WO2014096688A2 - Signature prédictive de la capacité de biominéralisation d'une huître perlière donneuse de greffons - Google Patents

Signature prédictive de la capacité de biominéralisation d'une huître perlière donneuse de greffons Download PDF

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pearl
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donor
oyster
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Caroline Joubert
Alexandre TAYALE
Caroline MONTAGNANI
Denis SAULNIER
Yannick Gueguen
David Piquemal
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Ifremer (Institut Français De Recherche Pour L'exploitation De La Mer)
Direction Des Ressources Marines
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the field of pearl farming.
  • the present invention more specifically relates to a predictive signature of the biomineralization capacity of a pearler oyster donor grafts.
  • the present invention also relates to a pearl oyster with high biomineralization capacity comprising the signature according to the invention.
  • Pearl culture is a human activity consisting of the cultivation, in the wild, of pearl oysters Pinctada sp for the production of cultured pearls.
  • the graft is a surgical operation in which the graft, a portion of the mantle of the donor oyster (about 4 mm 2 ) is inserted into the pearl pocket of the recipient oyster, in combination with a pearl ball, the nucleus .
  • the mineralizing epithelial border of the graft multiplies and lines the pearl pocket to form the pearl sac that encompasses the nucleus.
  • Said pearl bag deposits layers of mother-of-pearl around the nucleus, thus forming the pearl (Cochennec-Laureau et al, Aquatic Living Resource, 2010: 23, 131-140).
  • US Pat. No. 7,163,795 describes a method for identifying oysters capable of expressing the Nacrein protein (a protein constituting mother-of-pearl and potentially involved in the biomineralization process), which can be used in pearl farming.
  • This patent also describes a method for identifying optimal conditions for pearl formation, said method comprising analyzing the expression of Nacrein.
  • pearl farming is traditionally practiced in the open sea, it is difficult to adapt crop conditions.
  • Inoue et al. have described the relationship between the quality of the pearl produced and the gene expression profile of six genes involved in biomineralization within the pearl sac (Inoue et al., Zoological Science, 2011, 28: 32-6; Inoue et al. Mar Biotechnol, 2011, 13: 48-55).
  • the results presented by Inoue et al. are the first demonstration that the level of expression of a gene involved in biomineralization processes can be correlated with the quality of the pearl obtained.
  • the inventors carried out a large scale transcriptomic and proteomic study, and analyzed the relationship between (1) the gene expression profile and (2) the quality and growth (mother of pearl thickness) of the pearl during a transplant Experimental. This study allowed them to identify a particular genetic signature predictive of pearl quality.
  • the present invention therefore relates to a predictive signature of the biomineralization capacity of a donor oyster donor, said signature comprising the expression profile of at least two biomarkers comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 1 at SEQ ID NO: 42, their variants and fragments.
  • said signature is predictive of the commercial quality of the pearls obtained and / or the pearlescent deposit rate around the nucleus by using said donor oyster.
  • the present invention also relates to a predictive signature of the commercial quality of the beads obtained using a donor oyster and / or the rate of pearlescent deposition around the nucleus using said donor oyster, said signature comprising the expression profile in the coat of said donor oyster having at least one biomarker comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 18, 23, 26, 27, 28, 36, 39, 40 and 42, their variants and fragments.
  • the signature of the invention comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 3, 4, 5, 11 and 14, their variants and their fragments, and said signature. is predictive of the commercial quality of the beads obtained using said donor oyster.
  • the signature of the invention comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 8, 18, 23, 26, 27, 36, 39 or 40, their variants and their fragments, and said signature is predictive of the pearly deposition rate around the nucleus using said donor oyster.
  • the signature of the invention comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 28 or 42, their variants and their fragments, and said signature is furthermore predictive of the number surface defects of the beads obtained using said donor oyster.
  • Another object of the invention is an oyster donor graft of high biomineralization capacity, characterized in that it has a predictive signature as defined above.
  • the present invention also relates to a method for identifying a donor oyster according to the invention, in which:
  • the present invention also relates to a method for selecting a donor oyster according to the invention, in which:
  • step (b) comparing the level of expression obtained in step (a) with a level of control expression.
  • Another object of the invention further relates to a kit for carrying out the method according to the invention, comprising means for determining the expression profile of at least one biomarker as described in the present invention.
  • said means make it possible to determine the expression profile at the transcriptomic level by RT-PCR, RT-qPCR, quantitative high-throughput PCR.
  • said means make it possible to determine the expression profile at the protein level.
  • Another subject of the invention is a graft characterized in that it has a predictive signature as defined above, said graft being a part of the mantle epithelium of a donor oyster according to the invention.
  • the invention also relates to a recipient oyster grafted with a graft as defined above, in which a nucleus is present.
  • the invention furthermore relates to a method for producing at least one pearl of superior quality, comprising culturing at least one recipient oyster according to the invention, said oyster comprising the predictive signature of the invention and / or having been identified according to the method of identifying and / or selecting oyster according to the invention; as well as the pearl obtained by said process.
  • the invention further relates to a biomarker predictive of the biomineralization capacity of a donor donor oyster, said biomarker comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and their fragments.
  • the invention also relates to the use of at least one biomarker comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and their fragments, to determine the ability of biomineralization of a donor oyster.
  • the biomarker is selected from the list consisting of SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 18, 23, 26, 27, 28, 36, 39, 40 and 42, their variants and their fragments.
  • the invention also relates to the use of at least one biomarker selected from the sequences SEQ ID NO: 3, 4, 5, 11 and 14, preferably of the sequence SEQ ID NO: 4, for predicting the capacity of a Oyster donor graft to produce pearls of high commercial quality.
  • the invention also relates to the use of at least one biomarker selected from the sequences SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 42, preferably the sequence SEQ ID NO: 28 for predicting the capacity of a graft donor oyster. producing pearls with a low number of surface defects.
  • the invention also relates to the use of at least one biomarker selected from the sequences SEQ ID NO: 8, 18, 23, 26, 27, 36, 39 and 40, for predicting the ability of a donor oyster graft to produce pearls with a low number of surface defects.
  • pearl culture human activity for pearl oyster culture pearl production generally belonging to the genus Pinctada sp.
  • the oyster belongs to the genus Pinctada sp., Preferably to the species Pinctada fucata, Pinctada maxima or Pinctada margaritifera.
  • predictive biomarker of the high biomaterializing capacity of a donor oyster is meant a nucleotide sequence, preferably a gene, whose expression profile in a donor oyster is predictive of the high biomaterialization capacity of said donor pearl oyster, and therefore is predictive of the quality of pearls produced using this pearl oyster as donor of grafts.
  • the predictive biomarker of the invention comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the 42 nucleotide sequences of Table 1 below, their variants and their fragments:
  • the predictive biomarker of the invention comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the following nucleotide sequences, their variants and fragments: CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), mpl I-2 SEQ ID NO: 28), C75bis (SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40), and Protinh2-1 (SEQ ID NO: 42).
  • CALC-1 SEQ ID NO: 3
  • CLEC3-1 SEQ ID NO: 4
  • DERM-2 SEQ ID NO: 5
  • MUCO-2 SEQ
  • the fragments are nucleic acid sequences of more than 25 nucleotides, preferably of more than 50, 100, 150, 200 or more than 500 nucleotides.
  • a fragment of a sequence SEQ ID NO: X corresponds to a nucleotide sequence of more than 25 contiguous nucleotides, preferably of more than 50, 100, 150, 200 or more than 500 nucleotides. contiguous of SEQ ID NO: X.
  • a variant of a sequence SEQ ID NO: X is understood to mean any nucleic acid sequence comprising more than 25 nucleotides, preferably greater than 50, 100, 150, 200 or more than 500 contiguous nucleotides of a nucleotide sequence SEQ ID NO: X.
  • the term "variant of a sequence SEQ ID NO: X" is understood to mean a sequence comprising the sequence SEQ ID NO: X and between 1 to 500, preferably 1 to 200, more preferably 1 to 100 additional 5 'and / or 3' nucleic acids.
  • the term "variant of a sequence SEQ ID NO: X" is intended to mean a sequence exhibiting minor structural modifications and retaining the function of SEQ ID NO: X.
  • minor structural modifications include but not limited to deletions, substitutions or additions of bases, affecting 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nucleic acids.
  • the term "variant of a sequence SEQ ID NO: X” refers to a nucleotide sequence comprising more than 25, preferably of 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 or 3000 nucleotides having an identity of more than 75%, 80%, 90%, 95%, or more than 96%, 97%, 98%, 99% with the sequence SEQ ID NO: X.
  • identity corresponds to a percentage of identity between two (or more than two) sequences. This percentage is defined as the number of positions for which the bases are identical when the sequences are optimally aligned, divided by the total number of bases of the smaller of the two sequences. The differences between the sequences can be divided randomly and over all their lengths.
  • Two sequences are said to be optimally aligned when the percentage of identity is maximum. Moreover, as will become clear to those skilled in the art, it may be necessary to use additions of gaps (gaps) so as to obtain an optimal alignment between the two sequences.
  • the percentage identity between two nucleic acid sequences can therefore be determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid sequence to be compared can comprise additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is then calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and by multiplying the result obtained. by 100 to get the percentage of identity between these two sequences.
  • the methods of determining the identity are designed to give the greatest possible concordance between the compared sequences.
  • the percentage of identity can be determined by a particular mathematical model or by a computer program (generally referred to as an "algorithm"). Methods for calculating identity between nucleotide sequences are well known to those skilled in the art.
  • Non-limiting examples of such methods include those described in the following documents: Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, eds., Academy Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data Part 1, Griffin, AM, and Griffin, HG, eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academy Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073 (1988).
  • Methods of determining identity have been described in publicly available computer programs.
  • Preferred examples of methods using computer programs include, but are not limited to, the GCG software package, including GAP (Devereux et al., Nucl. Acid Res., 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol Biol 215, 403-410 (1990)).
  • the BLASTX program is available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al NCB / NLM / NIH Bethesda, Md 20894, Altschul et al., Supra).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the Smith-Waterman algorithm which is well known to those skilled in the art, can also be used to determine the percent identity between two sequences.
  • Predictive signature means a particular gene expression pattern, the presence of which in a donor pearl oyster is predictive of the high biomineralization capacity of said donor oyster, and therefore is predictive of the quality of the pearls produced and / or or the nacreous deposition rate around the nucleus using this donor oyster.
  • the predictive signature of the invention comprises from 1 to 42 predictive biomarkers as described above.
  • donor oyster high biomineralization capacity is meant a oyster donor grafts for obtaining high quality pearls, and / or obtaining faster pearls of higher quality.
  • a donor oyster of high biomineralization capacity makes it possible to obtain a pearl having a mother-of-pearl thickness around the core of greater than or equal to 0.8 mm, preferably greater than or equal to 1.5 mm, less 24 months, preferably in less than 21 months, more preferably in less than 18 months.
  • the donor oyster with a high biomineralization capacity of the invention leads to 100% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than 0.8 mm after 18 months of culture, and / or or obtaining 30.2% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than 1.5 mm after 18 months of culture. By comparison, in the absence of donor oyster selection, these percentages are respectively 80.9 and 13.4%.
  • pearls of superior quality is meant a pearl having a nacre thickness characteristic around the nucleus (obtaining a pearlescent deposit around the larger nucleus with the same culture time), and / or a number of defects. at the surface, and / or commercial grade above or below predetermined thresholds.
  • the quality of a pearl can be evaluated by 3 variables: a variable "mother of pearl thickness", a variable “number of defects on the surface of pearls", and a variable "commercial quality”.
  • a donor oyster of high biomineralization capacity is an oyster having at least one predictive biomarker according to the invention and / or at least one predictive signature of the invention.
  • the pearl thickness of a pearl corresponds to the thickness in millimeters of mother-of-pearl around the nucleus of the pearl. This can be measured, for example, by subtracting the diameter of the nucleus to the smallest diameter of the bead and dividing the difference in diameter by 2.
  • the diameters of the beads and nuclei can be measured by computer from scanned pearls and nucleus images.
  • a non-limiting example of analysis software that can be used to measure pearl size and nucleus is the ImageJ software.
  • a pearl of superior quality has a mother-of-pearl thickness of more than 0.8 mm, preferably of more than 1.2 mm, even more preferably of more than 1.5 mm.
  • the estimation of the quality of the pearls according to the number of defects corresponds to the classification of each pearl in a classification comprising 4 classes, according to the number of defects observed on their surface.
  • the defects taken into consideration for this classification are punctures, blisters and comets.
  • the first class comprises flawless beads; the second class comprises pearls having 1 to 5 defects; the third class includes pearls with more than 5 defects and the fourth class includes pearls completely covered with defects.
  • a pearl of superior quality belongs to the first class relating to the number of defects, i.e. has no defect.
  • the commercial quality of the pearl is assessed according to the surface condition (presence or absence of imperfections) and the luster (shine or brilliance) of the pearl, according to the definition given in the Deliberation No. ° 2005-42 of 4 February 2005 (Official Journal of Polynesia). According to this deliberation, the appreciation of the quality of the pearl corresponds to the classification of the pearls in 5 categories of quality, from class A to class D and to the class "Rebut". According to one embodiment of the invention, a pearl of superior quality belongs to class A.
  • the term "approximately”, placed before a number, means plus or minus 10% of the nominal value of this number.
  • the subject of the present invention is a pearly pearl oyster with a high biomineralization capacity.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, even more preferably more than about 95% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than or equal to about 0.8 mm, preferably greater than or equal to about 1.2 mm, more preferably greater than or equal to about 1.5 mm .
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain 100% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than or equal to approximately 0.8 mm, after a culture period of approximately 15 months. preferably about 16 months, more preferably about 18 months.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain more than approximately 30% of pearls having a mother-of-pearl thickness greater than or equal to approximately 1.5 mm, after a period of culture. about 15 months, preferably about 16 months, more preferably about 18 months.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, 30, 40 , 50, 60, 70, 80, 90% pearls with no surface defects.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain from about 10 to 20%, preferably from about 12.5 to 17.5%, more preferably from about 14.3% of pearls. showing no surface defects.
  • the inventors have shown that the donor oysters usually used graft allow only about 5.2% of pearls having no surface defects.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain more than 5%, preferably more than 10%, 20%, more preferably more than 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90% of pearls of category A and / or B.
  • donor oysters high biomineralization capacity allow to obtain about 10 to 50%, preferably about 20 to 30%, more preferably about 24.3% of Category A.
  • the donor oysters having a high biomineralization capacity make it possible to obtain from about 25 to 70%, preferably from about 40 to 60%, even more preferentially from about 51.4% of category A or B pearls. the inventors have shown that the donor oysters usually used graft allow only about 4.6% of grade A beads and about 19.5% of grade A or B pearls.
  • donor oysters of high biomineralization capacity (1) make it possible to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months. month of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, more preferably more than about 95% of pearls having a mother-of-pearl thickness of greater than or equal to approximately 0.8 mm, and (2) allowing more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, to be obtained, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% of beads having no surface defects.
  • donor oysters of high biomineralization capacity (1) make it possible to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months. month of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, more preferably more than about 95% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than or equal to about 0.8 mm, and (2) allowing more than 5%, preferably more than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 to be obtained , 90% Category A and / or B pearls.
  • donor oysters with high biomineralization capacity make it possible to obtain (1) more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% pearls having no surface defects, and (2) more than 5%, preferably more than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 , 80, 90% Category A and / or B pearls.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible (1) to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months of culture.
  • the donor oyster of high biomineralization capacity comprises a biomarker predictive of the biomineralizer quality, and / or a predictive signature of the biomineralizer quality.
  • the present invention therefore also relates to a biomarker predictive of the biomineralization capacity of an oyster.
  • the present invention therefore also relates to a predictive signature of the biomineralizing capacity of a donor oyster grafts.
  • the predictive biomarker of the oyster biomineralization capacity is a nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list comprising the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42 presented in the table 1, their variants and fragments.
  • the predictive biomarker of the invention comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the following nucleotide sequences, their variants and fragments: CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3 -1 (SEQ ID NO: 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14 ), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), mpl I-2 SEQ ID NO: 28), C75bis (SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40), and Protinh2-1 (SEQ ID NO: 42).
  • CALC-1 SEQ ID NO: 3
  • CLEC3 -1 SEQ ID NO: 4
  • DERM-2 SEQ ID NO: 5
  • the predictive signature of the invention comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list comprising the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42 presented in Table 1, their variants and fragments.
  • the predictive signature of the invention comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the following nucleotide sequences, their variants and their fragments : CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 11) ID NO: 27), mpl 1-2 SEQ ID NO: 28), C75bis (SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40), and Protinh2-1 (SEQ ID NO: 42).
  • CALC-1 SEQ ID NO: 3
  • CLEC3-1 SEQ ID NO:
  • the predictive signature of the invention comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 or 42 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list comprising the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42 presented in Table 1, their variants and their fragments.
  • the predictive signature of the invention comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the following nucleotide sequences, their variants and fragments: CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), mpl 1-2 SEQ ID NO: 28), C75bis ( SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40), and Protinh2-1 (SEQ ID NO: 42).
  • CALC-1 SEQ ID NO:
  • the donor oyster of high biomineralization capacity according to the invention makes it possible to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, more preferably more than about 95% beads having a mother-of-pearl thickness of greater than or equal to about 0.8 mm, preferably greater than or equal to about 1.2 mm, more preferably greater than or equal to about 1.5 mm.
  • the predictive biomarker is predictive of the nacre thickness around the nucleus, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of Table 2, their variants and their fragments.
  • the predictive biomarker is predictive of the nacre thickness around the nucleus, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the following nucleotide sequences, their variants and their fragments: MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), C75bis (SEQ ID NO. : 36), 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40).
  • MUCO-2 SEQ ID NO : 8
  • C46 SEQ ID NO: 18
  • PIF-2 SEQ ID NO: 23
  • C26bis SEQ ID NO: 26
  • C54 (C53bis) SEQ ID NO: 27
  • C75bis SEQ ID NO. : 36
  • 2 SEQ ID NO: 39
  • mp2-2 SEQ ID NO: 40
  • the predictive signature is predictive of the nacre thickness around the nucleus and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 2, their variants and their fragments.
  • the predictive signature comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or Nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 2, their variants and fragments.
  • the predictive signature comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nucleotide sequences selected from the following nucleotide sequences, their variants and their fragments: MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), C75bis (SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40).
  • MUCO-2 SEQ ID NO: 8
  • C46 SEQ ID NO: 18
  • PIF-2 SEQ ID NO: 23
  • C26bis SEQ ID NO: 26
  • C54 (C53bis) SEQ ID NO: 27
  • C75bis SEQ ID NO: 36
  • 2 SEQ ID NO: 39
  • mp2-2 SEQ ID NO: 40
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, 30, 40 , 50, 60, 70, 80, 90% pearls with no surface defects.
  • the predictive biomarker is predictive of the number of defects on the surface of the pearl, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of Table 3, their variants and their fragments.
  • the predictive biomarker is predictive of the number of defects on the surface of the bead, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from nucleotide sequences mpl 1-2 (SEQ ID NO: 28) and Protinh2 - 1 (SEQ ID NO: 42).
  • the predictive signature is predictive of the number of defects and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 3, their variants and their fragments.
  • the predictive signature is predictive of the number of defects and comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 or 18 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 3, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the number of surface defects and comprises the expression profile of 1 or 2 nucleotide sequences selected from nucleotide sequences mpl l-2 (SEQ ID NO : 28) and Protinh2-1 (SEQ ID NO: 42), their variants and fragments.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible to obtain more than 5%, preferably more than 10%, 20%, more preferably more than 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90% Category A and / or B pearls.
  • the predictive biomarker is predictive of the commercial quality of the pearl, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of Table 4, their variants and their fragments.
  • the predictive biomarker is predictive of the commercial quality of the pearl, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14), their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 4, their variants and their fragments .
  • the predictive signature is predictive of the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or 21 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 4, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5 nucleotide sequences selected from CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14), their variants and fragments.
  • donor oysters of high biomineralization capacity (1) make it possible to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months. month of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, more preferably more than about 95% of pearls having a mother-of-pearl thickness of greater than or equal to approximately 0.8 mm, and (2) allowing more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, to be obtained, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% of beads having no surface defects.
  • the predictive biomarker is predictive of the mother-of-pearl thickness around the nucleus and the number of defects on the surface of the pearl and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of the table. 5, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the mother-of-pearl thickness around the nucleus and the number of defects on the surface of the pearl and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 5, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the mother-of-pearl thickness around the nucleus and the number of defects on the surface of the pearl and comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 5, their variants and their fragments.
  • the predictive signature is predictive of the mother-of-pearl thickness around the nucleus and the number of defects on the surface of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 nucleotide sequences comprising or consisting of a sequence nucleotide selected from Table 2, variants and fragments thereof; and (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17 or 18 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 3, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the mother-of-pearl thickness around the nucleus and the number of defects on the surface of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from MUCO-2 (SEQ ID NO: 8) , C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), C75bis (SEQ ID NO: 36) , 2 (SEQ ID NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40), their variants and their fragments; and (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or I or 2 nucleotide sequences selected from nucleotide sequences mpl
  • donor oysters of high biomineralization capacity (1) make it possible to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months. month of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, more preferably more than about 95% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than or equal to about 0.8 mm, and (2) allowing more than 5%, preferably more than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 to be obtained , 90% Category A and / or B pearls.
  • the predictive biomarker is predictive of the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of Table 6, their variants and their fragments.
  • the predictive signature is predictive of the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 6, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 6, their variants and their fragments.
  • the predictive signature is predictive of the thickness and commercial quality of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or a 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 2, their variants and fragments; and (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or 21 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 4, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), C46 (SEQ ID NO: 18) , PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), C75bis (SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 39) , mp2-2 (SEQ ID NO: 40), their variants and fragments; and (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5 nucleotide sequences selected from CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4
  • donor oysters with high biomineralization capacity make it possible to obtain (1) more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% pearls having no surface defects, and (2) more than 5%, preferably more than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 , 80, 90% Category A and / or B pearls.
  • the predictive biomarker is predictive of the number of defects on the surface of the pearl and the commercial quality of the pearl and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of Table 7, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the number of defects and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 7, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 7, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the number of defects and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 or 18 nucleotide sequences comprising or consisting of in a nucleotide sequence selected from Table 3, their variants and fragments; and (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or 21 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 4, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the number of defects and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or 2 nucleotide sequences selected from nucleotide sequences mpl1-2 (SEQ ID NO: 28) and Protinh2-1 (SEQ ID NO: 42), variants thereof and fragments thereof; and (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5 nucleotide sequences selected from CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3 -1 (SEQ ID NO: 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), shem7-2 (SEQ ID NO: 11), C18 (SEQ ID NO: 14), their variants and fragments.
  • donor oysters with a high biomineralization capacity make it possible (1) to obtain, in less than 24 months of culture, preferably in less than 21 months of culture, more preferably in less than 18 months of culture. month of culture, more than about 25%, preferably about 30%, more preferably more than about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, more preferably more than about 95% pearls having a mother-of-pearl thickness greater than or equal to about 0.8 mm; (2) obtaining more than 5%, preferably more than 10%, more preferably more than 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% of pearls having no surface defects, and (3) obtaining more than 5%, preferably more than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% Category A pearls and / or B.
  • the predictive biomarker is predictive of the thickness, the number of defects on the surface and the commercial quality of the pearl, and comprises or consists of a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of the Table 8, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the pearl thickness around the nucleus, the number of defects and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile of at least one sequence nucleotide comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 8, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of mother-of-pearl thickness around the nucleus, the number of defects and the commercial quality of the pearl and includes the expression profile of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 8, their variants and fragments.
  • the predictive signature is predictive of the number of defects, the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 nucleotide sequences comprising or consisting of nucleotide sequence selected from Table 2, their variants and fragments; (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or of I or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17 or 18 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from Table 3, their variants and fragments; and (3) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence or I or a combination
  • the predictive signature is predictive of the number of defects, the thickness and the commercial quality of the pearl and comprises the expression profile (1) of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of 1 or a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nucleotide sequences comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), C46 (SEQ ID NO: 18), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C26bis (SEQ ID NO: 26), C54 (C53bis) (SEQ ID NO: 27), C75bis (SEQ ID NO: 36), 2 (SEQ ID NO: 26), NO: 39), mp2-2 (SEQ ID NO: 40), their variants and fragments; (2) at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence of I or of 2 nucleotide sequences selected from nucleotide sequences mpl1-2 (SEQ ID NO: 28) and Protinh
  • the predictive signature of the invention does not consist of the expression profiles of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 42.
  • the predictive signature of the invention does not consist of the expression profiles of SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 28.
  • the predictive signature of the invention comprises or consists of the expression profile of SEQ ID NO: 4.
  • this predictive signature is predictive of the commercial quality of the beads obtained using a donor oyster with said signature.
  • the predictive signature of the invention comprises or consists of the expression profile of SEQ ID NO: 28.
  • this predictive signature is predictive of the number of surface defects of the pearls obtained. using a donor oyster with said signature.
  • the predictive signature of the invention comprises or consists of the combination of the expression profiles of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 4. According to one embodiment, this predictive signature is predictive of number of surface defects of the pearls obtained and the commercial quality of the pearls obtained using a donor oyster with said signature.
  • a donor oyster with a high biomineralization capacity exhibits an overexpression or a subexpression of at least one predictive biomarker with respect to a control sample.
  • the predictive signature of the invention corresponds to overexpression or under-expression of at least one predictive biomarker within the biomineralizing tissue of a graft donor pearl oyster compared to a control sample as defined below.
  • overexpression or subexpression of a nucleotide sequence with respect to a control sample corresponds to a difference in expression level of a factor greater than or equal to 2, preferably greater or equal to 5, more preferably greater than or equal to 10 and even more preferably a factor greater than or equal to 25 relative to the control sample.
  • a donor pearl oyster with high biomineralization capacity exhibits overexpression or under-expression of at least one predictive biomarker compared to the control sample as defined below, according to Table 9 below.
  • SEQ ID NO: 13 had Thickness +
  • control sample corresponds to a set of grape-donor pearl oysters representative of the natural (wild) population of donor pearl oysters available to pearl farming professionals, and used in the grafting framework for commercial purposes.
  • the "Group A” target
  • donor pearl oysters producing on average pearls of superior quality (large mother-of-pearl thickness, few surface defects and / or better classification of quality)
  • the “Group B” (control or calibrator) corresponding, according to this embodiment, to a set of pearl oysters grafting representative of the natural (wild) population of pearl oyster donors available to professionals of pearl farming, and used in commercial grafting.
  • the quantitative PCR method is based on the use of fluorescent probes.
  • the Ct corresponds to the number of the PCR cycle from which the fluorescence emitted by said probes exceeds a predetermined threshold.
  • the target DCt corresponds to the average of the Ct differences between the predictive biomarkers of interest and the 18S and SAGE1 reference genes for the samples of grafts or pearl pockets of the target group "A"; and the DCt calibrator is the average of the Ct differences between the predictive biomarkers and the 18S and SAGE1 reference genes for graft or pearl pocket samples from the "B" calibrator group.
  • the target DCt corresponds to the median of the Ct differences between the predictive biomarkers and the 18S and SAGE1 reference genes for samples of grafts or pearl pockets of the "A" target group; and the DCt calibrator is the median of the Ct differences between the predictive biomarkers and the 18S and SAGE1 reference genes for graft or pearl pocket samples from the "B" calibrator group.
  • the present invention also relates to a graft derived from a donor pearl oyster of high biomineralization capacity according to the invention.
  • the present invention therefore relates to a graft comprising a predictive biomarker according to the invention and / or a predictive signature according to the invention.
  • the present invention also relates to a grafted recipient oyster comprising a graft derived from a donor oyster identified by the identification method of the invention.
  • the predictive signature according to the invention can be found in the perlier bag of said recipient oyster.
  • said predictive signature in the recipient oyster is predictive of the number of defects on the surface of the pearl, and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence, preferably of 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, or 8 nucleotide sequences selected from CLEC2-2 (SEQ ID NO: 1); C9 (SEQ ID NO: 6); MUCO-2 (SEQ ID NO: 8); C26bis (SEQ ID NO: 26); C54 (SEQ ID NO: 27); CALC-1 (SEQ ID NO: 3); C18 (SEQ ID NO: 14) and Cbind-3 (SEQ ID NO: 19), their variants and fragments.
  • CLEC2-2 SEQ ID NO: 1
  • C9 SEQ ID NO: 6
  • MUCO-2 SEQ ID NO: 8
  • C26bis SEQ ID NO: 26
  • C54 SEQ ID NO: 27
  • CALC-1 SEQ ID NO: 3
  • C18 SEQ ID NO: 14
  • Cbind-3 SEQ ID NO: 19
  • said predictive signature corresponds to an overexpression of CLEC2-2 (SEQ ID NO: 1), C9 (SEQ ID NO: 6), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), C26bis (SEQ ID NO: 26) and / or C54 (SEQ ID NO: 27), their variants and fragments; and / or a subexpression of CALC-1 (SEQ ID NO: 3); C18 (SEQ ID NO: 14) and / or Cbind-3 (SEQ ID NO: 19), their variants and fragments.
  • said predictive signature in the recipient oyster is predictive of the commercial quality of the pearl, and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence, preferably of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 nucleotide sequences selected from C3 (SEQ ID NO: 2); CALC-1 (SEQ ID NO: 3); CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4); MUCO-2 (SEQ ID NO: 8); C2 (SEQ ID NO: 17); C46 (SEQ ID NO: 18) and Cbind-3 (SEQ ID NO: 19), their variants and fragments.
  • C3 SEQ ID NO: 2
  • CALC-1 SEQ ID NO: 3
  • CLEC3-1 SEQ ID NO: 4
  • MUCO-2 SEQ ID NO: 8
  • C2 SEQ ID NO: 17
  • C46 SEQ ID NO: 18
  • Cbind-3 SEQ ID NO: 19
  • said predictive signature corresponds to a subexpression of C3 (SEQ ID NO: 2), CALC-1 (SEQ ID NO: 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8), C2 (SEQ ID NO: 17), C46 (SEQ ID NO: 18) and / or Cbind-3 (SEQ ID NO: 19), their variants and fragments.
  • said predictive signature in the recipient oyster is predictive of the nacre thickness around the nucleus, and comprises the expression profile of at least one nucleotide sequence, preferably of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 nucleotide sequences selected from CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4); DERM-2 (SEQ ID NO: 5); MUCO-2 (SEQ ID NO: 8); C88bis (SEQ ID NO: 9); C18 (SEQ ID NO: 14); ProtinH3-1 (SEQ ID NO: 16); C17 (SEQ ID NO: 21); PIF-2 (SEQ ID NO: 23); C6 (SEQ ID NO: 25); C26bis (SEQ ID NO: 26); C54 (SEQ ID NO: 27); CALC-1 (SEQ ID NO: 3); C46 (SEQ ID NO: 18); PMMG1-2 (SEQ ID NO: 29) and C35bis (SEQ ID NO: 38), their variants and fragments.
  • CLEC3-1 SEQ ID NO: 4
  • said predictive signature corresponds to an overexpression of CLEC3-1 (SEQ ID NO: 4), DERM-2 (SEQ ID NO: 5), MUCO-2 (SEQ ID NO: 8) , C88bis (SEQ ID NO: 9), C18 (SEQ ID NO: 14), ProtinH3-1 (SEQ ID NO: 16), C17 (SEQ ID NO: 21), PIF-2 (SEQ ID NO: 23), C6 (SEQ ID NO: 25), C26bis (SEQ ID NO: 26) and / or C54 (SEQ ID NO: 27), their variants and fragments; and / or sub-expression of CALC-1 (SEQ ID NO: 3), C46 (SEQ ID NO: 18), PMMG1-2 (SEQ ID NO: 29) and / or C35bis (SEQ ID NO: 38) , their variants and their fragments.
  • CLEC3-1 SEQ ID NO: 4
  • DERM-2 SEQ ID NO: 5
  • MUCO-2 SEQ ID NO: 8
  • C88bis SEQ ID NO
  • the present invention also relates to a process for identifying donor oysters with high biomineralization capacity.
  • the method of identifying donor oysters with high biomineralization capacity comprises:
  • step (a) determining the expression pattern of a predictive biomarker or predictive signature predictive biomarkers in a sample of a donor donor oyster, said signature being predictive of biomineralizer quality, and (b) the comparison of the expression profile obtained in step (a) with a control expression profile obtained within a group of pearl oysters donor of grafts representative of the natural population (group B "calibrator” ).
  • the method of the invention comprises determining the presence of a predictive signature of the mother-of-pearl thickness around the nucleus, the number of defects on the surface of the pearl and / or the commercial quality of the pearl, as described above.
  • the method of the invention makes it possible to compare the biomineralizing capacities of two groups of donor oysters ("target" group A and group “calibrator” B), and the level of expression of the group of donor pearl oysters "calibrator” B is used as a reference for the establishment of an expression profile within the group of donor pearl oysters with high "target” A biomineralization property.
  • the analysis of the expression profile is performed on a donor oyster graft, preferably following the sampling step.
  • the analysis of the expression profile is carried out on the graft donor oyster mantle before the grafting step.
  • the analysis of the expression profile is carried out on the oyster pearl bag which has received a graft, after the grafting step.
  • the determination of the expression profile is carried out at the level of RNA, of DNA and / or of the protein.
  • the determination of the expression profile corresponds to the determination of the level of transcription of the predictive biomarker (s) considered (s).
  • Methods for determining the level of transcription of a nucleotide sequence are well known to those skilled in the art, and include, but are not limited to, the following methods: RT-PCR, RT-PCR Quantitative (RT-qPCR), RT -qPCR high throughput, DNA chip, RNA chip.
  • the determination of the expression profile is performed at the protein level, and corresponds to the level of translation of the predictive biomarker (s) considered (s).
  • the methods for determining the level of translation of a nucleotide sequence are well known to those skilled in the art, and include, but are not limited to the following methods: Western blot, immunochemistry , ELISA, ELISA Sandwich, PAGE ...
  • the present invention also relates to an oyster identified by the identification method of the invention.
  • the oyster identified has a specific expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and their fragments .
  • the present invention also relates to a kit for determining the presence of a predictive biomarker according to the invention or a predictive signature according to the invention.
  • the kit according to the invention therefore allows the implementation of the identification method of the invention.
  • the kit comprises at least one means for determining the expression profile of at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list comprising the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO : 42, their variants and fragments.
  • the kit according to the invention comprises a control sample corresponding to biomaterial tissue material biomineralisator (coat) pearl oyster donor grafts from the natural population.
  • the kit according to the invention comprises means for determining the expression profile at the transcriptomic level by RT-PCR, RT-qPCR, high throughput quantitative PCR.
  • the kit comprises means for extracting total RNA, retro-transcription means, and / or means for amplifying at least one nucleotide sequence comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the list comprising the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and their fragments.
  • the amplification means comprise a polymerase and a buffer, free nucleotides and at least one pair of primers, each primer of which hybridises specifically and efficiently with a sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and fragments.
  • the pairs of primers are selected from the pairs of Table 10 below:
  • SEQ ID NO: 2 C3 ATTTCCACCACAGCCA CGTGGTACGGTGTGTC
  • SEQ ID NO: 7 1 CAATAAATAAAATACG AGAAAATGCTGCTATT
  • TGC (SEQ ID NO: 63)
  • AACC (SEQ ID NO: 64)
  • SEQ ID NO: 13 had TGCATTTCGCATTGTTG CATGTGCAGCCTCAAG
  • TACG (SEQ ID NO: 69)
  • ATTCG (SEQ ID NO: 70)
  • CTTAC (SEQ ID NO: 71) AAATAG (SEQ ID NO:
  • the kit according to the invention comprises means for determining the expression profile by determination of the expression profile at the protein level (by proteomic analysis).
  • the kit comprises one or more antibodies specifically recognizing one or more of the proteins encoded by the nucleotide sequences comprising or consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and fragments.
  • the kit also comprises means for extracting the total proteins.
  • the present invention also relates to a device comprising a support comprising one or more probes specific for one or more nucleotide sequences identified under the numbers SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and fragments for the implementation implementation of the identification method according to the invention.
  • probe is intended to mean any single-stranded DNA fragment or single-stranded RNA whose sequence is complementary to a sequence This can be detected by hybridization with the labeled probe (by incorporation of nucleotides coupled to radioactive atoms / isotopes or fluorescent / fluorochrome groups), which acts as a molecular "hook”.
  • the support of said device is selected from a glass membrane, a metal membrane, a polymer membrane, a silica membrane.
  • Such devices are, for example, DNA or RNA chips comprising one or more nucleotide sequences identified under the numbers SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and their fragments, or one or more sequences complementary to the nucleotide sequences identified as SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 42, their variants and fragments.
  • the subject of the invention is also a method for grafting recipient pearl oysters comprising inserting into the pearling pouch the recipient pearl oyster of a graft derived from a donor oyster of high biomineralization capacity according to the invention, corresponding to the epithelium of the donor oyster mantle, in combination with a nucleus.
  • the donor oyster of high biomineralization capacity has been identified according to the method of the invention.
  • the grafting method comprises (i) opening the recipient pearl oyster, (ii) making an incision in the tissues of the recipient pearl oyster to access the pearl pocket and allow, in a third step (iii) the insertion into the pearling pocket of the recipient pearl oyster of a graft, corresponding to a portion of the epithelium of the mantle of the donor oyster according to the invention ( about 4 mm 2 ), in combination with a nucleus.
  • the present invention also relates to a process for producing a pearl of superior quality, comprising the graft in a recipient oyster, of a graft derived from a donor oyster of high biomineralization capacity according to the invention.
  • the recipient oyster comprises a nucleus.
  • the pearl production process comprises the grafting of a nucleus in the pearling pouch of a recipient oyster, and the grafting of part of the mantle epithelium of a donor oyster of high biomineralization capacity according to the invention.
  • said pearl production process comprises a first step comprising the collection and rearing of pearl oysters to obtain donor pearl oysters according to the invention and recipient pearl oysters; advantageously, the donor pearl oysters according to the invention are then cleaned to remove any parasites; then the recipient pearl oysters are cultured, preferably for a period of 10 to 24 months, preferably 12 to 20 months, even more preferably 16 to 18 months.
  • the external mineralizing epithelial border of the graft multiplies and lines the pearl pocket, to give a pearl sac encompassing the nucleus, and will deposit layers of mother-of-pearl around the nucleus, resulting in the production of a pearl.
  • the present invention also relates to the pearl obtained by the process for obtaining pearls as described above, using an oyster of high biomineralization capacity according to the invention as graft donor oyster.
  • Figure 2 Protocol used to validate candidate biomarkers of pearl growth and quality in P. margaritifera.
  • the approach implemented consisted in developing a global approach to transcriptome analysis in order to identify nucleotide sequences differentially expressed in the epithelial cells of the tissues responsible for the biomineralization of the shell (coat) and the pearl (grafts and pearling bags in the pearl pockets) (Figure 1).
  • the approach consisted in developing two complementary transcriptomic approaches on the mineralizing tissues (mantle, graft and pearl sac) and a global proteomic approach in parallel on the mineralized tissues (shells and pearls) of P. margaritifera.
  • Four SAGE databases were set up on pearl mineralising tissues, grafts and pearl pockets, with the objective of identifying nucleotide sequences differentially expressed in terms of pearl oysters giving different grafts potentially associated with qualities. contrasting pearls.
  • P. margaritifera pearl oysters were used for global transcriptomic analyzes, global proteomic analysis, and experimental grafting to validate predictive biomarkers of pearl quality.
  • RNAs were isolated from a sample of cloak, graft or pearl sacs from the experimental graft and stored in RNAlater® (Ambion).
  • the tissues were rinsed with ImL PBS, scalpel dilacerated in a petri dish on ice and then taken up in 1 mL of Trizol® (Invitrogen). The extraction was carried out on an agitator overnight at 4 ° C.
  • the tubes were then incubated in a water bath for 5 min at 30 ° C and vortexed for 30 sec.
  • the ground material was centrifuged at 12000 g for 10 min at room temperature, and 1 mM of supernatant was removed and transferred to a new tube.
  • RNAs were precipitated overnight at -80 ° C 250 ⁇ ⁇ of isopropanol and 250 ⁇ ⁇ saline "High know" (0.8 M trisodium citrate, 1.2 M sodium chloride). The samples were centrifuged for 30 min at 15,000 g.
  • RNA pellet was vortexed twice with 1 mL of 70% ethanol followed by a centrifugation step of 15,000 g at 4 ° C for 15 min.
  • the pellets were then dried under a hood for 10 min at room temperature then taken up in 50 ⁇ ⁇ of RNAse-free water.
  • the tubes were then incubated in a water bath for 10 minutes at 55 ° C., before being homogenized by hand.
  • the RNAs were stored at -80 ° C.
  • RNA 6000 Nano kit The quality and quantity of the RNAs obtained were evaluated by electrophoresis on 1% agarose gel in 0.5X TAE at 100 mV, and by spectrophotometric assay with Nanodrop ND1000 and Agilent 2100 Bioanalyzer (RNA 6000 Nano kit). ).
  • Synthesis of graft and pearl pocket cDNAs for the determination of the relative expression level of predictive biomarkers of pearl quality candidates was performed using 800 ng graft RNA and pearl pockets, using SuperScriptTM II Reverse Transcriptase kit (InvitrogenTM- Cat No.: 18064-014) according to the supplier's instructions.
  • Measurement of the expression level of the candidate predictive biomarkers of pearl quality was performed by high throughput qPCR on the BioMark TM HD system (Fluidigm Corporation) using the 2XTaqManPreAmp Master Mix kit (Applied Biosystems - P / N 4384266 ) for the pre-amplification step and the 2XTaqMan Gene Expression Master Mix kit (Applied Biosystems - P / N 4369016) for the amplification step, following the supplier's instructions.
  • Four Fluidigm 96.96 DynamicArray Real Time PCR chips (BMK-M-96.96) were used.
  • the amplification program carried out is as follows: 2 min at 50 ° C.
  • the target DCt is the average of the Ct differences between the predictive biomarkers and the 18S and SAGE1 reference genes for the graft or pearl pocket samples of the "A" target group.
  • the DCt calibrator is the average of the Ct differences between the predictive biomarkers and the 18S and SAGE1 reference genes for graft or pearl pocket samples from the "B" calibrator group, as described in the present invention. Evaluation of the quality of pearls
  • the pearls harvested as part of the experimental graft were washed with coarse salt, rinsed in fresh water, wiped with a clean cloth and lustered.
  • the variable "Pearl thickness on the surface of the pearl” corresponds to the measurement in millimeters of the minimum thickness of nacre present on the surface of the nucleus. This was obtained by subtracting the diameter of the nucleus at the smallest diameter of the bead and dividing the diameter difference by 2. The diameters of the beads and nuclei were measured from images of beads and scanned nuclei. (300 pixels / cm, EPSON perfection 4990 photo scanner) and processed with ImageJ image analysis software (version 1.44).
  • the variable "Number of defects on the surface of pearls” corresponds to the classification of each pearl in 4 quality classes according to the number of defects observed on their surface (pearls without defects, pearls with 1 to 5 defects, pearls with more than 5 defects and pearls completely covered with defects).
  • the defects taken into consideration are the stings, blisters and comets.
  • a note ranging from 0 to 3 was assigned to each pearl according to the defect class to which it belongs (from 0 for pearls covered with defect to 3 for pearls without defect).
  • the variable "Commercial quality” corresponds to the classification of pearls into 5 quality categories (A, B, C, D and Rebut). This classification was carried out twice in accordance with the criteria defined by Deliberation No. 2005-42 of 4 February 2005 (Official Journal of Polynesia). In a second step, a score ranging from 0 to 4 was assigned to each pearl according to the category to which it belongs (from 0 for the category pearls "scrap" to 4 for pearls category "A"). In order to highlight the donor effect, the ranking of pearl oysters graft donors in order of increasing quality according to each variable was carried out. This ranking was achieved by assigning a score to each donor pearl oyster based on the evaluation of the quality of pearls harvested at 18 months as part of the experimental transplant.
  • Groups A target was performed by conducting an analysis of raw pearl quality and graft donor oyster grading data, a Dunn pairwise multiple comparison procedure, and an ascending classification. hierarchical. The constitution of these groups of donor pearl oysters then made it possible to define for each variable two sampling plans of grafts and pearl pockets at the origin of the production of contrasting pearls: a sampling plan of grafts derived from oysters donor pearls constituting groups A and B, and a sampling plan of pearl pockets from grafting of the donor pearl oyster grafts constituting groups A and B.
  • the global approach to transcriptome analysis has made it possible to identify a large number of nucleotide sequences expressed within the tissues responsible for the biomineralization of the shell and the pearl.
  • the constitution of the EST coat library allowed us to identify 82 nucleotide sequences encoding proteins potentially involved in the biomineralization of the shell in P. margaritifera.
  • the constitution of the SAGE banks of grafts and pearl pockets has made it possible to identify more than 5,000 gene sequences annotated and expressed within tissues responsible for the processes of biomineralization of the pearl.
  • the global proteomic approach implemented on the constituents of the shell and pearls made it possible to identify 130 protein sequences constituting the mineralized structures in P. margaritifera.
  • a nucleotide sequence is considered to be differentially expressed if the relative expression of said nucleotide sequence in group A is greater than or less than one factor, or "fold", greater than or equal to 2 to the expression of the same nucleotide sequence in group B as described in the present invention.
  • Table 11 Number of biomarkers of pearl quality in P. margaritifera, showing unfold greater than or equal to 2.
  • SEQ ID NO: 7 1 0.210 1.608 0.136 0.569 0.206 0.569
  • SEQ ID NO: 36 C75bis 5,703 1,512 0,604 1,155 0.604 0.882
  • Table 12 List of biomarker genes predicting pearl quality in P. margaritifera (results correspond to the difference in expression between Group A oysters and Group B oysters)
  • Table 13 Comparison of the means of the variables "Pearl thickness on the surface of the pearl", “Number of defects on the surface of the pearls” and “Commercial quality” according to the groups of donor oysters used during the G2 and G3 grafts.
  • the quality gain of the pearls produced by the group A donors compared to those of the group B on each of the "mother-of-pearl thickness on the surface of the pearl" variables, "Number of pearl surface defects” and “Commercial Quality” is 30%, 47% and 52% respectively (Table 13).
  • the quality gain of the pearls produced by the Group A donors is 28%, 42% and 66%, respectively.
  • the average values of each variable obtained in group B and in the group constituted by all the donors used during the transplant are similar, regardless of the graft G2 or G3 considered.
  • Relative expression levels of biomarkers predictive of pearl quality in P. margaritifera were determined by real-time PCR according to the methodology described in the present invention.
  • the expression levels in the donor group A and B were calculated for each of the grafts G2 and G3 and each of the 3 variables of interest: Thickness / Commercial Quality / Defects.
  • the levels of expression measured were compared with those obtained during the first graft (Gl) and confirm the previously obtained results.
  • Significant overexpression or subexpression levels fold greater than or equal to 2, denoted "+" and "-" respectively) for each of the 15 high biomaterialization biomarkers obtained during grafts G1, G2 and G3 are indicated. in table 14.
  • Table 14 Comparison of levels of overexpression or under-expression of biomaterials with high biomineralization capacity of group A donor pearl oysters compared to the control sample according to the graft considered, according to the graft considered.

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Abstract

La présente invention concerne une signature prédictive de la capacité de biominéralisation d'une huître donneuse de greffons, ladite signature comprenant le profil d'expression d'au moins un biomarqueur comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments. Un autre objet de l'invention est une huître perlière donneuse de greffons de haute capacité de biominéralisation, caractérisée en ce qu'elle présente une signature prédictive selon l'invention. L'invention concerne également un biomarqueur prédictif de la capacité de biominéralisation d'une huître perlière donneuse de greffons, ledit biomarqueur étant sélectionné parmi la liste consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42.

Description

SIGNATURE PRÉDICTIVE DE LA CAPACITÉ DE BIOMINÉRALISATION D'UNE HUÎTRE PERLIÈRE DONNEUSE DE GREFFONS
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la perliculture. La présente invention concerne plus précisément une signature prédictive de la capacité de biominéralisation d'une huître perlière donneuse de greffons. La présente invention concerne également une huître perlière de haute capacité de biominéralisation comprenant la signature selon l'invention.
ÉTAT TECHNIQUE ANTÉRIEUR À L'INVENTION
La perliculture est une activité humaine consistant en la culture, en milieu naturel, d'huîtres perlières Pinctada sp en vue de la production de perles de culture. Dans une première étape, les huîtres perlières qui serviront soit d'huîtres donneuses soit d'huîtres receveuses sont collectées et élevées, pour atteindre le niveau de développement nécessaire à la réussite de la greffe. La greffe est une opération chirurgicale au cours de laquelle le greffon, une partie du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm2) est inséré dans la poche perlière de l'huître receveuse, en combinaison avec une bille de nacre, le nucléus. Une fois insérée dans l'huître perlière receveuse, la bordure épithéliale minéralisatrice du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière pour former le sac perlier qui englobe le nucléus. Ledit sac perlier dépose alors des couches de nacre autour du nucléus, formant ainsi la perle (Cochennec-Laureau et al, Aquatic Living Resource, 2010 : 23, 131-140).
On estime que seules 3 à 5% en moyenne des perles produites sont de très bonne qualité. La majorité des perles présentent ainsi des défauts de surface, une couleur non- homogène ou une épaisseur de nacre trop faible. Du fait de l'importance économique de la perliculture, notamment en Polynésie française, il existe un besoin certain d'outils ou de méthodes permettant d'augmenter le pourcentage de perles de qualité produites. Afin d'identifier les huîtres perlières donneuses ou receveuses présentant des propriétés spécifiques permettant la production de perles de qualité, des approches génétiques, et particulièrement génomiques et transcriptomiques, ont été utilisées.
Les travaux de Wada et Komaru (Aquaculture, 1996, 142 :25-32) ont ainsi permis d'observer un « effet donneuse », correspondant à une influence de l'huître perlière donneuse sur les caractéristiques des perles, et notamment sur leur couleur et leur lustre.
Le brevet américain US 7,163,795 décrit une méthode pour identifier les huîtres capables d'exprimer la protéine Nacrein (une protéine constituant la nacre et potentiellement impliquée dans le processus de biominéralisation), qui peuvent être utilisées en perliculture. Ce brevet décrit également une méthode pour identifier les conditions optimales pour la formation de la perle, ladite méthode comprenant l'analyse de l'expression de la Nacrein. Cependant, la perliculture étant traditionnellement pratiquée en pleine mer, une adaptation des conditions de cultures paraît difficilement réalisable.
Dans deux études successives, Inoue et al. ont décrit la relation entre la qualité de la perle produite et le profil d'expression génique de six gènes impliqués dans la biominéralisation au sein du sac perlier (Inoue et al., Zoological Science, 2011, 28 :32- 6 ; Inoue et al., Mar Biotechnol, 2011, 13 :48-55). Les résultats présentés par Inoue et al. constituent la première démonstration que le niveau d'expression d'un gène impliqué dans les processus de biominéralisation peut être corrélé à la qualité de la perle obtenue.
En 2011, Kinoshita et al. ont publié les résultats d'une étude à grande échelle d'identification de gènes impliqués dans la biominéralisation chez Pinctada fucata, par une approche transcriptomique (Kinoshita et al., PLoS One, 2011;6(6):e21238). Cependant, cette étude ne fait pas de lien entre l'expression génique et la qualité de la perle.
Dans le but d'identifier des huîtres perlières donneuses de greffons de haute capacité de biominéralisation, les Inventeurs ont réalisé une étude transcriptomique et protéomique de grande échelle, et ont analysé la relation entre (1) le profil d'expression génique et (2) la qualité et la croissance (épaisseur de nacre) de la perle lors d'une greffe expérimentale. Cette étude leur a permis d'identifier une signature génique particulière prédictive de la qualité des perles.
RÉSUMÉ La présente invention concerne donc une signature prédictive de la capacité de biominéralisation d'une huître donneuse de greffons, ladite signature comprenant le profil d'expression d'au moins deux biomarqueurs comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation, ladite signature est prédictive de la qualité commerciale des perles obtenues et/ou de la vitesse de dépôt nacré autour du nucléus en utilisant ladite huître donneuse.
La présente invention concerne également une signature prédictive de la qualité commerciale des perles obtenues en utilisant une huître donneuse et/ou de la vitesse de dépôt nacré autour du nucléus en utilisant ladite huître donneuse, ladite signature comprenant le profil d'expression dans le manteau de ladite huître donneuse d'au moins un biomarqueur comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 1, 4, 5, 8, 11, 14, 18, 23, 26, 27, 28, 36, 39, 40 et 42, leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation, la signature de l'invention comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 3, 4, 5, 11 et 14, leurs variants et leurs fragments, et ladite signature est prédictive de la qualité commerciale des perles obtenues en utilisant ladite huître donneuse.
Selon un mode de réalisation, la signature de l'invention comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 8, 18, 23, 26, 27, 36, 39 ou 40, leurs variants et leurs fragments, et ladite signature est prédictive de la vitesse de dépôt nacré autour du nucléus en utilisant ladite huître donneuse. Selon un mode de réalisation, la signature de l'invention comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 28 ou 42, leurs variants et leurs fragments, et ladite signature est en outre prédictive du nombre de défauts de surface des perles obtenues en utilisant ladite huître donneuse. Un autre objet de l'invention est une huître donneuse de greffons de haute capacité de biominéralisation, caractérisée en ce qu'elle présente une signature prédictive telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé d'identification d'une huître donneuse selon l'invention, dans lequel :
(a) on détermine, dans un échantillon biologique de ladite huître, le niveau d'expression d'au moins deux biomarqueurs prédictifs tel que décrit ci- dessus, et
(b) on compare le niveau d'expression obtenu à l'étape (a) à un niveau d'expression témoin. La présente invention concerne également un procédé de sélection d'une huître donneuse selon l'invention, dans lequel :
(a) on détermine, dans un échantillon biologique de ladite huître, le niveau d'expression d'au moins deux biomarqueurs prédictifs tel que décrit ci- dessus, et
(b) on compare le niveau d'expression obtenu à l'étape (a) à un niveau d'expression témoin.
Un autre objet de l'invention concerne en outre un kit permettant la mise en œuvre du procédé selon l'invention, comprenant des moyens de détermination du profil d'expression d'au moins un biomarqueur tel que décrit dans la présente invention. Selon un premier mode de réalisation, lesdits moyens permettent de déterminer le profil d'expression au niveau transcriptomique par RT-PCR, RT-qPCR, PCR quantitative à haut débit. Selon un second mode de réalisation, lesdits moyens permettent de déterminer le profil d'expression au niveau protéique. Un autre objet de l'invention est un greffon caractérisé en ce qu'il présente une signature prédictive telle que définie ci-dessus, ledit greffon étant une partie de l'épithélium du manteau d'une huître donneuse selon l'invention.
L'invention concerne également une huître receveuse greffée avec un greffon tel que défini ci-dessus, dans laquelle un nucléus est présent.
L'invention concerne en outre un procédé de production d'au moins une perle de qualité supérieure, comprenant la culture d'au moins une huître receveuse selon l'invention, ladite huître comprenant la signature prédictive de l'invention et/ou ayant été identifiée selon le procédé d'identification et/ou de sélection d'huître selon l'invention ; ainsi que la perle obtenue par ledit procédé.
L'invention concerne en outre un biomarqueur prédictif de la capacité de biominéralisation d'une huître donneuse de greffons, ledit biomarqueur comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionné parmi la liste consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un biomarqueur comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionné parmi la liste consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments, pour déterminer la capacité de biominéralisation d'une huître donneuse de greffons. Selon un mode de réalisation, le biomarqueur est sélectionné parmi la liste consistant en SEQ ID NO : 1, 4, 5, 8, 11, 14, 18, 23, 26, 27, 28, 36, 39, 40 et 42, leurs variants et leurs fragments.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un biomarqueur sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4, 5, 11 et 14, de préférence de la séquence SEQ ID NO : 4, pour prédire la capacité d'une huître donneuse de greffon à produire des perles de haute qualité commerciale. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un biomarqueur sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 42, de préférence la séquence SEQ ID NO : 28 pour prédire la capacité d'une huître donneuse de greffon à produire des perles présentant un faible nombre de défauts de surface. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un biomarqueur sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO : 8, 18, 23, 26, 27, 36, 39 et 40, pour prédire la capacité d'une huître donneuse de greffon à produire des perles présentant un faible nombre de défauts de surface.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes suivants ont la signification suivante :
Par « Perliculture », on entend une activité humaine ayant pour but la production de perle de cultures par des huîtres perlières, appartenant généralement au genre Pinctada sp. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'huître appartient au genre Pinctada sp., de préférence, aux espèces Pinctada fucata, Pinctada maxima ou Pinctada margaritifera.
Par « biomarqueur prédictif de la haute capacité biominéralisatrice d'une huître perlière donneuse », (ci-après dénommé « biomarqueur prédictif »), on entend une séquence nucléotidique, de préférence un gène, dont le profil d'expression dans une huître donneuse est prédictif de la haute capacité de biominéralisation de ladite huître perlière donneuse, et par conséquent est prédictif de la qualité des perles produites en utilisant cette huître perlière comme donneuse de greffons. Selon un mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif de l'invention comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les 42 séquences nucléotidiques du Tableau 1 ci-dessous, leurs variants et leurs fragments :
Figure imgf000008_0001
Tableau 1 Selon un mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif de l'invention comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les 15 séquences nucléotidique s suivantes, leurs variants et leurs fragments : CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), mpl l-2 SEQ ID NO : 28), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42).
Selon un mode de réalisation de l'invention, les fragments sont des séquences d'acides nucléiques de plus de 25 nucléotides, de préférence de plus de 50, 100, 150, 200 ou plus de 500 nucléotides. Selon un mode de réalisation de l'invention, un fragment d'une séquence SEQ ID NO : X correspond à une séquence nucléotidique de plus de 25 nucléotides contigus, de préférence de plus de 50, 100, 150, 200 ou plus de 500 nucléotides contigus de SEQ ID NO : X. Selon un mode de réalisation, on entend par variant d'une séquence SEQ ID NO : X toute séquence d'acide nucléique comprenant plus de 25 nucléotides, de préférence de plus de 50, 100, 150, 200 ou plus de 500 nucléotides contigus d'une séquence d'acides nucléotidiques SEQ ID NO : X.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on entend par variant d'une séquence SEQ ID NO : X une séquence comprenant la séquence SEQ ID NO : X et entre 1 à 500, de préférence 1 à 200, plus préférentiellement 1 à 100 acides nucléiques additionnels en 5' et/ou en 3' .
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on entend par variant d'une séquence SEQ ID NO: X une séquence présentant des modifications structurelles mineures et conservant la fonction de SEQ ID NO: X. Des exemples de telles modifications structurelles mineures incluent, sans y être limités, des délétions, substitutions ou additions de bases, affectant 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 acides nucléiques.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on entend par variant d'une séquence SEQ ID NO : X une séquence nucléotidique comprenant plus de 25, de préférence plus de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 ou 3000 nucléotides ayant une identité de plus de 75%, 80%, 90%, 95%, ou plus de 96%, 97%, 98%, 99% avec la séquence SEQ ID NO : X.
Au sens de la présente invention, le terme «identité», lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques, se réfère au degré de parenté entre ces séquences nucléotidiques, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux bases ou plus.
Selon l'invention, « identité » correspond à un pourcentage d'identité entre deux (ou plus de 2) séquences. Ce pourcentage est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus petite des 2 séquences. Les différences entre les séquences peuvent être réparties au hasard et sur toutes leurs longueurs.
Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut donc être déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est alors calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Préférentiellement, les méthodes de détermination de l'identité sont conçues pour donner la plus grande concordance possible entre les séquences comparées. Le pourcentage d'identité peut être déterminé par un modèle mathématique particulier ou par un programme d'ordinateur (généralement désigné par le terme d' « algorithme »). Des méthodes de calcul de l'identité entre des séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples non limitatifs de telles méthodes incluent celles décrites dans les documents suivants : Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., éd., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Génome Projects, Smith, D. W., éd., Académie Press, New York, 1993; Computer Analysis of Séquence Data Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Séquence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Académie Press, 1987; Séquence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; et Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073 (1988).
Des méthodes de détermination de l'identité ont été décrites dans des programmes d'ordinateurs accessibles au public. Des exemples préférés de méthodes utilisant des programmes d'ordinateurs incluent, sans y être limités, le progiciel GCG, incluant GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Le programme BLASTX est disponible auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et d'autres sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). L'algorithme de Smith- Waterman, qui est bien connu de l'homme du métier, peut également être utilisé pour déterminer le pourcentage d'identité entre deux séquences.
Par « Signature prédictive », on entend un profil d'expression génique particulier, dont la présence dans une huître perlière donneuse est prédictive de la haute capacité de biominéralisation de ladite huître donneuse, et par conséquent est prédictive de la qualité des perles produites et/ou de la vitesse de dépôt nacré autour du nucleus en utilisant cette huître donneuse. Selon un mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive de l'invention comprend de 1 à 42 biomarqueurs prédictifs tels que décrits ci- dessus. Par « Huître donneuse de haute capacité de biominéralisation », on entend une huître donneuse de greffons permettant l'obtention de perles de qualité supérieure, et/ou l'obtention plus rapide de perles de qualité supérieure. Ainsi, selon un mode de réalisation, une huître donneuse de haute capacité de biominéralisation permet l'obtention d'une perle présentant une épaisseur de nacre autour du nucléus supérieure ou égale à 0.8 mm, de préférence supérieure ou égale à 1.5 mm, en moins de 24 mois, de préférence en moins de 21 mois, plus préférentiellement en moins de 18 mois. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'huître donneuse de haute capacité de biominéralisation de l'invention conduit à l'obtention de 100% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure à 0.8 mm après 18 mois de culture, et/ou à l'obtention de 30,2 % de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure à 1,5 mm après 18 mois de culture. Par comparaison, en l'absence de sélection des huîtres donneuses, ces pourcentages sont respectivement de 80,9 et 13,4 %.
Par « perles de qualité supérieure », on entend une perle ayant une caractéristique d'épaisseur de nacre autour du nucleus (obtention d'un dépôt nacré autour du nucleus plus important avec le même temps de culture), et/ou un nombre de défaut à la surface, et/ou une qualité commerciale supérieurs ou inférieurs à des seuils prédéterminés. Dans le cadre de la présente invention, la qualité d'une perle peut être évaluée par 3 variables : une variable « épaisseur de nacre », une variable « nombre de défauts à la surface des perles », et une variable « qualité commerciale ». Selon l'invention, une huître donneuse de haute capacité de biominéralisation est une huître présentant au moins un biomarqueur prédictif selon l'invention et/ou au moins une signature prédictive de l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'épaisseur de nacre d'une perle correspond à l'épaisseur en millimètres de nacre présente autour du nucleus de la perle. Celle-ci peut être mesurée, par exemple, par soustraction du diamètre du nucléus au plus petit diamètre de la perle et division de la différence de diamètre par 2. Selon un mode de réalisation de l'invention, les diamètres des perles et des nucléi peuvent être mesurés par informatique à partir d'images de perles et de nucléus scannés. Un exemple non- limitatif de logiciel d'analyse qui peut être utilisé pour la mesure de la taille des perles et des nucléus est le logiciel ImageJ. Selon un mode de réalisation de l'invention, une perle de qualité supérieure présente une épaisseur de nacre de plus de 0.8 mm, de préférence de plus de 1.2 mm, encore plus préférentiellement de plus de 1.5 mm.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'estimation de la qualité des perles en fonction du nombre de défauts correspond à la classification de chaque perle dans une classification comprenant 4 classes, en fonction du nombre de défauts observés à leur surface. Les défauts pris en considération pour cette classification sont les piqûres, les boursouflures et les comètes. Selon un mode de réalisation de l'invention, la première classe comprend les perles sans défaut ; la seconde classe comprend les perles présentant de 1 à 5 défauts ; la troisième classe comprend les perles présentant plus de 5 défauts et la quatrième classe comprend les perles entièrement recouvertes de défauts. Selon un mode de réalisation de l'invention, une perle de qualité supérieure appartient à la première classe relative au nombre de défauts, i.e. ne présente aucun défaut.
Selon un mode de réalisation, la qualité commerciale de la perle s'apprécie selon l'état de surface (présence ou absence d'imperfections) et le lustre (éclat ou brillance) de la perle, conformément à la définition donnée dans la Délibération n°2005-42 du 4 février 2005 (Journal Officiel de la Polynésie). Selon cette délibération, l'appréciation de la qualité de la perle correspond à la classification des perles en 5 catégories de qualité, de la classe A à la classe D et à la classe « Rebut ». Selon un mode de réalisation de l'invention, une perle de qualité supérieure appartient à la classe A.
Au sens de la présente invention, le terme « environ », placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE La présente invention a pour objet une huître perlière donneuse de haute capacité de biominéralisation.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, de préférence supérieure ou égale à environ 1.2 mm, plus préférentiellement supérieure ou égale à environ 1.5 mm.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention de 100% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, après une période de culture d'environ 15 mois, de préférence d'environ 16 mois, plus préférentiellement d'environl8 mois.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention de plus d'environ 30% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 1.5 mm, après une période de culture d'environ 15 mois, de préférence d'environ 16 mois, plus préférentiellement d'environ 18 mois.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface. Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention d'environ 10 à 20%, de préférence d'environ 12.5 à 17.5%, plus préférentiellement d'environ 14.3% de perles ne présentant aucun défaut de surface. Par comparaison, les Inventeurs ont montré que les huîtres donneuses de greffons habituellement utilisées ne permettent l'obtention que d'environ 5.2% de perles ne présentant aucun défaut de surface.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence plus de 10%, 20%, plus préférentiellement de plus de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B. Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention d'environ 10 à 50%, de préférence d'environ 20 à 30%, plus préférentiellement d'environ 24.3% de perles de catégorie A. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention d'environ 25 à 70%, de préférence d'environ 40 à 60%, encore plus préférentiellement d'environ 51.4% de perles de catégorie A ou B. Par comparaison, les Inventeurs ont montré que les huîtres donneuses de greffons habituellement utilisées ne permettent l'obtention que d'environ 4.6% de perles de catégorie A et d'environ 19.5% de perles de catégorie A ou B.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation (1) permettent l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, et (2) permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation (1) permettent l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, et (2) permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence plus de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention (1) de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface, et (2) de plus de 5%, de préférence plus de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B. Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent (1) l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm; (2) l'obtention de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface, et (3) l'obtention de plus de 5%, de préférence plus de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B.
Selon la présente invention, l'huître donneuse de haute capacité de biominéralisation comprend un biomarqueur prédictif de la qualité biominéralisatrice, et/ou une signature prédictive de la qualité biominéralisatrice.
La présente invention concerne donc également un biomarqueur prédictif de la capacité de biominéralisation d'une huître.
La présente invention a donc également pour objet une signature prédictive de la capacité biominéralisatrice d'une huître donneuse de greffons.
Selon l'invention, le biomarqueur prédictif de la capacité de biominéralisation d'une huître est une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi la liste comprenant les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42 présentées dans le tableau 1, leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif de l'invention comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les 15 séquences nucléotidiques suivantes, leurs variants et leurs fragments : CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), mpl l-2 SEQ ID NO : 28), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42). Selon l'invention, la signature prédictive de l'invention comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi la liste comprenant les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42 présentées dans le tableau 1, leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive de l'invention comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les 15 séquences nucléotidiques suivantes, leurs variants et leurs fragments : CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), mpl l-2 SEQ ID NO : 28), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), et Protinh2- 1 (SEQ ID NO : 42).
Selon un mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive de l'invention comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 ou 42 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi la liste comprenant les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42 présentées dans le tableau 1, leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive de l'invention comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les 15 séquences nucléotidiques suivantes, leurs variants et leurs fragments : CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), mpl l-2 SEQ ID NO : 28), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42). Selon un mode de réalisation, l'huître donneuse de haute capacité de biominéralisation selon l'invention permet l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, de préférence supérieure ou égale à environ 1.2 mm, plus préférentiellement supérieure ou égale à environ 1.5 mm.
Selon ce mode de réalisation, le biomarqueur prédictif est prédictif de l'épaisseur de nacre autour du nucléus, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du Tableau 2, leurs variants et leurs fragments.
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Tableau 2
Selon un mode de réalisation, le biomarqueur prédictif est prédictif de l'épaisseur de nacre autour du nucléus, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidique s suivantes, leurs variants et leurs fragments : MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40).
Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le Tableau 2, leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation, la signature prédictive comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le Tableau 2, leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation, la signature prédictive comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 séquences nucléotidiques sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques suivantes, leurs variants et leurs fragments : MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40). Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface. Selon ce mode de réalisation, le biomarqueur prédictif est prédictif du nombre de défauts à la surface de la perle, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du Tableau 3, leurs variants et leurs fragments.
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Tableau 3 Selon ce mode de réalisation, le biomarqueur prédictif est prédictif du nombre de défauts à la surface de la perle, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques mpl 1-2 (SEQ ID NO : 28) et Protinh2- 1 (SEQ ID NO : 42).
Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionné dans le tableau 3, leurs variants et leurs fragments. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 3, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts de surface et comprend le profil d'expression d' 1 ou de 2 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi les séquences nucléotidiques mpl l-2 (SEQ ID NO : 28) et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence plus de 10%, 20%, plus préférentiellement de plus de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B.
Selon ce mode de réalisation, le biomarqueur prédictif est prédictif de la qualité commerciale de la perle, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du Tableau 4, leurs variants et leurs fragments.
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Tableau 4
Selon ce mode de réalisation, le biomarqueur prédictif est prédictif de la qualité commerciale de la perle, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), leurs variants et leurs fragments.
Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionné dans le tableau 4, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 4, leurs variants et leurs fragments. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation (1) permettent l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, et (2) permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface. Selon ce mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif est prédictif de l'épaisseur de nacre autour du nucléus et du nombre de défauts à la surface de la perle et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du Tableau 5, leurs variants et leurs fragments.
Figure imgf000023_0001
Tableau 5 Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus et du nombre de défauts à la surface de la perle et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 5, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus et du nombre de défauts à la surface de la perle et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 5, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus et du nombre de défauts à la surface de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 2, leurs variants et leurs fragments ; et (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 3, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus et du nombre de défauts à la surface de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), leurs variants et leurs fragments ; et (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' I ou de 2 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi les séquences nucléotidiques mpl l-2 (SEQ ID NO : 28) et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42), leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation (1) permettent l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm, et (2) permettent l'obtention de plus de 5%, de préférence plus de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B.
Selon ce mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif est prédictif de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du tableau 6, leurs variants et leurs fragments.
Figure imgf000025_0001
Tableau 6 Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 6, leurs variants et leurs fragments. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 6, leurs variants et leurs fragments. Selon un autre mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 2, leurs variants et leurs fragments ; et (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 4, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), leurs variants et leurs fragments ; et (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent l'obtention (1) de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface, et (2) de plus de 5%, de préférence plus de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B.
Selon ce mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif est prédictif du nombre de défauts à la surface de la perle et de la qualité commerciale de la perle et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du tableau 7, leurs variants et leurs fragments.
Figure imgf000027_0001
Tableau 7
Selon ce mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 7, leurs variants et leurs fragments. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 7, leurs variants et leurs fragments. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 3, leurs variants et leurs fragments ; et (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 4, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou de 2 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi les séquences nucléotidiques mpl l-2 (SEQ ID NO : 28) et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42), leurs variants et leurs fragments ; et (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation permettent (1) l'obtention, en moins de 24 mois de culture, de préférence en moins de 21 mois de culture, plus préférentiellement en moins de 18 mois de culture, de plus d'environ 25%, de préférence d'environ 30%, plus préférentiellement de plus d'environ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore plus préférentiellement de plus d'environ 95% de perles présentant une épaisseur de nacre supérieure ou égale à environ 0.8 mm; (2) l'obtention de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, plus préférentiellement de plus de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles ne présentant aucun défaut de surface, et (3) l'obtention de plus de 5%, de préférence plus de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de perles de catégorie A et/ou B.
Selon ce mode de réalisation de l'invention, le biomarqueur prédictif est prédictif de l'épaisseur, du nombre de défauts à la surface et de la qualité commerciale de la perle, et comprend ou consiste en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences nucléotidiques du tableau 8, leurs variants et leurs fragments.
Figure imgf000029_0001
Tableau 8
Selon ce mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus, du nombre de défauts et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 8, leurs variants et leurs fragments.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus, du nombre de défauts et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 8, leurs variants et leurs fragments.
Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts, de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 2, leurs variants et leurs fragments ; (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' I ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 3, leurs variants et leurs fragments ; et (3) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ou d' I ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée dans le tableau 4, leurs variants et leurs fragments. Selon ce mode de réalisation, la signature prédictive est prédictive du nombre de défauts, de l'épaisseur et de la qualité commerciale de la perle et comprend le profil d'expression (1) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' 1 ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C46 (SEQ ID NO : 18), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C26bis (SEQ ID NO : 26), C54(C53bis) (SEQ ID NO : 27), C75bis (SEQ ID NO : 36), 2 (SEQ ID NO : 39), mp2-2 (SEQ ID NO : 40), leurs variants et leurs fragments ; (2) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' I ou de 2 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi les séquences nucléotidiques mpl l-2 (SEQ ID NO : 28) et Protinh2-l (SEQ ID NO : 42), leurs variants et leurs fragments ; et (3) d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique d' I ou d'une combinaison de 2, 3, 4, 5 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), shem7-2 (SEQ ID NO : 11), C18 (SEQ ID NO : 14), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation, la signature prédictive de l'invention n'est pas constituée par les profils d'expression de SEQ ID NO : 28 et de SEQ ID NO : 42.
Selon un mode de réalisation, la signature prédictive de l'invention n'est pas constituée par les profils d'expression de SEQ ID NO : 42 ou de SEQ ID NO : 28. Selon un mode de réalisation, la signature prédictive de l'invention comprend ou est constituée par le profil d'expression de SEQ ID NO : 4. Selon un mode de réalisation, cette signature prédictive est prédictive de la qualité commerciale des perles obtenues en utilisant une huître donneuse dotée de ladite signature. Selon un mode de réalisation, la signature prédictive de l'invention comprend ou est constituée par le profil d'expression de SEQ ID NO : 28. Selon un mode de réalisation, cette signature prédictive est prédictive du nombre de défauts de surface des perles obtenues en utilisant une huître donneuse dotée de ladite signature.
Selon un mode de réalisation, la signature prédictive de l'invention comprend ou est constituée par la combinaison des profils d'expression de SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 4. Selon un mode de réalisation, cette signature prédictive est prédictive du nombre de défauts de surface des perles obtenues et de la qualité commerciale des perles obtenues en utilisant une huître donneuse dotée de ladite signature.
Selon un mode de réalisation de l'invention, une huître donneuse de haute capacité de biominéralisation présente une surexpression ou une sous-expression d'au moins un biomarqueur prédictif par rapport à un échantillon témoin.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la signature prédictive de l'invention correspond à une surexpression ou à une sous-expression d'au moins un biomarqeur prédictif au sein du tissu biominéralisateur d'une huître perlière donneuse de greffons par rapport à un échantillon témoin tel que défini ci-dessous.
Selon un mode de réalisation de l'invention, une surexpression ou une sous-expression d'une séquence nucléotidique par rapport à un échantillon témoin correspond à une différence du niveau d'expression d'un facteur supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 5, plus préférentiellement supérieur ou égal à 10 et encore plus préférentiellement d'un facteur supérieur ou égal à 25 par rapport à l'échantillon témoin.
Selon un mode de réalisation, une huître perlière donneuse de haute capacité de biominéralisation présente une surexpression ou une sous-expression d'au moins un biomarqeur prédictif par rapport à l'échantillon témoin tel que défini ci-dessous, selon le tableau 9 ci-dessous.
Identifiant Nom Variable impactée Surexpression /
Sous-expression
Epaisseur +
SEQ ID NO : 1 CLEC2-2 Nombre de défauts +
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 2 C3 Nombre de défauts +
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 3 CALC-1 Nombre de défauts +
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 4 CLEC3-1 Nombre de défauts +
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 5 DERM-2 Nombre de défauts -
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 6 C9 Nombre de défauts -
Qualité commerciale -
Epaisseur -
SEQ ID NO : 7 1 Nombre de défauts -
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 8 MUCO-2 Nombre de défauts +
Qualité commerciale +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 9 C88bis Nombre de défauts -
Qualité commerciale +
Épaisseur +
SEQ ID NO : 10 shem5-l
Qualité commerciale +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 11 shem7-2
Qualité commerciale +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 12 C85
Qualité commerciale +
SEQ ID NO : 13 eu Epaisseur +
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 14 C18
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 15 C22
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 16 Protinh3-l
Qualité commerciale -
Épaisseur +
SEQ ID NO : 17 C2
Qualité commerciale - Epaisseur -
SEQ ID NO : 18 C46
Qualité commerciale +
Epaisseur -
SEQ ID NO : 19 Cbind-3
Qualité commerciale -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 20 C66ter
Qualité commerciale +
Épaisseur +
SEQ ID NO : 21 C17
Nombre de défauts +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 22 PLW-2
Nombre de défauts -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 23 PIF-2
Nombre de défauts +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 24 46
Nombre de défauts +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 25 C6
Nombre de défauts -
Epaisseur +
SEQ ID NO : 26 C26bis
Nombre de défauts +
Epaisseur +
SEQ ID NO : 27 C54(C53bis)
Nombre de défauts +
Qualité commerciale -
SEQ ID NO : 28 mpl l-2
Nombre de défauts +
SEQ ID NO : 29 PMMG1-2 Epaisseur +
SEQ ID NO : 30 73 Epaisseur +
SEQ ID NO : 31 C23 Epaisseur +
SEQ ID NO : 32 Cl Épaisseur +
SEQ ID NO : 33 MNK-1 Epaisseur +
SEQ ID NO : 34 PLC-2 Epaisseur +
SEQ ID NO : 35 mp9-2 Epaisseur +
SEQ ID NO : 36 C75bis Epaisseur +
SEQ ID NO : 37 13 Epaisseur +
SEQ ID NO: 38 C35bis Epaisseur -
SEQ ID NO: 39 2 Epaisseur -
SEQ ID NO: 40 mp2-2 Epaisseur -
SEQ ID NO: 41 C8 Epaisseur +
SEQ ID NO: 42 Protinh2-l Nombre de défauts -
+ : surexpression par rapport à l'échantillon témoin
- : sous-expression par rapport à l'échantillon témoin
Tableau 9
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon témoin correspond à un ensemble d'huîtres perlières donneuses de greffons représentatif de la population naturelle (sauvage) d'huîtres perlières donneuses à disposition des professionnels de la perliculture, et utilisées dans le cadre de greffes à but commercial. Selon un mode de réalisation de l'invention, le niveau d'expression relatif des biomarqueurs prédictifs est déterminé par PCR quantitative selon la méthode du 2Λ- ΔΔΟ: (Livak and Schmittgen, 2001) selon la formule suivante : fold = 2A-AACt = Λ- [DCt cible - DCt calibrator], par la comparaison des deux groupes d'huitres perlières donneuses suivants :
le « Groupe A » (cible), correspondant, selon ce mode de réalisation de l'invention, aux huîtres perlières donneuses produisant en moyenne des perles de qualité supérieure (épaisseur de nacre importante, peu de défauts de surface et/ou meilleure classification de qualité) ; et
- le « Groupe B » (témoin ou calibrator) correspondant, selon ce mode de réalisation, à un ensemble d'huîtres perlières donneuses de greffons représentatif de la population naturelle (sauvage) d'huîtres perlières donneuses à disposition des professionnels de la perliculture, et utilisées dans le cadre de greffes à but commercial. Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode de PCR quantitative est basée sur l'utilisation de sondes fluorescentes. Le Ct correspond au numéro du cycle de PCR à partir duquel la fluorescence émise par lesdites sondes dépasse un seuil prédéterminé.
Selon un premier mode de réalisation, le DCt cible correspond à la moyenne des différences de Ct entre les biomarqueurs prédictifs d'intérêt et les gènes de référence 18S et SAGEl pour les échantillons de greffons ou de poches perlières du groupe cible « A » ; et le DCt calibrator correspond à la moyenne des différences de Ct entre les biomarqueurs prédictifs et les gènes de référence 18S et SAGEl pour les échantillons de greffons ou de poches perlières du groupe calibrator « B ».
Selon un second mode de réalisation, le DCt cible correspond à la médiane des différences de Ct entre les biomarqueurs prédictifs et les gènes de référence 18S et SAGEl pour les échantillons de greffons ou de poches perlières du groupe cible « A » ; et le DCt calibrator correspond à la médiane des différences de Ct entre les biomarqueurs prédictifs et les gènes de référence 18S et SAGEl pour les échantillons de greffons ou de poches perlières du groupe calibrator « B ». La présente invention concerne également un greffon issu d'une huître perlière donneuse de haute capacité de biominéralisation selon l'invention.
La présente invention concerne donc un greffon comprenant un biomarqueur prédictif selon l'invention et/ou une signature prédictive selon l'invention. La présente invention concerne également une huître receveuse greffée comprenant un greffon issu d'une huître donneuse identifiée par le procédé d'identification de l'invention.
Selon un mode de réalisation, suite à la greffe d'une huître receveuse par un greffon issu d'une huître donneuse selon l'invention, la signature prédictive selon l'invention peut être retrouvée au niveau du sac perlier de ladite huître receveuse.
Selon un mode de réalisation, ladite signature prédictive chez l'huître receveuse est prédictive du nombre de défauts à la surface de la perle, et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique, de préférence de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi CLEC2-2 (SEQ ID NO : 1) ; C9 (SEQ ID NO : 6) ; MUCO-2 (SEQ ID NO : 8) ; C26bis (SEQ ID NO : 26) ; C54 (SEQ ID NO : 27) ; CALC-1 (SEQ ID NO : 3) ; C18 (SEQ ID NO : 14) et Cbind-3 (SEQ ID NO : 19), leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite signature prédictive correspond à une surexpression de CLEC2-2 (SEQ ID NO : 1), C9 (SEQ ID NO : 6), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C26bis (SEQ ID NO : 26) et/ou C54 (SEQ ID NO : 27), leurs variants et leurs fragments ; et/ou à une sous-expression de CALC-1 (SEQ ID NO : 3) ; C18 (SEQ ID NO : 14) et/ou Cbind-3 (SEQ ID NO : 19), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation, ladite signature prédictive chez l'huître receveuse est prédictive de la qualité commerciale de la perle, et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique, de préférence de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi C3 (SEQ ID NO : 2) ; CALC-1 (SEQ ID NO : 3) ; CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4) ; MUCO-2 (SEQ ID NO : 8) ; C2 (SEQ ID NO : 17) ; C46 (SEQ ID NO : 18) et Cbind-3 (SEQ ID NO : 19), leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite signature prédictive correspond à une sous-expression de C3 (SEQ ID NO : 2), CALC-1 (SEQ ID NO : 3), CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C2 (SEQ ID NO : 17), C46 (SEQ ID NO : 18) et/ou Cbind-3 (SEQ ID NO : 19), leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation, ladite signature prédictive chez l'huître receveuse est prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus, et comprend le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique, de préférence de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 séquences nucléotidiques sélectionnées parmi CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4) ; DERM-2 (SEQ ID NO : 5) ; MUCO-2 (SEQ ID NO : 8) ; C88bis (SEQ ID NO : 9) ;C18 (SEQ ID NO : 14) ; Protinh3-l (SEQ ID NO : 16) ;C17 (SEQ ID NO : 21) ; PIF-2 (SEQ ID NO : 23) ; C6 (SEQ ID NO : 25) ; C26bis (SEQ ID NO : 26) ; C54 (SEQ ID NO : 27) ; CALC-1 (SEQ ID NO : 3) ; C46 (SEQ ID NO : 18) ; PMMG1-2 (SEQ ID NO : 29) et C35bis (SEQ ID NO : 38), leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite signature prédictive correspond à une surexpression de CLEC3-1 (SEQ ID NO : 4), DERM-2 (SEQ ID NO : 5), MUCO-2 (SEQ ID NO : 8), C88bis (SEQ ID NO : 9), C18 (SEQ ID NO : 14), Protinh3-l (SEQ ID NO : 16), C17 (SEQ ID NO : 21), PIF-2 (SEQ ID NO : 23), C6 (SEQ ID NO : 25), C26bis (SEQ ID NO : 26) et/ou C54 (SEQ ID NO : 27), leurs variants et leurs fragments ; et/ou à une sous-expression de CALC-1 (SEQ ID NO : 3), C46 (SEQ ID NO : 18), PMMG1-2 (SEQ ID NO : 29) et/ou C35bis (SEQ ID NO : 38), leurs variants et leurs fragments.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification d'huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation.
Selon la présente invention, le procédé d'identification d'huîtres donneuses de haute capacité de biominéralisation comprend :
(a) la détermination du profil d'expression d'un biomarqueur prédictif ou de plusieurs biomarqueurs prédictifs formant une signature prédictive dans un échantillon d'une huître donneuse de greffons, ladite signature étant prédictive de la qualité biominéralisatrice, et (b) la comparaison du profil d'expression obtenu à l'étape (a) à un profil d'expression témoin obtenu au sein d'un groupe d'huîtres perlières donneuses de greffons représentatif de la population naturelle (groupe B « calibrator »).
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend la détermination de la présence d'une signature prédictive de l'épaisseur de nacre autour du nucléus, du nombre de défauts à la surface de la perle et/ou de la qualité commerciale de la perle, comme décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention permet la comparaison des capacités biominéralisatrices de deux groupes d'huîtres donneuses (groupe « cible » A et groupe « calibrator » B), et le niveau d'expression du groupe d'huîtres perlières donneuses « calibrator » B sert de référence à l'établissement d'un profil d'expression au sein du groupe d'huîtres perlières donneuses de haute propriété de biominéralisation « cible » A.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'analyse du profil d'expression est réalisée sur un greffon de l'huître donneuse, de préférence à la suite de l'étape de prélèvement.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'analyse du profil d'expression est réalisée sur le manteau d'huîtres donneuses de greffon, avant l'étape de greffe.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'analyse du profil d'expression est réalisée sur le sac perlier d'huîtres ayant reçu un greffon, après l'étape de greffe. Selon un mode de réalisation de l'invention, la détermination du profil d'expression est réalisée au niveau de ARN, de ADN et/ou de la protéine.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la détermination du profil d'expression correspond à la détermination du niveau de transcription du ou des biomarqueur(s) prédictifs) considéré(s). Les méthodes de détermination du niveau de transcription d'une séquence nucléotidique sont bien connues de l'homme du métier, et comprennent, sans y être limitées, les méthodes suivantes : RT-PCR, RT-PCR quantitative (RT- qPCR), RT-qPCR à haut débit, puce à ADN, puce à ARN. Selon un mode de réalisation de l'invention, la détermination du profil d'expression est réalisée au niveau protéique, et correspond au niveau de traduction du ou des biomarqueurs(s) prédictifs(s) considéré(s). Les méthodes de détermination du niveau de traduction d'une séquence nucléotidique (i.e. d'expression de la protéine traduite) sont bien connues de l'homme du métier, et comprennent, sans y être limitées, les méthodes suivantes : Western-Blot, immunochimie, ELISA, ELISA Sandwich, PAGE...
La présente invention a également pour objet une huître identifiée par le procédé d'identification de l'invention. Selon ce mode de réalisation, l'huître identifiée possède un profil d'expression spécifique d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments.
La présente invention a également pour objet un kit pour déterminer la présence d'un biomarqueur prédictif selon l'invention ou d'une signature prédictive selon l'invention.
Le kit selon l'invention permet donc la mise en œuvre du procédé d'identification de l'invention.
Selon l'invention, le kit comprend au moins un moyen permettant de déterminer le profil d'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionné parmi la liste comprenant les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments. Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend un échantillon témoin correspondant à du matériel biologique de tissus biominéralisateur (manteau) d'huîtres perlières donneuses de greffons issues de la population naturelle.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le kit selon l'invention comprend des moyens permettant de déterminer le profil d'expression au niveau transcriptomique par RT-PCR, RT-qPCR, PCR quantitative à haut débit.
Selon ce mode de réalisation, le kit comprend des moyens d'extraction de l'ARN total, des moyens de rétro-transcription, et/ou des moyens d'amplification d'au moins une séquence nucléotidique comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi la liste comprenant les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les moyens d'amplification comprennent une polymérase et un tampon, des nucléotides libres et au moins un couple d'amorces, dont chaque amorce s 'hybride de façon spécifique et efficace avec une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les couples d'amorces sont sélectionnés parmi les couples du Tableau 10 ci-dessous :
Identifiant Nom Amorce sens Amorce antisens
SEQ ID NO : 1 CLEC2-2 AGCTACTGGCGCTCGA TGCAGATGAAGCCATG
TG (SEQ ID NO: 43) TGAG (SEQ ID NO: 44)
SEQ ID NO : 2 C3 ATTTCCACCACAGCCA CGTGGTACGGTGTGTC
GTAAAC (SEQ ID NO: CTAAC (SEQ ID NO: 46) 45)
SEQ ID NO : 3 CALC-1 CTCCATGCACAGACAT GCCAGTAATACGGACC
GACC (SEQ ID NO: 47) TTGG (SEQ ID NO: 48)
SEQ ID NO : 4 CLEC3-1 CATCGGTGACCATAGC CGTCTTTCAAGGAAGC
CATAC (SEQ ID NO: 49) TGTTG (SEQ ID NO: 50)
SEQ ID NO : 5 DERM-2 CACAGTGGTCACGAGG TGATGCAACTTGGGGT
ACAG (SEQ ID NO: 51) CAG (SEQ ID NO: 52)
SEQ ID NO : 6 C9 CCGGACACTGGAAGTC TGCTCTGCACCCAGAA
ATTAG (SEQ ID NO: 53) TATG (SEQ ID NO: 54)
SEQ ID NO : 7 1 CAATAAATAAAATACG AGAAAATGCTGCTATT
GCACAGTTC (SEQ ID AAATGGTG (SEQ ID NO: 55) NO: 56)
SEQ ID NO : 8 MUCO-2 AGTGGAACCGGAACTG CACATCTCCAACTCCA
GTG (SEQ ID NO: 57) GCAAG (SEQ ID NO: 58)
SEQ ID NO : 9 C88bis CCGGCTCCGTTACCACT CCTATGGGCTGGTCGT
AC (SEQ ID NO: 59) ACTC (SEQ ID NO: 60)
SEQ ID NO : 10 shem5-l GTCCGAAACCAAATCG CTGTGGTGATGGTGAC
TCTG (SEQ ID NO: 61) TTCG (SEQ ID NO: 62)
SEQ ID NO : 11 shem7-2 TAGCAAGCGCCAAATA AAGTGATGCCGAACCT
TGC (SEQ ID NO: 63) AACC (SEQ ID NO: 64)
SEQ ID NO : 12 C85 AGTTCGTTTTGGTCCAC TTCAGGGTGCCATCTT
CTG (SEQ ID NO: 65) GTC (SEQ ID NO: 66)
SEQ ID NO : 13 eu TGCATTTCGCATTGTTG CATGTGCAGCCTCAAG
TATG (SEQ ID NO: 67) GTATC (SEQ ID NO: 68)
SEQ ID NO : 14 C18 CCGCGTCAAGACCATA GCAGCATTTGTAAACC
TACG (SEQ ID NO: 69) ATTCG (SEQ ID NO: 70)
SEQ ID NO : 15 C22 CAACAAACCATCGGTC TGCATAGGTCCCGGTA
CTTAC (SEQ ID NO: 71) AAATAG (SEQ ID NO:
72)
SEQ ID NO : 16 Protinh3-l TATGCGTGTGACTGTCC TCAATGCAAACGATCT
TGA (SEQ ID NO: 73) GTCC (SEQ ID NO: 74)
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Tableau 10
Selon un mode de réalisation de l'invention, le kit selon l'invention comprend des moyens permettant de déterminer le profil d'expression par détermination du profil d'expression au niveau protéique (par analyse protéomique). Selon ce mode de réalisation, le kit comprend un ou plusieurs anticorps reconnaissant spécifiquement une ou plusieurs des protéines encodées par les séquences nucléotidiques comprenant ou consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments.
Selon un mode de réalisation, le kit comprend également des moyens d'extraction des protéines totales.
La présente invention a également pour objet un dispositif comprenant un support comprenant une ou plusieurs sondes spécifiques d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments pour la mise en œuvre du procédé d'identification selon l'invention.
Dans le cadre de la présente invention on entend par sonde tout fragment d'ADN simple brin ou d'ARN simple brin dont la séquence est complémentaire à une séquence recherchée : celle-ci pourra ainsi être décelée par hybridation avec la sonde marquée (par incorporation de nucléotides couplés à des atomes/isotopes radioactifs ou de groupements fluorescents/fluorochromes), qui joue le rôle d'un "hameçon" moléculaire.
Selon des modes de mise en œuvre préférés, le support dudit dispositif est choisi parmi une membrane de verre, une membrane métallique, une membrane polymère, une membrane de silice.
De tels dispositifs sont par exemple des puces à ADN ou à ARN comprenant une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments, ou une ou plusieurs séquences complémentaires des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 42, leurs variants et leurs fragments.
L'invention a également pour objet un procédé de greffe d'huîtres perlières receveuses comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon issu d'une huître donneuse de haute capacité de biominéralisation selon l'invention, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'huître donneuse de haute capacité de biominéralisation a été identifiée selon le procédé de l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de greffe comprend (i) l'ouverture de l'huître perlière receveuse, (ii) la réalisation d'une incision dans les tissus de l'huître perlière receveuse pour accéder à la poche perlière et permettre, dans une troisième étape (iii) l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse selon l'invention (environ 4 mm2), en combinaison avec un nucléus.
La présente invention concerne également un procédé de production d'une perle de qualité supérieure, comprenant la greffe dans une huître receveuse, d'un greffon issu d'une huître donneuse de haute capacité de biominéralisation selon l'invention. Il est bien entendu que l'huître receveuse comprend un nucléus. Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de production de perle comprend la greffe d'un nucléus dans la poche perlière d'une huître receveuse, et la greffe d'une partie de l'épithélium du manteau d'une huître donneuse de haute capacité de biominéralisation selon l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production de perle comprend une première étape comprenant la collecte et l'élevage des huîtres perlières pour obtenir des huîtres perlières donneuses selon l'invention et des huîtres perlières receveuses ; avantageusement, les huîtres perlières donneuses selon l'invention sont ensuite nettoyées pour retirer d'éventuels parasites ; puis les huîtres perlières receveuses sont mises en culture, de préférence pendant une durée de 10 à 24 mois, de préférence de 12 à 20 mois, encore plus préférentiellement de 16 à 18 mois. Pendant la période de culture, la bordure épithéliale externe minéralisatrice du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière, pour donner un sac perlier englobant le nucléus, et qui va déposer des couches de nacre autour du nucleus, résultant ainsi en la production d'une perle.
La présente invention concerne également la perle obtenue par le procédé d'obtention de perle tel que décrit ci-dessus, utilisant une huître de haute capacité de biominéralisation selon l'invention comme huître donneuse de greffon.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Présentation de l'approche expérimentale mise en place.
Figure 2 : Protocole utilisé pour la validation de biomarqueurs candidats de la croissance et de la qualité de la perle chez P. margaritifera.
EXEMPLES
La présente invention sera mieux comprise et interprétée au vu des exemples ci-dessous.
L'objectif de cette étude était de développer une signature prédictive de la qualité de la perle récoltée, pour la sélection d'huîtres donneuses de greffons de « haute qualité minéralisatrice ». Démarche expérimentale
La démarche mise en place a consisté à développer une approche globale d'analyse du transcriptome afin d'identifier des séquences nucléotidiques exprimées différentiellement au sein des cellules épithéliales des tissus responsables de la biominéralisation de la coquille (manteau) et de la perle (greffons et sacs perliers contenus dans les poches perlières) (Figure 1). La démarche a consisté à développer deux approches transcriptomiques complémentaires sur les tissus minéralisateurs (manteau, greffon et sac perlier) et une approche protéomique globale en parallèle sur les tissus minéralisés (coquilles et perles) de P. margaritifera. Quatre banques de données SAGE ont été mises en place sur des tissus minéralisateurs de la perle, greffons et poches perlières, dans l'objectif d'identifier des séquences nucléotidiques différentiellement exprimées en fonction d'huitres perlières donneuses de greffons différentes potentiellement associées à des qualités de perles contrastées. Une banque EST de manteau a également été développée en parallèle par pyroséquençage sur du manteau, le tissu biominéralisateur de la coquille. Enfin, l'approche protéomique globale a été développée en parallèle sur les tissus minéralisés de P. margaritifera afin d'identifier les protéines qui composent la coquille et la perle. La mise en place des approches transcriptomiques et protéomique globales a permis d'aboutir à la sélection par « approche candidat » ou « en aveugle » de biomarqueurs de la qualité de la perle candidats codant des protéines impliquées dans les processus de biominéralisation chez P. margaritifera. La validation des biomarqueurs a été entreprise grâce à la réalisation d'une greffe expérimentale qui a permis d'une part d'évaluer la qualité des perles récoltées et de mettre en évidence un « effet donneuse », et d'autre part de disposer de matériel biologique (greffons et poches perlières) à l'origine de la production de perles de qualité contrastées. La validation des biomarqueurs candidats a par la suite été entreprise par PCR quantitative à haut-débit et a consisté à corréler statistiquement le niveau d'expression des biomarqueurs candidats à une réalité biologique (la qualité des perles). L'analyse du taux d'expression des biomarqueurs prédictifs candidats au sein des greffons des huîtres perlières donneuses et des poches perlières des huîtres perlières receveuses, mise en relation avec l'effet donneuse a abouti à l'identification de biomarqueurs prédictifs de la qualité des perles. Matériels et méthodes Huîtres
Des huîtres perlières P. margaritifera ont été utilisées dans le cadre des analyses transcriptomiques globales, de l'analyse protéomique globale et de la greffe expérimentale pour la validation des biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle.
Greffe expérimentale (Gl)
40 huîtres perlières de Polynésie française P. margaritifera de 3 ans environ ont été utilisées comme huîtres donneuses de greffons. Une trentaine de greffons ont été découpés à partir du manteau de chaque valve de chaque huître perlière donneuse. Un minimum de 2 greffons en provenance de chaque donneuse a été conservé. Les greffons restant en provenance de chaque valve de chaque huître perlière donneuse ont été greffés dans des huîtres perlières receveuses. Un total de 1978 huîtres perlières receveuses ont été greffées avec des nucléus 2.4 bio. Des prélèvements de poches perlières et de perles ont été réalisés à huit temps : 1 jour, 7 jours, 21 jours, 2 mois, 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois.
Protocoles d'extraction des ARN, de synthèse des cDNA et de PCR quantitative
Extraction des ARN totaux
Les ARN ont été isolés à partir d'un échantillon de manteau, de greffon ou de poches perlières issus de la greffe expérimentale et conservés dans du RNAlater® (Ambion). Les tissus ont été rincés avec ImL de PBS, dilacérés au scalpel dans une boite de pétri sur glace puis repris dans 1 mL de Trizol® (Invitrogen). L'extraction s'est déroulée sur agitateur sur la nuit à 4°C. Les tubes ont ensuite été mis à incuber au bain-marie 5 min à 30°C, puis vortexés pendant 30 sec. Le broyât a été centrifugé à 12000 g pendant 10 min à température ambiante, et ImL de surnageant a été prélevé et transféré dans un nouveau tube. La séparation des acides nucléiques et des protéines a été réalisée en ajoutant 200
Figure imgf000045_0001
de chloroforme par tube, et en mélangeant par inversion. Après 15 min d'incubation à température ambiante, les tubes ont été centrifugés à 12000g pendant 10 min à 4°C. La phase supérieure, d'environ 500
Figure imgf000045_0002
et contenant les ARN, a été transférée dans un nouveau tube. Les ARN ont été précipités sur la nuit à -80°C par 250 μΐ^ d'isopropanol et 250 μΐ^ d'une solution saline « High sait» (0,8 M TriSodium Citrate ; 1,2 M chlorure de sodium). Les échantillons ont été centrifugés 30 min à 15000 g. Le surnageant a été vidé, et le culot d'ARN a été lavé deux fois au vortex avec 1 mL d'éthanol à 70% suivi d'une étape de centrifugation de 15000 g à 4°C pendant 15 min. Les culots ont ensuite été séchés sous la hotte 10 min à température ambiante puis repris dans 50 μΐ^ d'eau RNAse free. Les tubes ont alors été mis à incuber au bain- marie 10 min à 55°C, avant d'être homogénéisés à la main. Les ARN ont été stockés à - 80°C. La qualité et la quantité des ARN obtenus ont été évaluées par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% dans du TAE 0,5X à 100 mV, et par dosage spectrophotométrique au Nanodrop ND1000 et à l'Agilent 2100 Bioanalyzer (kit RNA 6000 Nano).
Transcription inverse
La synthèse des ADNc de greffons et de poches perlières pour la détermination du niveau d'expression relatif des biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle candidats a été réalisée à partir de 800 ng d'ARN de greffons et de poches perlières, en utilisant le kit SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (InvitrogenTM- Cat. No: 18064- 014) selon les instructions du fournisseur.
PCR quantitative
La mesure du niveau d'expression des biomarqueurs prédictifs candidats de la qualité de la perle a été réalisé par qPCR haut-débit sur le système BioMark™ HD (Fluidigm Corporation) en utilisant le kit 2XTaqManPreAmp Master Mix (Applied Biosystems - P/N 4384266) pour l'étape de préamplification et le kit 2XTaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems - P/N 4369016) pour l'étape d'amplification, en suivant les instructions du fournisseur. Quatre puces Fluidigm 96.96 DynamicArray Real Time PCR (BMK-M-96.96) ont été utilisées. Le programme d'amplification réalisé est le suivant : 2 min à 50°c puis 10 min de dénaturation à 95°C, 35 cycles d'amplification (15 sec de dénaturation à 95°C, 1 min d'hybridation et d'élongation à 60°C) avec une mesure de fluorescence à la fin de chaque cycle, et courbe de dissociation de 60°C à 95°C avec une mesure de la fluorescence en continu tous les 1°C. Les données ont été extraites et analysées à l'aide des logiciels Fluidigm Real-time analysis (Fluidigm Corporation) et Biomark Melting Curve analysis (Fluidigm Corporation). Le niveau d'expression relatif des gènes a été déterminé par la méthode du 2Λ-ΔΔα (Livak and Schmittgen, 2001) selon la formule suivante : fold = 2Λ-ΔΔα = 2A-[DCt cible - DCtcalibrator] . Le DCt cible correspond à la moyenne des différences de Ct entre les biomarqueurs prédictifs et les gènes de référence 18S et SAGE1 pour les échantillons de greffons ou de poches perlières du groupe cible « A ». Le DCt calibrator correspond à la moyenne des différences de Ct entre les biomarqueurs prédictifs et les gènes de référence 18S et SAGE1 pour les échantillons de greffons ou de poches perlières du groupe calibrator « B », tel que décrit dans la présente invention. Évaluation de la qualité des perles
Préalablement à leur évaluation, les perles récoltées dans le cadre de la greffe expérimentale ont été lavées au gros sel, rincées dans de l'eau douce, essuyées avec un chiffon propre et lustrées.
Afin de procéder à l'évaluation globale de la qualité des perles, les paramètres de qualité des perles ont été décomposés en différentes variables de la manière suivante : une variable « Épaisseur de nacre à la surface de la perle », une variable « Nombre de défauts à la surface des perles » et une variable « Qualité commerciale ».
La variable « Épaisseur de nacre à la surface de la perle » correspond à la mesure en millimètre de l'épaisseur minimale de nacre présente à la surface du nucléus. Celle-ci a été obtenue par soustraction du diamètre du nucléus au plus petit diamètre de la perle et division de la différence de diamètre par 2. Les diamètres des perles et des nuclei ont été mesurés à partir d'images de perles et de nuclei scannées (300 pixels/cm, scanner EPSON perfection 4990 photo) et traitées avec le logiciel d'analyse d'image ImageJ (version 1.44). La variable « Nombre de défauts à la surface des perles » correspond à la classification de chaque perle en 4 classes de qualité en fonction du nombre de défauts observés à leur surface (perles sans défaut, perles avec 1 à 5 défauts, perles avec plus que 5 défauts et perles complètement recouvertes de défauts). Les défauts pris en considération sont les piqûres, les boursouflures et les comètes. Dans un second temps une note allant de 0 à 3 a été attribuée à chaque perle en fonction de la classe de défaut à laquelle elle appartient (de 0 pour les perles recouvertes de défaut à 3 pour les perles sans défaut).
La variable « Qualité commerciale » correspond à la classification des perles en 5 catégories de qualité (A, B, C, D et Rebut). Cette classification a été réalisée à deux reprises conformément aux critères définis par la Délibération n°2005-42 du 4 février 2005 (Journal Officiel de la Polynésie). Dans un second temps une note allant de 0 à 4 a été attribuée à chaque perle en fonction de la catégorie à laquelle elle appartient (de 0 pour les perles de catégorie « rebut » à 4 pour les perles de catégorie « A »). Afin de mettre en évidence l'effet donneuse, le classement des huîtres perlières donneuses de greffons par ordre croissant de qualité en fonction de chaque variable a été réalisé. Ce classement a été réalisé par l'attribution d'une note à chaque huître perlière donneuse sur la base de l'évaluation de la qualité des perles récoltées à 18 mois dans le cadre de la greffe expérimentale. Pour la variable « Épaisseur de nacre à la surface de la perle », cette note correspond à la moyenne des épaisseurs des perles récoltées par donneuse. Pour les variables « Nombre de défauts à la surface des perles » et « Qualité commerciale », la note de chaque huître perlière donneuse correspond à la moyenne des notes des perles récoltées par donneuse.
Constitution des plans d'échantillonnages de greffons et de poches perlières pour la validation des biomarqueurs de la croissance et de la qualité de la perle
Afin de constituer des groupes d'échantillons de greffons et de poches perlières issus d'huîtres perlières donneuses à l'origine de la production de perles de qualité contrastée, deux groupes d'huîtres perlières donneuses de greffons ont été créés pour chacune des variables « Épaisseur », « Qualité » et « Défaut », sur la base de l'effet donneuse et de la qualité des perles de 18 mois récoltées dans le cadre de la greffe expérimentale. Le « Groupe A » (cible), correspondant aux huîtres perlières donneuses produisant en moyenne des perles de qualité supérieure (épaisseur de nacre importante, peu de défauts de surface et/ou meilleure classification de qualité). Le « Groupe B » (témoin ou calibrator) correspondant à un ensemble d'huîtres perlières donneuses de greffons représentatif de la population naturelle (sauvage) d'huîtres perlières donneuses à disposition des professionnels de la perliculture, et utilisées dans le cadre de greffes à but commercial.
La constitution des « Groupes A » (cible) a été réalisée en procédant à une analyse des données brutes de la qualité des perles et du classement des huîtres perlières donneuses de greffons, une procédure de comparaison multiple par paire de Dunn, et une classification ascendante hiérarchique. La constitution de ces groupes d'huîtres perlières donneuses a ensuite permis de définir pour chaque variable deux plans d'échantillonnages de greffons et de poches perlières à l'origine de la production de perles contrastées : un plan d'échantillonnage de greffons issus des huîtres perlières donneuses constituant les groupes A et B, et un plan d'échantillonnage de poches perlières issues de la greffe des greffons des huîtres perlières donneuses constituant les groupes A et B.
Analyses statistiques
L'ensemble des analyses statistiques réalisées dans le cadre de la validation des biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle ont été réalisées à l'aide du logiciel Xlstat (version 2009.4.02) pour les tests de Shapiro-Wilk, Kruskall-Wallis, la procédure de comparaison multiple de Dunn et la classification ascendante hiérarchique, et du logiciel R (version 2.10.0) pour le test de Wilcoxon. Le test de normalité de Shapiro- Wilk a été utilisé avec un seuil a de 5%. Le test de Kruskall-Wallis a été réalisé avec un seuil a de 5%. La procédure de comparaison multiple de Dunn a été réalisée en appliquant au niveau de signification une correction de Bonferroni (seuil corrigé a = 0.01%). La classification ascendante hiérarchique a été réalisée en utilisant la distance du χ2 comme indice de dissimilarités et la méthode de Ward comme méthode d'agrégation. Aucun nombre de classe n'a été imposé et le niveau de troncature a été défini de manière automatique. Le test de Wilcoxon a été utilisé avec un seuil a de 5% et de manière unilatérale.
Résultats
L'approche globale d'analyse du transcriptome a permis d'identifier un grand nombre de séquences nucléotidiques exprimées au sein des tissus responsables de la biominéralisation de la coquille et de la perle. La constitution de la banque EST de manteau nous a permis d'identifier 82 séquences nucléotidiques codant des protéines potentiellement impliquées dans la biominéralisation de la coquille chez P. margaritifera. La constitution des banques SAGE de greffons et de poches perlières a permis d'identifier plus de 5 000 séquences de gènes annotés et exprimés au sein de tissus responsables des processus de biominéralisation de la perle. Enfin, l'approche protéomique globale mise en place sur les constituants de la coquille et des perles a permis d'identifier 130 séquences protéiques constitutives des structures minéralisées chez P. margaritifera. Au final, l'exploitation de ces banques de données protéomique et transcriptomiques a permis de sélectionner un ensemble de 268 biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle candidats et, dont 205 codent des protéines inconnues à ce jour chez P. margaritifera. Sur les 268 biomarqueurs identifiés, 224 couples d'amorces efficaces et spécifiques ont été mis au point et 188 biomarqueurs prédictifs candidats ont été sélectionnés et testés. La validation des biomarqueurs prédictifs candidats en tant que biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle a consisté à corréler le niveau d'expression de ces biomarqueurs prédictifs à la qualité commerciale, à l'épaisseur et au nombre de défauts des perles obtenues dans le cadre de la greffe (Figure 2).
L'analyse du taux d'expression des biomarqueurs candidats a ainsi été réalisée au sein des tissus biominéralisateurs de la perle et a permis d'identifier des séquences nucléotidiques différentiellement exprimées en fonction de la qualité des perles récoltées. Une séquence nucléotidique est considérée comme différentiellement exprimée si l'expression relative de ladite séquence nucléotidique dans le groupe A est supérieure ou inférieure d'un facteur, ou « fold », supérieur ou égal à 2 à l'expression de la même séquence nucléotidique dans le groupe B, tel que décrit dans la présente invention.
L'analyse conjointe des analyses du niveau d'expression des séquences nucléotidiques en corrélation avec la qualité des perles a abouti à la validation d'un ensemble de 42 biomarqueurs prédictifs de la croissance et de la qualité de la perle chez P. margaritifera (tableau 11). Variable Sens du niveau Nombre de Nombre total de d'expression des biomarqueurs biomarqueurs non biomarqueurs différentiellement redondants entre les
(groupe A vs. groupe exprimés au sein variables
B) des greffons
Epaisseur Surexpression 37 42
Sous-expression 6
Défauts Surexpression 11
Sous-expression 7
Qualité commerciale Surexpression 7
Sous-expression 14
Tableau 11 : Nombre de biomarqueurs de la qualité de la perle chez P. margaritifera, présentant unfold supérieur ou égal à 2.
La liste complète des 42 biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle obtenus est présentée dans les tableaux 1 et 12.
Différence d'expression entre les huîtres du groupe A et les huîtres du groupe B pour les critères
Qualité
Épaisseur Défauts commerciale
Identifiant Nom Greffon Poches Greffon Poches Greffon Poches
SEQ ID NO 1 CLEC2-2 4,986 0,581 0,040 0,847 2,626 19,279
SEQ ID NO 2 C3 9,535 1,000 0,254 0,229 2,707 1,097
SEQ ID NO 3 CALC-1 3,990 0,335 0,003 0,004 2,218 0,024
SEQ ID NO 4 CLEC3-1 3,399 6,109 0,067 0,202 15,906 1,507
SEQ ID NO 5 DERM-2 3,245 3,649 0,188 1,171 0,188 1,781
SEQ ID NO 6 C9 9,793 1,482 0,094 0,960 0,094 2,672
SEQ ID NO 7 1 0,210 1,608 0,136 0,569 0,206 0,569
SEQ ID NO 8 MUCO-2 19,752 2,164 2,128 0,245 8,262 3,504
SEQ ID NO 9 C88bis 11,366 2,350 4,244 1,323 0,193 1,563
SEQ ID NO 10 shem5-l 45,682 1,478 10,853 0,784 0,528 1,516
SEQ ID NO 11 shem7-2 7,064 1,825 7,670 0,905 0,918 0,972
SEQ ID NO 12 C85 6,565 1,959 2,523 1,224 0,633 1,640
SEQ ID NO 13 C14 29,368 1,612 0,211 0,978 1,723 0,581
SEQ ID NO 14 C18 17,062 2,323 0,173 0,733 0,925 0,242
SEQ ID NO 15 C22 12,098 1,714 0,427 0,560 1,722 2,742
SEQ ID NO 16 Protinh3-l 8,790 2,573 0,439 1,340 0,572 2,265
SEQ ID NO 17 C2 6,480 1,091 0,257 0,433 0,643 0,998
SEQ ID NO 18 C46 0,199 0,040 2,902 0,462 0,517 1,217
SEQ ID NO 19 Cbind-3 0,470 1,508 0,135 0,131 1,136 0,118
SEQ ID NO 20 C66ter 5,562 1,777 2,696 0,762 0,925 1,541 SEQ ID NO: 21 C17 22,072 2,210 0,990 1,040 3,654 0,388
SEQ ID NO: 22 PLW-2 19,542 1,336 0,823 0,942 0,317 1,789
SEQ ID NO: 23 PIF-2 7,020 5,150 0,642 1,303 3,094 1,310
SEQ ID NO: 24 46 6,497 1,936 0,623 0,719 3,023 1,465
SEQ ID NO: 25 C6 6,153 2,619 0,563 1,198 0,260 0,565
SEQ ID NO: 26 C26bis 5,437 6,844 1,156 1,257 2,553 2,880
SEQ ID NO: 27 C54(C53bis) 9,155 4,211 0,965 0,448 6,646 2,288
SEQ ID NO: 28 mpll-2 1,178 3,283 0,441 1,618 5,525 2,593
SEQ ID NO: 29 PMMG1-2 12,967 0,268 0,502 0,129 1,296 3,741
SEQ ID NO: 30 73 8,999 1,052 0,869 1,004 0,936 0,509
SEQ ID NO: 31 C23 7,991 1,515 0,721 0,816 0,788 0,760
SEQ ID NO: 32 Cl 6,654 1,289 0,985 0,650 0,736 0,867
SEQ ID NO: 33 MNK-1 6,218 1,294 1,674 0,745 1,384 1,030
SEQ ID NO: 34 PLC-2 6,153 1,316 1,338 0,747 0,856 0,107
SEQ ID NO: 35 mp9-2 6,140 1,569 1,169 0,978 1,169 1,248
SEQ ID NO: 36 C75bis 5,703 1,512 0,604 1,155 0,604 0,882
SEQ ID NO: 37 13 5,210 1,724 1,129 0,990 1,129 1,501
SEQ ID NO: 38 C35bis 0,198 0,364 0,986 0,589 0,566 1,269
SEQ ID NO: 39 2 0,153 1,061 1,012 0,716 0,593 1,586
SEQ ID NO: 40 mp2-2 0,056 1,054 1,839 1,007 1,220 1,007
SEQ ID NO: 41 C8 5,595 1,280 1,163 0,543 0,808 0,950
SEQ ID NO: 42 Protinh2-l 1,175 1,335 0,619 0,972 0,025 1,022
Tableau 12 : Liste des gènes biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle chez P. margaritifera (les résultats correspondent à la différence d' expression entre les huîtres du groupe A et les huîtres du groupe B)
Ces travaux ont donc permis de mettre en évidence une signature prédictive de la capacité de biominéralisation d'une huître perlière donneuse.
15 des 42 biomarqueurs SEQ ID NO : 1 à 42 ont par la suite été évalués à partir d'un jeu de données résultant de deux campagnes de greffes supplémentaires et indépendantes de celle décrite ci-dessus.
Greffes expérimentales Lors de greffe G2, 67 huîtres donneuses de greffons ont été utilisées. Lors de la greffe G3, 64 huîtres donneuses de greffons provenant d'un autre lot que celui des huîtres G2 ont été utilisées. Cinquante greffons ont été découpés à partir du manteau de chaque valve de chaque huître perlière donneuse. Deux greffons en provenance de chaque donneuse ont été conservés (1 greffon par valve) afin de déterminer, selon la méthode décrite dans la présente invention, les niveaux d'expression de 15 des 42 biomarqueurs SEQ JD NO : 1 à 42. Les greffons restant en provenance de chaque valve de chaque huître perlière donneuse ont été greffés dans des huîtres perlières receveuses, 3208 huîtres pour G2 et 3051 huîtres pour G3, en utilisant des nucléus de diamètre identique. Les perles de G2 ont été récoltées 15 mois post- greffe, celles de G3 à 16 mois postgreffe.
Classement des donneuses de greffons pour les greffes G2 et G3 Une note a été attribuée à chaque huître perlière donneuse sur la base de l'évaluation de la qualité des perles récoltées et selon le mode de calcul décrit dans la présente invention. Un total de 2074 et 1879 perles provenant des greffes G2 et G3 respectivement ont été analysées sur chacune des 3 variables « Epaisseur de nacre à la surface de la perle », « Nombre de défauts à la surface des perles » et « Qualité commerciale ». Pour chacune des greffes G2 et G3, 4 huîtres perlières donneuses produisant en moyenne des perles de qualité supérieure (épaisseur de nacre importante, peu de défauts de surface et/ou meilleure classification de qualité) et constituant le Groupe A (cible), ont été sélectionnées (Tableau 13). Le Groupe B (témoin ou calibrator) correspond à un ensemble de 23 huîtres perlières donneuses de greffons représentatif de la population d'huîtres perlières utilisées lors des greffes G2 et G3.
Tableau 13 : Comparaison des moyennes des variables « Epaisseur de nacre à la surface de la perle », « Nombre de défauts à la surface des perles » et « Qualité commerciale » selon les groupes d'huîtres donneuses utilisées lors des greffe G2 et G3. Le gain de qualité des perles produites par les donneuses du groupe A par rapport à celles du groupe B, exprimé en pourcentage, est indiqué en gras et entre parenthèse. Valeur moyenne des variables de qualité selon les groupes d'huître donneuses étudiées, pour chacune des greffes G2 et G3
Greffes G2 G3
Moyennes des Toutes B A Toutes B A variables / Groupe donneuses donneuses
de donneuses
Epaisseur 1,707 1,688 2,196 1,597 1,585 2,022
(+30%) (+28%)
Nombre de défauts 1,529 1,447 0,771 1,688 1,673 0,970
(+47%) (+42%)
Qualité commerciale 1,557 1,594 2,429 1,356 1,276 2,118
(+52%) (+66%)
Résultats
En ce qui concerne l'analyse des perles de la greffe G2, le gain de qualité des perles produites par les donneuses du groupe A par rapport à celles du groupe B sur chacune des variables « Epaisseur de nacre à la surface de la perle », « Nombre de défauts à la surface des perles » et « Qualité commerciale » est de 30%, 47% et 52% respectivement (Tableau 13). Pour la greffe G3, le gain de qualité des perles produites par les donneuses du groupe A est de 28%, 42% et 66% respectivement. Les valeurs moyennes de chaque variable obtenues dans le groupe B et dans le groupe constitué par l'ensemble des donneuses utilisées lors de la greffe sont similaires, quelle que soit la greffe G2 ou G3 considérée. Ces résultats illustrent la représentativité des donneuses du groupe B sélectionnées au sein de la population de donneuses utilisées lors des deux greffes indépendantes G2 et G3.
Les niveaux d'expression relatifs de 15 biomarqueurs prédictifs de la qualité de la perle chez P. margaritifera ont été déterminés par PCR en temps réel selon la méthodologie décrite dans la présente invention. Ainsi les niveaux d'expression dans le groupe des donneuses A et B ont été calculés pour chacune des greffes G2 et G3 et chacune des 3 variables d'intérêt : Epaisseur / Qualité commerciale / Défauts. Les niveaux d'expression mesurés ont été comparés à ceux obtenus lors de la première greffe (Gl) et confirment les résultats préalablement obtenus. Les niveaux de surexpression ou de sous-expression significatifs (fold supérieur ou égal 2, notés « + » et « - » respectivement) pour chacun des 15 biomarqueurs de haute capacité de biominéralisation, obtenus lors des greffes Gl, G2 et G3, sont indiqués dans le tableau 14.
Tableau 14 : Comparaison des niveaux de surexpression ou de sous-expression des biomarqueurs de haute capacité de biominéralisation des huîtres perlières donneuses du groupe A par rapport à l'échantillon témoin selon la greffe considérée, selon la greffe considérée.
Figure imgf000055_0001
L'analyse conjointe des analyses du niveau d'expression de 15 des 42 biomarqueurs SEQ ID NO : 1 à 42 en corrélation avec la qualité des perles obtenues lors de trois greffes expérimentales indépendantes a donc abouti à la définition d'une liste affinée de 15 biomarqueurs prédictifs de la croissance et de la qualité de la perle chez P. margaritifera (Tableau 14).

Claims

REVENDICATIONS
1. Signature prédictive de la qualité commerciale des perles obtenues en utilisant une huître donneuse et/ou de la vitesse de dépôt nacré autour du nucléus en utilisant ladite huître donneuse, ladite signature comprenant le profil d'expression dans le manteau de ladite huître donneuse d'au moins un biomarqueur comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 1, 4, 5, 8, 11, 14, 18, 23, 26, 27, 28, 36, 39, 40 et 42, leurs variants et leurs fragments.
2. Signature prédictive selon la revendication 1, ladite signature comprenant le profil d'expression dans le manteau de ladite huître donneuse d'au moins une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 3, 4, 5, 11 et 14, leurs variants et leurs fragments, et ladite signature étant prédictive de la qualité commerciale des perles obtenues en utilisant ladite huître donneuse.
3. Signature prédictive selon la revendication 1 ou la revendication 2, ladite signature comprenant le profil d'expression dans le manteau de ladite huître donneuse d'au moins une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 8, 18, 23, 26, 27, 36, 39 ou 40, leurs variants et leurs fragments, et ladite signature étant prédictive de la vitesse de dépôt nacré autour du nucléus en utilisant ladite huître donneuse.
4. Signature prédictive selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ladite signature comprenant le profil d'expression dans le manteau de ladite huître donneuse d'au moins une séquence nucléotidique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 28 ou 42, leurs variants et leurs fragments, et ladite signature étant en outre prédictive du nombre de défauts de surface des perles obtenues en utilisant ladite huître donneuse.
5. Procédé d'identification et/ou de sélection d'une huître donneuse de greffons de haute capacité de biominéralisation, dans lequel :
(a) on détermine, dans un échantillon biologique de ladite huître, le niveau d'expression d'au moins deux biomarqueurs prédictif tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, et (b) on compare le niveau d'expression obtenu à l'étape (a) à un niveau d'expression témoin.
6. Kit permettant la mise en œuvre du procédé selon la revendication 5, comprenant des moyens de détermination du profil d'expression d'au moins un biomarqueur tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits moyens permettent de déterminer le profil d'expression au niveau transcriptomique par RT-PCR, RT-qPCR, PCR quantitative à haut débit.
7. Kit permettant la mise en œuvre du procédé selon la revendication 5, comprenant des moyens de détermination du profil d'expression d'au moins un biomarqueur tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits moyens permettent de déterminer le profil d'expression au niveau protéique.
8. Procédé de production d'au moins une perle de qualité supérieure, comprenant la culture d'au moins une huître receveuse comprenant la signature prédictive selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou identifiée selon le procédé d'identification de la revendication 5.
9. Utilisation d'au moins un biomarqueur comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sélectionné parmi la liste consistant en SEQ ID NO : 1, 4, 5, 8, 11, 14, 18, 23, 26, 27, 28, 36, 39, 40 et 42, leurs variants et leurs fragments, pour déterminer la capacité de biominéralisation d'une huître donneuse de greffons.
10. Utilisation d'au moins un biomarqueur sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4, 5, 11 et 14, de préférence de la séquence SEQ ID NO : 4, pour prédire la capacité d'une huître donneuse de greffon à produire des perles de haute qualité commerciale.
11. Utilisation d'au moins un biomarqueur sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 42, de préférence la séquence SEQ ID NO : 28 pour prédire la capacité d'une huître donneuse de greffon à produire des perles présentant un faible nombre de défauts de surface.
12. Utilisation d'au moins un biomarqueur sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO : 8, 18, 23, 26, 27, 36, 39 et 40, pour prédire la capacité d'une huître donneuse de greffon à produire des perles présentant un faible nombre de défauts de surface.
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