WO2014102430A1 - TRATAMIENTO TERAPÉUTICO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS T y B Y LINFOMAS HUMANOS POR INHIBICIÓN DEL RECEPTOR DE INTERLEUQUINA-7 (IL-7R) - Google Patents

TRATAMIENTO TERAPÉUTICO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS T y B Y LINFOMAS HUMANOS POR INHIBICIÓN DEL RECEPTOR DE INTERLEUQUINA-7 (IL-7R) Download PDF

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María Luisa TORIBIO GARCÍA
Sara GONZÁLEZ GARCÍA
Marina GARCÍA PEYDRÓ
Juan ALCAIN SÁNCHEZ
Patricia FUENTES VILLAREJO
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Definitions

  • the present invention is part of the chemistry and pharmacy sector, specifically referring to the therapeutic use of human interleukin 7 (IL-7) receptor inhibitor agents for the treatment and / or prevention of acute lymphoblastic leukemia ( LLA) human T and B cells (LLA-T and LLA-B, respectively), extensible to T and B lymphomas.
  • IL-7R human interleukin 7 receptor inhibitor agents for the treatment and / or prevention of acute lymphoblastic leukemia ( LLA) human T and B cells (LLA-T and LLA-B, respectively), extensible to T and B lymphomas.
  • LLA acute lymphoblastic leukemia
  • LLA-T and LLA-B LLA-T and LLA-B, respectively
  • the present invention also makes reference to the identification of IL-7R as a marker of cells that initiate and maintain LLA-T and LLA-B leukemias (LICs).
  • ALL is an aggressive tumor that appears due to the oncogenic transformation of T or B lymphoid progenitors during development (ALL-T and ALL-B, respectively), and constitutes the most frequent childhood cancer (Pui et al., 2008).
  • ALL and lymphomas especially between ALL-T and T-lymphomas, so most clinical oncologists agree that both entities represent two manifestations of the same disease that, in fact, are usually treated with the same therapies (Aifantis et al., 2008).
  • ALL is therefore used to define both pathologies.
  • ALL especially ALL-T
  • ALL-T has a poor prognosis, although the development of intensive chemotherapy treatments in recent decades has significantly increased the life expectancy of patients with ALL of both cell types.
  • chemotherapy has a high toxicity and the frequency of relapses, which is the main cause of treatment failure, remains very high (of the order of 20%).
  • the 5-year survival in these cases is not greater than 1 1%, which reveals an extremely high mortality rate of patients not responding to conventional chemotherapy treatment (Hunger et al., 201 1). Therefore, it is urgent to develop new therapeutic strategies to prevent and / or treat recurrences and reduce mortality.
  • ALL leukemia initiating cells
  • LSC leukemic stem cells
  • LLA-T and LLA-B are a group of signaling molecules that participate in the survival and / or proliferation of normal lymphoid cells (Maude et al., 2012).
  • This group includes mTOR, PI3K and JAK family kinases, which are associated with membrane receptors for lymphoid growth factors, such as the interleukin-7 receptor (IL-7R) and that of the stromal-derived thympoietin thymus (TSLP-R).
  • IL-7R interleukin-7 receptor
  • TSLP-R stromal-derived thympoietin thymus
  • PI3K / mTOR and / or JAK / STAT signaling pathways is an important characteristic of ALL (Maude et al., 2012; Tasian et al., 2012) that determines the proliferation of leukemic cells independently of the union of growth factors (IL-7 and TSLP) to their corresponding membrane receptors (IL-7R and TSLP-R).
  • the use of specific drugs capable of inhibiting hyperactivation of the JAK / STAT and PI3K / mTOR signaling pathways is expected as an effective therapeutic strategy for the treatment of most leukemia and lymphomas, including those with activating mutations in signaling molecules associated with IL-7R or TSLP-R (Maude et al., 2012; Tasian et al., 2012), or activating mutations in the IL-7R and TSLP-R receptors themselves (Zenatti et al., 201 1; Shochat et ai, 2011; Mullighan et al., 2009; Tasian et al., 2012). These therapies are currently in preclinical phase or in clinical trials, and their clinical relevance is still unknown.
  • the IL-7R receptor is expressed during the development of T and B lymphocytes, and TSLP-R is exclusive to B lymphocytes, and both are maintained in a high proportion of the corresponding LLA-T and / or LLA-B leukemia. (Dibirdik et al., 1991; De Waele et al., 2001) and lymphomas (Dalloul et al., 1992; Frishman et al., 1993).
  • the IL- 7R consists IL-7Ra chain and a chain and c common to other cytokine receptors that heterodimerize in the presence of IL-7 (Goodwin et al .
  • TSLP-R is a heterodimer formed by IL-7Ra and a specific chain encoded by the CRLF2 gene. Therefore, both receptors share the IL-7Ra chain, so this molecule is a common target potential in T and B cell leukemias.
  • the expression of IL-7R is identified as a marker of the LICs of the LLA-T and LLA-B leukemias, whose functional inhibition prevents grafting and leukemic expansion in vivo.
  • a first aspect of the present invention is a compound useful for treating Acute T-cell Lymphoblastic Leukemias (ALL-T) or B-cell Acute Lymphoblastic Leukemias (ALL-B) characterized by inhibiting signaling of IL-7R membrane receptors and TSLP-R containing the Interleukin 7 receptor alpha chain (IL-7Ra).
  • ALL-T Acute T-cell Lymphoblastic Leukemias
  • ALL-B B-cell Acute Lymphoblastic Leukemias
  • IL-7Ra Interleukin 7 receptor alpha chain
  • the inhibitor agent described above characterized in that said agent is an antibody or a fragment thereof, capable of specifically and / or selectively recognizing the IL-7Ra protein and blocking the binding of its ligand, IL-7 or TSLP.
  • the present invention also refers to a pharmaceutical composition and / or medicament characterized by or comprising at least one inhibitor agent described above.
  • said pharmaceutical composition and / or medicament is characterized in that it comprises a therapeutically acceptable amount of at least one vehicle, and / or an excipient, and / or an additive.
  • xenotransplant model described above, characterized in that it constitutes a pre-clinical model for the in vivo study of the expansion and survival of leukemic cells and their SCIs, as well as efficiency Therapeutic treatment.
  • Figure 1 Expression of functional IL-7Rs in cell lines derived from human LLA-T and LLA-B leukemias.
  • A Expression of IL-7R in LLA-T and LLA-B cell lines analyzed by staining with an anti-IL-7Ra antibody and flow cytometry.
  • B RT-PCR analysis of the mRNA expression of the IL7R gene encoding human IL-7Ra (SEQ ID No. 2) in LLA-T lines (KOPTK1 and P12 / ICHIKAWA) in which no expression of the membrane protein.
  • C Stimulation with IL-7 of CUTLL1 cells and Western Blot detection of phosphorylation activation of the JAK / STAT5, PI3K / AKT and MAPK / ERK pathways.
  • Figure 2 The constitutive expression of IL-7R is a characteristic of the primary leukemic cells of patients with ALL-T.
  • IL-7R in bone marrow leukemic cells of three patients (T-ALL5, T-ALL8 and T-ALL9) analyzed by staining with an anti-IL-7Ra antibody and flow cytometry.
  • FIG. 3 The constitutive expression of IL-7R in human primary LLA-T leukemias confers an advantage of proliferation and increased grafting capacity in vivo to leukemic cells.
  • FIG. 4 The constitutive expression of IL-7R in human primary LLA-B leukemias confers an advantage of proliferation and increased grafting capacity in vivo to leukemic cells.
  • (B) Phenotypic characterization of leukemic cells derived from a human LLA-B (LLA-401) that colonize different organs after transplantation in immunodeficient mice. The graphs on the right show the relative numbers of IL-7R + cells and the fluorescence intensity of IL-7R expression in the LLA-B cells recovered in the different mouse organs (n 3). The selective expansion of cells with increased levels of IL-7R with respect to pre-transplant cells is observed, indicating their growth advantage and greater grafting capacity in vivo.
  • Acute T lymphoblastic leukemia initiating cells are characterized by the constitutive expression of high levels of IL-7R.
  • Phenotypic analysis of the LLA-T SCIs functionally defined in the conventional model of serial xenotransplantation.
  • Flow cytometric analysis presents changes in the levels of IL-7R expression in leukemic cells from the bone marrow of three patients diagnosed with ALL-T (T-ALL5, T-ALL8 and T-ALL9), after two consecutive xenotransplants in NSG immunodeficient mice.
  • Successive enrichment is observed in vivo in cells with increased levels of IL-7R compared to pre-transplant cells, indicating that the expression of IL-7R is a characteristic of those leukemic cells with greater graft and proliferation capacity in alive, called SCIs.
  • FIG. 1 Schematic representation of the sites of recognition in the mRNA of the human IL7R gene by shRNAs sh1-5 (of sequences SEQ ID No. 3-7 respectively), used to silence the expression of IL-7Ra.
  • FIG. 1 Schematic representation of the sites of recognition in the mRNA of the human IL7R gene by shRNAs sh1-5 (of sequences SEQ ID No. 3-7 respectively), used to silence the expression of IL-7Ra.
  • FIG. 1 Schematic representation of the sites of recognition in the mRNA of the human IL7R gene by shRNAs sh1-5 (of sequences SEQ ID No. 3-7 respectively), used to silence the expression of IL-7Ra.
  • B Expression of IL-7Ra in the membrane of CUTLL1 cells infected with lentiviral vectors containing the different shRNAs against IL7R. The percentage of positive cells is shown after 4 days of selection with puromycin.
  • C IL-7Ra membrane expression in the CUTLL1, HPB-ALL and SUPT
  • FIG. 7 The silencing of the constitutive expression of IL-7R by shRNA is functional in vivo in LLA-T cell lines and blocks tumor expansion.
  • A, D Transduction efficiency (% of GFP + cells) and membrane expression of IL-7Ra analyzed by flow cytometry in cells of the LLA-T HPB-ALL (A) and CUTLL1 (D) leukemic lines transplanted into immunodeficient mice after infection with the sh5 (SEQ ID No. 7) or shsc (SEQ ID No.8) vectors.
  • B, E Expression of CD4 and IL-7R analyzed by flow cytometry in cells of a representative tumor derived from the HPB-ALL (B) or CUTLL1 (E) line shown in (A, D). The histograms on the right show the expression of IL-7Ra in GFP + cells vs GFP cells.
  • the shaded histograms represent staining with an irrelevant isotypic antibody.
  • the numbers indicate the percentage of positive cells.
  • C, F Relative numbers (% of GFP + cells) of cells transduced with sh5 (SEQ ID No. 7) or shsc (SEQ ID No. 8) in tumors developed in vivo from HPB-ALL cells (C) or CUTLL1 (F).
  • the bars represent the mean ⁇ SEM of the analysis of 5 mice from each group injected with HPB-ALL and 2 mice from each group injected with CUTLL1.
  • Figure 8 The silencing of the constitutive expression of IL-7R by shRNA is functional in vivo in LLA-B cell lines and blocks tumor expansion.
  • A Transduction efficiency (% of GFP + cells) and membrane expression of IL-7Ra analyzed by flow cytometry in LLA-B NALM-6 leukemic line cells transplanted in immunodeficient mice after infection with sh5 carrier vectors (SEQ ID No. 7) or shsc control (SEQ ID No. 8).
  • B In vivo tumor growth rate of the NALM-6 cells shown in (A).
  • C Phenotypic characterization by flow cytometry of a representative tumor of each group using anti-CD19 and anti-IL-7Ra antibodies. The histogram on the left shows the expression of IL-7R in GFP + cells and GFP cells. The shaded histograms represent staining with an irrelevant isotypic antibody. The percentage of positive cells is indicated.
  • Figure 9 Inhibition of constitutive expression of IL-7R by shRNA in primary human LLA-T leukemias is an efficient strategy to prevent graft and tumor progression in vivo.
  • Blocking the binding of IL-7 to IL-7R with an anti-IL-7Ra monoclonal antibody inhibits IL-7 dependent activation of the MAPK / ERK, PI3K / AKT and JAK / STAT5 pathways and represses the expansion of human primary LLA-T leukemias.
  • A Expression of IL-7Ra in primary progenitors of human T lymphocytes isolated from postnatal thymus (DN2 thymocytes).
  • B Activation of the MAPK / ERK and PI3K / AKT pathways in human thymocytes DN2 in response to IL-7 analyzed by Western Blot.
  • C Relative proliferation of DN2 thymocytes treated with an (Ac) blocking antibody against IL-7Ra or with an anti-isotypic control antibody in co-cultures with stroma OP9-DL4 and IL-7.
  • E Relative proliferation and
  • F cell cycle, analyzed by flow cytometry, of HPB-ALL line cells grown in vitro in the absence of IL-7 and in the presence of anti-IL-7Ra Ac or of a control Ac .
  • G Inhibition of in vitro cell proliferation of human primary leukemia T-ALL5 by Ac anti-IL-7Ra in a co-culture with OP9-DL4 and IL-7.
  • a first aspect of the invention relates to an inhibitor of the function of the ⁇ chain of the interleukin 7 receptor (IL-7Ra) encoded by the IL7R gene with SEQ ID No. 1, for use in medicine, in particular for prevent and / or treat acute human lymphoblastic leukemia, preferably acute lymphoblastic leukemia of T cells (ALL-T) and / or B-cells (ALL-B).
  • this aspect of the invention also contemplates the protection of the use of the above blocking agent for the preparation of a pharmaceutical composition or medicament useful for the prevention and / or treatment of said lymphoblastic leukemia, either of T cells and / or of cells. B, and more preferably to inhibit the SCIs of said lymphoblastic leukemias and prevent recurrence.
  • prevention refers to the function of preventing recurrence and / or the development of acute human lymphoblastic leukemia, preferably ALL-T or ALL-B, and / or T or B lymphomas in individuals. at high risk of developing or suffering from the disease, such as individuals who have previously been treated for this same disease, with this or another type of treatment (eg chemotherapy), and who having recovered have a high probability of developing recurrences .
  • the term “treatment” refers to the function of eliminating leukemic cells and disease in patients diagnosed with acute human lymphoblastic leukemia, preferably ALL-T or ALL-B, and / or T or B lymphomas.
  • acute lymphoblastic leukemia refers to a hematological cancer characterized by the oncogenic transformation of lymphoid progenitors during their development.
  • acute lymphoblastic T leukemia or "acute lymphoblastic T-cell leukemia” refers to a hematologic cancer characterized by the oncogenic transformation of the T-cell progenitors during developing.
  • acute lymphoblastic leukemia B or acute lymphoblastic B-cell leukemia refers to a hematological cancer characterized by the oncogenic transformation of B-cell progenitors during development. .
  • the term "inhibitor of the function of the ⁇ chain of the interleukin 7 receptor” refers to at least one antibody and / or a fragment thereof, capable of specifically and / or selectively recognizing the IL protein -7Ra and block the binding of its ligand, or to gene silencing vectors, comprising at least one oligonucleotide sequence complementary to the IL7R gene, preferably, of the human IL7R gene with SEQ ID No. 1.
  • SEQ ID No. 1 is the sequence of cDNA corresponding to the coding sequence of the messenger RNA of the alpha chain of the human interleukin 7 receptor (IL7R) of Homo sapiens (NCBI Database; Access number: NM_002185.2).
  • the term "interleukin 7 receptor (IL-7R)” refers to the heterodimer consisting of the IL-7Ra chain and the e chain, common to other cytokine receptors.
  • the " ⁇ chain of the interleukin 7 receptor (IL-7Ra)” refers to one of the two subunits that is part of the IL-7R and TSLP-R receptors and is encoded by the human IL7R gene, preferably by the IL7R gene with sequence SEQ ID No. 1.
  • the amino acid sequence of the ⁇ -chain of IL-7R corresponds to the translated sequence of the coding region 90-1469 of SEQ ID No. 1 and consists of SEQ ID No. 2
  • anti-IL7Ra antibodies preferably monoclonal antibodies, capable of binding / recognizing / reacting specifically and / or selectively to / with the ligand binding site in the IL-7Ra protein human (Pandrau-Garc ⁇ a et al., 1994) encoded by the IL7R gene with SEQ ID No.
  • IL7R gene preferably refers to the human gene with SEQ ID No. 1 encoding the protein IL-7Ra SEQ ID No. 2.
  • anti-IL7Ra antibody refers non-limitingly to immunoglobulin molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with the human IL-7Ra protein receptor encoded by the gene. IL7R with SEQ ID No. 1, and a Fe fragment capable of fixing complement.
  • said antibody inhibits the binding of IL-7 with the human IL-7Ra protein, and thus neutralizes the biological function of the protein, such as, and not limited to, the anti-IL-7Ra R34-34 antibody.
  • Immunologically active portions of immunoglobulin molecules are not excluded from the term.
  • immunologically active immunoglobulin molecules examples include the F (ab) and F (ab ') 2 fragments, which can be generated by treating the antibody with an enzyme such as pepsin, which contain an antigen binding site that is specifically binds (immunoreacts) with the molecule of the invention to which they recognize, but they lack the Fe fragment and are not able to fix complement.
  • an enzyme such as pepsin
  • specific blocking peptides are also included.
  • the antibodies can be polyclonal (typically include different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen).
  • the monoclonal antibody can be altered biochemically or by genetic manipulation, or it can be synthetic, possibly lacking the antibody in whole or in parts, of portions that are not necessary for the recognition of the IL7Ra protein receptor and being replaced by others that communicate to the antibody additional advantageous properties.
  • the antibody can also be recombinant, chimeric, humanized, synthetic or a combination of any of the foregoing.
  • a "recombinant antibody or polypeptide” is an antibody that has been produced in a host cell transformed or transfected with the nucleic acid encoding the antibody against the IL-7Ra molecule, or that produces the antibody against the IL-7Ra molecule as a result of homologous recombination.
  • a “chimeric antibody” is that immunoglobulin molecule that through genetic engineering techniques has been modified so that its variable part or Fab maintains the original characteristics and its constant part or Fe is recognized by human cells.
  • the term "humanized antibody”, as understood herein, refers to an immunoglobulin that retains a complementarity determining region (CDR) from the original monodonal immunoglobulin (eg, donor immunoglobulin) and substantially conserved framework regions. of a human acceptor immunoglobulin.
  • CDR complementarity determining region
  • substantially of a human acceptor immunoglobulin means that the majority or key conserved framework residues come from the human acceptor sequence, however allowing substitution of residues in certain positions for selected residues to improve the activity of the humanized immunoglobulin (for example, altering the activity in such a way as to mimic more the activity of the donor immunoglobulin) or selected to reduce the immunogenicity of the humanized immunoglobulin.
  • synthetic antibody is understood, as used herein, an antibody that is generated using recombinant DNA technology such as, for example, an antibody expressed by a bacteriophage. It should also be considered that the term means an antibody that has been generated by the synthesis of a DNA molecule encoding the antibody and that said DNA molecule expresses an antibody protein, or an antibody-specific amino acid sequence, in which the sequence DNA or amino acid has been obtained using the DNA or synthetic amino acid sequencing technology that is available and is well known in the art.
  • the IL-7Ra function blocking agent as defined above is selected from the group consisting of: an anti-IL7Ra antibody capable of specifically binding / recognizing / reacting and / or selectively to / with the IL protein -7Ra encoded by the IL7R gene with SEQ ID No. 1 and inhibit ligand binding and neutralize the biological function of the human IL-7Ra protein, a fragment of said antibody responsible for the IL-7Ra binding of the antibody and any combination thereof.
  • the anti-IL7Ra antibody is a monodonal antibody and more preferably it is a humanized monodonal antibody, capable of binding human complement and / or having antibody-dependent cytotoxic cell activity (ADCC), where said antibodies are directed in front of the IL-7Ra chain.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxic cell activity
  • examples of human anti-IL7Ra blocking monoclonal antibodies are those described in Pandrau-Garc ⁇ a et al., 1994.
  • a second aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition and / or medicament comprising at least a therapeutically effective amount of a blocking agent of IL-7Ra function according to any of those defined above.
  • the Pharmaceutical composition and / or prior medicine is useful for use in the treatment and / or prevention of acute human lymphoblastic leukemia, both T cells and B cells, and may comprise in addition to the blocking agent or active ingredient, at least one vehicle, and / or a pharmaceutically acceptable excipient and / or additive.
  • the administration of the pharmaceutical compositions of the invention will be carried out with a "therapeutically effective dose", being sufficient to demonstrate a benefit to the patient, usually preferably related to a decrease in the number of LLA-T and / or LLA-B leukemia-initiating cells (SCI), or their replicative capacity in the patient.
  • a “therapeutically effective dose” being sufficient to demonstrate a benefit to the patient, usually preferably related to a decrease in the number of LLA-T and / or LLA-B leukemia-initiating cells (SCI), or their replicative capacity in the patient.
  • Such benefit can mean the improvement of at least one symptom related to acute lymphoblastic leukemia.
  • the prescription of the treatment that is, the decisions on the dose, periodicity, duration, etc., will fall under the responsibility of the general practitioner or the specialist who treats the infected patient.
  • the term "therapeutically effective dose” or “therapeutically effective amount” refers to an amount (or amount per unit mass of the individual to which it is administered) of a drug or blocking agent that causes a therapeutic effect detectable in an individual or a group of individuals to whom it is administered, causing minimal side or toxic effects.
  • the therapeutically effective amount useful to produce a therapeutic effect in any given patient can be determined by conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • the term "therapeutically effective dose-50" or “therapeutically effective dose-95” includes a statistical value in which the therapeutic effect must be detectable in 50% or 95% of the individuals to whom it is administered.
  • the effective therapeutic dose does not cause any. However, although sometimes toxic effects may occur, a compromise can be reached in which they are considered to be preferable to the normal development of the disease or condition without the administration of the drug or compound, and in turn can be treated by therapies additional.
  • compositions may comprise, in addition to the active ingredient, one or more pharmaceutically acceptable carriers, "vehicle” being understood as any diluent, adjuvant or excipient known to the specialist administered with the active ingredient. Such materials must not be toxic and, in addition, not interfere with the efficacy of the active ingredient (the blocking agent of the IL-7R ⁇ chain function, in the case of the present invention).
  • vehicle will depend on the route of administration, which may be oral, or by injection, for example, cutaneous, subcutaneous or intravenous. Because target cells to prevent or treat acute lymphoblastic leukemia are found in peripheral blood, they may, by definition, indicate a need for access to blood for treatment.
  • parenteral includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal or intraperitoneal administration. Of these, the most preferred is intravenous administration.
  • parenterally acceptable aqueous solution which is non-pyrogenic and has an appropriate pH, stability and tonicity.
  • isotonic vehicles such as a saline injection.
  • Anti-IL-7Ra antibodies will typically be provided by conventional technique in a pharmaceutically acceptable buffer, for example sterile saline, sterile buffered water, combinations of the above, etc., and may contain dextrose or other saccharide or glycol solution. such as ethylene glycol, propylene glycol or polyethylene glycol.
  • a pharmaceutically acceptable buffer for example sterile saline, sterile buffered water, combinations of the above, etc.
  • Suitable pharmaceutical vehicles and methods for preparing parenterally administrable agents are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by EW Martin, 1995.
  • the vehicles of the invention are approved by the regulatory agency of a state government or a federal government, or they are listed in the American Pharmacopoeia, in the European Pharmacopoeia or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more particularly in humans.
  • a third aspect of the invention relates to a method of prevention and / or treatment of a human acute lymphoblastic leukemia comprising administration to an individual in need of a therapeutically effective amount of a blocking agent, and / or of a pharmaceutical composition and / or medication as any of those defined above.
  • the term "individual in need” refers to an individual affected by acute human lymphoblastic leukemia, preferably ALL-T or ALL-B, or at high risk of developing or suffering from the disease, such as individuals who have previously treated for this same disease, with this or another type of treatment (eg chemotherapy), and having recovered have a high probability of developing recurrences.
  • a fourth aspect of the invention relates to a successive xenograft procedure in mice for the identification, survival, grafting and expansion of a cell initiator of the leukemia (SCI), which comprises injecting in vivo, preferably intravenously, a suspension of leukemic cells from an individual with acute lymphoblastic leukemia (preferably from individuals with ALL-T and / or ALL-B), in a mouse model immunodeficient, where said SCI has the advantage of growth and expresses the IL7Ra receptor, and to raise the transplanted mouse.
  • SCI cell initiator of the leukemia
  • Successive transplantation consists of injecting in vivo, preferably intravenously, into the immunodeficient mouse, the human leukemic cells expanded in a first immunodeficient mouse (preferably, but not exclusively, in the peripheral blood, the bone marrow, the spleen, the thymus , or the liver), in successive mice, which allows the selection of cells with the greatest growth potential in vivo and capable of self-renewal and reproduction of leukemia, characteristic properties of SCIs, for example and without limitation the procedure described for the identification of SCIs of acute myeloid leukemia (AML), a type of leukemia with an origin and treatment other than ALL.
  • AML acute myeloid leukemia
  • the above procedure generally comprises the following steps: preferably injecting intravenously a suspension of cells (0.5-1x10 6 cells) of patients diagnosed with acute lymphoblastic leukemia of T cells or B cells in an immunodeficient, irradiated mouse subletically with 1.5 Gys;
  • the leukemia cells expanded preferably, but not exclusively, in the peripheral blood, the bone marrow, the spleen, the thymus, or the liver, and characterized by flow cytometry as human leukemic cells by the expression of human cell markers such as, but not exclusively, CD45;
  • SCIs with greater growth and self-renewal potential can be selected by additional stages of cell injection and expansion in successive mice from the cells expanded in the second mouse or from the cells expanded in a previous successive mouse.
  • the graft of the leukemia initiating cell is produced, allowing the maintenance, survival and / or expansion of said SCI.
  • in vivo grafting of the leukemic cell refers to the expansion of human leukemic cells in transplanted animals, preferably in the bone marrow, spleen, thymus, or liver.
  • leukemia cells refer to lymphoid cells, preferably from bone marrow or peripheral blood, of an individual or patient diagnosed with acute lymphoblastic leukemia, including ALL-T and / or ALL-B, which may express or not levels detectable by flow cytometry of the IL7Ra receptor.
  • Anterior lymphoid cells after transplantation in the mouse increase the expression of the IL7Ra receptor, indicating a growth advantage of cells with higher levels of IL7Ra expression.
  • the term "lymphoid cell” refers to a human cell with T-lymphocyte or B-lymphocyte markers, such as, but not exclusively, CD7 or CD19, respectively.
  • the term "immunodeficient mouse” refers to a mutant mouse that combines the characteristics of the NOD / ShiLtJ genetic background, the combined severe immunodeficiency mutation (scid) and the deficiency of the gamma chain of the IL-2 receptor , common to other cytokines, such as the mutant mouse NOD / SCID / yc nu "(NSG) obtained commercially (The Jackson Labora ⁇ ory, S ⁇ ock number 005557).
  • the NOD.Cg- Prkdc scid Il2rg tmm rails '/ SzJ lack mature T, B or NK cells and are deficiencies in cyanokine signaling, which results in a better graft of human hemaiopoieic stem cells or hemaiopoieic cells of human peripheral blood, which is obtained with hear mouse strains. They indicate that the NSG model has an extraordinary utility for tumor stem cell transplant studies.
  • primary human leukemia refers to ALL-T or ALL-B obtained from a patient after diagnosis and prior to treatment.
  • a fifth aspect of the invention refers to the use of the mouse xenotransplant procedure defined above to clinically study the effectiveness of a treatment against acute lymphoblastic leukemia, preferably in the clinical study of the effectiveness of a treatment with a function blocking agent. of the ⁇ chain of the interleukin receptor 7 as defined above in the present invention.
  • EXAMPLE 1 Cell lines established in vitro from human acute lymphoblastic leukemia express functional IL-7R receptors that activate the JAK / STAT, PI3K / AKT and MAPK / ERK signaling pathways in response to IL-7.
  • FIG. 1 An example of this characteristic is shown in Figure 1 where the analysis of the expression of IL-7R is summarized by marking with a commercial monoclonal antibody (mAb) anti-human IL-7Ra protein (BD Biosciences) and flow cytometry in a panel of 7 LLA-T cell lines (KOPTK1, P12ICHIKAWA, CUTLL1, SUPT1, DND41, HPB-ALL and JURKAT) and three LLA-B lines (REH, NALM-6 and HPB-NULL).
  • mAb monoclonal antibody
  • IL-7R expression is characteristic of most of the analyzed ALL, although it is heterogeneous, with lines with high levels of expression, lines with low or undetectable protein levels, but positive for mRNA and lines with undetectable levels of protein and mRNA (Figure 1 B).
  • Figure 1 B Western Blot molecular studies focusing on the three signaling pathways associated with IL-7R, JAK / STAT, PI3K / AKT and MAPK / ERK, demonstrated the functionality of the receptors expressed in the leukemic lines.
  • Figure 1 C shows that activation of IL-7R in response to IL-7 activates all three pathways on the LLA-T CUTLL1 line.
  • EXAMPLE 2 The expression of IL-7R in primary acute lymphoblastic leukemia LLA-T and LLA-B confers an advantage of in vivo expansion to leukemic cells.
  • IL-7R expression was first analyzed in various samples of primary human leukemia obtained from blood and / or bone marrow (MO) of patients diagnosed with ALL-T or ALL-B. After the anti-IL-7Ra mAb and flow cytometry analysis, IL-7R expression was confirmed in the three LLA-T leukemias ( Figures 2, 3) and in the four LLA-B leukemias ( Figure 4A ) Primary analyzed, although variable levels of expression were detected.
  • mice combine the characteristics of the NOD / ShiLtJ genetic background, the combined severe immunodeficiency mutation (scid) and the deficiency of the IL-2 receptor gamma chain, common to other cytokines.
  • the technical specifications of The Jackson Laboratory indicate that the result of these mutations is a NOD.Cg-Prkdc scid ll2rg tm1Wil / SzJ mouse, which lacks mature T, B or NK cells and is deficient in cytokine signaling, which determines a better graft of human hematopoietic stem cells or mature hematopoietic cells of human peripheral blood, than that obtained with other mouse strains.
  • the NSG model is also suitable for Tumor stem cell transplant studies. Therefore, this model was used to analyze the in vivo tumor potential of primary leukemic cells from the bone marrow or blood of patients, and the contribution of cells expressing IL-7R to tumor expansion (Figure 3A) .
  • mice (10 6 ) were injected intravenously (iv) into the orbital sinus of NSG immunodeficient mice 6-8 weeks old, sublettally irradiated with 1.5 Gy. In some experiments the results were corroborated in other models of immunodeficient mice such as Rag2 - / - xyc - / -.
  • the example in Figure 3B shows that mice transplanted with LLA-T (T-ALL5) leukemia developed leukemia in vivo after a period of 1 to 14 weeks post-transplant, with a high percentage observed (around 80% ) of LLA-T leukemic cells derived from the patient in the spleen, bone marrow and thymus of mice, and a smaller proportion (14%) in the blood.
  • T-ALL5 LLA-T
  • the leukemia showed a CD4 + CD8 + phenotype similar to the phenotype of the patient's leukemic cells, indicating that the xenotransplantation model is very efficient for propagating and expanding human LLA-T leukemic cells (Figure 3B).
  • the most novel finding was the observation that the leukemic populations expanded in vivo in all the organs analyzed were enriched in cells positive for IL-7R expression, and with increased expression levels compared to the population of the transplanted patient in the mice ( Figure 3B).
  • the leukemic cells of the LLA-T and LLA-B that expand more efficiently in vivo are those that express higher levels of IL-7R, which reveals an important function of IL-7R in the tumor progression
  • EXAMPLE 3 Constitutive expression of high levels of IL-7R in SCIs of human acute lymphoblastic leukemia LLA-T.
  • IL-7R expression may be a functional marker of SCIs, or leukemia-initiating cells, in human acute lymphoblastic leukemia.
  • SCIs SCIs
  • leukemia-initiating cells SCIs
  • the two characteristics of SCIs are their capacity for self-renewal and their potential to graft and reproduce leukemia permanently. These functions are characteristic of those cells that maintain their leukemic potential in vivo after successive transplants.
  • FIG. 5 shows the results of transplants performed with three primary LLA-T leukemias obtained from the blood of patients (T-ALL5, T-ALL8 and T-ALL9), which were transplanted intravenously (0.5-1x10 6 cells) in NSG mice 6-8 weeks old sublettally irradiated with 1.5 Gy. At 8-10 weeks post-transplantation, the leukemic cells were isolated from the MOs of the mice and transplanted again (0.5-1x10 6 cells) into NSG mice.
  • IL-7R + cells of LLA-T are also SCIs whose tumor expansion advantage is revealed in vivo by successive xenotransplants.
  • IL-7R + cells expanded in vivo from LLA-B leukemia should include SCIs and, according to the expression of IL7R in lymphomas (Daloul et al., 1992), The existence of functional SCIs with IL-7R is expected for T and B lymphomas.
  • EXAMPLE 4 Efficient inhibition of IL-7R expression in vitro in human LLA-T leukemia cell lines by silencing the IL7R gene encoding the IL-7Ra chain by transduction with shRNAs-bearing lentiviral vectors.
  • IL-7R constitutive expression of IL-7R in the LICs of human ALL suggests that these receptors may be relevant functional targets susceptible to therapeutic manipulation.
  • IL7R gene silencing strategies by transduction with lentiviral vectors containing hairpins or " RNA short hairpins (shRNA), capable of specifically inducing the degradation of the mRNA of the IL7R gene encoding the IL-7Ra chain, or blocking protein translation.
  • shRNA short hairpins capable of specifically inducing the degradation of the mRNA of the IL7R gene encoding the IL-7Ra chain, or blocking protein translation.
  • shRNA RNA short hairpins
  • the IL-7R silencing strategy with shRNAs is efficient in vivo and, more importantly, demonstrates the participation of IL-7R in the in vivo leukemic expansion of LLA-T and LLA-B cell lines capable of proliferating in vitro. independently of IL-7 and / or TSLP.
  • EXAMPLE 6 The inhibition of constitutive expression of IL-7R in human primary LLA-T leukemias constitutes an efficient therapeutic strategy to block the graft and tumor expansion of ALL-T in vivo.
  • IL-7R The contribution of IL-7R that is constitutively expressed in human primary ALL leukemia to the maintenance and expansion of leukemia in vivo is unknown.
  • preclinical models of LLA leukemia xenotransplantation were established, in which the expression of IL-7R was silenced by shRNA transduction.
  • Leukemic cells from patients diagnosed with ALL-T transduced with shlL-7R sh5 (SEQ ID No. 7) were used prior to transplantation in NSG immunodeficient mice.
  • shsc SEQ ID No. 8
  • mice By restriction on the number of primary cells available, some experiments were performed with leukemic cells from the blood of patients (10 6 ) who were transplanted and expanded in vivo for 11-14 weeks by xenotransplantation in immunodeficient mice.
  • the cells expanded in the MO of these mice were isolated and transduced with sh5 (SEQ ID No. 7) or shsc (SEQ ID No. 8) carrier lentiviral vectors in OP9-DL4 stromal co-cultures supplemented with IL-7 and, subsequently, they were transplanted into new mice (Figure 9A).
  • silencing of IL-7R in primary T-ALL leukemias constitutively expressing IL-7R constitutes an efficient therapeutic strategy to inhibit grafting and leukemic expansion in vivo. Consequently, mere expression of the IL-7R receptor in the membrane of LLA-T cells and / or the binding of IL-7 to IL-7R expressed in LLA-T is crucial for leukemic expansion in vivo.
  • EXAMPLE 7 The role of IL7R in human acute lymphoblastic leukemia LLA-T and LLA-B can be blocked by the use of anti-IL7Ra monoclonal antibodies in what makes it a therapeutic target.
  • Example 6 suggests the possibility that IL-7R expression in primary LLA-T cells is functionally relevant for leukemic expansion in vivo due to its ability to bind to IL-7 produced in vivo. in the xenotransplantation and transmission model of the corresponding cell proliferation signals.
  • the proliferation capacity of LLA leukemia was examined after blocking the binding of IL-7 to IL-7R with a commercially obtained monoclonal antibody directed against the IL-7Ra chain (Imgenex, clone R34-34 ).
  • the antibody was very efficient in blocking the binding of IL-7 to IL-7R in the HPB-ALL cell line in which it dramatically inhibited the activation of the JAK STAT5 pathway in response to IL-7 (Figure 10D), although It did not affect cell viability (Figure 10E) or proliferation capacity (Figure 10F) of HPB-ALL cells in vitro, as expected, due to their independence from IL-7.
  • SEQ ID No. 1 Gene IL-7R. Sequence encoding the messenger RNA of the alpha chain of the human interleukin 7 receptor (IL7R). Type of sequence: cDNA. Sequence length: 1809 nucleotide bases. Origin of the sequence: Homo sapiens. NCBI database. (Access number: NM_002185.2). Coding region: amino acids 90-1469.
  • SEQ ID No. 2 IL-7R protein.
  • SEQ ID No. 3 shRNAl (sh1). Nucleotide sequence of shRNA number 1 against the alpha chain of IL-7R. Type of sequence: RNA. Sequence length: 58 nucleotide bases. Origin of the sequence: Artificial sequence (Sigma-Aldrich, TRCN0000058228). Sequences complementary to the IL-7Ra gene that will make up the RNA hairpin: amino acids 5-25 and amino acids 32-53. Complementary region of the IL-7Ra gene: amino acids 679-699 of SEQ. ID. No 1
  • SEQ ID No. 4 shRNA2 (sh2). Nucleotide sequence of shRNA number 2 against the alpha chain of IL-7R. Type of sequence: RNA. Sequence length: 58 nucleotide bases. Origin of the sequence: Artificial sequence (Sigma-Aldrich, TRCN0000058229). Sequences complementary to the IL-7Ra gene that will make up the RNA hairpin: amino acids 5-25 and amino acids 32-53. Complementary region of the IL-7Ra gene: amino acids 272-292 of the SEQ. ID. No 1
  • SEQ ID No. 5 shRNA3 (sh3). Nucleotide sequence of shRNA number 3 against the alpha chain of IL-7R. Type of sequence: RNA. Sequence length: 58 nucleotide bases. Origin of the sequence: Artificial sequence (Sigma-Aldrich, TRCN0000058230). Sequences complementary to the IL-7Ra gene that will make up the RNA hairpin: amino acids 5-25 and amino acids 32-53. Complementary region of the IL-7Ra gene: amino acids 1369-1416 of the SEQ. ID. No 1
  • SEQ ID No. 6 shRNA4 (sh4). Nucleotide sequence of shRNA number 4 against the alpha chain of IL-7R. Type of sequence: RNA. Sequence length: 58 nucleotide bases. Origin of the sequence: Artificial sequence (Sigma-Aldrich, TRCN0000058231). Sequences complementary to the IL-7Ra gene that will make up the RNA hairpin: amino acids 5-25 and amino acids 32-53. Complementary region of the IL-7Ra gene: amino acids 1 174-1194 of the SEQ. ID. No 1 SEQ ID No. 7: shRNA5 (sh5). Nucleotide sequence of shRNA number 5 against the alpha chain of IL-7R. Type of sequence: RNA.
  • Sequence length 58 nucleotide bases. Origin of the sequence: Artificial sequence (Sigma-Aldrich, TRCN0000058232). Sequences complementary to the IL-7Ra gene that will make up the RNA hairpin: amino acids 5-25 and amino acids 32-53. Complementary region of the IL-7Ra gene: amino acids 390-410 of the SEQ. ID. No 1
  • SEQ ID No. 8 shRNA scumble (shsc). Nucleotide sequence of a shRNA that does not recognize any human or mouse gene. Type of sequence: RNA. Sequence length: 58 nucleotide bases. Origin of the sequence: Artificial sequence (Sigma-Aldrich, SHC002). Sequences that will make up the RNA hairpin: amino acids 5-25 and amino acids 32-53.
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Abstract

La presente invención se refiere altratamiento terapéutico de leucemiaslinfoblásticasagudas (LLA) humanasde células T y B (LLA-T y LLA-B)y linfomas humanos,por inhibición del receptor de interleuquina-7 (IL-7R) humana. Un primer aspecto de la presente invención es un agente inhibidor o bloqueante, preferentemente un anticuerpo o un fragmento del mismo,capaz de bloquear la función de la cadena α del receptor de interleuquina 7 (IL-7Rα) humano,para la prevención y/o el tratamiento de una LLAhumana o de un linfoma humano. Así mismo, la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica y aun modelo de identificación, expansión y mantenimiento in vivo de células iniciadoras de LLA-T y LLA-B primarias humanas con capacidad de iniciar el injerto de la leucemia en ratones inmunodeficientes, así comola caracterización de estas células iniciadoras de LLA-T y LLA-B como células que expresan altos niveles del IL-7R.

Description

TRATAMIENTO TERAPÉUTICO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS T y B Y LINFOMAS HUMANOS POR INHIBICIÓN DEL RECEPTOR DE INTERLEUQUINA-7 (IL-7R)
DESCRIPCIÓN
Sector de la técnica
La presente invención forma parte del sector de la química y la farmacia, en concreto se refiere al uso terapéutico de agentes inhibidores del receptor de la interleuquina 7 (IL-7) humana para el tratamiento y/o la prevención de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) humana de células T y B (LLA-T y LLA-B, respectivamente), extensible a linfomas T y B. La presente invención también hace referencia a la identificación del IL-7R como un marcador de las células que inician y mantienen las leucemias LLA-T y LLA-B (LICs).
Estado de la técnica
La LLA es un tumor agresivo que aparece por la transformación oncogénica de los progenitores linfoides T o B durante su desarrollo (LLA-T y LLA-B, respectivamente), y constituye el cáncer infantil más frecuente (Pui et al., 2008). Existen grandes similitudes entre las LLAs y los linfomas, especialmente entre las LLA-T y los linfomas T, por lo que la mayoría de los oncólogos clínicos coinciden en que ambas entidades representan dos manifestaciones de la misma enfermedad que, de hecho, suelen tratarse con las mismas terapias (Aifantis et al., 2008). El término LLA se utiliza, por tanto, para definir ambas patologías.
La LLA, especialmente la LLA-T, tiene un mal pronóstico, aunque el desarrollo de tratamientos de quimioterapia intensiva en las últimas décadas ha incrementado notablemente la esperanza de vida de los pacientes con LLA de ambos tipos celulares. Sin embargo, la quimioterapia tiene una gran toxicidad y la frecuencia de recaídas, que constituye la principal causa del fracaso del tratamiento, sigue siendo muy alta (del orden del 20%). Además, la supervivencia a 5 años en estos casos no es mayor del 1 1 %, lo que revela una tasa de mortalidad extremadamente alta de los pacientes no respondedores al tratamiento convencional de quimioterapia (Hunger et al., 201 1). Por tanto, es urgente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para prevenir y/o tratar las recidivas y reducir la mortalidad.
La mayoría de las recaídas de la LLA ocurren en fases tempranas post-tratamiento y reflejan la resistencia al mismo de una población clonal de células que ya estaban presentes en el momento del diagnóstico (Bailey et al., 2006), y que son las responsables del inicio, la propagación y el mantenimiento de la leucemia, por lo que se denominan células iniciadoras de la leucemia (LIC, del inglés leukemia initiating cell), o células madre leucémicas (LSC, del inglés leukemla stem cell). El éxito del tratamiento frente a la LLA dependerá, por tanto, de la eficiente eliminación de las LICs. Aunque se han realizado importantes esfuerzos para desarrollar nuevos tratamientos que cumplan este objetivo (Pui y Jeha, 2007), el desarrollo de drogas específicas frente a las LICs que reduzcan la frecuencia de recidivas está todavía en sus fases iniciales. Esta labor es compleja, ya que las LICs representan menos del 1 % de la población leucémica total y aún no se han encontrado marcadores específicos de estas células. En consecuencia, el éxito de cualquier nueva terapia depende del desarrollo de estrategias que permitan identificar a las LICs de las LLA-T y LLA-B y caracterizarlas, para avanzar en el diseño de nuevas maniobras que permitan eliminarlas.
Entre las moléculas que se han identificado recientemente como posibles dianas de intervención terapéutica en LLA-T y LLA-B se encuentra un grupo de moléculas de señalización que participan en la supervivencia y/o proliferación de las células linfoides normales (Maude et al., 2012). En este grupo se incluyen mTOR, PI3K y quinasas de la familia JAK, que se asocian a receptores de membrana para factores de crecimiento linfoides, como son el receptor de la interleuquina-7 (IL-7R) y el de la timopoyetina derivada del estroma tímico (TSLP-R). La activación aberrante de las vías de señalización PI3K/mTOR y/o JAK/STAT es una importante característica de las LLAs (Maude et al., 2012; Tasian et al., 2012) que determina la proliferación de las células leucémicas de manera independiente de la unión de factores de crecimiento (IL-7 y TSLP) a sus correspondientes receptores de membrana (IL-7R y TSLP-R). Por ello, la utilización de drogas específicas capaces de inhibir la hiperactivación de las vías de señalización JAK/STAT y PI3K/mTOR se prevé como una eficaz estrategia terapéutica para el tratamiento de la mayoría de las leucemias y linfomas, incluyendo aquellas con mutaciones activadoras en las moléculas de señalización asociadas al IL-7R o al TSLP-R (Maude et al., 2012; Tasian et al., 2012), o mutaciones activadoras en los propios receptores IL-7R y TSLP-R (Zenatti et al., 201 1 ; Shochat et ai, 2011 ; Mullighan et al., 2009; Tasian et al., 2012). Estas terapias se encuentran en fase preclínica o en ensayos clínicos en la actualidad, y su relevancia clínica es aún desconocida.
No obstante, se sabe que, además de PI3K/mTOR y JAK/STAT, existen otras vías acopladas a los receptores IL-7R y TSLP-R, como por ejemplo MAPK/ERK, que regulan funcionalmente a las anteriores, lo que aumenta el espectro de posibles dianas implicadas en la supervivencia y proliferación de las células leucémicas. Esta heterogeneidad hace previsible la necesidad del uso combinado de diferentes drogas, específicas de rutas de activación individuales, lo que puede suponer un considerable aumento de la toxicidad del tratamiento. Por tanto, el reto actual está en la intervención terapéutica simultánea de todas las vías de señalización acopladas a los receptores IL-7R y TSLP-R y susceptibles de hiperactivación en leucemias y linfomas.
Dentro de las posibilidades de intervención terapéutica simultánea estaría la inhibición de las vías de señalización a nivel del propio receptor. El receptor IL-7R se expresa durante el desarrollo de los linfocitos T y B, y el TSLP-R es exclusivo de los linfocitos B, y ambos se mantienen en una alta proporción de las correspondientes leucemias LLA-T y/o LLA-B (Dibirdik et al., 1991 ; De Waele et al., 2001) y linfomas (Dalloul et al., 1992; Frishman et al., 1993). El IL- 7R está constituido por la cadena IL-7Ra y una cadena yc, común a otros receptores de citoquinas, que heterodimerizan en presencia de IL-7 (Goodwin et al., 1990; Noguchi et al., 1993), lo que induce la activación de las vías de señalización mencionadas. A su vez, el TSLP-R es un heterodímero formado por IL-7Ra y una cadena específica codificada por el gen CRLF2. Por tanto, ambos receptores comparten la cadena IL-7Ra, por lo que esta molécula es una potencial diana común en leucemias de células T y B. Diferentes estudios indican que las leucemias LLA-B y LLA-T y diferentes tipos de linfomas T y B son capaces de responder a IL-7 o TSLP in vitro, (Touw et al., 1990; Benjamín et al., 1994; Nishii et al., 1999; Barata et al., 2004; Sasson et al., 2010; González-García et al. 2009; Dalloul et al., 1992; Frishman et al., 1993), lo que reforzaría la relevancia de los receptores IL-7R y TSLP-R como dianas de intervención terapéutica.
Sin embargo, el sello característico de las leucemias y linfomas es la independencia de factores de crecimiento (Hanahan and Weinberg, 2000), por lo que el bloqueo funcional de los receptores para IL-7 o TSLP, o incluso su eliminación de la superficie celular, no se ha considerado hasta el momento como una estrategia terapéutica prometedora. Además, se desconoce la relevancia de estos receptores en la fisiopatología de las ALLs in vivo, o en la capacidad de generación tumoral de las LICs, que es finalmente responsable de las resistencias a los tratamientos y/o de las recaídas de las ALLs. Esta información es esencial para el diseño de terapias específicas que, estando dirigidas frente a una única molécula, por ejemplo IL-7Ra, puedan incidir de forma generalizada en la mayoría de LLAs y linfomas T y B.
En esta invención se identifica la expresión del IL-7R como un marcador de las LICs de las leucemias LLA-T y LLA-B, cuya inhibición funcional impide el injerto y la expansión leucémica in vivo.
Breve Descripción de la Invención Un primer aspecto de la presente invención es un compuesto útil para tratar Leucemias Linfoblásticas Agudas de células T (LLA-T) o Leucemias Linfoblásticas Agudas de células B (LLA-B) caracterizado por que inhibe la señalización de los receptores de membrana IL-7R y TSLP-R que contienen la cadena alfa del receptor de Interleuquina 7 (IL-7Ra).
En otra realización preferente de la presente invención, se hace referencia al agente inhibidor anteriormente descrito, caracterizado por que dicho agente es un anticuerpo o un fragmento del mismo, capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente la proteína IL-7Ra y bloquear la unión de su ligando, IL-7 o TSLP.
La presente invención hace referencia también a una composición farmacéutica y/o medicamento caracterizada/o por comprender al menos un agente inhibidor descrito anteriormente. Preferentemente, dicha composición farmacéutica y/o medicamento se caracteriza por que comprende una cantidad terapéuticamente aceptable de al menos un vehículo, y/o un excipiente, y/o un aditivo.
En otro aspecto de la invención, se hace referencia a un modelo de identificación, expansión y mantenimiento in vivo de células LICs de LLA-T y LLA-B primarias humanas con capacidad de iniciar el injerto de la leucemia en ratones inmunodeficientes NOD/SCID/ycnu" (NSG), y a la caracterización de estas LICs como células que expresan altos niveles del IL-7R.
En otra realización preferente de la presente invención se hace referencia al modelo de xenotransplante anteriormente descrito, caracterizado por constituir un modelo pre-clínico para el estudio in vivo de la expansión y supervivencia de las células leucémicas y de sus LICs, así como de la eficiencia terapéutica de un tratamiento.
Descripción de las figuras
Figura 1. Expresión de IL-7Rs funcionales en líneas celulares derivadas de leucemias LLA- T y LLA-B humanas.
(A) Expresión de IL-7R en líneas celulares LLA-T y LLA-B analizadas mediante tinción con un anticuerpo anti-IL-7Ra y citometría de flujo. (B) Análisis por RT-PCR de la expresión de ARNm del gen IL7R que codifica para IL-7Ra humana (SEQ ID No. 2) en líneas LLA-T (KOPTK1 y P12/ICHIKAWA) en las que no se detecta expresión de la proteína en membrana. (C) Estimulación con IL-7 de células CUTLL1 y detección mediante Western Blot de la activación por fosforilación de las vías JAK/STAT5, PI3K/AKT y MAPK/ERK. Figura 2. La expresión constitutiva del IL-7R es una característica de las células leucémicas primarias de pacientes con LLA-T.
Expresión de IL-7R en células leucémicas de médula ósea de tres pacientes (T-ALL5, T-ALL8 y T-ALL9) analizada mediante tinción con un anticuerpo anti-IL-7Ra y citometría de flujo.
Figura 3. La expresión constitutiva del IL-7R en leucemias primarias LLA-T humanas confiere una ventaja de proliferación y mayor capacidad de injerto in vivo a las células leucémicas.
(A) Esquema del sistema experimental de xenotrasplante de leucemias primarias LLA-T humanas en ratones inmunodeficientes NOD/SCID/ycnu" (NSG). (B) Caracterización fenotípica de las células leucémicas procedentes de una LLA-T primaria humana (T-ALL5) tras su injerto en diferentes órganos linfoides del huésped y expresión del IL-7R (negro) superpuesta a los niveles de expresión de IL-7R en las células del paciente previamente al trasplante (blanco). Las gráficas de la derecha muestran los números relativos de células IL-7R+ y la intensidad de fluorescencia de la expresión del IL-7R en las células LLA-T recuperadas en los diferentes órganos del ratón con respecto a las trasplantadas del paciente (n=3). Se observa la expansión selectiva de células con niveles aumentados del IL-7R respecto a las células pre-trasplante, lo que indica su ventaja de crecimiento y su mayor capacidad de injerto in vivo.
Figura 4. La expresión constitutiva del IL-7R en leucemias primarias LLA-B humanas confiere una ventaja de proliferación y mayor capacidad de injerto in vivo a las células leucémicas.
(A) Caracterización fenotípica y niveles de expresión del IL-7R en diferentes muestras de pacientes diagnosticados de LLA-B. Se indican los porcentajes de células positivas para cada marcador analizadas por citometría de flujo. (B) Caracterización fenotípica de las células leucémicas derivadas de una LLA-B humana (LLA-401) que colonizan diferentes órganos tras su trasplante en ratones inmunodeficientes. Las gráficas de la derecha muestran los números relativos de células IL-7R+ y la intensidad de fluorescencia de la expresión del IL-7R en las células LLA-B recuperadas en los diferentes órganos del ratón (n=3). Se observa la expansión selectiva de células con niveles aumentados del IL-7R respecto a las células pre-trasplante, lo que indica su ventaja de crecimiento y su mayor capacidad de injerto in vivo.
Figura 5. Las células iniciadoras de la leucemia (LICs) linfoblástica aguda T se caracterizan por la expresión constitutiva de altos niveles del IL-7R.
Análisis fenotípico de las LICs de la LLA-T, definidas funcionalmente en el modelo convencional de xenotrasplante seriado. El análisis por citometría de flujo presenta los cambios en los niveles de expresión de IL-7R en las células leucémicas procedentes de la médula ósea de tres pacientes diagnosticados de LLA-T (T-ALL5, T-ALL8 y T-ALL9), tras dos xenotrasplantes consecutivos en ratones inmunodeficientes NSG. Se observa el enriquecimiento sucesivo in vivo en células con niveles aumentados del IL-7R respecto a las células pre-trasplante, lo que indica que la expresión del IL-7R es una característica de aquellas células leucémicas con mayor capacidad de injerto y de proliferación in vivo, denominadas LICs.
Figura 6. Silenciamiento de la expresión y función de IL-7Ra en líneas leucémicas LLA-T humanas por shRNA.
(A) Representación esquemática de los sitios de reconocimiento en el ARNm del gen IL7R humano por los shRNAs sh1-5 (de secuencias SEQ ID No. 3-7 respectivamente), utilizados para silenciar la expresión de IL-7Ra. (B) Expresión de IL-7Ra en la membrana de células CUTLL1 infectadas con vectores lentivirales que contienen los diferentes shRNAs frente al IL7R. Se muestra el porcentaje de células positivas tras 4 días de selección con puromicina. (C) Expresión en membrana de IL-7Ra en las líneas CUTLL1 , HPB-ALL y SUPT1 infectadas con los diferentes shRNAs frente al IL7R. Los datos representan las medias ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. (D) Expresión relativa de ARNm de IL7R analizada mediante PCR cuantitativa en células HPB-ALL infectadas con los diferentes shRNAs. Los valores se normalizaron a la expresión endógena de GAPDH. (E) Expresión en la membrana de IL-7Ra (izquierda) y expresión intracelular de fosfo-STAT5 (derecha) por citometría de flujo en células HPB-ALL silenciadas para IL7R con sh4 (SEQ ID No. 6) o transducidas con un shRNA control (shsc, SEQ ID No. 8) y estimuladas con IL-7 durante 30 minutos.
Figura 7. El silenciamiento de la expresión constitutiva del IL-7R por shRNA es funcional in vivo en líneas celulares LLA-T y bloquea la expansión tumoral.
(A, D) Eficiencia de transducción (% de células GFP+) y expresión en membrana de IL-7Ra analizadas por citometría de flujo en células de las líneas leucémicas LLA-T HPB-ALL (A) y CUTLL1 (D) trasplantadas en ratones inmunodeficientes tras su infección con los vectores sh5 (SEQ ID No. 7) o shsc (SEQ ID No.8). (B, E) Expresión de CD4 y de IL-7R analizada por citometría de flujo en células de un tumor representativo derivado de la línea HPB-ALL (B) o CUTLL1 (E) mostradas en (A, D). Los histogramas de la derecha muestran la expresión de IL- 7Ra en las células GFP+ vs las células GFP . Los histogramas sombreados representan la tinción con un anticuerpo isotípico irrelevante. Los números indican el porcentaje de células positivas. (C, F) Números relativos (% de células GFP+) de células transducidas con sh5 (SEQ ID No. 7) o shsc (SEQ ID No. 8) en los tumores desarrollados in vivo a partir de células HPB-ALL (C) o CUTLL1 (F). Las barras representan la media ± SEM del análisis de 5 ratones de cada grupo inyectados con HPB-ALL y 2 ratones de cada grupo inyectados con CUTLL1. Se indica la significación estadística de los resultados. La gráfica inferior en (C) representa la intensidad media de fluorescencia ± SEM de la expresión del IL-7R en los tumores HPB-ALL generados in vivo (n=5).
Figura 8. El silenciamiento de la expresión constitutiva del IL-7R por shRNA es funcional in vivo en líneas celulares LLA-B y bloquea la expansión tumoral.
(A) Eficiencia de transducción (% de células GFP+) y expresión en membrana de IL-7Ra analizadas por citometría de flujo en células de la línea leucémica LLA-B NALM-6 trasplantadas en ratones inmunodeficientes tras su infección con vectores portadores de sh5 (SEQ ID No. 7) o de shsc control (SEQ ID No. 8). (B) Tasa de crecimiento tumoral in vivo de las células NALM-6 mostradas en (A). (C) Caracterización fenotípica mediante citometría de flujo de un tumor representativo de cada grupo utilizando anticuerpos anti-CD19 y anti-IL-7Ra. El histograma de la izquierda muestra la expresión del IL-7R en las células GFP+ y las células GFP . Los histogramas sombreados representan la tinción con un anticuerpo isotípico irrelevante. Se indica el porcentaje de células positivas. (D) Cuantificación del porcentaje de células transducidas (% de células GFP+) (arriba) y de la intensidad media de fluorescencia (abajo) de la expresión en membrana del IL-7R determinada por citometría de flujo. Las barras representan la media ± SEM del análisis de 3 ratones de cada grupo. Se indica la significación estadística de los resultados.
Figura 9. La inhibición de la expresión constitutiva del IL-7R por shRNA en leucemias primarias LLA-T humanas es una eficiente estrategia para impedir el injerto y la progresión tumoral in vivo.
(A) Modelo experimental preclínico utilizado como prueba de concepto de la eficiencia terapéutica de agentes inhibidores del IL-7R para el tratamiento de la LLA humana. Se utilizaron dos leucemias LLA-T (T-ALL5 y T-ALL8) que se trasplantaron en ratones NSG como método de expansión. La estrategia de inhibición utilizada fue el silenciamiento del gen IL-7R mediante infección con vectores lentivirales portadores de un ARN de interferencia frente a IL-7Ra (sh5, SEQ ID No. 7). Las transducciones se realizaron en las células leucémicas expandidas in vivo tras el xenotrasplante, mediante su co-cultivo in vitro sobre la línea estromal OP9-DL4 e IL-7 en presencia del vector lentiviral. La transducción con el shRNA control (shsc, SEQ ID No. 8) se utilizó como referencia de la progresión tumoral in vivo, analizada tras el xenotrasplante de las células control transducidas en ratones NSG. Se muestra la cuantificación por citometría de flujo del número de células de las leucemias T-ALL5 y T-ALL8 infectadas con los vectores lentivirales portadores de los shRNA (caracterizadas por la expresión de GFP) en el momento del xenotrasplante, así como de las células leucémicas silenciadas o control identificadas en los órganos indicados 8 semanas postransplante. n>7, **p<0,01. Figura 10. El bloqueo de la unión de IL-7 al IL-7R con un anticuerpo monoclonal anti-IL-7Ra inhibe la activación dependiente de IL-7 de las vías MAPK/ERK, PI3K/AKT y JAK/STAT5 y reprime la expansión de leucemias LLA-T primarias humanas.
(A) Expresión de IL-7Ra en progenitores primarios de linfocitos T humanos aislados de timo postnatal (timocitos DN2). (B) Activación de las vías MAPK/ERK y PI3K/AKT en timocitos humanos DN2 en respuesta a IL-7 analizada por Western Blot. (C) Proliferación relativa de timocitos DN2 tratados con un anticuerpo (Ac) bloqueante frente a IL-7Ra o con un anticuerpo anti-isotípico control en co-cultivos con estroma OP9-DL4 e IL-7. (D) Análisis mediante Western Blot de la activación de STAT5 tras la estimulación con IL-7 en la línea leucémica HPB-ALL pre- tratada con el Ac anti-IL-7Ra o con un Ac control. (E) Proliferación relativa y (F) ciclo celular, analizado por citometría de flujo, de células de la línea HPB-ALL cultivadas in vitro en ausencia de IL-7 y en presencia del Ac anti-IL-7Ra o de un Ac control. (G) Inhibición de la proliferación celular in vitro de la leucemia primaria humana T-ALL5 por el Ac anti-IL-7Ra en un co-cultivo con OP9-DL4 e IL-7.
Descripción Detallada de la Invención
Un primer aspecto de la invención se refiere a un agente inhibidor de la función de la cadena α del receptor de interleuquina 7 (IL-7Ra) codificada por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 , para su uso en medicina, en concreto para prevenir y/o tratar una leucemia linfoblástica aguda humana, preferentemente una leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) y/o de células B (LLA-B). Asimismo, este aspecto de la invención también contempla la protección del uso del agente bloqueante anterior para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento útil para la prevención y/o el tratamiento de dicha leucemia linfoblástica, ya sea de células T y/o de células B, y más preferentemente para inhibir a las LICs de dichas leucemias linfoblásticas y evitar la aparición de recidivas.
En la presente invención, el término "prevención" se refiere a la función de evitar la aparición de recidivas y/o el desarrollo de leucemia linfoblástica aguda humana, preferentemente LLA-T o LLA-B, y/o linfomas T o B en individuos con alto riesgo de desarrollar o padecer la enfermedad, como por ejemplo individuos que han sido tratados previamente de esta misma enfermedad, con este u otro tipo de tratamiento (p. ej. quimioterapia), y que habiéndose recuperado tienen una alta probabilidad de desarrollar recidivas.
En la presente invención, el término "tratamiento" se refiere a la función de eliminar las células leucémicas y la enfermedad en pacientes con diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda humana, preferentemente LLA-T o LLA-B, y/o linfomas T o B. En la presente invención, el término "leucemia linfoblástica aguda (LLA)" se refiere a un cáncer hematológico caracterizado por la transformación oncogénica de los progenitores linfoides durante su desarrollo.
En la presente invención, el término "leucemia T linfoblástica aguda (LLA-T)" o "leucemia linfoblástica aguda de tipo células T" se refiere a un cáncer hematológico caracterizado por la por la transformación oncogénica de los progenitores de los linfocitos T durante su desarrollo.
En la presente invención, el término "leucemia B linfoblástica aguda (LLA-B)" o "leucemia linfoblástica aguda de células B" se refiere a un cáncer hematológico caracterizado por la por la transformación oncogénica de los progenitores de los linfocitos B durante su desarrollo.
En la presente invención, el término "agente inhibidor de la función de la cadena α del receptor de la interleuquina 7" se refiere a al menos un anticuerpo y/o un fragmento del mismo, capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente la proteína IL-7Ra y bloquear la unión de su ligando, o a vectores de silenciamiento génico, que comprenden al menos una secuencia oligonucleotídica complementaria al gen IL7R, preferentemente, del gen IL7R humano con SEQ ID No. 1. SEQ ID No. 1 es la secuencia de cDNA correspondiente a la secuencia codificante del ARN mensajero de la cadena alfa del receptor de la interleuquina 7 humana (IL7R) de Homo sapiens (Base de datos del NCBI; Número de acceso: NM_002185.2).
En la presente invención, el término "receptor de interleuquina 7 (IL-7R)" se refiere al heterodímero constituido por la cadena IL-7Ra y la cadena ye, común a otros receptores de citoquinas. En particular, la "cadena α del receptor de interleuquina 7 (IL-7Ra)" se refiere a una de las dos subunidades que forma parte de los receptores IL-7R y TSLP-R y está codificada por el gen IL7R humano, preferentemente por el gen IL7R con secuencia SEQ ID No. 1. En este caso, la secuencia de aminoácidos de la cadena α del IL-7R corresponde a la secuencia traducida de la región codificante 90-1469 de SEQ ID No. 1 y consiste en SEQ ID No. 2.
Como agentes bloqueantes de la función de IL-7Ra, la presente invención hace referencia a aquellos agentes conocidos por un experto en la materia. A continuación se citan los siguientes ejemplos de manera no limitante: a) anticuerpos anti-IL7Ra, preferentemente anticuerpos monoclonales, capaces de unirse/ reconocer/reaccionar específicamente y/o selectivamente a/con el sitio de unión de ligando en la proteína IL-7Ra humana (Pandrau-García et al., 1994) codificada por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 y producir la inhibición de la señalización mediada por el receptor IL-7R y/o TSLP-R (Levin et al., 1999); b) fragmentos de anticuerpos anti-ILRa responsables de la unión al receptor IL-7Ra humano, y por tanto de inducir efectos iguales o similares a los de los anticuerpos definidos anteriormente;
En la presente invención, el término "gen IL7R" se refiere preferentemente al gen humano con SEQ ID No. 1 que codifica para la proteína IL-7Ra SEQ ID No. 2.
En la presente invención, el término "anticuerpo anti-IL7Ra" se refiere de forma no limitante a moléculas de inmunoglobulinas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con el receptor proteico humano IL-7Ra codificado por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 , y un fragmento Fe capaz de fijar complemento. Preferentemente, dicho anticuerpo inhibe la unión de la IL-7 con la proteína IL-7Ra humana, y neutraliza así la función biológica de la proteína, como por ejemplo, y sin carácter limitante, el anticuerpo anti-IL- 7Ra R34-34. No se excluyen del término las porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen los fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina, que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la molécula de la invención a la que reconocen, pero carecen del fragmento Fe y no son capaces de fijar complemento. Preferentemente, también se incluyen péptidos específicos bloqueantes. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente o mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del receptor proteico IL7Ra y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores.
Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del anticuerpo frente a la molécula IL-7Ra, o que produce el anticuerpo contra la molécula IL-7Ra como resultado de la recombinación homologa.
Un "anticuerpo quimérico" es aquella molécula inmunoglobulina que mediante técnicas de ingeniería genética ha sido modificada para que su parte variable o Fab mantenga las características originales y su parte constante o Fe sea reconocido por las células humanas. El término "anticuerpo humanizado", tal como se entiende en la presente invención se refiere a una inmunoglobulina que conserva una región determinante de complementariedad (CDR) procedente de la inmunoglobulina monodonal original (por ejemplo, inmunoglobulina donadora) y regiones de marco conservado variables sustancialmente de una inmunoglobulina aceptora humana. La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina aceptora humana" significa que la mayoría o los restos de marco conservado clave proceden de la secuencia aceptora humana, permitiendo sin embargo la sustitución de restos en ciertas posiciones por restos seleccionados para mejorar la actividad de la inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, alterar la actividad de tal forma que imite más la actividad de la inmunoglobulina donadora) o seleccionados para reducir la inmunogenicidad de la inmunoglobulina humanizada.
Se entiende por el término "anticuerpo sintético", como se usa en la presente memoria, un anticuerpo que se genera usando la tecnología de ADN recombinante tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago. Debería considerarse también que el término significa un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y que dicha molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia aminoacídica específica del anticuerpo, en el que la secuencia de ADN o aminoacídica se ha obtenido usando la tecnología de secuenciación de ADN o aminoácidos sintéticos que está disponible y es bien conocida en la materia.
En una realización preferida, el agente bloqueante de la función de IL-7Ra según se definió anteriormente se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-IL7Ra capaz de unirse/reconocer/reaccionar específicamente y/o selectivamente a/con la proteína IL-7Ra codificada por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 e inhibir la unión de ligando y neutralizar la función biológica de la proteína IL-7Ra humana, un fragmento de dicho anticuerpo responsable de la unión a IL-7Ra del anticuerpo y cualquier combinación de los mismos.
En una realización preferida de la anterior, el anticuerpo anti-IL7Ra es un anticuerpo monodonal y más preferentemente es un anticuerpo monodonal humanizado, capaz de unir complemento humano y/o tener actividad celular citotóxica dependiente de anticuerpo (ADCC), donde dichos anticuerpos están dirigidos frente a la cadena IL-7Ra. Según la invención, y sin que sirva de limitación, ejemplos de anticuerpos monoclonales bloqueantes anti-IL7Ra humano son los descritos en Pandrau-García et al., 1994.
Un segundo aspecto de la invención hace referencia a una composición farmacéutica y/o medicamento que comprende al menos una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente bloqueante de la función de IL-7Ra según cualquiera de los definidos anteriormente. La composición farmacéutica y/o medicamento anterior resulta de utilidad para su uso en el tratamiento y/o prevención de la leucemia linfoblástica aguda humana, tanto de células T como de células B, y puede comprender además del agente bloqueante o principio activo, al menos un vehículo, y/o un excipiente y/o un aditivo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con la presente invención, la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención se llevará a cabo con una "dosis terapéuticamente eficaz", siendo suficiente para que demuestre un beneficio para el paciente, por lo general preferentemente relacionado con una disminución del número de células iniciadoras de la leucemia (LIC) LLA-T y/o LLA-B, o de la capacidad replicativa de las mismas en el paciente. Tal beneficio puede suponer la mejora de al menos un síntoma relacionado con la leucemia linfoblástica aguda. La prescripción del tratamiento, es decir, las decisiones sobre las dosis, periodicidad, duración, etc., recaerá bajo la responsabilidad del médico general o del especialista que atienda al paciente infectado.
En el ámbito de la presente invención, el término "dosis terapéuticamente eficaz" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad (o cantidad por unidad de masa del individuo al que se le administra) de un fármaco o agente bloqueante que ocasiona un efecto terapéutico detectable en un individuo o un grupo de individuos a los que les es administrada, ocasionando mínimos efectos secundarios o tóxicos. La cantidad terapéuticamente eficaz útil para producir un efecto terapéutico en cualquier paciente dado se puede determinar mediante técnicas convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica. El término "dosis terapéuticamente eficaz-50" o "dosis terapéuticamente eficaz-95" incluye un valor estadístico en el que el efecto terapéutico debe ser detectable en el 50% o el 95% de los individuos a los que les es administrada. En lo relativo a los efectos tóxicos del fármaco o compuesto, es preferible que la dosis terapéutica eficaz no ocasione ninguno. Sin embargo, aunque en ocasiones puedan darse efectos tóxicos, puede llegarse a un compromiso en el que se considera que éstos son preferibles al desarrollo normal de la enfermedad o dolencia sin la administración del fármaco o compuesto, y pueden a su vez ser tratados mediante terapias adicionales.
Las composiciones farmacéuticas, de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, entendiéndose por "vehículo" cualquier diluyente, adyuvante o excipiente conocido por el especialista que se administra con el principio activo. Tales materiales deben no ser tóxicos y, además, no interferir con la eficacia del ingrediente activo (el agente bloqueante de la función de la cadena α del IL-7R, en el caso de la presente invención). La naturaleza precisa del vehículo dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, o mediante inyección, por ejemplo, cutánea, subcutánea o intravenosa. Debido a que las células diana para prevenir o tratar una leucemia linfoblástica aguda se encuentran en sangre periférica, pueden estar indicando, por definición, una necesidad de acceso a la sangre para su tratamiento. En el caso de utilizar tratamientos basados en anticuerpos anti-IL-7Ra, la vía de administración de dichos anticuerpos es preferiblemente parenteral. Como se usa en este documento, el término "parenteral" incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. De todas estas, la más preferida es la administración intravenosa. Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o bien inyección en el lugar de la dolencia, el principio activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, que sea apirógena y que tenga un pH apropiado, estabilidad y tonicidad. Aquellos que sean expertos en la técnica podrán preparar soluciones apropiadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tal como una inyección salina.
Los anticuerpos anti-IL-7Ra se proporcionarán típicamente mediante la técnica convencional en un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo solución salina estéril, agua tamponada estéril, combinaciones de las anteriores, etc., y pueden contener dextrosa u otra solución de sacárido o de glicol tal como etilénglicol, propilénglicol o polietilénglicol. Vehículos farmacéuticos adecuados y métodos para preparar agentes administrables por vía parenteral se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin, 1995. Preferiblemente, los vehículos de la invención están aprobados por la agencia reguladora de un gobierno de estado o un gobierno federal, o están enumerados en la Farmacopea Estadounidense, en la Farmacopea Europea u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en humanos.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de prevención y/o tratamiento de una leucemia linfoblástica aguda humana que comprende la administración a un individuo en necesidad de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente bloqueante, y/o de una composición farmacéutica y/o medicamento como cualquiera de los definidos anteriormente.
En la presente invención, el término "individuo en necesidad" se refiere a un individuo afectado de leucemia linfoblástica aguda humana, preferentemente LLA-T o LLA-B, o con alto riesgo de desarrollar o padecer la enfermedad, como por ejemplo individuos que han sido tratados previamente de esta misma enfermedad, con este u otro tipo de tratamiento (p. ej. quimioterapia), y que habiéndose recuperado tienen una alta probabilidad de desarrollar recidivas.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de xenotrasplante sucesivo en ratón para la identificación, supervivencia, injerto y expansión de una célula iniciadora de la leucemia (LIC), que comprende inyectar in vivo, preferentemente por vía intravenosa, una suspensión de células leucémicas procedentes de un individuo con leucemia linfoblástica aguda (preferentemente de individuos con LLA-T y/o LLA-B), en un modelo de ratón inmunodeficiente, donde dicha LIC tiene ventaja de crecimiento y expresa el receptor IL7Ra, y criar al ratón trasplantado. El trasplante sucesivo consiste en inyectar in vivo, preferentemente por vía intravenosa, en el ratón inmunodeficiente, las células leucémicas humanas expandidas en un primer ratón inmunodeficiente (preferentemente, pero no exclusivamente, en la sangre periférica, la médula ósea, el bazo, el timo, o el hígado), en sucesivos ratones, lo que permite seleccionar las células con mayor potencial de crecimiento in vivo y capaces de auto-renovarse y reproducir la leucemia, propiedades características de las LICs, como por ejemplo y sin carácter limitante el procedimiento descrito para la identificación de las LICs de la leucemia mieloide aguda (AML), un tipo de leucemia con un origen y tratamiento distinto de la LLA.
Por tanto, el procedimiento anterior comprende de manera general las siguientes etapas: inyectar preferentemente por vía intravenosa una suspensión de células (0.5-1x106 células) de pacientes diagnosticados de leucemia linfoblástica aguda de células T o de células B en un ratón inmunodeficiente, irradiado subletalmente con 1.5 Gys;
- criar al ratón durante 6-8 semanas en racks ventilados para producir la expansión de las células inyectadas en la etapa anterior;
- extraer del ratón previamente inyectado en la etapa anterior las células de leucemia expandidas preferentemente, pero no exclusivamente, en la sangre periférica, la médula ósea, el bazo, el timo, o el hígado, y caracterizadas por citometría de flujo como células leucémicas humanas por la expresión de marcadores de células humanas como por ejemplo , pero no exclusivamente, CD45;
- seleccionar y expandir las células con mayor potencial de auto-renovación, de crecimiento y de injerto in vivo, que son las LICs capaces de reproducir la leucemia, mediante inyección de las células de leucemia extraídas en la etapa anterior en un segundo ratón inmunodeficiente irradiado subletalmente con 1.5 Gys, y la cría de dicho ratón para producir la expansión de dichas células durante 6-8 semanas.
Adicionalmente, se pueden seleccionar LICs con mayor potencial de crecimiento y auto- renovación mediante etapas adicionales de inyección y expansión celular en sucesivos ratones a partir de las células expandidas en el segundo ratón o de las células expandidas en un ratón sucesivo anterior. De este modo, tanto en el segundo ratón como en el ratón sucesivo inyectado o trasplantado se produce el injerto de la célula iniciadora de la leucemia (LIC), permitiendo el mantenimiento, la supervivencia y/o la expansión de dicha LIC.
Según la invención, el injerto in vivo de la célula leucémica se refiere a la expansión de las células leucémicas humanas en los animales trasplantados, preferentemente en la médula ósea, el bazo, el timo, o el hígado.
En el procedimiento anterior, las células de leucemia hacen referencia a células linfoides procedentes preferentemente de la médula ósea o de la sangre periférica, de un individuo o paciente diagnosticado de leucemia linfoblástica aguda, incluyendo LLA-T y/o LLA-B, que pueden expresar o no niveles detectables por citometría de flujo del receptor IL7Ra. Las células linfoides anteriores tras su trasplante en el ratón aumentan la expresión del receptor IL7Ra, lo que indica una ventaja de crecimiento de las células con mayores niveles de expresión de IL7Ra. En el ámbito de la presente invención, el término "célula linfoide" se refiere a una célula humana con marcadores de linfocitos T o de linfocitos B, como por ejemplo, pero no exclusivamente, CD7 o CD19, respectivamente.
En la presente invención, el término "ratón inmunodeficiente" se refiere a un ratón muíante que combina las características del fondo genético NOD/ShiLtJ, la mutación de inmunodeficiencia severa combinada (scid) y la deficiencia de la cadena gamma del receptor de IL-2, común a otras citoquinas, como por ejemplo el ratón muíante NOD/SCID/ycnu" (NSG) obtenido comercialmeníe (The Jackson Laboraíory, Síock number 005557). Como resulíado de esías muíaciones, los raíones NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtmm '/SzJ carecen de células maduras T, B o NK y son deficieníes en señalización por ciíoquinas, lo que deíermina un mejor injerto de células madre hemaíopoyéíicas humanas o células hemaíopoyéíicas de sangre periférica humana, que la obíenida con oirás cepas de ratón. Recientes estudios indican que el modelo NSG tiene una extraordinaria utilidad para los estudios de trasplante de células madre tumorales.
En la presente invención, el término "leucemia primaria humana" se refiere a la LLA-T o LLA-B obtenida de un paciente tras el diagnóstico y previamente a su tratamiento.
Un quinto aspecto de la invención hace referencia al uso del procedimiento de xenotrasplante en ratón anteriormente definido para estudiar clínicamente la efectividad de un tratamiento contra una leucemia linfoblástica aguda, preferentemente en el estudio clínico de la efectividad de un tratamientos con un agente bloqueante de la función de la cadena α del receptor de interleuquina 7 como los definidos anteriormente en la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Ejemplos de realización de la invención
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1 : Las líneas celulares establecidas in vitro a partir de leucemias linfoblásticas agudas humanas expresan receptores IL-7R funcionales que activan las vías de señalización JAK/STAT, PI3K/AKT y MAPK/ERK en respuesta a IL-7.
Datos descritos previamente indican que diferentes líneas celulares establecidas in vitro a partir de leucemias linfoblásticas agudas T y B humanas expresan receptores para IL-7 (IL-7R), aunque son independientes de IL-7 para su crecimiento (Dibirdik et al., 1991 ; De Waele et al., 2001). Un ejemplo de esta característica se muestra en la Figura 1 donde se resume el análisis de la expresión del IL-7R mediante mareaje con un anticuerpo monoclonal (mAb) comercial anti- proteína IL-7Ra humana (BD Biosciences) y citometría de flujo en un panel de 7 líneas celulares LLA-T (KOPTK1 , P12ICHIKAWA, CUTLL1 , SUPT1 , DND41 , HPB-ALL y JURKAT) y tres líneas LLA-B (REH, NALM-6 y HPB-NULL). Como se muestra en la Figura 1A, la expresión del IL-7R es característica de la mayoría de las LLAs analizadas, aunque es heterogénea, observándose líneas con altos niveles de expresión, líneas con niveles de proteína bajos o indetectables, pero positivas para ARNm y líneas con niveles indetectables de proteína y ARNm (Figura 1 B). Estudios moleculares por Western Blot centrados en las tres vías de señalización asociadas al IL-7R, JAK/STAT, PI3K/AKT y MAPK/ERK, demostraron la funcionalidad de los receptores expresados en las líneas leucémicas. En la Figura 1 C se muestra que la activación del IL-7R en respuesta a IL-7 activa las tres vías en la línea LLA-T CUTLL1. Por tanto, las líneas celulares establecidas a partir de leucemias linfoblásticas agudas humanas constituyen un modelo adecuado para el estudio de la función del IL-7R. EJEMPLO 2: La expresión de IL-7R en leucemias linfoblásticas agudas primarias LLA-T y LLA-B humanas confiere una ventaja de expansión in vivo a las células leucémicas.
Para analizar la posible contribución de la expresión del IL-7R a la fisiopatología de la leucemia LLA humana, primeramente se analizó la expresión del IL-7R en diversas muestras de leucemias primarias humanas obtenidas de la sangre y/o la médula ósea (MO) de pacientes diagnosticados de LLA-T o LLA-B. Tras el mareaje con el mAb anti-IL-7Ra y análisis por citometría de flujo, se confirmó la expresión del IL-7R en las tres leucemias LLA-T (Figuras 2, 3) y en las cuatro leucemias LLA-B (Figura 4A) primarias analizadas, aunque se detectaron niveles variables de expresión.
Seguidamente se analizó la relevancia fisiopatológica in vivo de la expresión constitutiva del IL- 7R en las leucemias LLA-T y LLA-B primarias. Para ello, se utilizó un sistema experimental de xenotrasplante de células leucémicas en ratones inmunodeficientes NOD/SCID/ycnu" (NSG) (The Jackson Laboratory, Stock number 005557), que constituye un modelo similar al descrito para un tipo de leucemias de origen mieloide distinto de las LLA (DOI 1). Estos ratones combinan las características del fondo genético NOD/ShiLtJ, la mutación de inmunodeficiencia severa combinada (scid) y la deficiencia de la cadena gamma del receptor de IL-2, común a otras citoquinas. En las especificaciones técnicas de The Jackson Laboratory se indica que el resultado de estas mutaciones es un ratón NOD.Cg- Prkdcscid ll2rgtm1Wil/SzJ, que carece de células maduras T, B o NK y es deficiente en señalización por citoquinas, lo que determina un mejor injerto de células madre hematopoyéticas humanas o células hematopoyéticas maduras de sangre periférica humana, que la obtenida con otras cepas de ratón. El modelo NSG es asimismo idóneo para los estudios de trasplante de células madre tumorales. Se utilizó, por tanto, este modelo para analizar el potencial tumoral in vivo de las células leucémicas primarias procedentes de la médula ósea o sangre de los pacientes, y la contribución de las células que expresan IL-7R a la expansión tumoral (Figura 3A). Las células leucémicas (106) se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) en el seno orbital de ratones inmunodeficientes NSG de 6-8 semanas de edad, irradiados subletalmente con 1.5 Gy. En algunos experimentos se corroboraron los resultados en otros modelos de ratones inmunodeficientes como los Rag2-/-xyc-/-. En el ejemplo de la Figura 3B se muestra que los ratones trasplantados con una leucemia LLA-T (T-ALL5) desarrollaron leucemia in vivo tras un periodo de 1 1 a 14 semanas post-trasplante, observándose un alto porcentaje (alrededor del 80%) de células leucémicas LLA-T derivadas del paciente en el bazo, la médula ósea y el timo de los ratones, y una menor proporción (14%) en la sangre. La leucemia mostró un fenotipo CD4+CD8+ similar al fenotipo de las células leucémicas del paciente, lo que indica que el modelo de xenotrasplante es muy eficiente para propagar y expandir células leucémicas LLA-T humanas (Figura 3B). El hallazgo más novedoso fue la observación de que las poblaciones leucémicas expandidas in vivo en todos los órganos analizados estaban enriquecidas en células positivas para la expresión del IL-7R, y con niveles de expresión incrementados en comparación con la población del paciente trasplantada en los ratones (Figura 3B).
La misma estrategia se utilizó para valorar la contribución del IL-7R a la expansión in vivo de leucemias LLA-B humanas primarias. Se utilizaron las cuatro LLA-B primarias mostradas en la Figura 4A. Los resultados obtenidos para una de ellas se muestran como ejemplo en la Figura 4B, donde se observa que, al igual que en las LLA-T, las células de la LLA-B primaria que injertan y se expanden eficientemente in vivo en los diferentes órganos de los animales trasplantados representan una población enriquecida en células que expresan elevados niveles del IL-7R en su superficie, significativamente superiores a los de las células aisladas del paciente (Figura 4B).
En conclusión, los datos indican que las células leucémicas de las LLA-T y LLA-B que se expanden con mayor eficiencia in vivo son aquellas que expresan mayores niveles del IL-7R, lo que revela una importante función del IL-7R en la progresión tumoral.
EJEMPLO 3: Expresión constitutiva de altos niveles del IL-7R en LICs de leucemia linfoblástica aguda LLA-T humana.
Los resultados mostrados en el Ejemplo 2 sugieren que la expresión del IL-7R puede ser un marcador funcional de las LICs, o células iniciadoras de la leucemia, en las leucemias linfoblásticas agudas humanas. Las dos características de las LICs son su capacidad de auto- renovación y su potencial de injertar y reproducir la leucemia de forma permanente. Estas funciones son propias de aquellas células que mantienen su potencial leucémico in vivo tras sucesivos trasplantes. Para analizar si las células IL-7R+ de las LLAs poseen las funciones propias de las LICs, realizamos dos trasplantes sucesivos de estas leucemias en ratones NSG, según el procedimiento de xenotrasplante sucesivo en ratón descrito en la descripción detallada de la invención. En la Figura 5 se muestran los resultados de los trasplantes realizados con tres leucemias LLA-T primarias obtenidas de la sangre de los pacientes (T-ALL5, T-ALL8 y T-ALL9), que se trasplantaron por vía intravenosa (0.5-1x106 células) en ratones NSG de 6-8 semanas de edad irradiados subletalmente con 1.5 Gy. A las 8-10 semanas pos-trasplante, las células leucémicas se aislaron de las MO de los ratones y se transplantaron de nuevo (0.5-1x106 células) en ratones NSG. Transcurridas 8-10 semanas del segundo trasplante, se analizaron las células leucémicas humanas en los diferentes órganos del ratón observándose que, en todas las leucemias analizadas, las células que se expanden in vivo en los animales tras los dos trasplantes sucesivos se enriquecen progresivamente en células positivas para el IL-7R con niveles incrementados de expresión en la membrana. Por tanto, las células IL-7R+ de la LLA-T son además LICs cuya ventaja de expansión tumoral se revela in vivo por xenotrasplantes sucesivos. Por analogía, y conforme a los datos de la Figura 4, las células IL-7R+ expandidas in vivo a partir de leucemias LLA-B deben incluir LICs y, conforme a la expresión del IL7R en linfomas (Daloul et al., 1992), se prevé la existencia de LICs con IL-7R funcionales para los linfomas T y B.
EJEMPLO 4: Eficiente inhibición de la expresión del IL-7R in vitro en líneas celulares de leucemias LLA-T humanas mediante silenciamiento del gen IL7R que codifica para la cadena IL-7Ra por transduccion con vectores lentivirales portadores de shRNAs.
La expresión constitutiva del IL-7R en las LICs de las LLAs humanas sugiere que estos receptores pueden ser relevantes dianas funcionales susceptibles de manipulación terapéutica. Para analizar de forma directa la contribución del IL-7R a la capacidad tumoral de las LLA-T, se eliminó la expresión del IL-7R en líneas celulares ALL siguiendo estrategias de silenciamiento de gen IL7R mediante transduccion con vectores lentivirales que contienen horquillas o "short hairpins" de ARN (shRNA), capaces de inducir específicamente la degradación del ARNm del gen IL7R que codifica para la cadena IL-7Ra, o de bloquear la traducción proteica. Se analizó independientemente el efecto de cinco shRNAs distintos (sh1-5) obtenidos comercialmente (SIGMA) con secuencias SEQ ID No. 3-7, y complementariedad en diferentes zonas del ARNm del IL7R (Figura 6A), sobre la expresión en la membrana de la proteína IL-7Ra. Como control, se utilizaron las mismas células transducidas con un vector lentiviral portador de un shRNA irrelevante o "scrumble" (shsc) con secuencia SEQ ID No. 8.
Mediante citometría de flujo se observó que tres de los cinco shRNAs (sh2 o SEQ ID No. 4, sh4 o SEQ ID No. 6, y sh5 o SEQ ID No. 7) eran capaces de inducir el silenciamiento de IL-7Ra a nivel proteico en más del 90% de las células CUTLL1 y SUPT1 , mientras que sh1 con SEQ ID No. 3 y sh3 con SEQ ID No. 5, no fueron igualmente eficientes (Figura 6B, C). En la línea HPB- ALL, los shRNAs inhibidores sh2, sh4 y sh5, silenciaron la expresión de la proteína IL-7Ra en una población minoritaria (Figura 6C), aunque el silenciamiento a nivel de ARNm fue más acusado (Figura 6D). A pesar de este efecto parcial, las células HPB-ALL silenciadas en las que pudo detectarse IL-7R en la membrana mostraron niveles de expresión significativamente menores que los controles (Figura 6E, izqda.), y estos niveles parecían ser insuficientes para inducir una respuesta óptima a la IL-7, a juzgar por la deficiente fosforilación de su efector STAT5 (Figura 6E, dcha.). Por tanto, es posible silenciar de forma estable la expresión del IL-7R y bloquear su función in vitro en líneas celulares leucémicas mediante la transduccion de shRNAs. EJEMPLO 5: Eficiente silenciamiento in vivo de la expresión del IL-7R en líneas celulares de leucemias LLA-T y LLA-B: Inhibición de la expansión celular y la diseminación in vivo.
Para analizar la eficiencia in vivo de la estrategia de silenciamiento diseñada, utilizamos una adaptación del sistema de xenotrasplante descrito en la descripción detallada de la invención, consistente en la inyección subcutánea de líneas celulares leucémicas humanas LLA-T y LLA-B (2-5x106 células) en el flanco derecho de ratones NSG. En este sistema se generan tumores subcutáneos que llegan a colonizar los órganos linfoides secundarios y finalmente establecen metástasis en diferentes órganos, entre ellos el sistema nervioso central, lo que recapitula los eventos que se suceden en los pacientes de LLA. Las líneas tumorales humanas LLA-T y LLA-B en estudio se infectaron con los vectores lentivirales portadores del shRNA frente al IL7R (sh5, SEQ ID No. 7) o del control shsc (SEQ ID No. 8), utilizando en ambos casos GFP como marcador. Tras la infección, las células se trasplantaron en ratones inmunodeficientes en los que se analizó el injerto y crecimiento de tumores sólidos subcutáneos a lo largo del tiempo.
En el caso de las LLA-T, se utilizaron dos líneas que expresan altos niveles del IL-7R: CUTLL1 y HPB-ALL (Figura 1A). Los porcentajes de transducción (% de células GFP+) de las líneas CUTLL1 o HPB-ALL trasplantadas fueron mayores del 50% y la transducción con sh5 resultó siempre en una disminución significativa de los niveles de expresión del IL-7R en la membrana (Figura 7A, D). En las Figuras 7B y 7E se muestra que todos los ratones inyectados con células LLA-T con expresión constitutiva del IL-7R, transducidas con sh5 (SEQ ID No. 7) o con shsc (SEQ ID No. 8), desarrollaron tumores con cinéticas similares, que fueron palpables a partir de la tercera o cuarta semana post-trasplante. Sin embargo, la composición de los tumores en ambos casos fue distinta. Los tumores generados en ratones trasplantados con células HPB-ALL (Figura 7B) o CUTLL1 (Figura 7E) transducidas con sh5 (SEQ ID No. 7) estaban constituidos casi exclusivamente por células no transducidas, negativas para GFP (75-90%), que conservaban la expresión del IL-7R en la superficie celular. En efecto, las células GFP+ silenciadas con sh5 (SEQ ID No. 7) prácticamente desaparecieron in vivo en estos animales, lo que pone de manifiesto su reducido potencial tumoral. Es importante destacar que, aunque se detectó una pequeña población residual de células GFP+ transducidas con sh5 en los tumores generados in vivo, estas células expresaban niveles significativamente reducidos, aunque detectables, del IL-7R, con respecto a las células no transducidas o a los controles shsc (Figura 7C, panel inferior), lo que demuestra la eficiencia del silenciamiento in vivo. Por el contrario, los tumores derivados de las líneas transducidas con el shsc control (SEQ ID No. 8) mantenían una relación constante de células GFP+ y GFP- indicativa de un potencial oncogénico equivalente al de las células transducidas control y las no transducidas (Figura 7B, C y 7E, F). La misma estrategia se utilizó para analizar el efecto del silenciamiento del IL-7R en células leucémicas LLA-B con expresión constitutiva del IL-7R, utilizando como modelo la línea NALM-6 (Figura 1), transducida con vectores portadores de sh5 (SEQ ID No. 7) o shsc control (SEQ ID No. 8) (Figura 8). Los resultados fueron idénticos a los obtenidos con las líneas LLA-T, ya que todos los animales desarrollaron tumores, pero la población transducida con sh5 contribuyó de forma muy minoritaria a la generación tumoral in vivo, en comparación con las células no transducidas o transducidas con el vector control portador de shsc. De nuevo, la población residual portadora de sh5 mostró niveles reducidos de expresión del IL-7R (Figura 8C, D). Por tanto, la estrategia de silenciamiento del IL-7R con shRNAs es eficiente in vivo y, más importante, demuestra la participación del IL-7R en la expansión leucémica in vivo de líneas celulares LLA-T y LLA-B capaces de proliferar in vitro de manera independiente de IL-7 y/o TSLP.
EJEMPLO 6. La inhibición de la expresión constitutiva del IL-7R en leucemias primarias LLA-T humanas constituye una eficiente estrategia terapéutica para bloquear el injerto y la expansión tumoral de la LLA-T in vivo.
Se desconoce cuál es la contribución del IL-7R que se expresa constitutivamente en las leucemias LLA primarias humanas al mantenimiento y expansión de la leucemia in vivo. Para aclarar este aspecto, se establecieron modelos preclínicos de xenotrasplante de leucemias LLA, en las que se silenció la expresión del IL-7R por transducción con shRNA. Se utilizaron células leucémicas procedentes de pacientes diagnosticados de LLA-T transducidas con el shlL-7R sh5 (SEQ ID No. 7) previamente a su trasplante en ratones inmunodeficientes NSG. Como control se usaron las mismas leucemias transducidas con shsc (SEQ ID No. 8). Por restricción en el número de células primarias disponibles, algunos experimentos se realizaron con células leucémicas de la sangre de los pacientes (106) que se trasplantaron y expandieron in vivo durante 11-14 semanas por xenotrasplante en ratones inmunodeficientes. Las células expandidas en la MO de estos ratones se aislaron y se transdujeron con vectores lentivirales portadores de sh5 (SEQ ID No. 7) o shsc (SEQ ID No. 8) en co-cultivos con estroma OP9-DL4 suplementados con IL-7 y, posteriormente, se trasplantaron en nuevos ratones (Figura 9A). Se observó que las eficiencias de transducción lentiviral (y también retroviral, datos no mostrados) se incrementaba considerablemente al usar células humanas ex vivo recién extraídas de los pacientes o expandidas en los ratones, en comparación con las células criopreservadas de los pacientes (Figura 9B, D). Los datos obtenidos con dos leucemias independientes, T-ALL5 y T- ALL8, mostraron que el silenciamiento del IL-7R resultaba en un bloqueo dramático del injerto y de la expansión tumoral de las leucemias primarias in vivo en diferentes órganos del ratón (médula ósea, bazo, hígado, timo), en comparación con las leucemias transducidas con shsc control (Figura 9C,E). Por tanto, el silenciamiento del IL-7R en leucemias primarias T-ALL que expresan constitutivamente el IL-7R constituye una eficiente estrategia terapéutica para inhibir el injerto y la expansión leucémica in vivo. En consecuencia, la mera expresión del receptor IL-7R en la membrana de las células LLA-T y/o la unión de la IL-7 al IL-7R expresado en la LLA-T son cruciales para la expansión leucémica in vivo.
EJEMPLO 7. La función del IL7R en leucemias linfoblásticas agudas humanas LLA-T y LLA-B puede ser bloqueada mediante el empleo de anticuerpos monoclonales anti-IL7Ra en lo que lo convierte en una diana terapéutica.
Los datos proporcionados en el Ejemplo 6 sugieren la posibilidad de que la expresión del IL-7R en las células primarias de la LLA-T es funcionalmente relevante para la expansión leucémica in vivo debido a su capacidad de unión a la IL-7 producida in vivo en el modelo de xenotrasplante y de transmisión de las correspondientes señales de proliferación celular. Para analizar esta posibilidad se examinó la capacidad de proliferación de las leucemias LLA tras el bloqueo de la unión de IL-7 al IL-7R con un anticuerpo monoclonal obtenido comercialmente, dirigido frente a la cadena IL-7Ra (Imgenex, clon R34-34). En primer lugar, corroboramos la capacidad bloqueante del anticuerpo en progenitores intratímicos de linfocitos T humanos (timocitos en el estadio DN2), que expresan altos niveles del IL-7R y son dependientes de IL-7 para su proliferación (Figura 10A). El tratamiento con el anticuerpo inhibió la señalización celular inducida por IL-7 (Figura 10B), así como la proliferación in vitro de los timocitos DN2 en co- cultivos con estroma OP9-DL4 e IL-7 (Figura 10C). Asimismo, el anticuerpo resultó muy eficiente bloqueando la unión de IL-7 al IL-7R en la línea celular HPB-ALL en la que inhibió drásticamente la activación de la vía JAK STAT5 en respuesta a la IL-7 (Figura 10D), aunque no afectó la viabilidad celular (Figura 10E) o la capacidad de proliferación (Figura 10F) de las células HPB- ALL in vitro, como era esperable, debido a su independencia de IL-7.
Una vez comprobada la función bloqueante del anticuerpo anti-IL-7Ra R34-34, analizamos su efecto sobre la proliferación de células leucémicas primarias en respuesta a IL-7 en el sistema OP9-DL4. Utilizamos células de una LLA-T (T-ALL5) con niveles altos de expresión del IL-7R (Figura 5) y observamos que el Ac anti-IL-7Ra inhibía significativamente la proliferación de estas células en respuesta a la IL-7 (Figura 10G H). Por tanto, la unión de la IL-7 a su receptor expresado constitutivamente en leucemias LLA primarias desempeña una relevante función en la expansión leucémica, que puede ser inhibida mediante el tratamiento con anticuerpos anti- IL- 7Ra, lo que indica que el receptor IL-7Ra es una relevante diana de intervención terapéutica.
Lista de secuencias de la invención SEQ ID No. 1 : Gen IL-7R. Secuencia codificante del ARN mensajero de la cadena alfa del receptor de la interleuquina 7 humana (IL7R). Tipo de secuencia: cDNA. Longitud de la secuencia: 1809 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Homo sapiens. Base de datos del NCBI. (Número de acceso: NM_002185.2). Región codificante: aminoácidos 90-1469.
SEQ ID No. 2: Proteína IL-7R. Secuencia polipeptídica de la cadena alfa del receptor de la interleuquina 7 humana (IL7R). Tipo de secuencia: Proteína. Longitud de la secuencia: 459 aminoácidos. Origen de la secuencia: Homo sapiens. Base de datos del NCBI. (Número de acceso: NP_002176.2).
SEQ ID No. 3: shRNAl (sh1). Secuencia de nucleótidos del shRNA número 1 frente a la cadena alfa del IL-7R. Tipo de secuencia: RNA. Longitud de la secuencia: 58 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Secuencia artificial (Sigma-Aldrich, TRCN0000058228). Secuencias complementarias al gen de IL-7Ra que conformaran la horquilla de RNA: aminoácidos 5-25 y aminoácidos 32-53. Región complementaria del gen IL-7Ra: aminoácidos 679-699 de la SEQ. ID. No 1.
SEQ ID No. 4: shRNA2 (sh2). Secuencia de nucleótidos del shRNA número 2 frente a la cadena alfa del IL-7R. Tipo de secuencia: RNA. Longitud de la secuencia: 58 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Secuencia artificial (Sigma-Aldrich, TRCN0000058229). Secuencias complementarias al gen de IL-7Ra que conformaran la horquilla de RNA: aminoácidos 5-25 y aminoácidos 32-53. Región complementaria del gen IL-7Ra: aminoácidos 272-292 de la SEQ. ID. No 1.
SEQ ID No. 5: shRNA3 (sh3). Secuencia de nucleótidos del shRNA número 3 frente a la cadena alfa del IL-7R. Tipo de secuencia: RNA. Longitud de la secuencia: 58 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Secuencia artificial (Sigma-Aldrich, TRCN0000058230). Secuencias complementarias al gen de IL-7Ra que conformaran la horquilla de RNA: aminoácidos 5-25 y aminoácidos 32-53. Región complementaria del gen IL-7Ra: aminoácidos 1369-1416 de la SEQ. ID. No 1.
SEQ ID No. 6: shRNA4 (sh4). Secuencia de nucleótidos del shRNA número 4 frente a la cadena alfa del IL-7R. Tipo de secuencia: RNA. Longitud de la secuencia: 58 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Secuencia artificial (Sigma-Aldrich, TRCN0000058231). Secuencias complementarias al gen de IL-7Ra que conformaran la horquilla de RNA: aminoácidos 5-25 y aminoácidos 32-53. Región complementaria del gen IL-7Ra: aminoácidos 1 174-1194 de la SEQ. ID. No 1. SEQ ID No. 7: shRNA5 (sh5). Secuencia de nucleotidos del shRNA número 5 frente a la cadena alfa del IL-7R. Tipo de secuencia: RNA. Longitud de la secuencia: 58 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Secuencia artificial (Sigma-Aldrich, TRCN0000058232). Secuencias complementarias al gen de IL-7Ra que conformaran la horquilla de RNA: aminoácidos 5-25 y aminoácidos 32-53. Región complementaria del gen IL-7Ra: aminoácidos 390-410 de la SEQ. ID. No 1.
SEQ ID No. 8: shRNA scumble (shsc). Secuencia de nucleotidos de un shRNA que no reconoce ningún gen humano ni de ratón. Tipo de secuencia: RNA. Longitud de la secuencia: 58 bases nucleotídicas. Origen de la secuencia: Secuencia artificial (Sigma-Aldrich, SHC002). Secuencias que conformaran la horquilla de RNA: aminoácidos 5-25 y aminoácidos 32-53.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un agente bloqueante de la función de la cadena α del receptor de interleuquina 7 (IL-7Ra) humano codificada por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 para su uso en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento útil para la prevención y/o el tratamiento de una leucemia linfoblástica aguda humana o de un linfoma humano.
2. El agente bloqueante según la reivindicación 1 , donde dicho agente bloqueante se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-IL7Ra capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente con la proteína IL-7Ra humana codificada por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 , un fragmento de dicho anticuerpo responsable de la unión a IL-7Ra del anticuerpo, un vector de silenciamiento génico que comprende una secuencia oligonucleotídica complementaria al gen IL7R, y cualquier combinación de los mismos.
3. El agente bloqueante según la reivindicación 2, donde el anticuerpo es monoclonal.
4. El agente bloqueante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
5. El agente bloqueante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde dicho anticuerpo inhibe la unión de la IL-7 con la proteína IL-7Ra humana codificada por el gen IL7R con SEQ ID No. 1 y neutraliza su función biológica.
6. Una composición farmacéutica y/o medicamento caracterizada/o por comprender al menos una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente bloqueante definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una leucemia linfoblástica aguda humana T y/o B o de un linfoma humano.
7. La composición farmacéutica y/o medicamento según la reivindicación 6 caracterizada/o por que comprende además al menos un vehículo, y/o un excipiente, y/o un aditivo farmacéuticamente aceptable.
8. Método de prevención y/o tratamiento de una leucemia linfoblástica aguda humana y de un linfoma humano caracterizado por que comprende la administración a un individuo en necesidad de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente bloqueante definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición farmacéutica y/o medicamento definida/o en una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.
9. Un procedimiento de xenotrasplante en ratón para la supervivencia y expansión de una célula leucémica caracterizado por que comprende injertar in vivo una célula leucémica derivada de un individuo con leucemia linfoblástica aguda o linfoma en un modelo de ratón inmunodef ¡cíente, donde dicha célula aumenta la expresión del receptor IL7Ra tras el trasplante, y criar al ratón injertado.
10. Uso del procedimiento de xenotrasplante en ratón definido en la reivindicación 9 para identificar, mantener y crecer una célula iniciadora de la leucemia (LIC) que expresa el receptor IL7Ra proveniente de un individuo con leucemia linfoblástica aguda o con linfoma.
11. Uso del procedimiento de xenotrasplante en ratón definido en la reivindicación 9 para estudiar clínicamente la efectividad de un tratamiento contra una leucemia linfoblástica aguda o un linfoma.
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