF

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WO2014117238A1 PCT/BR2014/000026 BR2014000026W WO2014117238A1 WO 2014117238 A1 WO2014117238 A1 WO 2014117238A1 BR 2014000026 W BR2014000026 W BR 2014000026W WO 2014117238 A1 WO2014117238 A1 WO 2014117238A1
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fractions
extracts
paradisiac
inflorescences
musa
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PCT/BR2014/000026
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Fernanda BOVO
Iara José Messias REASON
Juliana Bello Baron MAURER
Selma Faria Zawadzki BAGGIO
Elisa PEREZ
Itamar Francisco ANDREAZZA
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Universidade Federal Do Paraná
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the invention is in the fields of Chemistry, Pharmacology,
  • Veterinary more specifically in the field of herbal medicines, since it refers to obtaining extracts and fractions of inflorescences of Musa paradisiac L, the use of extracts, fractions and development of formulations from inflorescences or products of Musa paradisiac L as anti-asthmatic, anti-inflammatory and immunomodulatory in acute and chronic asthma.
  • asthma chronic respiratory disease
  • bronchodilators drugs that increase airway caliber by relaxing your smooth muscle.
  • the stimulants of ⁇ -adrenergic receptors are the most widely used.
  • Theophylline, a methylxanthine, and antimuscarinic drugs are also used to reverse airway constriction.
  • Long-term control is most often achieved with anti-inflammatory drugs such as
  • corticosteroids Other drugs are also used as leukotriene pathway inhibitors and mast cell degranulation inhibitors.
  • ROGÉRIO A. P .; FONTANARI, C; BORDUCCHI,, E, et al.
  • the present invention relates to obtaining extracts and fractions from inflorescences of Musa paradisiac L. and the use of aqueous, hydroalcoholic extract or fractions in the production of acute and / or chronic asthma medicaments, due to their anti-asthmatic and anti-asthma properties. -inflammatory and decreased Th 2 response (immunomodulatory activity). Additionally, the invention relates to formulations with extracts and fractions of inflorescences or products of Musa paradisiac L.
  • Figure 1A shows images of cross-sectional photomicrographs.
  • Figure 1B refers to photomicrograph images of sections
  • Figure 1 C refers to photomicrograph images of sections
  • Figure 1D refers to images of cross-sectional photomicrographs.
  • Figure 1 E refers to photomicrograph images of sections
  • Figure 2A shows images of photomicrographs of pulmonary histological sections of the peribronobular eye areas of asthmatic animals studied in experiment 2 (curative therapy). Staining with
  • Hematoxylin / Eosin and 100X magnification Hematoxylin / Eosin and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 2B shows photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of non-asthmatic animals studied in experiment 2 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 2C refers to images of cross-section photomicrographs. histological findings of the peribronalveolar areas of the animals of the EAQ group (aqueous extract of M. paradisiac L) studied in experiment 2
  • Figure 2D refers to photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the animals of the EHA group (M. paradisiac L hydroalcoholic extract) studied in experiment 2 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 2E refers to photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the Dexa group animals (dexamethasone-treated animals) studied in experiment 2 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 10 ⁇ increase. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 3A refers to photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of asthmatic animals studied in experiment 3 (preventive therapy). Staining with
  • Hematoxylin / Eosin and 100X magnification Hematoxylin / Eosin and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 3B refers to photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of non-asthmatic animals studied in experiment 3 (preventive therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 3C shows photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the FHEX group animals (fraction resulting from the / 7-hexane partitions) ; studied in experiment 3 (preventive therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 3D refers to images of photomicrographs of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the animals of the FBUT group (fraction resulting from n-butanol partition) studied in experiment 3 (therapy, preventive). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 3E shows photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the Dexa group animals (dexamethasone-treated animals) studied in experiment 3 (preventive therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 4A refers to photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the asthmatic animals studied in experiment 4 (curative therapy). Staining with
  • Hematoxylin / Eosin and 100X magnification Hematoxylin / Eosin and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 4B refers to photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of non-asthmatic animals studied in experiment 4 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 4C shows photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the animals from the FAC group (fraction resulting from ethyl acetate partition) studied in experiment 4 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 4D shows images of photomicrographs of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of the animals of the FBUT group (fraction resulting from / 7-butanol partition) studied in experiment 4 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 4E shows photomicrograph images of pulmonary histological sections of the peribronalveolar areas of Dexa group animals (dexamethasone-treated animals) studied in experiment 4 (curative therapy). Hematoxylin / Eosin staining and 10 ⁇ increase. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figure 5A shows graphical representations of the results of the IL4 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EH A). ELISA dosage.
  • Figure 5B shows graphical representations of the results of the IL5 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 5C refers to graphical representations of the results of the IL6 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 5D shows graphical representations of the results of the IL12 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 5E refers to graphical representations of the results of the IL17 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 5F shows graphical representations of the results of the TN F- ⁇ cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 6 refers to graphical representations of the results of the IgE determination experiment performed on Swiss mouse serum from experiment 5 (preventive therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 7A shows graphical representations of the results of the IL4 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 6 (EAQ and EHA curative therapy). ELISA dosage.
  • Figure 7B refers to graphical representations of the results of the IL5 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 6 (EAQ and EHA curative therapy). ELISA dosage.
  • Figure 7C refers to graphical representations of the results of the IL6 cytokine determination experiment performed on macerated lungs obtained by expenment 6 (curative therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 7D refers to graphical representations of the results of the IL12 cytokine determination experiment performed on lung macerate solutions obtained from experiment 6 (EAQ and EHA curative therapy). ELISA dosage.
  • Figure 7E refers to graphical representations of the results of the IL17 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 6 (EAQ and EHA curative therapy). ELISA dosage.
  • Figure 7F refers to graphical representations of the results of the TNF- ⁇ cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 6 (EAQ and EHA curative therapy). ELISA dosage.
  • Figure 8 refers to graphical representations of the results of the IgE determination experiment performed on Swiss mouse serum from experiment 6 (curative therapy with EAQ and EHA). ELISA dosage.
  • Figure 9A is graphical representations of the results of the IL4 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained by experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBU.T). ELISA dosage.
  • Figure 9B refers to graphical representations of the results of the IL5 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBU . T). ELISA dosage.
  • Figure 9C shows graphical representations of the results of the IL6 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained by experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • Figure 9D shows graphical representations of the results of the IL12 cytokine determination experiment performed on lung macerate solutions obtained from experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT), ELISA Dosage.
  • Figure 9E refers to graphical representations of the results of the IL 7 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • Figure 9F refers to graphical representations of the results of the TNF- cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • Figure 10 refers to graphical representations of the results of the IgE determination experiment performed on Swiss mouse serum from experiment 7 (Preventive Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • Figure 11A shows graphical representations of the results of the IL4 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained by the ⁇ experiment (FREX, FAC, FCLO, FBUT Curative Therapy). ELISA dosage.
  • Figure 11 B refers to graphical representations of the results of the IL5 cytokine determination experiment performed on lung macerate solutions obtained from experiment 8 (FREX Curative Therapy, FAC, FCLO, FBUT)., ELISA Dosage.
  • Figure 11C refers to graphical representations of the results of the IL6 cytokine determination experiment performed on lung macerate solutions obtained from experiment 8 (FREX, FAC, FCLO, FBUT Curative Therapy). ELISA dosage.
  • Figure 11 D refers to graphical representations of the results of the IL12 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 8 (FREX, FAC, FCLO, FBUT Curative Therapy). ELISA dosage.
  • Figure 11 E refers to graphical representations of the results of the IL17 cytokine determination experiment performed on lung macerated solutions obtained from experiment 8 (Curative Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • Figure 11F is graphical representations of the results of the TNF- cytokine determination experiment performed on macerated lungs obtained by experiment 8 (Curative Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • Figure 12 refers to graphical representations of the results of the IgE determination experiment performed on Swiss mouse serum from experiment 8 (Curative Therapy with FREX, FAC, FCLO, FBUT). ELISA dosage.
  • the present invention describes obtaining extracts and fractions from inflorescences or products of Musa paradisiac L. and the use of aqueous extract, idroalcoholic or fractions in the production of acute and chronic (preferably orally) asthma medicament. its anti-asthmatic and anti-inflammatory properties and decreased Th2 response.
  • the invention describes formulations containing extracts and fractions of Musa paradisiac L. for acute or chronic asthma.
  • the invention relates to aqueous and hydroalcoholic extracts and fractions obtained from inflorescences of Musa paradisiac L.
  • the extracts are obtained by extracting the inflorescence products of Musa paradisiac L., by cooking, turbolysis, pressing, decoction, osmosis, infusion, hydroalcoholic, alcoholic, grinding, followed by pressing, or resting, decanting using reagents.
  • the extracts are preferably obtained by decoction, maceration and grinding.
  • inflorescences of Musa paradisiac, L. can be used for preparation acute and chronic asthma medicaments as shown below in the exemplary embodiment of the invention.
  • such extracts when administered orally in asthmatic Swiss mice demonstrated anti-inflammatory, anti-asthmatic, and decreased Th2 standard interleukin (immunomodulation) properties proven by decreasing pulmonary inflammation and in both acute and chronic asthma.
  • the present invention proposes the use of a phytotherapeutic formulation, preferably in the pharmaceutical form of granules, from the extract or fractions of paradisiacal Musa.
  • the pharmaceutical form comprises from 1 to 8% inflorescence dry extract or Musa paradisiac L (active) product; 0.01 to 1% antimicrobial preservative; from 0.01 to 1% antioxidant; 1 to 5% sorbitol sweetener; from 15 to 80% sucrose sweetener; 0.5 to 5% adsorbent.
  • the active dry extract may consist of: aqueous extract,
  • the dry extract is used.
  • the antimicrobial preservative is preferably sodium benzoate.
  • the antioxidant is preferably ascorbic acid.
  • the adsorbent is preferably 0
  • the invention would comprise: 2.67 g of Musa paradisiac L (active) dry inflorescence extract; 0.3 g of
  • This form will preferably be stored as granulated sache in separate envelopes.
  • the sache should be diluted in water to a volume of 90 ml, corresponding to 6 doses of 15 ml. Each 15 ml dpse contains the daily requirement for a dry extract for an adult 70 kg.
  • the shelf life after dilution is 6 days.
  • a plant exsiccata was deposited at the Municipal Botanical Museum of Curitiba-PR (MBM) under registration MBM: 367379. The taxonomic identification was performed by the curator of the MBM Herbarium.
  • the aqueous extract used in the other tests was prepared with 80 g of fresh plant material, previously washed and cut into approximately 2 cm pieces. Then the material was submitted to
  • the hydroalcoholic extract was prepared with 80 g of fresh plant material, previously washed and cut into approximately 2 cm pieces. The material was then subjected to decontamination with 70% (v / v) aqueous ethanol for 2 min with subsequent rapid washings with distilled water. To the decontaminated material was added 200 mL of 70% (v / v) aqueous ethanol, and subjected to turbolysis for 10 min. The material resulting from this process was left to macerate; in an amber bottle, closed at room temperature and protected from light for 10 days. The material was filtered under reduced pressure. The filtrate was concentrated to dryness under rotary evaporator under reduced pressure at 40 ° C. The material] obtained was resuspended in 200 mL of distilled water, stored in an amber flask, frozen and kept at - 20 ° C. This extract was called EHA.
  • the plant material (2.8 kg) was ground under turbolysis to approximately 1 cm fragments. Then 2.8 L of 80% (v / v) aqueous methanol was added to the material and the material was kept under maceration in a closed container in the dark at room temperature with daily shaking by inversion for 14 days. After this, the material was sequentially filtered on cotton and qualitative vacuum filter paper. The obtained filtrate was
  • the EMET was first fractionated with 1: 1 (v / v) n-hexane in a separatory funnel and after vigorous stirring, the hexane phase was separated. This process was repeated again. The two n-hexane partitions were added to a single vial and stored at 4 ° C for removal of the formed emulsion which was removed in a separatory funnel. The resulting fraction was named FHEX, which was kept at -20 ° C.
  • mice Male Swiss mice, 6 animals per group were used. The animals were immunized on days 0, 7, 14 and 21 with intraperitoneal injection of 28 pg OVA and 6 mg aluminum hydroxide diluted in 0.4 ml of sterile saline, followed by two 70 pg nasal instillations of diluted OVA. 50 ⁇ l saline (days 14 and 21). The non-asthmatic group was not immunized with either OVA or aluminum hydroxide, corresponding to the control group. The animals were sacrificed on day 22.
  • FCLO FCLO
  • FAC FAC
  • FBUT FBUT
  • the FCLO, FAC, FBUT (50, pL) were administered orally once daily on the 19th, 20th and 21st of the experiments. FHEX was not used in experiment 4.
  • the experimental groups are described in Table 2.
  • control groups used in the above experiments Asthmatic group: immunized and untreated animal; Healthy group: unimmunized animal, untreated; Saline group: immunized animal treated with saline daily (preventive therapy), or on days 19, 20, 21 (curative therapy); Dexa group: animal immunized and treated on days 18 and 21 with dexamethasone 0.5 mg / kg
  • control groups used in the above experiments Asthmatic group: immunized and untreated animal; Healthy group: unimmunized animal, untreated; Saline group: immunized animal treated with saline daily (preventive therapy), or on days 9, 20, 21 (curative therapy); Dexa group: animal immunized and treated on days 18 and 21 with dexamethasone 0.5 mg / kg
  • Inflammatory infiltrate in the lung tissue II
  • IIL Inflammatory infiltrate in the bronchial lumen
  • edema edema
  • Figures 1A, 1 B, 1C, 1 D M 1 E refer to photomicrographs of lung histological sections of the animals from the study groups in Preventive Therapy 1.
  • the photos indicate peribronalveolar areas of the lungs of asthmatic animals (A); non-asthmatic (B); EAQ group (C); group EHA (D) and Dexa (E). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figures 2A, 2B, 2C, 2D and 2E refer to photomicrographs of pulmonary histological sections of the animals of the study groups of experiment 2 - curative therapy. The photos indicate penbroncoalveolar areas of the lungs of asthmatic (A) and non-asthmatic (B) animals. EAQ group (C); group EHA (D) and dexa (E). Hematpxillin / Eosin staining and increase of 00X. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Table 4 Reading of the histopathology of the lungs of Swiss mice in an experimental asthma model treated with different M. paradisiac L. fractions on days 19, 20 and 21 (experiment 2).
  • the animals treated with FHEX showed significant decrease of the inflammatory condition in relation to the asthmatic control.
  • the improvement occurred in both the perbronchial and perialveolar areas, where there is a decrease in the inflammatory infiltrate characteristic of asthma.
  • parameter "II" the FHEX group showed better improvement than the dexa group.
  • the improvement was comparable to the dexa group.
  • the animals treated with FBUT showed no improvement in the general inflammatory picture when compared to the dexa group ( Figures 3A, 3B, 3C, 3D and 3E and Table 5).
  • Figures 3A, 3B, 3C, 3D and 3E are cross-sectional photomicrographs.
  • the photos indicate peribronalveolar areas of the lungs of asthmatic (A) and non-asthmatic (B) animals; FHEX group (C); FBUT group (D) and dexa group (E). Hematoxylin / Eosin staining and 100X magnification. Arrows point to regions rich in inflammatory cells.
  • Figures 4A, 4B, 4C, 4D and 4E are cross-sectional photomicrographs.
  • ND Reading not performed due to poor quality in tissue fixation.
  • II Inflammatory Infiltrate
  • IIL Luminal Inflammatory Infiltrate
  • IL4, IL5, IL6, IL12, IL 7 and TNF ⁇ cytokines were performed in lung macerated solutions. The lungs were removed from the freezer and left at room temperature until completely thawed. These were then individually weighed and packed in polyethylene test tubes, then added with 400 mg / ml saline. The material was submitted to automated pistil maceration for physical tissue rupture. The material was centrifuged at 4500 rpm for 8 min at 4 ° C. Samples were analyzed in duplicate using eBioscience Commercial ELISA Kit (Ready-SET-GO! (San Diego, CA, USA),
  • 96-hole flat-bottom high binding protein catalog No. 9018, Corning, Lowell, MA, USA
  • plates were sensitized for 18 h at 4 ° C at 100 pL / capture antibody well for each cytokine.
  • IgE dosing the pre-sensitized plates of the kit were used. Plates were washed 5 times with 250 ⁇ l / well wash plate washer (Bio Tek).
  • TMEJZ tetramethylbenzidine chromogen substrate
  • the standard cure was prepared using eight concentrations of the specific standard; for each cytokine tested (IL4, IL5, IL6, IL 2, IL17 or TNF ⁇ ) or IgE,
  • cytokine concentrations IL4, IL5, IL6 and TNF- ⁇
  • low concentrations IL12 and IL 7 when compared to healthy animals. Cytokine determinations are shown in Figures 5A (IL4), 5B (IL5), and 5C (IL6) and Figures 5D (IL12), 5E (IL17) and 5F (TNF-a).
  • IL4, IL5, IL6 and TNF- ⁇ concentrations remain high in saline treated animals. This demonstrates that there was no significant effect of daily handling of these animals, and that the vehicle used in the experiment does not interfere with IL4, IL5 and IL6 and TNF- ⁇ levels ( Figures 5A (IL4), 5B (IL5), and 5C ( IL6) and Figures 5D (IL12), 5E (IL17) and 5F (TNF-a)).
  • the preventive EHA treated animals showed a greater IL5 decrease than the aqueous extract treated animals. However, the decrease found was smaller than that of the group treated with
  • Figures 5A (IL4), 5B (IL5), and 5C (IL6) show that the EAQ and EHA of M. paradisiac L. have an effect on decreasing interleukin concentrations in OVA-immunized Swiss mice. In some cases the decrease found was comparable to the concentration of dexamethasone. These data are important as they show that such extracts are promising for use in treating asthma.
  • the preventive therapy tested here simulates an individual who is not exactly in the asthma crisis yet. That is, it would be a treatment in an attempt to prevent individuals from entering the asthmatic crisis.
  • Figures 5A, 5B, 5C demonstrate respectively the determination of IL4 (A), IL5 (B) and IL6 (C) in lung homogenate of Swiss mice from the 5 - preventive therapy experiment. Note: ELISA Dosage
  • FIGS. 5D, 5E, 5F plot, respectively, the determination of IL12 (D), IL17 (E) and TNF- ⁇ (F) in lung homogenate of Swiss mice from experiment 5 - preventive therapy. note:
  • Figure 6 refers to the IgE determination in serum of Swiss mice hurts experiment 5 - preventive therapy.
  • IgE concentrations decreased significantly in the EAQ treated group as compared to asthmatic control.
  • the decrease in IgE level in this group was comparable to the dexamethasone-treated group, which also showed significant difference when compared to the control.
  • Figure 7B shows that there was a significant difference between IL5 levels in healthy animals compared to asthmatics. It can also be demonstrated that EAQ and EHA caused more than half decreases in IL5 levels compared to asthmatic animals (Figure 7B).
  • Figure 7C shows that there was no significant decrease in IL6 levels in animals treated with both extracts.
  • Figures 7A, 7B, 7C are a graphical representation of the determination of IL4 (A) IL5 (B) and IL6 (C), respectively, in lung homogenate of the Swiss mice from experiment 6 - curative therapy. Note: ELISA dosage.
  • Figures 7D, 7E and 7F refer to the graphical representation of IL12 (D), IL17 (E) and TNF- (F) determination, respectively, in lung homogenate of Swiss mice from experiment 6 - curative therapy. Note: ELISA dosage.
  • Figure 8 is a graphical representation of serum IgE determination of Swiss mice from experiment 6 - curative therapy. This figure shows that there was no statistically significant decrease in IgE concentrations in the EAQ and EHA treated
  • Figure 9A demonstrates that some M. paradisiac L. fractions may decrease IL4 levels of preventive treated animals compared to asthmatic animals. In the hexane fraction, for example, the decrease was close to half (figure 9A). Other fractions, ethyl acetate, for example, were also able to lower IL4 concentrations, but not as effectively as the chloroform fraction.
  • Figure 9B demonstrates that there was a significant decrease in IL5 levels in the healthy and hexane fraction treated groups compared to the control group. Other fractions were also able to decrease the
  • Figure 9C demonstrates that some treated fractions were able to dilute IL6 concentrations.
  • the chloroform, hexane and butanolic fractions showed a reduction of close to half of these levels, when compared to asthmatic animals.
  • the decrease in these fractions was comparable to the dexamethasone treated groups.
  • Figures 9A, 9B, 9C are the graphical representation of the determination of IL4 (A), IL5i (B) and IL6 (C); respectively, in homogenate of lungs of Swiss mice of experiment 7 - preventive therapy. Note: ELISA dosage.
  • FIGS. 9D, 9E, 9F are, respectively, [graphical representations of the determination of IL12 (D), ILi17 (E) and TNF-ot (F), respectively, in lung homogenate of Swiss mice from experiment 7 - preventive therapy. Note: ELISA dosage.
  • IgE determination Figure 10 is a graphical representation of serum IgE determination of Swiss mice from experiment 7 - preventive therapy. This figure shows that IgE concentrations decreased significantly in the FCLO, FHEX and FBUT treated groups as compared to asthmatic control. The decrease in IgE levels in these groups was comparable to the dexamethasone treated group.
  • Figure 11A demonstrates that the tested fractions have effects in decreasing IL4 concentrations when compared to curative asthmatic groups.
  • the butanolic fraction showed a decrease close to the levels of the dexamethasone treated group.
  • Figure 11B demonstrates that the tested fractions have effects in decreasing IL5 concentrations as compared to curatively asthmatic groups. All groups treated with the different fractions showed a reduction close to half when compared to the asthmatic group, and the decrease of these groups was close to the levels of the dexamethasone treated group.
  • Figure 11C demonstrates that the tested fractions have effects in decreasing IL6 concentrations when compared to curative asthmatic groups.
  • Figures 11A; 11 B, 11C refer to the graphical representation of IL4 (A), IL5 (B) and IL6 (C) determination in lung homogenate of Swiss mice from experiment 4 - curative therapy, Npta: ELISA assay.
  • Figures 11 D, 11 E, 11 F refer to the graphical representation of determination of IL12 (D), IL17 (E) and TNF- ⁇ (F) in lung homogenate of Swiss mice from experiment 8 - curative therapy. Note: ELISA dosage.
  • Figure 12 refers to the graphical representation of IgE determination in serum of Swiss mice from the curative therapy experiment 8. This figure demonstrates that IgE concentrations did not show statistically significant decrease in the groups treated with the test fractions when compared to the asthmatic control. The decrease was significant in the dexamethasone treated group.

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Abstract

A presente invenção refere-se à obtenção de extratos e frações de inflorescências de Musa paradisiaca L., ao uso destes e ao desenvolvimento de formulações na produção de medicamentos a partir de produtos ou inflorescências de Musa paradisiaca L. como antiasmático, anti-inflamatório e imunomodulador em asma aguda e crônica. As propriedades fitoterápicas foram demonstradas através da diminuição da inflamação broncoalveolar (comprovada por histopatológico) e sistêmica (diminuição de IgE) e da diminuição da resposta Th2 em camundongos asmáticos.

Description

EXTRATOS E FRAÇÕES DE MUSA PARADISÍACA L. E SEUS USOS
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção se insere nas áreas da Química, Farmacologia,
Dermatologia, Cosmetologia, Medicinal, Terapêutica, Homeopática e
Veterinária, mais especificamente no campo dos fitoterápicos, uma vez que se refere à obtenção de extratos e frações de inflorescências de Musa paradisíaca L, ao uso dos extratos, frações e desenvolvimento de formulações a partir de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L como antiasmático, anti- inflamatório e imunomodulador em asma aguda e crónica.
DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA
A ocorrência da asma tem aumentado dramaticamente tanto em países desenvolvidos como naqueles em desenvolvimento (ÇARLSEN, 2003). No Brasil, a asma é considerada um problema de saúde pública, onde ocorrem mais de 350 mil hospitalizações e, aproximadamente, 2500 mortes, por ano (JARDIM, 2007).
Resultados do "International Study pf Asthma and Allergies in
Childhood" realizado nas cidades de Curitiba (PR), Itabira (MG), Recife (PE), Salvador (BA), São Paulo (SP), Porto Alegre (RS) e Uberlândia (MG) mostraram que escolares entre 06 e 07 anos apresentaram, um índice de 72% de asmáticos e entre adolescentes 13 e 14 anos este índice aumenta para 93% (SOLÉ et al., 2000). A asma interfere no lazer e no trabalho,, motiva
atendimentos repetidos em pronto-socorros e em ambulatórios brasileiros, provoca hospitalizações e pode levar a; óbito (CAMPOS; LEMOS, 2008).
Essa doença se mostra como um dos principais motivos de falta no trabalho e escola (PONTE et al., 2006), consequentemente diminui o rendimento dos indivíduos, desta forma esses relatos despertam p interesse tanto económico como em bepeficip da saúde publica geral.
O tratamento da asma, atualmente, em curto prazo é obtido com broncodilatadores, fármacos que aumentam o calibre das vias aéreas ao relaxarem a sua musculatura lisa. Dentre estes fármacos, os estimulantes dos receptores β-adrenérgicos são os mais amplamente utilizados. A teofilina, uma metilxantina, e os fármacos antimuscarínicos também são utilizados para reverter a constrição das vias aéreas. O controle em longo prazo é mais frequentemente obtido com fármacos anti-inflamatórios, como
corticoesteroides. Outros fármacos também são utilizados como os inibidores da via dos leucotrienos e inibidores de degranulação de mastócitos
(KATZUNG, 2006).
No Brasil, porém, grande parte da população afetada não tem acesso aos medicamentos específicos, fato que resulta em um número exagerado de pacientes frequentando os prontos-socorros, faltando às escolas e trabalho. Isto leva ao somatório de dois custos: (i) os custos diretos, representados por aqueles que estão associados diretamente à intervenção, como compra de medicamentos para as crises de asma, custos das hospitalizações, salários dos profissionais envolvidos no atendimento; e (ii) os custos indiretos:
representados pela ausência à escola e trabalho, as despesas de idas ao pronto-socorro, além das despesas referentes ao acompanhante. Na área da saúde ainda tem-se o que se chama de custos intangíveis, que são difíceis de serem mensurados, como o sofrimento pessoal ou familiar (JARDIM, 2007). Assim, considerando a alta prevalência de asma no Brasil,; bem cqmo os custos e efeitos indesejados da terapia alopática convencional utilizada atualmente, estudos fitoterápicos como alternativa para o tratamento e/ou prevenção apresentam importância em saúde pública. Acrescenta-se a isso, a
biodisponibilidade de espécies vegetais no Brasil e a possibilidade de tratamento com excelente relação custo/benefício bem como rpenor ocorrência de efeitos colaterais.
Portanto, o tratamento de asrna alérgica com inflorescências de Musa paradisíaca L proposto pela presente invenção mostra-se de grande
importância, uma vez descritoique existem poucos fármacos utilizados para o tratamento desta patologia e que qs mesmos apresentam efeitos colaterais importantes. É válido lembrar também que não há, no mercado brasileiro, medicamento fitoterápico antiasmático, registrado na ANN/ISA.
Não é conhecida nenhuma anterioridade envolvendo a utilização de inflorescências de Musa paradisíaca L. em processos inflamatórios pulmonares nem mesmo o tratamento de asma alérgica, como é, proposto pela presente invenção.
As referências utilizadas nas informações supracitadas foram:
CARLSEN, K.H. Can asthma and allergy be prevented in real life? Allergy v. 58, p. 730-732, 2003; JARDIM, J.R. A farmacoeconomia e o tratamento da asma. J Bras Pneumol. - Editorial. V. 33, n. 1 , p. 1-3, 2007; SOLÉ D, YAMADA E, VANA AT, WERNECK G, SOLANO DE FREITAS L, SOLOGUREN MJ, et al. International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC): prevalence of asthma and asthma-related symptoms among Brazilian schoolchildren. J Investigai Allergol Clin Immunol., v. 1 1 , n. 2, p. 123-8, 2000; Campos HS, Lemos ACM. A asma e a DPOC na visão do pneumologista. J Bras Pneumol., v. 35, n. 4, p. 301-309, 2009; Ponte EV, Franco R, Nascimento HF, Souza- Machado A, Cunha S, Barreto ML, et al. Lack of control of severe asthma is associated with co-existence of moderate-tosevere rhinitis. Allergy., v. 63, n. 5, p. 564-9, 2008; KATZUNG, B. G. Farmacologia Básica & Clínica. 9a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009; JARDIM, J.R. A farmacoeconomia e o tratamento da asma. J Bras Pneumol. - Editorial., v. 33, n.; 1 , p. 1-3, 2007;
ROGÉRIO, A. P.; FONTANARI, C; BORDUCCHI, ,E, et al. Anti-inflammatory effects pf Lafoensia pacari and ellagic acid in a mu.rine model of asthma:
European Journal of Pharmacplogy, v. i580, p. 262-270, 2008.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere à obtenção de extratos e frações a partir de inflorescências de Musa paradisíaca L. e da utilização do extraio aquoso, hidroalcoólico ou frações na produção de medicamento para asma aguda e/ou crónica, por conta das suas propriedades antiasmátiqa e anti-inflamatória e diminuição da resposta Th2 (atividade imunomodulaçlora). Adicionalmente, a invenção se refere a formulações com extratos e frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L.
i As referidas propriedades foram demonstradas através da diminuição da inflamação broncoalveolar (comprovada por histopatolpgíco) e sistémica (diminuição do número de leucócitos) de camundongos asmáticos e de diminuição nos níveis de interleucipas padrão Th2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1A se refere a imagens de fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveoíares dos animais asmáticos estudados no experimento 1 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxiiina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 1 B se refere a imagens de fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais não asmáticos estudados no experimento 1 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 1 C se refere a imagens de fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo EAQ (extrato aquoso de M, paradisíaca L.) estudados no experimento 1 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 1 D se refere a imagens de fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo EHA (extrato hidroalcoólico de M. paradisíaca L.) estudados no experimento 1 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 1 E se refere a imagens de fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo Dexa (animais tratados com dexametasona) estudados no experimento 1 (terapia preventiva). Coloração copi ^ematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 2A se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalyeolares dos animais asmáticos estudados no experimento 2 (terapia curativa). Coloração com
Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam, regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 2B se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais não asmáticos estudados no experimento 2 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 2C se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo EAQ (extrato aquoso de M. paradisíaca L) estudados no experimento 2
(terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 2D se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo EHA (extrato hidroalcoólico de M. paradisíaca L) estudados no experimento 2 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 2E se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo Dexa (animais tratados com dexametasona) estudados no experimento 2 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 10ΌΧ. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 3A se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais asmáticos estudados no experimento 3 (terapia preventiva). Coloração com
Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 3B se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais não asmáticos estudados no experimento 3 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontapn regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 3C se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo FHEX (fração resultante das partições /7-hexânicas);estudados no experimento 3 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 3D se refere a imagens de, fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo FBUT (fração resultante da partição com n-butanol) estudados no experimento 3 (terapia, preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias. A figura 3E se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo Dexa (animais tratados com dexametasona) estudados no experimento 3 (terapia preventiva). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 4A se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais asmáticos estudados no experimento 4 (terapia curativa). Coloração com
Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 4B se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais não asmáticos estudados no experimento 4 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 4C se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo FAC (fração resultante da partição com apetato de etila) estudados no experimento 4 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 4D se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dos animais do grupo FBUT (fração resultante da partição com /7-butanol) estudados no experimento 4 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 4E se refere a imagens de fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares das áreas peribroncoalveolares dps animais do grupo Dexa (animais tratados com dexametasona) estudados no experimento 4 (terapia curativa). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 10ΌΧ. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
A figura 5A se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL4 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EH A). Dosagem por ELISA. A figura 5B se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL5 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 5C se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL6 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 5D se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL12 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 5E se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL17 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 5F se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação ide citocina TN F-α realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 6 se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de IgE realizadas em soro de camundongos suíços do experimento 5 (terapia preventiva com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 7A se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL4 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 7B se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL5 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 7C se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL6 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo expenmento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 7D se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL12 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 7E se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL17 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 7F se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina TNF-α realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 8 se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de IgE realizadas em soro de camundongos suíços do experimento 6 (terapia curativa com EAQ e EHA). Dosagem por ELISA.
A figura 9A se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL4 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos peio experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBU.T). Dosagem por ELISA.
A figura 9B se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL5 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBU.T). Dosagem por ELISA.
A figura 9C se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL6 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos peio experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 9D se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL12 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBUT), Dosagem por ELISA. A figura 9E se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL 7 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 9F se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina TNF- realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 10 se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de IgE realizadas em soro de camundongos suíços do experimento 7 (Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 11A se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL4 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento ΰ (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 11 B se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL5 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 8 (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT)., Dosagem por ELISA.
A figura 11C se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL6 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 8 (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 11 D se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina IL12 realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 8 (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 11 E se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação ,de citocina IL17 realizadas em soluções de macerados de pulmqes obtidos pelo experimento 8 (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 11F se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de citocina TNF- realizadas em soluções de macerados de pulmões obtidos pelo experimento 8 (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
A figura 12 se refere a representações gráficas dos resultados do experimento de determinação de IgE realizadas em soro de camundongos suíços do experimento 8 (Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT). Dosagem por ELISA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve a obtenção de extratos e frações a partir de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L. e da utilização do extrato aquoso, idroalcoólico ou frações na produção de medicamento para asma aguda e crónica (preferencialmente por via oral), por conta das suas propriedades antiasmática e anti-inflamatória e diminuição da resposta Th2. Além disso, a invenção descreve formulações contendo extratos e frações de Musa paradisíaca L. para asma aguda ou crónica.
Obtenção de extratos e frações de inflorescências de Musa paradisíaca L.
A invenção se refere a extratos aquosos e hidroalcoólicos e de frações obtidas a partir de inflorescências de Musa paradisíaca L.
Os extratos são obtidos por extrações dos produtos de inflorescências de Musa paradisíaca L., por métodos de cozimento, turbólise, prensagem, decocção, osmose, infusão, hidroalcoólico, alcoólico, trituração, seguidos de prensagem, ou repouso, decantação, com uso de reagentes químicos, naturais, ou por método somente químico, físico, físiço-químico, biológico ou orgânico, para obtenção do extrato e substrato, essência, tintura, seiva, massa, sumo, pó, frações, para emprego ou comercialização total pu parcial com finalidades de aplicação nas áreas da química, farmacologia, dermatologia, cosmetologia, medicinal, terapêutica, homeopática, fitoterápica, veterinária, nas formas hipocrática e galênica, natural ou sintética, o extrato, substrato, a essência, a tintura. Os extratos são preferencialmente obtidos por decocção, maceração e trituração.
Uso dos extratos e frações de inflorescências de Musa paradisíaca L.
como antiasmático, anti-infíamatório e imunomodulador (diminuição de interleucinas padrão Th^ na asma aguda e crónica.
Os extratos e frações obtidos por extração dos produtos e de
inflorescências de Musa paradisíaca, L. podem ser utilizados para preparação de medicamentos para asma aguda e crónica, conforme comprovado abaixo, no item exemplo de concretização/comprovação da invenção.
No referido item (exemplo de concretização/comprovação da invenção), tais extratos quando administrados por via oral em camundongos suíços asmáticos demonstraram propriedades anti-inflamatória, antiasmática, e de diminuição de interleucinas padrão Th2 (imunomodulação) comprovadas através da diminuição da inflamação pulmonar e sistémica, tanto na asma aguda como em asma crónica.
Formulações com extratos e f rações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L.
A presente invenção propõe a utilização de uma formulação fitoterápica, preferencialmente na forma farmacêutica de grânulos, a partir do extrato ou frações de inflorescências de Musa paradisíaca.
A forma farmacêutica compreende de 1 a 8% de extrato seco de inflorescência ou de produto de Musa paradisíaca L (ativo); de 0,01 a 1 % de conservante antimicrobiano; de 0,01 a 1 % de antioxidante; de 1 a 5% de edulcorante sorbitol; de 15 a, 80% de edulcorante sacarose; de 0,5 a 5% de adsorvente.
O extrato seco ativo pode ser constituído de: extrato aquoso,
hidroalcoólico ou das frações n-hexânica, clorofórmica, acetato de etila e n- butanólica obtidos de inflorescência ou produto de Musa paradisíaca L. É utilizado preferencialmente p extrato seco.
O conservante antimicrobiano é preferencialmente o Benzoato de Sódio.
O antioxidante é preferencialmente o Ácido Ascórbico.
O adsorvente é preferencialmente 0| Dióxido de Silício Coloidal.
Um exemplo de concretização d,a invenção compreenderia: 2,67 g de extrato seco de inflorescência de Musa paradisíaca L (ativo); 0,3 g de
Benzoato de Sódio (conservante antimicrobiano); 0,3 g de Ácido Ascórbico (antioxidante); 4 g de Sorbitol (edulcorante); 30,03 g de Sacarose
(edulcorante); 0,7 g de Dióxido de silício coloidal (adsorvente); totalizando 38g (equivalente a 100%). Esta forma será armazenada preferencialmente como sache granulado em envelopes separados. O sache deve ser diluído em água até completar um volume de 90 ml, correspondente a 6 doses de 15 ml. Cada dpse de 15 ml contém a necessidade diária de extrato seco para um adulto de 70 Kg.
No exemplo em questão, o prazo de validade após diluição corresponde a 6 dias.
Exemplo de Concretização/Comprovação da Invenção - Efeitos Anti- inflamatório e Antiasmático
Procedência do material vegetal in natura
Inflorescências de M. paradisíaca L. foram coletadas no município de Maringá (PR), em novembro de 2008 e foram utilizadas como material vegetal para preparação dos extratos.
Uma exsicata da planta foi depositada no Museu Botânico Municipal de Curitiba-PR (MBM) sob registro MBM: 367379. A identificação taxonômica foi realizada pelo curador do Herbário do MBM.
Preparação do extraio aquoso de M. paradisíaca L.
O extrato aquoso utilizado nos demais ensaios, foi preparado com 80 g de material vegetal in natura, previamente lavado e cortado em pedaços de aproximadamente 2 cm. Em seguida, submeteu-se o material à
descontaminação com etanol aquoso 70% (v/v), por.2 mim, com posteriores lavagens rápidas com água destilada. Ao material descontaminado foram adicionados 200 mL de água destilada, O conteúdo foi submetido a uma turbólise e levado ao banho-maria a 70°C durante 1 h. O material foi filtrado e o extrato obtido, denominado EAQ, foi devidamente identificado, congelado e mantido a -20°C.
Preparação do extrato hidroalcoólico de M. paradisíaca L.
O extrato hidroalcoólico foi preparado com 80 g de material vegetal in natura, previamente lavadoi e cortado em pedaços de aproximadamente 2 cm. Em seguida, submeteu-se o material à, descontaminação com etanol aquoso 70% (v/v), por 2 min, com posteriores lavagens rápidas com água destilada. Ao material descontaminado foram adicionados 200 mL de etanol aquoso 70% (v/v), e submetido à turbólise por 10, min. O material resultante deste processo foi deixado em maceração; em frasco âmbar, fechado, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por 10 dias. O rnaterial foi filtrado sob pressão reduzida. O filtrado foi concentrado, até secura, em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, a 40°C. O material] obtido foi ressuspendido em 200 mL de água destilada, sendo acondicionado em frasco âmbar, congelado e mantido a - 20°C. Este extrato foi denominado EHA.
Preparação do extraio metanólico de M. paradisíaca L.
O material vegetal (2,8 kg) foi triturado sob turbólise até fragmentos de aproximadamente 1 cm. Em seguida, 2,8 L de metanol aquoso a 80% (v/v) foram adicionados ao material e este foi mantido sob maceração em recipiente fechado, no escuro, à temperatura ambiente, com agitações diárias por inversão durante 14 dias. Após isso, o material foi filtrado sequencialmente, em algodão e em papel de filtro qualitativo a vácuo. O filtrado obtido foi
concentrado em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, a 60°C, até aproximadamente 300 mL. O extrato resultante (EMET) foi submetido ao fracionamento por partição utilizando solventes com diferentes polaridades, como descrito a seguir.
Preparação das frações Hexânica, Clorofórmica, Acetato de etila, Butanólica
O EMET foi, primeiramente, fracionado com n-hexano na proporção 1 :1 (v/v), em funil de separação e após agitação vigorosa, a fase hexânica foi separada. Este processo foi repetido novamente. As duas partições n- hexânicas foram adicionadas a um único frasco e armazenadas a 4°C, para destituição da emulsão formada, a qual foi retirada em funil de separação. A fração resultante foi denominada de FHEX, a qual foi mantida a - 20°C.
Na sequência, o extrato residual foi fracionado com clorofórmio, na proporção 1 :1 (v/v), em funil de separação e após agitação vigorosa, a fase clorofórmica foi separada. O procedimento foi repetido, novamente, resultando a fração denominada FCLO, a qual foi mantida a -20°C. Este mesmo
procedimento foi realizado para o posterior fracionamento com os solventes, acetato de etila e π-butanol, obtendo-se as frações denominadas FAC e FBUT, respectivamente.
As frações FHEX, FCLO, FAC e FBUT foram concentradas
separadamente em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, a 40°C, até aproximadamente 40 mL. O volume das frações foi completado com qsp 50 mL com os respectivos solventes. Para os ensaios utilizando q modelo
experimental de asma, 0 mL das frações FHEX, FCLO, FAC e FBUT foram novamente concentradas, em separado, em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, a 40°C, até secura. ;O material resultante foi ressuspendido em 20 mL de água destilada. Indução da Inflamação: Imunização dos animais com ovoalbumina (OVA)
Utilizaram-se camundongos suíços machos, 6 animais por grupo. Os animais foram imunizados nos dias 0, 7, 14 e 21 com injeção Intraperitoneal de 28 pg OVA e ,6 mg de hidróxido de alumínio diluídos em 0,4 ml_ de salina estéril, seguidas de duas instilações nasais de 70 pg de OVA diluídos em 50 pL de salina (dias 14 e 21). O grupo não asmático não foi imunizado nem com OVA nem com hidróxido de alumínio, correspondendo ao grupo controle. Os animais foram sacrificados no 22° dia.
Demonstração do efeito antiasmático e anti-inflamatório de M. paradisíaca L na terapia preventiva e curativa da asma
Para avaliação do efeito dos diferentes extratos ou frações no modelo experimental de asma, foram realizados os experimentos testes, utilizando o protocolo supracitado, os quais estão descritos a seguir:
Experimentos 1 e 5 - Avaliação dos EAQ e EHA, na terapia preventiva. Os EAQ e EHA (50 pL), foram administrados, via oral, uma vez ao dia nos 21 dias dos experimentos. Os grupos experimentais estão descritos na Tabela 1.
Experimentos 2 e 6- Avaliação dos EAQ e EHA, na terapia curativa. Os EAQ e EHA (50 pL) fpram administrados via oral, uma vez ao dia nos anos dias 19, 20 e 21 dos experimentos. Os grupos experimentais estão descritos na Tabela .
Experimentos 3 e 7 - Avaliação das FHEX, FCLO, FAC, FBUT, na terapia preventiva. As FHEX, FCLO, FAC, FBUT (50 pL), foram administrados, via oral, uma vez ao dia nos 21 dias dos experimentos. Os grupos
experimentais estão descritos na Tabela 2.
Experimentos 4 e 8 - Avaliação das FCLO, FAC, FBUT, na terapia curativa. As, FCLO, FAC, FBUT (50 ,pL), foram administrados via oral, uma vez ao dia nos dias 19, 20 e 21 dos experimentos. A FHEX não foi utilizada no experimento 4. Os grupos experimentais estão descritos na Tabela 2.
TABELA 1 : GRUPOS EXPERIMENTAIS DE CAMUNDONGOS SUÍÇOS DESAFIADOS COM OVA E TRATAMENTOS REALIZADOS COM EAQ E EHA
NOS EXPERIMENTOS 1 e 5 (PREVENTIVO) e 2 et 6 (CURATIVO)
Grupos Imunização Número de Tratamento
experimentais animais Grupo Asmático sim 6 nenhum
Grupo Saudável 6 nenhum
não
Grupo Salina sim 6 Salina por 21 dias
Grupo EAQ sim 6 EAQ 21 dias
Experimentos 1 e
5
Grupo EHA sim 6 EHA 21 dias
Experimentos 1
e 5
Grupo EAQ sim 6 EAQ 3 dias
Experimentos 2 e
6
Grupo EHA sim 6 EHA 3 dias
Experimentos 2
e 6
Grupo DEXA sim 6 Dexametasona
0,5mg/Kg 18 e 21 dias
Os grupos controles utilizados nos experimentos acima: Grupo asmático: animal imunizado e não tratado; Grupo saudável: animal não imunizado, não tratado; Grupo salina: animal imunizado tratado com salina diariamente (terapia preventiva), ou nos dias 19, 20, 21 (terapia curativa); Grupo dexa: animal imunizado e tratado nos dias 18 e 21 com dexametasona 0,5 mg/Kg
intramuscular.
TABELA 2: GRUPOS EXPERIMENTAIS DE CAMUNDONGOS SUÍÇOS DESAFIADOS COM OVA E PROCEDIMENTOS
EXPERIMENTAIS/TRATAMENTOS REALIZADOS COM FHEX; FCLO, FAC, FBUT NQS EXPERIMENTOS 3 e 7 (TRATAMENTO PREVENTIVO) E
EXPERIMENTOS 4 e 8 (TRATAMENTO CURATIVO)
Grupos Imunização Número de Tratamento
experimentais animais Grupo Asmático 6 nenhum
Grupo Saudável 6 nenhum
Grupo Salina 6 Salina 21 dias
Grupo HEX 6 FHEX 21 dias Experimentos 3 e 7
Grupo CLO sim FCLO 21 dias
Experimentos 3 e
7
Grupo AC sim FAC 21 dias
Experimentos 3 e 7
Grupo BUT sim FBUT 21 dias
Experimentos 3 e
7
Grupo ÇLO sim FCLO 3 dias
Experimentos 4 e 8
Grupo AC FAC 3 dias
Experimentos 4 e
8
Grupo BUT sim 6 FBUT 3 dias
Experimentos 4 e 8
Grupo DEXA sim Dexametasona
0,5mg/Kg 18 e 21 dias
Os grupos controles utilizados nos experimentos acima: Grupo asmático: animal imunizado e não tratado; Grupo saudável: animal não imunizado, não tratado; Grupo salina: animal imunizado tratado com salina diariamente (terapia preventiva), ou nos dias 9, 20, 21 (terapia curativa); Grupo dexa: animal imunizado e tratado nos dias 18 e 21 com dexametasona 0,5 mg/Kg
intramuscular.
Para todos os experimentos citados, no 22° dia, depois de adequada anestesia com xilazina/quetanina, o sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca. O sangue foi centrifugado, por 5 min 5000 rpm, o soro separado e refrigerado a -80 °C para posterior quantificação de IgE. Os pulmões foram seccionados e o lobo superior direito de cada animal foi fixado com fixador Carnoy (metanohácido acético, 3:1 , v/v) e posteriormente analisados por exame histopatológico.
Nos exames histopatológicos os pulmões foram analisados através de 3 parâmetros: Infiltrado Inflamatório no tecido pulmonar (II), Infiltrado Inflamatório no lúmen brônquico (IIL) e Edema. Tais parâmetros foram quantificados em cruzes (+) onde o mínimo é O e o máximo são +++,
Análise histopatológica dos pulmões - experimento 1
Os animais tratados com EAQ e EHA mostraram importante diminuição do quadro inflamatório em relação ao controle asmático. A melhora do quadro aconteceu tanto nas áreas peribrônquieas, como nas áreas perialveolares, onde pode-se verificar uma diminuição de infiltrado inflamatório característico da asma.iNo parâmetro "II" tanto o grupo EAQ quanto EHA demonstraram melhoras superiores ao do grupo dexa, e np parâmetro "Edema", a melhora foi comparável ao grupo dexa (figuras 1A, B, 1C, 1 Qi 1 E e Tabela 3).
As figuras 1A, 1 B, 1C, 1 DM 1 E se referem a fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares dos animais dos grupos estudados do experimento 1 - terapia preventiva. As fotos indicam áreas peribroncoalveolares de pulmões dos animais asmáticos (A); não asmáticos (B); grupo EAQ (C); grupo EHA (D) e Dexa (E). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
Tabela 3: Leitura dos histopatológicos de( pulmões de camundongos suíços, em modelo experimental de asma, tratados com as diferentes frações de M. paradisíaca L. por 21 dias (Experimento 1 ). Grupos II Edema IIL Experimentais
Asmático +++ + +
Saudável + 0 0
EAQ + + +
EHA + + + dexa ++ + o
Nota: *lnfiltrado Inflamatório (II); Infiltrado Inflamatório Luminal (IIL)
Terapia Curativa com EAQ e EHA - Experimento 2
Análise histopatológica (Experimento 2)
Os animais tratados com EAQ e EHA mostraram importante diminuição do quadro inflamatório em relação ao controle asmático. A melhora pode ser verificada pela diminuição de infiltrado inflamatório característico da asma (Figura 2A, 2B, 2C, 2C e 2E). No parâmetro "Edema" tanto o grupo EAQ quanto EHA demonstraram melhoras comparáveis ao grupo dexa. No parâmetro "II" o grupo EAQ demonstrou melhora superior ao grupo dexa, sendo no grupo EHA a melhora comparável ao grupo dexa (Figuras 2A, 2B, 2C, 2D e 2E e Tabela 4).
As figuras 2A, 2B, 2C, 2D e 2E se referem a fotomicrografias de cortes histológicos pulmonares dos animais dos grupos estudados do experimento 2 - terapia curativa. As fotos indicam áreas penbroncoalveolares de pulmões dos animais asmáticos (A) e não asmáticos (B). grupo EAQ (C); grupo EHA (D) e dexa (E). Coloração com Hematpxilina/Eosina e aumento de 00X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
Tabela 4: Leitura dos histopatológicps de pulmões de camundongos suíços, em modelo experimental de asma, tratados com as diferentes f rações de M. paradisíaca L. nos dias 19 20 e 21 (experimento 2).
Grupos II Edema IIL
Experimentais Asmático +++ + +
Saudável + 0 0
EAQ + + +
EHA ++ + +
Dexa ++ + o
Nota: Infiltrado Inflamatório (II); Infiltrado Inflamatório Luminal (ML) Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO, FBUT - Experimento 3
Análise histopatológica (Experimento 3)
Os animais tratados com FHEX mostraram importante diminuição do quadro inflamatório em relação ao controle asmático. A melhora do quadro aconteceu tanto nas áreas períbrônquicas como nas áreas perialveolares, onde se pode verificar uma diminuição de infiltrado inflamatório característico da asma. No parâmetro "II" o grupo FHEX demonstrou melhora superior ao do grupo dexa. Nos demais parâmetros a melhora foi comparável ao grupo dexa. Os animais tratados com FBUT não demonstraram melhora do quadro geral inflamatório quando comparado ao grupo dexa (Figuras 3A, 3B, 3C, 3D e 3E e Tabela 5).
As figuras 3A, 3B, 3C, 3D e 3E são fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares dos animais dos grupos estudados do experimento 3 - terapia preventiva. As fotos indicam áreas peribroncoalveolares de pulmões dos animais asmáticos (A) e não asmáticos (B); grupo FHEX(C); grupo FBUT (D) e grupo dexa (E). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias.
Tabela 5. Leitura dos histopatológicos de pulmões de camundongos suíços, em modelo experimental de asma,, tratados com as diferentes frações de . paradisíaca L. por 21 dias (Experimento 3).
! Grupos II Edema nu
Experimentais
Asmático +++ + + Saudável + 0 0
FHEX + + . +
FCLO ND ND ND
FAC ND ND ND
FBUT preventivo ++ ++ +++
Dexa ++ + 0
Nota: ND: Leitura não realizada devido baixa de qualidade na fixação do tecido. Infiltrado Inflamatório (II); Infiltrado Inflamatório Luminal (IIL)
Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT (Experimento 4)
Anáiise histopatológica (Experimento 4)
Pode-se verificar uma melhora no quadro geral inflamatório dos grupos tratados FAC e FBUT. A melhora, tanto nos grupo FAC quanto no FBUT aconteceu nos três parâmetros, Infiltrado Inflamatório (II); Infiltrado Inflamatório Luminal (IIL). Sendo que em ambos os grupos a melhora foi superior à observada com a medicação padrão dexametasona. É importante ressaltar que no parâmetro "ML" somente na terapia curativa foi possível diminuir o IIL até zero. Também é válido ressaltar que dentre todas as leituras, nos 4
experimentos, o FBUT na terapia curativa foi o que apresentou os melhores resultados nos exames histopatológicos. (Figuras 4A, 4B, 4C, 4D e 4E e Tabela 6).
As figuras 4A, 4B, 4C, 4D e 4E são fotomicrografias de cortes
histológicos pulmonares dos animais dos grupos estudados do experimento 4 (terapia curativa). As fotos indicam áreas penbroncoalveolares de pulmões dos animais asmáticos (A) e não asmáticos (B); grupo FAC(C); grupo FBUT (D) e grupo dexa (E). Coloração com Hematoxilina/Eosina e aumento de 100X. As setas apontam regiões ricas em células inflamatórias, .
Tabela 6: Leitura dos histopatológicos de pulmões de camundongos suíços, em modelo experimental de asma, tratados com as diferentes frações de M. paradisíaca L. nos dias 19,20 e 21 (Experimento 4). , Grupos II Edema IIL Experimentais
Asmático +++ + +
Saudável + 0 0
FCIO ND ND ND
FACT + + 0
FBU 0 + 0 dexa ++ + o
ND: Leitura não realizada devido baixa de qualidade na fixação do tecido.
Infiltrado Inflamatório (II); Infiltrado Inflamatório Luminal (IIL).
Exemplo de Concretização/Comprovação da Invenção - Efeitos
Imunomoduladores - Quantificação de citocinas e de IgE
Preparo das amostras para quantificação das citocinas
As quantificações das citocinas IL4, IL5, IL6, IL12, IL 7 e TNFa foram realizadas em soluções de macerados de pulmões. Os pulmões foram retirados do freezer e deixados à temperatura ambiente até total descongelamento. Estes foram então pesados individualmente e acondicionados em tubos de ensaio de polietileno, acrescentando-se então solução salina na proporção de 400 mg/mL. O material foi submetido à maceração automatizada com pistilo para ruptura física do tecido. O material foi centrifugado a 4500 rpm, por 8 min, a 4°C. Ás amostras foram analisadas em duplicata, utilizando kit comercial de ELISA (Ready-SET-GO!) da eBioscience (San Diego, CA, EUA),
individualmente para cada citocina testada.
Preparo das amostras para quantificação de IgE
O sangue total obtido após punção cardíaca dos animais foi centrifugado a 4000 pm por 5 min e o soro armazenado em alíquotas de 0,5 mL, a -20°C. Para a realização do ELISA o soro foi diluído 1 : 1000 em tampão diluente e 100 L/poço dessa diluição foram adicionados., As amostras foram analisadas em duplicata, utilizando kit comercia,! de ELISA (Ready-SET-GO!) da Shibayagi (Ishihara, Japão).
Ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) para dosagem de citocinas e lgE
Para o ensaio de ELISA, placas de poliestireno ("high binding protein" - catálogo n° 9018, Corning, Lowell, MA, EUA) com 96 orifícios, de fundo chato, foram sensibilizadas durante 18 h a 4°C, com 100 pL/poço do anticorpo de captura para cada citocina. No caso da dosagem de IgE foram utilizadas as placas pré-sensibilizadas do kit. As placas foram lavadas 5 vezes com 250 pL/poço de tampão de lavagem em lavadora de placas (marca Bio Tek,
Winooski, EUA), e em seguida, a reação foi bloqueada com 200 pL/poço da solução de diluição.
Após 1 h de incubação à temperatura ambiente e 5 ciclos de lavagem das placas, 100 pL/poço das amostras (macerado pulmonar para as citocinas e soro para IgE) e padrões específicos para cada citocina/lgE foram adicionados. As placas foram novamente incubadas por 2 h à temperatura ambiente. Em s guida, essas foram lavadas 5 vezes com 250 pL/poço de tampão de lavagem, e o anticorpo de detecção adicionado (100 pL/poço). Passada 1 h de incubação à temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com 250 pL/poço de tampão de lavagem. Ad,ipionou-se 100 pL/poço da enzima Avidina-HRP ("horse radish peroxidase") e as placas foram novamente incubadas à temperatura ambiente por 30 min. Após 7 lavagens, 100 pL/poço do substrato cromógeno tetrametilbenzidina (TMEJZ) foram adicionados e incubados no escuro, por 15 min à temperatura ambiente. A reação foi bloqueada com 50 pL de H2S04 a 1 N e a leitura da absorbância realizada em espectrofotômetro para microplacas (marca Bio Tek, modelo EPOCH,
Winooski, EUA) a 450 nm. A çur a padrãq foi preparada utilizando-se oito concentrações do padrão específico; para cada citocina testada (IL4, IL5, IL6, IL 2, IL17 ou TNFa) ou IgE,
Determinação do efeito dos extratos e frações de M. paradisíaca L. na terapia preventiva e curativa da asma ,
Experimento 5 1 Determinação de citocinas IL4, IL5, IL6, IL12, IL17 e TNF-a - Terapia Preventiva com EAQ e EH A
O grupo de animais asmáticos > (controles); mostraram altas
concentrações das citocinas (IL4, IL5, IL6 e TNF-α) e baixas concentrações das IL12 e IL 7 quando comparados aos animais saudáveis. As determinações das citocinas estão mostradas nas figuras 5A (IL4), 5B (IL5), e 5C (IL6) e nas figuras 5D (IL12), 5E (IL17) e 5F (TNF-a).
As altas concentrações das IL4, IL5 e IL6 eram esperadas, nos animais asmáticos, uma vez que são características de murinos asmáticos o aumento de interleucinas padrão Th2 locais (nos pulmões) e sistémica. O aumento na concentração de TNF-α também era esperado nestes animais asmáticos uma vez que é uma citocina pró-inflamatória. Pode-se verificar que as
concentrações de IL4, IL5, IL6 e TNF-α continuam altas nos animais tratados com salina. Isso demonstra que não houve efeito importante da manipulação diária desses animais, e que o veículo utilizado no experimento não apresenta interferência nos níveis de IL4, IL5 e IL6 e TNF-α (figuras 5A (IL4), 5B (IL5), e 5C (IL6) e nas figuras 5D (IL12), 5E (IL17) e 5F (TNF-a)).
As baixas concentrações de IL12 nos grupos asmáticos estão dentro dos resultados esperados, uma vez que a IL12 é uma interleucina padrão Th! e, portanto deve estar inibida em doenças padrões Th2 como a asma.
É importante salientar que as concentrações de IL4 diminuem nos grupos tratados com os extratos (figura 5A) e que as concentrações de IL4 após os tratamentos, ficam comparáveis às dos animais tratados com
dexametasona, medicação consagrada no tratamento de asma (figuras 5A).
Os animais tratados com o EHA preventivamente mostraram uma diminuição de IL5 maior que os animais tratados corri o extrato aquoso. Porém, a diminuição encontrada foi menor do que a do grupo tratado com
dexametasona (figura 5B (IL5)).
A concentração de IL6 dos animais tratados por 21 dias com os EAQ e EHA iestái mostrada na figura 5C (IL6). Pode-se verificar que houve uma diminuição, próxima à metade, das concentrações de Ιίδ ,ηοε grupos tratados com o EHA. Essa diminuição é comparável aos níveis dos animais tratados com dexametasona (figura 5C).
Assim, os dados mostrados; nas figuras 5A (IL4), 5B (IL5), e 5C (IL6) mostram que os EAQ e EHA de M. paradisíaca L. têm efeito na diminuição das concentrações de interleucinas em camundongos suíços imunizados com OVA. Em alguns casos a diminuição encontrada foi comparável à concentração de dexametasona. Estes dados são importantes, pois mostram que tais extratos são promissores para a utilização no tratamento de asma.
A terapia preventiva aqui testada simula um indivíduo que ainda não está exatamente na crise asmática. Ou seja, seria um tratamento na tentativa de impedir os indivíduos de entrarem na crise asmática.
A literatura mostra trabalhos experimentais utilizando extratos vegetais de diferentes plantas, Lafoensia pacari, por exemplo, com eficientes
diminuições de níveis de interleucinas padrão Th2 em animais asmáticos (ROGÉRIO et al., 2008). Porém, não há relatos na literatura de experimentos utilizando M. paradisíaca L, nesta doença.
As figuras 5A, 5B, 5C demonstram respectivamente, a determinação de IL4 (A), IL5 (B) E IL6 (C) em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 5 - terapia preventiva. Nota: Dosagem por ELISA
As figuras 5D, 5E, 5F representam graficamente, respectivamente, a determinação de IL12 (D), IL17 (E) E TNF-α (F) em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 5 - terapia preventiva. Nota:
Dosagem por ELISA
Determinação de IgE
A figura 6 se refere à determinação IgE em soro dos camundongos suíços dói experimento 5 - terapia preventiva. No experimento 1 (terapia preventiva), a concentrações de IgE diminuiu significativamente no grupo tratado com EAQ, quando comparado ao controle asmático. A diminuição do nível de IgE nesse grupo foi comparável ao grupo tratado com dexametasona, que também mostrou diferença significativa quando comparada ao controle.
Experimento 6 - Terapia Curativa com EAQ e EUA
Determinação de Citocinas IL4, IL5, IL6, IL12, IL17 e TNF-a
Assim como na terapia preventiva, na terapia curativa os animais imunizados com OVA também mostraram altos valores de citocinas, devido à reação imunológica ao antígeno, no caso desse experimento (OVA). Pode-se verificar que as concentrações de IL4, IL5, IL6, IL12, IL17 e TNF-α continuam altas nos animais tratados com salina. Isso demonstra que não houve efeito importante da manipulação diária desses animais, e que o veículo utilizado no experimento não apresenta interferência nos níveis de IL4, IL5, IL6, IL12, IL 7 e TNF- (Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F, respectivamente).
Os dados da figura 7A mostram que o EHA diminuiu próximo à metade os níveis de IL4 dos animais tratados curativamente, quando comparado aos animais asmáticos. A diminuição foi comparável à dexametasona. O EAQ também provocou uma diminuição nos níveis de IL4, apesar de não ter diminuído tanto quanto o EHA (figura 7A).
A figura 7B, mostra que houve diferença significativa entre os níveis de IL5 dos animais saudáveis em relação aos asmáticos. Pode-se demonstrar ainda os EAQ e EHA provocaram diminuições, de mais da metade, nos níveis de IL5 quando comparados aos animais asmáticos (figura 7B).
A figura 7C mostra que não houve diminuição importante nos níveis de IL6 dos animais tratados com ambos os extratos.
Assim, é possível verificar que EAQ e EHA obtidos de inflorescência de M. paradisíaca L. apresenta promissor, uso no tratamento curativo de asma.
As figuras 7A, ,7B, 7C são a representação gráfica da determinação de IL4 (A)„ IL5 (B) E IL6 (C), respectivamente, em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 6 - terapia curativa. Nota: Dosagem por ELISA.
As figuras 7D, 7E e 7F se referem a representação gráfica referente a determinação de IL12 (D), IL17 (E) e TNF- (F), respectivamente, em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 6 - terapia curativa. Nota: Dosagem por ELISA.
Determinação de IgE
A figura 8 se refere a uma representação gráfica da determinação IgE em soro dos camundongos suíços do experimento 6 - terapia curativa. Esta figura mostra que não houve diminuição estatisticamente significativa nas concentrações de IgE nos gnjpos tratados com EAQ ,e EHA, quando
comparado ao controle asmático.
Experimento 7 - Terapia Preventiva com FREX, FAC, FCLO. FBUT
Determinação de citoçinas IL4, IL5, IL6, IL12, IL17 e TNF-cc
Os animais imunizados com OVA mostraram altos valores de IL4, IL5 e IL6. Isso é uma característica de indivíduos asmáticos, que têm suas IL4 altas, devido à reação imunológica ao;antígeno, no caso desse experimento (OVA). Pode-se verificar que as concentrações de IL4, IL5 e IL6 continuam altas nos animais tratados com o veículo. Isso demonstra que não houve efeito importante da manipulação diária desses animais, e que o veículo utilizado no experimento não apresenta interferência nos níveis de IL4, IL5 e IL6 (figuras 9A, 9B, 9C, respectivamente).
A figura 9A demonstra que algumas frações de M. paradisíaca L. podem diminuir os níveis de IL4 de animais tratados preventivamente quando comparados aos animais asmáticos. Na fração, por exemplo, hexânica a diminuição foi próxima à metade (figura 9A). Outras frações, a acetato de etila, por exemplo, também foram capazes de diminuir as concentrações de IL4, porém não tão efetivamente do que a fração clorofórmica.
A figura 9B demonstra que houve diminuição significativa dos níveis de IL5 nos grupos saudáveis e grupo tratado com a fràção hexano, em relação ao grupo controle. Outras frações também foram capazes de diminuir a
concentração de IL5,, grupo tratado com hexano, por exemplo, porém a diminuição não significativa estatisticamente (figura 9B).
A figura 9C demonstra que algumas frações tratadas foram capazes de diluírem as concentrações de IL6. As frações clorofórmica, hexânica e butanólica apresentaram diminuição de próximo da metade destes níveis, quando comparados aos animais asmáticos. A diminuição das referidas frações foram comparáveis aos grupos tratados com dexametasona.
Assim, pode-se verificar que algumas das frações testadas são capazes de, induzir a diminuição das concentrações de interleucinas padrão Th2-i É vagido ressaltar ainda que a fração clorofórmica demonstrou ação importante em todas as interleucinas dosadas na terapia preventiva.
As figuras 9A, 9B, 9C são a representação igráfica da determinação de IL4 (A), IL5 i(B) E IL6 (C); respectivamente, em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 7 - terapia preventiva. Nota: Dosagem por ELISA.
As figuras; 9D, 9E, 9F são, respectivamente, as [representações gráficas da determinação de IL12 (D), ILi17 (E) e TNF-ot (F), respectivamente, em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 7 - terapia preventiva. Nota: Dosagem por ELISA.
Determinação de IgE A figura 10 é a representação gráfica da determinação IgE em soro dos camundongos suíços do experimento 7 - terapia preventiva. Esta figura mostra que as concentrações de IgE diminuíram significativamente nos grupos tratados com FCLO, FHEX e FBUT, quando comparados ao controle asmático. A diminuição dos níveis de IgE nesses grupos foi comparável ao grupo tratado com dexametasona.
Experimento 8 - Terapia Curativa com FREX, FAC, FCLO, FBUT
Determinação de citocinas IL4, IL5, IL6, IL12, IL17 e TNF-a
A figura 11 A demonstra que as frações testadas apresentam efeitos na diminuição das concentrações de IL4, quando comparados aos grupos asmáticos curativamente. A fração butanólica apresentou uma diminuição próxima aos níveis do grupo tratado com dexametasona.
A figura 11B demonstra que as frações testadas apresentam efeitos na diminuição das concentrações de IL5, quando comparados aos grupos asmáticos curativamente. Todos os grupos tratados com as diferentes frações apresentaram diminuição próxima à metade quando comparados ao grupo asmático, e ainda a diminuição desses grupos foi próxima aos níveis do grupo tratado com dexametasona.
A figura 11C demonstra que as frações testadas apresentam efeitos na diminuição das concentrações de IL6, quando comparados aos grupos asmáticos curativamente. A fração; clorofórmica apresentou a melhor
diminuição, porém a diminuição não,foi tão efetiva quanto à do grupo tratado com dexametasona.
A figuras 11A,; 11 B, 11C se referem a representação gráfica da determinação de IL4 (A), IL5 (B) E IL6 (C) em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 4 - terapia curativa, Npta: Dosagem por ELISA.
As figuras 11 D, 11 E, 11 F se referem a representação gráfica da determinação dé IL12 (D), IL17 (E) e TNF-α (F) em homogenato de pulmões dos camundongos suíços do experimento 8 - terapia curativa. Nota: Dosagem por ELISA.
Determinação de IgE
A figura 12 se refere à representação gráfica, da determinação IgE em soro dos camundongos suíços do experimento 8 terapia curativa. Esta figura demonstra que as concentrações de IgE não demonstraram diminuição estatisticamente significativa nos grupos tratados com as frações testes, quando comparados ao controle asmático. A diminuição foi significativa no grupo tratado com dexametasona.
Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1- Obtenção de extratos ou f rações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L. caracterizado pelo fato de ser por cozimento, turbólise, prensagem, decocção, osmose, infusão, hidroalcoóiico, alcoólico, trituração, seguidos de prensagem, ou repouso, decantação, com uso de reagentes químicos, naturais, ou por método somente químico, físico, físico-químico, biológico ou orgânico.
2- Obtenção de extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de ser obtido extrato e substrato, essência, tintura, seiva, massa, sumo, pó, frações.
3- Obtenção de extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato dos extratos serem obtidos por decocção, maceração ou trituração.
4- Uso dos extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L. caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar asma aguda.
5- Uso dos extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L. caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar asma crónica.
6- Uso dos extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L. caracterizado pela sua atividade anti-inflamatória.
7- Uso dos extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L. caracterizado pela sua atividade antiasmática.
8- Uso dos extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L caracterizado pela sua atividade imunomoduladora.
,9- Uso dos extratos ou frações de inflorescências pu produtos de Musa paradisíaca L. caracterizado pelo fato de ser para asma aguda.
10- Uso dos extratos ou frações de inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L caracterizado pelo fato de ser para asma crónica.
1 1 - Formulação farmacêutipa com extratos e frações de
inflorescências ou produtos ide Musa paradisíaca L, caracterizado pelo fato de compreender de 1 a 8% de extrato seco de produto ou inflorescência de Musa paradisíaca L; de 0,01 a, 1% de conservante antimiçrobiano; de 0,01 a 1% de antioxidante; de 1 a 15% de edulcorante sorbitol; de 15 a 80% de edulcorante sacarose; de 0,5 a 5 % de adsorvente.
12- Formulação, de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pelo fato do extrato seco ser: o extrato aquoso, hidroalcoólico ou das frações n- hexânica, clorofórmica, acetato de etila e n-butanólica obtidos de
inflorescências ou produtos de Musa paradisíaca L.
13- Formulação, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo fato do conservante antimicrobiano ser o benzoato de sódio.
14- Formulação, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo fato do antioxidante ser o ácido ascórbico.
15- Formulação, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo fato do adsorvente é preferencialmente o dióxido de silício coloidal.
16- Formulação, de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pelo fato de ser apresentada na forma ;de grânulos,.
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