CN105051207A - 预测移植物供体珍珠牡蛎的生物矿化能力的标志 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种标志，所述标志预测移植物供体牡蛎的生物矿化能力，所述标志包含至少一种生物标志物的表达谱，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自SEQIDNO1至SEQIDNO42、其变体以及片段。本发明的另一个主题是一种具有高生物矿化能力的移植物供体珍珠牡蛎，所述移植物供体珍珠牡蛎的特征在于它具有根据本发明的预测标志。本发明还涉及一种生物标志物，所述生物标志物预测移植物供体珍珠牡蛎的生物矿化能力，所述生物标志物选自由SEQIDNO1至SEQIDNO42组成的清单。

Description

预测移植物供体珍珠牡蛎的生物矿化能力的标志
技术领域
本发明涉及珍珠养殖的领域。本发明更具体地涉及移植物供体珍珠牡蛎的生物矿化能力的预测标志。本发明还涉及一种包含根据本发明的标志的具有高生物矿化能力的珍珠牡蛎。
背景技术
珍珠养殖是一项涉及在天然环境中养殖珠母贝属种(Pinctadasp.)珍珠牡蛎以生产养殖珍珠的人类活动。在第一步骤中，采集将被用于供体牡蛎或接受体牡蛎的珍珠牡蛎并且对这些珍珠牡蛎进行培育以达到为成功移植所需的发育水平。移植是一种外科手术，在所述外科手术中，将移植物——即供体牡蛎的外套膜的一部分(约4mm2)——连同珍珠母珠粒(即核)一起插入到接受体牡蛎的珍珠囊袋(pearlpouch)中。在被插入到接受体珍珠牡蛎中之后，所述移植物的矿化上皮边缘增殖并且内衬于所述珍珠囊袋以形成珍珠囊，所述珍珠囊围绕所述核。所述珍珠囊然后使珍珠母层在核周围沉积，从而形成珍珠(Cochennec-Laureau等,AquaticLivingResource,2010:23,131-140)。
据估计，所生产的珍珠当中平均仅有3％至5％具有非常高的品质。大部分的珍珠具有表面缺陷、不均匀的颜色或过薄的珍珠母厚度。由于珍珠养殖在经济上的重要性，特别是在法属波利尼西亚(FrenchPolynesia)，因此需要使得所生产的高品质珍珠的百分比能够提高的工具或方法。
为了鉴定具有使得能够生产高品质珍珠的特定特性的供体珍珠牡蛎或接受体珍珠牡蛎，已经利用了遗传学方法，特别是基因组学和转录组学方法。
Wada和Komaru(Aquaculture,1996,142:25-32)的研究工作由此已经使得有可能对“供体效应”进行观测，该效应对应于供体珍珠牡蛎对珍珠的特征、特别是对它们的颜色和光泽的影响。
美国专利US7163795描述了一种用于鉴定能够表达蛋白质珍珠母素(Nacrein)(一种构成珍珠母并且潜在地参与生物矿化过程的蛋白质)的牡蛎的方法，所述方法可以用于珍珠养殖中。该专利还描述了一种用于鉴定形成珍珠的最佳条件的方法，所述方法包括分析珍珠母素的表达。然而，由于珍珠养殖在传统上是在开放的海域上进行的，因此似乎难以对养殖条件进行调整。
在连续两项研究中，Inoue等描述了所生产的珍珠的品质与参与珍珠囊中的生物矿化的六种基因的基因表达谱之间的关系(Inoue等,ZoologicalScience,2011,28:32-6；Inoue等,MarBiotechnol.,2011,13:48-55)。由Inoue等所呈现的结果构成了对以下的首次证实：参与生物矿化过程的基因的表达水平可能与所获得的珍珠的品质具有相关性。
在2011年，Kinoshita等公布了通过转录组学方法对参与合浦珠母贝(Pinctadafucata)中的生物矿化的基因进行鉴定的一项大规模研究的结果(Kinoshita等,PLoSOne,2011；6(6):e21238)。然而，这项研究没有确立基因表达与珍珠品质之间的关系。
为了鉴定具有高生物矿化能力的移植物供体珍珠牡蛎，本申请的发明人进行了大规模的转录组学研究和蛋白质组学研究，并且分析了在实验性移植期间(1)基因表达谱与(2)品质和生长(珍珠母厚度)之间的关系。这项研究使得他们能够鉴定预测珍珠品质的特定基因标志。
发明内容
本发明因此涉及移植物供体牡蛎的生物矿化能力的预测标志，所述标志包含至少两种生物标志物的表达谱，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段。
根据一个实施方案，所述标志预测使用所述供体牡蛎所获得的珍珠的商业品质和/或在核周围的珍珠母沉积速率。
本发明还涉及通过使用供体牡蛎所获得的珍珠的商业品质和/或使用所述供体牡蛎在核周围的珍珠母沉积速率的预测标志，所述标志包含在所述供体牡蛎的外套膜中的至少一种生物标志物的表达谱，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1、4、5、8、11、14、18、23、26、27、28、36、39、40和42、其变体以及片段。
根据一个实施方案，本发明的标志包含选自SEQIDNO:3、4、5、11和14、其变体以及片段的至少一个核苷酸序列的表达谱，并且所述标志预测使用所述供体牡蛎所获得的珍珠的商业品质。
根据一个实施方案，本发明的标志包含选自SEQIDNO:8、18、23、26、27、36、39或40、其变体以及片段的至少一个核苷酸序列的表达谱，并且所述标志预测使用所述供体牡蛎的在核周围的珍珠母沉积速率。
根据一个实施方案，本发明的标志包含选自SEQIDNO:28或42、其变体以及片段的至少一个核苷酸序列的表达谱，并且所述标志还预测使用所述供体牡蛎所获得的珍珠的表面缺陷数目。
本发明还涉及一种具有高生物矿化能力的移植物供体牡蛎，所述牡蛎的特征在于它具有如上文所限定的预测标志。
本发明还涉及一种用于鉴定根据本发明的供体牡蛎的方法，其中：
(a)在所述牡蛎的生物样品中，测定如上文所述的至少两种预测性生物标志物的表达水平，以及
(b)将在步骤(a)中所获得的表达水平与对照表达水平相比较。
本发明还涉及一种用于选择根据本发明的供体牡蛎的方法，其中：
(a)在所述牡蛎的生物样品中，测定如上文所述的至少两种预测性生物标志物的表达水平，以及
(b)将在步骤(a)中所获得的表达水平与对照表达水平相比较。
本发明还涉及一种使得能够实施根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于测定如本发明中所述的至少一种生物标志物的表达谱的工具。根据第一个实施方案，所述工具使得有可能通过RT-PCR、RT-qPCR以及高速定量PCR在转录组水平上测定所述表达谱。根据第二个实施方案，所述工具使得有可能在蛋白质水平上测定所述表达谱。
本发明还涉及一种移植物，所述移植物的特征在于它具有如上文所限定的预测标志，所述移植物是根据本发明的供体牡蛎的外套膜的上皮的一部分。
本发明还涉及一种移植有如上文所限定的移植物的接受体牡蛎，其中存在核。
本发明还涉及一种用于生产至少一种更高品质珍珠的方法，所述方法包括养殖根据本发明的至少一种接受体牡蛎，所述牡蛎包含本发明的预测标志和/或已经依据根据本发明的牡蛎鉴定方法和/或选择方法加以鉴定；以及通过所述方法获得的珍珠。
本发明还涉及一种预测移植物供体牡蛎的生物矿化能力的生物标志物，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自由SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段组成的清单。
本发明还涉及至少一种生物标志物用以确定移植物供体牡蛎的生物矿化能力的用途，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自由SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段组成的清单。根据一个实施方案，所述生物标志物选自由SEQIDNO:1、4、5、8、11、14、18、23、26、27、28、36、39、40和42、其变体以及片段组成的清单。
本发明还涉及至少一种生物标志物用以预测移植物供体牡蛎生产高品质商业珍珠的能力的用途，所述生物标志物选自序列SEQIDNO:3、4、5、11以及14，优选地序列SEQIDNO:4。
本发明还涉及至少一种生物标志物用以预测移植物供体牡蛎生产具有少数表面缺陷的珍珠的能力的用途，所述生物标志物选自序列SEQIDNO:28和SEQIDNO:42，优选地序列SEQIDNO:28。
本发明还涉及至少一种生物标志物用以预测移植物供体牡蛎生产具有少数表面缺陷的珍珠的能力的用途，所述生物标志物选自序列SEQIDNO:8、18、23、26、27、36、39以及40。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
术语“珍珠养殖”指的是一项意图用珍珠牡蛎生产养殖珍珠的人类活动，所述珍珠牡蛎一般属于珠母贝属种。根据本发明的一个实施方案，所述牡蛎属于珠母贝属种，优选地属于合浦珠母贝(Pinctadafucata)、大珠母贝(Pinctadamaxima)或黑蝶珠母贝(Pinctadamargaritifera)种。
术语“预测供体珍珠牡蛎的高生物矿化能力的生物标志物”(在下文中被称为“预测性生物标志物”意指核苷酸序列，优选地基因，它在供体牡蛎中的表达谱预测所述供体珍珠牡蛎的高生物矿化能力，并且因此预测使用所述珍珠牡蛎作为移植物供体所生产的珍珠的品质。根据本发明的一个实施方案，本发明的预测性生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自下表1中的42个核苷酸序列、其变体以及片段：
表1
根据本发明的一个实施方案，本发明的预测性生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自以下15个核苷酸序列、其变体以及片段：CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、mp11-2(SEQIDNO:28)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、以及Protinh2-1(SEQIDNO:42)。
根据本发明的一个实施方案，所述片段是超过25个核苷酸、优选地超过50个、100个、150个、200个或超过500个核苷酸的核酸序列。根据本发明的一个实施方案，序列SEQIDNO:X的片段对应于SEQIDNO:X的超过25个连续核苷酸、优选地超过50个、100个、150个、200个或超过500个连续核苷酸的核苷酸序列。
根据一个实施方案，短语“序列SEQIDNO:X的变体”意指包含核苷酸序列SEQIDNO:X的超过25个核苷酸、优选地超过50个、100个、150个、200个或超过500个连续核苷酸的任何核酸序列。
根据本发明的另一个实施方案，短语“序列SEQIDNO:X的变体”意指在5'端和/或在3'端具有1至500个、优选地1至200个、更优选地1至100个另外的核酸的包含序列SEQIDNO:X的序列。
根据本发明的另一个实施方案，短语“序列SEQIDNO:X的变体”意指具有对SEQIDNO:X的微小结构修饰并且保持SEQIDNO:X的功能的序列。这些微小结构修饰的实例包括而不限于影响1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核酸的碱基缺失、取代或添加。
根据本发明的另一个实施方案，短语“序列SEQIDNO:X的变体”意指包含与序列SEQIDNO:X具有大于75％、80％、90％、95％或大于96％、97％、98％、99％的同一性的超过25个、优选地超过50个、100个、150个、200个、300个、400个、500个、1000个、1500个、2000个或3000个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的意义上，术语“同一性”在用于指代两个或更多个核苷酸序列的序列之间的关系时，指的是所述核苷酸序列之间的相似度，如通过具有两个或更多个碱基的链之间一致的数目所确定。
根据本发明，“同一性”对应于两个(或多于2个)序列之间同一性百分比。这个百分比被定义为在这些序列被最佳地比对时具有相同碱基的位置的数目除以这2个序列中最小的序列的碱基总数。这些序列之间的差异可以随机分布并且分布在它们的整个长度上。
当同一性百分比最大时，两个序列被认为是最佳比对的。此外，如对于本领域技术人员来说将是更加清楚的是，可能需要通过添加空位来获得两个序列之间的最佳比对。两个核酸序列之间的同一性百分比因此可以通过比较所述两个最佳比对的序列来确定，其中待比较的核酸序列相对于参考序列可以包含添加或缺失以实现所述两个序列之间的最佳比对。同一性百分比然后通过下述方式来计算：确定在这两个序列之间具有相同核苷酸的相同位置的数目，用所述相同位置的数目除以比较窗中位置的总数并且将所获得的结果乘以100以获得所述两个序列之间的同一性百分比。
优选地，用于确定同一性的方法经过设计以使得所比较的序列之间具有最大可能的匹配。
同一性百分比可以通过特定的数学模型或通过计算机程序(一般由术语“算法”来表示)来确定。用于计算核苷酸序列之间的同一性的方法是本领域技术人员公知的。这些方法的非限制性实例包括以下文献中所述的那些：ComputationsMolecularBiology(《计算分子生物学》),Lesk,A.M.编著,纽约州的牛津大学出版社(OxfordUniversityPress,NewYork),1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects(《生物计算：信息学和基因组计划》),Smith,D.W.编著,纽约州的学术出版社(AcademicPress,NewYork),1993；ComputerAnalysisofSequenceDataPart1(《序列数据的计算机分析》第1部分),Griffin,A.M.和GriffinH.G.编著,新泽西州的休玛纳出版社(HumanaPress,NewJersey),1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology(《分子生物学的序列分析》),vonHeinje,G.,学术出版社,1987；SequenceAnalysisPrimer(《序列分析入门》),Grivskov,M.和Devereux,J.编著,纽约州的米斯托克顿出版社(M.StocktonPress,NewYork),1991；以及Carillo等,SIAMJ.AppliedMath.,48,1073(1988)。
用于确定同一性的方法已被描述在公众可获得的计算机程序中。使用计算机程序的方法的优选实例包括而不限于软件包GCG，包含GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.2,387(1984)；威斯康星州麦迪逊的威斯康星大学的遗传学计算机小组(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,WI))、BLASTP、BLASTN、以及FASTA(Altschul等,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可在美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)和其它来源(BLASTManual(《BLAST手册》),Altschul等,NCB/NLM/NIH,马里兰州的贝塞斯达(Bethesda,Md.),20894；Altschul等(同上))获得。还可以使用本领域技术人员公知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法来确定两个序列之间的同一性百分比。
术语“预测标志”指的是特定的基因表达谱，它在供体珍珠牡蛎中的存在预测所述供体牡蛎的高生物矿化能力，并且因此预测使用所述供体牡蛎所生产的珍珠的品质和/或在核周围的珍珠母沉积速率。根据本发明的一个实施方案，本发明的预测标志包含如上文所述的1至42种预测性生物标志物。
短语“具有高生物矿化能力的供体牡蛎”指的是使得能够获得更高品质的珍珠和/或使得能够更快地获得更高品质的珍珠的移植物供体牡蛎。因此，根据一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得能够在少于24个月内、优选地在少于21个月内、更优选地在少于18个月内获得在核周围具有大于或等于0.8mm、优选地大于或等于1.5mm的珍珠母厚度的珍珠。根据本发明的一个实施方案，本发明的具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得在养殖18个月后获得100％的具有大于0.8mm的珍珠母厚度的珍珠，和/或在养殖18个月后获得30.2％的具有大于1.5mm的珍珠母厚度的珍珠。相比之下，在不选择供体牡蛎的情况下，这些百分比分别是80.9％和13.4％。
术语“更高品质的珍珠”指的是相对于预定阈值具有更高或更低的以下特征的珍珠：在核周围的珍珠母的厚度(在相同的养殖时间内在核周围获得更大的珍珠母沉积物)、和/或表面缺陷数目、和/或商业品质。在本发明的背景下，珍珠的品质可以通过3个变量来评价：“珍珠母厚度”变量、“珍珠表面的缺陷数目”变量、以及“商业品质”变量。根据本发明，具有高生物矿化能力的供体牡蛎是具有根据本发明的至少一种预测性生物标志物和/或本发明的至少一种预测标志的牡蛎。
根据本发明的一个实施方案，珍珠的珍珠母的厚度对应于在珍珠的核周围的珍珠母以毫米计的厚度。这可以例如通过用珍珠的最小直径减去核的直径并且将直径的差值除以2来测量。根据本发明的一个实施方案，珍珠和核的直径可以通过基于扫描的珍珠和核的图像进行计算来测量。可以用于测量珍珠和核的尺寸的分析软件的非限制性实例是ImageJ软件。根据本发明的一个实施方案，更高品质的珍珠具有大于0.8mm、优选地大于1.2mm、并且甚至更优选地大于1.5mm的珍珠母厚度。
根据本发明的一个实施方案，基于缺陷数目对珍珠品质进行的评定对应于在含有4个类别的分类系统中基于在它们的表面所观测到的缺陷数目对每一个珍珠进行的分类。这种分类所考虑的缺陷是凹坑、泡疤以及斑点。根据本发明的一个实施方案，第一类包括没有缺陷的珍珠；第二类包括具有1至5个缺陷的珍珠；第三类包括具有超过5个缺陷的珍珠；并且第四类包括完全被缺陷覆盖的珍珠。根据本发明的一个实施方案，更高品质的珍珠就缺陷数目来说属于第一类，即不具有任何缺陷。
根据一个实施方案，珍珠的商业品质是根据珍珠的表面状态(存在或不存在瑕疵)和光泽(光彩或亮度)来评估的，根据2005年2月4日的第2005-42号审议(Deliberation)(法属波利尼西亚的官方公报(OfficialJournalofFrenchPolynesia))中所提供的定义。根据这一审议，对珍珠品质的评估对应于将珍珠分为5个品质类别，即A类至D类和“不合格”类别。根据本发明的一个实施方案，更高品质的珍珠属于A类。
在本发明的意义上，位于数字前面的术语“约”意指比所述数字的标称值多或少10％。
具体实施方式
本发明涉及一种具有高生物矿化能力的供体珍珠牡蛎。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm，优选地大于或等于约1.2mm，更优选地大于或等于约1.5mm的珍珠母厚度的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能在约15个月，优选地约16个月，并且更优选地约18个月的养殖期后获得100％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠。
根据本发明的另一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能在约15个月，优选地约16个月，并且更优选地约18个月的养殖期后获得超过约30％的具有大于或等于约1.5mm的珍珠母厚度的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠。根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得约10％至20％，优选地约12.5％至17.5％，更优选地约14.3％的没有表面缺陷的珍珠。相比之下，本申请的发明人已经证实通常使用的移植物供体牡蛎仅使得有可能获得约5.2％的没有表面缺陷的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得超过5％，优选地超过10％、20％，更优选地超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得约10％至50％，优选地约20％至30％，更优选地约24.3％的属于A类的珍珠。根据本发明的另一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得约25％至70％，优选地约40％至60％，更优选地约51.4％的属于A类或B类的珍珠。相比之下，本申请的发明人已经证实通常使用的移植物供体牡蛎仅使得有可能获得约4.6％的属于A类的珍珠和约19.5％的属于A类或B类的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎(1)使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％，或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠；以及(2)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎(1)使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％，或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠；以及(2)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得(1)超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠；以及(2)超过5％，优选地超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎(1)使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％，或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠；以及(2)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠；以及(3)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据本发明，具有高生物矿化能力的供体牡蛎包含生物矿化品质的预测性生物标志物和/或生物矿化品质的预测标志。
本发明因此还涉及牡蛎的生物矿化能力的预测性生物标志物。
本发明因此还涉及移植物供体牡蛎的生物矿化能力的预测标志。
根据本发明，牡蛎的生物矿化能力的预测性生物标志物是包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自包括表1中所呈现的序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段的清单。根据本发明的一个实施方案，本发明的预测性生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自以下15个核苷酸序列、其变体以及片段：CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、mp11-2(SEQIDNO:28)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、以及Protinh2-1(SEQIDNO:42)。
根据本发明，本发明的预测标志包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自包括表1中所呈现的序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段的清单。根据本发明的一个实施方案，本发明的预测标志包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自以下15个核苷酸序列、其变体以及片段：CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、mp11-2(SEQIDNO:28)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、以及Protinh2-1(SEQIDNO:42)。
根据本发明的一个实施方案，本发明的预测标志包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个或42个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自包括表1中所呈现的序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段的清单。根据本发明的一个实施方案，本发明的预测标志包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自以下15个核苷酸序列、其变体以及片段：CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、mp11-2(SEQIDNO:28)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、以及Protinh2-1(SEQIDNO:42)。
根据一个实施方案，根据本发明的具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm，优选地大于或等于约1.2mm，更优选地大于或等于约1.5mm的珍珠母厚度的珍珠。
根据这个实施方案，所述预测性生物标志物预测在核周围的珍珠母厚度，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表2中的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
SEQ ID NO:10 shem5-1
SEQ ID NO:11 shem7-2
SEQ ID NO:12 C85
SEQ ID NO:13 C14
SEQ ID NO:14 C18
SEQ ID NO:15 C22
SEQ ID NO:16 Protinh3-1
SEQ ID NO:17 C2
SEQ ID NO:18 C46
SEQ ID NO:19 Cbind-3
SEQ ID NO:20 C66ter
SEQ ID NO:21 C17
SEQ ID NO:22 PLW-2
SEQ ID NO:23 PIF-2
SEQ ID NO:24 46
SEQ ID NO:25 C6
SEQ ID NO:26 C26bis
SEQ ID NO:27 C54(C53bis)
SEQ ID NO:29 PMMG1-2
SEQ ID NO:30 73
SEQ ID NO:31 C23
SEQ ID NO:32 C1
SEQ ID NO:33 MNK-1
SEQ ID NO:34 PLC-2
SEQ ID NO:35 mp9-2
SEQ ID NO:36 C75bis
SEQ ID NO:37 13
SEQ ID NO:38 C35bis
SEQ ID NO:39 2
SEQ ID NO:40 mp2-2
SEQ ID NO:41 C8
表2
根据一个实施方案，所述预测性生物标志物预测在核周围的珍珠母厚度，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自以下核苷酸序列、其变体以及片段：MUCO-2(SEQIDNO:8)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)。
根据这个实施方案，所述预测标志预测在核周围的珍珠母厚度并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据一个实施方案，所述预测标志包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据一个实施方案，所述预测标志包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列选自以下核苷酸序列、其变体以及片段：MUCO-2(SEQIDNO:8)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠。
根据这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠表面的缺陷数目，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表3中的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 基因名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
SEQ ID NO:21 C17
SEQ ID NO:22 PLW-2
SEQ ID NO:23 PIF-2
SEQ ID NO:24 46
SEQ ID NO:25 C6
SEQ ID NO:26 C26bis
SEQ ID NO:27 C54(C53bis)
SEQ ID NO:28 mp11-2
SEQ ID NO:42 Protinh2-1
表3
根据这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠表面的缺陷数目，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自核苷酸序列mp11-2(SEQIDNO:28)和Protinh2-1(SEQIDNO:42)。
根据这个实施方案，所述预测标志预测缺陷数目，并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测缺陷数目，并且包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表3的核苷酸序列、其变体或片段或由选自表3的核苷酸序列、其变体或片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测表面缺陷数目，并且包含1个或2个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自核苷酸序列mp11-2(SEQIDNO:28)和Protinh2-1(SEQIDNO:42)、其变体以及片段。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得超过5％，优选地超过10％、20％，更优选地超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠的商业品质，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表4中的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 基因名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
SEQ ID NO:10 shem5-1
SEQ ID NO:11 shem7-2
SEQ ID NO:12 C85
SEQ ID NO:13 C14
SEQ ID NO:14 C18
SEQ ID NO:15 C22
SEQ ID NO:16 Protinh3-1
SEQ ID NO:17 C2
SEQ ID NO:18 C46
SEQ ID NO:19 Cbind-3
SEQ ID NO:20 C66ter
SEQ ID NO:28 mp11-2
表4
根据这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠的商业品质，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自核苷酸序列CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、其变体以及片段。
根据这个实施方案，所述预测标志预测珍珠的商业品质，并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的商业品质，并且包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的商业品质，并且包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列选自CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、其变体以及片段。
根据本发明的另一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎(1)使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％，甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠；以及(2)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠。
根据本发明的这个实施方案，所述预测性生物标志物预测在核周围的珍珠母厚度和珍珠表面的缺陷数目，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表5中的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 基因名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
SEQ ID NO:21 C17
SEQ ID NO:22 PLW-2
SEQ ID NO:23 PIF-2
SEQ ID NO:24 46
SEQ ID NO:25 C6
SEQ ID NO:26 C26bis
SEQ ID NO:27 C54(C53bis)
表5
根据这个实施方案，所述预测标志预测核周围的珍珠母的厚度和珍珠表面的缺陷数目，并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表5的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表5的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测核周围的珍珠母的厚度和珍珠表面的缺陷数目，并且包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表5的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表5的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据另一个实施方案，所述预测标志预测在核周围的珍珠母厚度和珍珠表面的缺陷数目，并且包含(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段组成；以及(2)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测核周围的珍珠母厚度和珍珠表面的缺陷数目，并且包含(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自以下各项的核苷酸序列或由选自以下各项的核苷酸序列组成：MUCO-2(SEQIDNO:8)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、其变体以及片段；以及(2)包括1个核苷酸序列或2个核苷酸序列或由1个核苷酸序列或2个核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自核苷酸序列mp11-2(SEQIDNO:28)和Protinh2-1(SEQIDNO:42)、其变体以及片段。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎(1)使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％，或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠；以及(2)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据本发明的这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠的厚度和商业品质，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表6的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 基因名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
SEQ ID NO:10 shem5-1
SEQ ID NO:11 shem7-2
SEQ ID NO:12 C85
SEQ ID NO:13 C14
SEQ ID NO:14 C18
SEQ ID NO:15 C22
SEQ ID NO:16 Protinh3-1
SEQ ID NO:17 C2
SEQ ID NO:18 C46
SEQ ID NO:19 Cbind-3
SEQ ID NO:20 C66ter
表6
根据这个实施方案，所述预测标志预测珍珠的厚度和商业品质，并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表6的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表6的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的厚度和商业品质，并且包含1个核苷酸序列的表达谱或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表6的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表6的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的厚度和商业品质，并且包含：(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段组成；以及(2)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的厚度和商业品质，并且包含：(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自以下各项的核苷酸序列或由选自以下各项的核苷酸序列组成：MUCO-2(SEQIDNO:8)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、其变体以及片段；以及(2)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列选自CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、其变体以及片段。
根据本发明的另一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎使得有可能获得(1)超过5％，优选地超过10％，更优选地15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠；以及(2)超过5％，优选地超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据本发明的这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠表面的缺陷数目和珍珠的商业品质，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表7中的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
SEQ ID NO:28 mp11-2
表7
根据本发明的这个实施方案，所述预测标志预测珍珠的缺陷数目和商业品质，并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表7的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表7的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的厚度和商业品质，并且包含1个核苷酸序列的表达谱，或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表7的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表7的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测了珍珠的缺陷数目和商业品质，并且包含下述表达谱，所述表达谱包括：(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、或18个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段组成；以及(2)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测珍珠的缺陷数目和商业品质，并且包含(1)包括1个或2个核苷酸序列或由1个或2个核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自核苷酸序列mp11-2(SEQIDNO:28)和Protinh2-1(SEQIDNO:42)、其变体以及片段；以及(2)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列选自CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、其变体以及片段。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎(1)使得有可能在养殖少于24个月内，优选地在养殖少于21个月内，更优选地在养殖少于18个月内获得超过约25％，优选地约30％，更优选地超过约40％、50％、60％、70％、80％，或甚至更优选地超过约95％的具有大于或等于约0.8mm的珍珠母厚度的珍珠；以及(2)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％，更优选地超过15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的没有表面缺陷的珍珠；以及(3)使得有可能获得超过5％，优选地超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的属于A类和/或B类的珍珠。
根据本发明的这个实施方案，所述预测性生物标志物预测珍珠的厚度、表面的缺陷数目以及商业品质，并且包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自表8中的核苷酸序列、其变体以及片段。
标识号 基因名称
SEQ ID NO:1 CLEC2-2
SEQ ID NO:2 C3
SEQ ID NO:3 CALC-1
SEQ ID NO:4 CLEC3-1
SEQ ID NO:5 DERM-2
SEQ ID NO:6 C9
SEQ ID NO:7 1
SEQ ID NO:8 MUCO-2
SEQ ID NO:9 C88bis
表8
根据本发明的这个实施方案，所述预测标志预测核周围的珍珠母的厚度、缺陷数目以及珍珠的商业品质，并且包含至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表8的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表8的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，所述预测标志预测核周围的珍珠母的厚度、缺陷数目以及珍珠的商业品质，并且包含1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个核苷酸序列的组合的表达谱，所述核苷酸序列包含选自表8的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表8的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据这个实施方案，所述预测标志预测珍珠的缺陷数目、厚度以及商业品质，并且包含(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表2的核苷酸序列、其变体以及片段组成；(2)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表3的核苷酸序列、其变体以及片段组成；以及(3)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段或由选自表4的核苷酸序列、其变体以及片段组成。
根据这个实施方案，所述预测标志预测珍珠的缺陷数目、厚度以及商业品质，并且包含(1)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列包含选自以下各项的核苷酸序列或由选自以下各项的核苷酸序列组成：MUCO-2(SEQIDNO:8)、C46(SEQIDNO:18)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(C53bis)(SEQIDNO:27)、C75bis(SEQIDNO:36)、2(SEQIDNO:39)、mp2-2(SEQIDNO:40)、其变体以及片段；(2)包括1个或2个核苷酸序列或由1个或2个核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自核苷酸序列mp11-2(SEQIDNO:28)和Protinh2-1(SEQIDNO:42)、其变体以及片段；以及(3)包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的至少一个核苷酸序列的表达谱：1个核苷酸序列或2个、3个、4个、5个核苷酸序列的组合，所述核苷酸序列选自CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、shem7-2(SEQIDNO:11)、C18(SEQIDNO:14)、其变体以及片段。
根据一个实施方案，本发明的预测标志不是由SEQIDNO:28和SEQIDNO:42的表达谱所构成。
根据一个实施方案，本发明的预测标志不是由SEQIDNO:42或SEQIDNO:28的表达谱所构成。
根据一个实施方案，本发明的预测标志包含SEQIDNO:4的表达谱或由SEQIDNO:4的表达谱构成。根据一个实施方案，这种预测标志预测使用赋有所述标志的供体牡蛎所获得的珍珠的商业品质。
根据一个实施方案，本发明的预测标志包含SEQIDNO:28的表达谱或由SEQIDNO:28的表达谱构成。根据一个实施方案，这种预测标志预测使用赋有所述标志的供体牡蛎所获得的珍珠的表面缺陷数目。
根据一个实施方案，本发明的预测标志包含SEQIDNO:28和SEQIDNO:4的表达谱或由SEQIDNO:28和SEQIDNO:4的表达谱构成。根据一个实施方案，这种预测标志预测使用赋有所述标志的供体牡蛎所获得的珍珠的表面缺陷数目和所获得的珍珠的商业品质。
根据本发明的一个实施方案，具有高生物矿化能力的供体牡蛎相对于对照样品具有至少一种预测性生物标志物的过表达或低表达。
根据本发明的一个实施方案，本发明的预测标志对应于相对于如下文所定义的对照样品在移植物供体珍珠牡蛎的生物矿化组织中至少一种预测性生物标志物的过表达或低表达。
根据本发明的一个实施方案，核苷酸序列相对于对照样品的过表达或低表达对应于在表达水平上相对于对照样品有大于或等于2倍，优选地大于或等于5倍，更优选地大于或等于10倍并且甚至更优选地大于或等于25倍的差异。
根据一个实施方案，根据下表9，具有高生物矿化能力的供体珍珠牡蛎相对于对照样品具有至少一种预测性生物标志物的如下文所定义的过表达或低表达。
+：相对于对照样品过表达
-：相对于对照样品低表达
表9
根据本发明的一个实施方案，所述对照样品对应于代表可由珍珠养殖专业人员获得的并且用于针对商业目的的移植物的背景下的天然(野生)供体珍珠牡蛎群体的一组移植物供体珍珠牡蛎。
根据本发明的一个实施方案，预测性生物标志物的相对表达水平是通过定量PCR，根据2^-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)，根据下式：倍数＝2^-ΔΔCt＝^-[DCt目标-DCt校准物]，通过比较以下两组供体珍珠牡蛎来确定的：
-“组A”(目标)根据本发明的这个实施方案对应于平均来说生产具有更高品质(高珍珠母厚度、少数的表面缺陷和/或更好的品质分类)的珍珠的供体珍珠牡蛎；以及
-“组B”(对照或校准物)根据这个实施方案对应于代表可由珍珠养殖专业人员获得的并且用于针对商业目的的移植物的背景下的天然(野生)供体珍珠牡蛎群体的一组移植物供体珍珠牡蛎。
根据本发明的一个实施方案，所述定量PCR方法是基于荧光探针的使用。Ct对应于由所述探针发射的荧光超过预定阈值时PCR循环的数目。
根据第一个实施方案，目标DCt对应于目标组“A”的移植物或珍珠囊袋样品的目标预测性生物标志物与参考基因18S和SAGE1之间Ct的差值的平均值；并且校准物DCt对应于校准物组“B”的移植物或珍珠囊袋样品的目标预测性生物标志物与参考基因18S和SAGE1之间Ct的差值的平均值。
根据第二个实施方案，目标DCt对应于目标组“A”的移植物或珍珠囊袋样品的预测性生物标志物与参考基因18S和SAGE1之间Ct的差值的中值；并且校准物DCt对应于校准物组“B”的移植物或珍珠囊袋样品的预测性生物标志物与参考基因18S和SAGE1之间Ct的差值的中值。
本发明还涉及一种来自根据本发明的具有高生物矿化能力的供体珍珠牡蛎的移植物。
本发明因此涉及一种移植物，所述移植物包含根据本发明的预测性生物标志物和/或根据本发明的预测标志。
本发明还涉及一种移植接受体牡蛎，所述牡蛎包含来自通过本发明的鉴定方法所鉴定的供体牡蛎的移植物。
根据一个实施方案，在用来自根据本发明的供体牡蛎的移植物对接受体牡蛎进行移植后，可以在所述接受体牡蛎的珍珠囊处发现根据本发明的预测标志。
根据一个实施方案，所述接受体牡蛎中的所述预测标志预测珍珠表面的缺陷数目，并且包含至少一个核苷酸序列，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自CLEC2-2(SEQIDNO:1)、C9(SEQIDNO:6)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(SEQIDNO:27)、CALC-1(SEQIDNO:3)、C18(SEQIDNO:14)和Cbind-3(SEQIDNO:19)、其变体以及片段。根据本发明的一个实施方案，所述预测标志对应于CLEC2-2(SEQIDNO:1)、C9(SEQIDNO:6)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、C26bis(SEQIDNO:26)和/或C54(SEQIDNO:27)、其变体以及片段的过表达；和/或CALC-1(SEQIDNO:3)、C18(SEQIDNO:14)和/或Cbind-3(SEQIDNO:19)、其变体以及片段的低表达。
根据一个实施方案，所述接受体牡蛎中的所述预测标志预测珍珠的商业品质，并且包含至少一个核苷酸序列、优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自C3(SEQIDNO:2)、CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、C2(SEQIDNO:17)、C46(SEQIDNO:18)和Cbind-3(SEQIDNO:19)、其变体以及片段。根据本发明的一个实施方案，所述预测标志对应于C3(SEQIDNO:2)、CALC-1(SEQIDNO:3)、CLEC3-1(SEQIDNO:4)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、C2(SEQIDNO:17)、C46(SEQIDNO:18)和/或Cbind-3(SEQIDNO:19)、其变体以及片段的低表达。
根据一个实施方案，所述接受体牡蛎中的所述预测标志预测核周围的珍珠母的厚度，并且包含至少一个核苷酸序列、优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸序列的表达谱，所述核苷酸序列选自CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、C88bis(SEQIDNO:9)、C18(SEQIDNO:14)、Protinh3-1(SEQIDNO:16)、C17(SEQIDNO:21)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C6(SEQIDNO:25)、C26bis(SEQIDNO:26)、C54(SEQIDNO:27)、CALC-1(SEQIDNO:3)、C46(SEQIDNO:18)、PMMG1-2(SEQIDNO:29)和C35bis(SEQIDNO:38)、其变体以及片段。根据本发明的一个实施方案，所述预测标志对应于CLEC3-1(SEQIDNO:4)、DERM-2(SEQIDNO:5)、MUCO-2(SEQIDNO:8)、C88bis(SEQIDNO:9)、C18(SEQIDNO:14)、Protinh3-1(SEQIDNO:16)、C17(SEQIDNO:21)、PIF-2(SEQIDNO:23)、C6(SEQIDNO:25)、C26bis(SEQIDNO:26)和/或C54(SEQIDNO:27)、其变体以及片段的过表达；和/或CALC-1(SEQIDNO:3)、C46(SEQIDNO:18)、PMMG1-2(SEQIDNO:29)和/或C35bis(SEQIDNO:38)、其变体以及片段的低表达。
本发明还涉及一种用于鉴定具有高生物矿化能力的供体牡蛎的方法。
根据本发明，所述用于鉴定具有高生物矿化能力的供体牡蛎的方法包括：
(a)在移植物供体牡蛎的样品中测定形成预测标志的一种预测性生物标志物或多种预测性生物标志物的表达谱，所述标志预测生物矿化的品质，以及
(b)将在步骤(a)中所获得的表达谱与在代表天然群体的一组移植物供体珍珠牡蛎(“校准物”组B)中所获得的对照表达谱相比较。
根据本发明的一个实施方案，本发明的方法包括确定预测以下各项的标志的存在：核周围的珍珠母厚度、珍珠表面的缺陷数目和/或珍珠的商业品质，如上文所述。
根据本发明的一个实施方案，本发明的方法使得能够比较两组供体牡蛎(“目标”组A和“校准物”组B)的生物矿化能力，并且“校准物”B组中的供体珍珠牡蛎的表达水平用作参考以确立“目标”A组中具有高生物矿化特性的供体珍珠牡蛎的表达谱。
根据本发明的一个实施方案，优选地在采集步骤之后，对供体牡蛎的移植物进行表达谱的分析。
根据本发明的一个实施方案，在移植步骤前，对移植物供体牡蛎的外套膜进行表达谱的分析。
根据本发明的一个实施方案，在移植步骤之后，对已经接受移植物的牡蛎珍珠囊进行表达谱的分析。
根据本发明的一个实施方案，在RNA水平、DNA水平和/或蛋白质水平上对表达谱进行测定。
根据本发明的一个实施方案，对表达谱进行测定对应于测定所考虑的一种或多种预测性生物标志物的转录水平。用于测定核苷酸序列的转录水平的方法是本领域技术人员公知的，并且包括而不限于以下方法：RT-PCR、定量RT-PCR(RT-qPCR)、高速RT-qPCR、DNA芯片、RNA芯片。
根据本发明的一个实施方案，在蛋白质水平上对表达谱进行测定，并且对应于所考虑的一种或多种预测性生物标志物的翻译水平。用于测定核苷酸序列的翻译(即所翻译的蛋白质的表达)水平的方法是本领域技术人员公知的，并且包括而不限于以下方法：蛋白质印迹法、免疫化学、ELISA、夹心ELISA、PAGE……。
本发明还涉及一种通过本发明的鉴定方法所鉴定的牡蛎。根据这个实施方案，所鉴定的牡蛎具有对至少一个核苷酸序列特异的表达谱，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段。
本发明还涉及一种用于确定根据本发明的预测性生物标志物或根据本发明的预测标志的存在的试剂盒。
根据本发明的试剂盒因此使得能够实施本发明的鉴定方法。
根据本发明，所述试剂盒包含使得有可能测定至少一个核苷酸序列的表达谱的至少一种工具，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自包括序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段的清单。
根据一个实施方案，根据本发明的试剂盒包含对照样品，所述对照样品对应于来自天然群体的移植物供体珍珠牡蛎的生物矿化组织(外套膜)的生物材料。
根据本发明的一个实施方案，根据本发明的试剂盒包含使得有可能在转录组水平上通过RT-PCR、RT-qPCR、或高速定量PCR测定表达谱的工具。
根据这个实施方案，所述试剂盒包含用于提取总RNA的工具、逆转录工具、和/或用于扩增至少一个核苷酸序列的工具，所述核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自包括序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段的清单。
根据本发明的一个实施方案，所述扩增工具包括聚合酶和缓冲液、游离核苷酸以及至少一对引物，其中每一种引物特异性地并且有效地与选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段的序列杂交。
根据本发明的一个实施方案，引物对选自下表10中的引物对：
表10
根据本发明的一个实施方案，根据本发明的试剂盒包含使得有可能通过在蛋白质水平上测定表达谱(通过蛋白质组分析)来测定表达谱的工具。
根据这个实施方案，所述试剂盒包含特异性识别由包含以下序列或由以下序列组成的核苷酸序列所编码的蛋白质中的一种或多种的一种或多种抗体：SEQIDNO:1至SEQIDNO:42、其变体以及片段。
根据一个实施方案，所述试剂盒还包含总蛋白提取工具。
本发明还涉及一种装置，所述装置包含载体，所述载体包含对以编号SEQIDNO:1至SEQIDNO:42所标识的一个或多个核苷酸序列、其变体以及片段具有特异性的一种或多种探针，以实施根据本发明的鉴定方法。
在本发明的背景下，术语“探针”意指任何单链DNA片段或单链RNA片段，所述片段的序列与所搜寻的序列互补：它因此可以通过与经过标记(通过掺入与放射性原子/同位素或荧光/荧光染料基团连接的核苷酸)的探针杂交而被检测到，所述探针充当分子“诱捕物(hook)”。
根据优选的实施方案，所述装置的载体选自玻璃膜、金属膜、聚合物膜或二氧化硅膜。
这些装置是例如DNA芯片或RNA芯片，所述芯片包含以编号SEQIDNO:1至SEQIDNO:42所标识的一个或多个核苷酸序列、其变体以及片段，或与以编号SEQIDNO:1至SEQIDNO:42所标识的核苷酸序列、其变体以及片段互补的一个或多个序列。
本发明还涉及一种用于对接受体珍珠牡蛎进行移植的方法，所述方法包括将来自根据本发明的具有高生物矿化能力的供体牡蛎的移植物连同核一起插入到接受所述移植物的珍珠牡蛎的珍珠囊袋中，所述移植物对应于供体牡蛎的外套膜的上皮。根据本发明的一个实施方案，已经根据本发明的方法对所述具有高生物矿化能力的供体牡蛎进行鉴定。
根据本发明的一个实施方案，所述移植方法包括(i)打开接受体珍珠牡蛎；(ii)在接受体珍珠牡蛎的组织中形成切口以可以触及珍珠囊袋并且使得有可能在第三步骤(iii)中将移植物连同核一起插入到接受体珍珠牡蛎的珍珠囊袋中，所述移植物对应于根据本发明的供体牡蛎的外套膜的上皮的一部分(约4mm2)。
本发明还涉及一种用于生产具有更高品质的珍珠的方法，所述方法包括将来自根据本发明的具有高生物矿化能力的供体牡蛎的移植物移植到接受体牡蛎中。应当了解的是，所述接受体牡蛎包含核。根据本发明的一个实施方案，所述珍珠生产方法包括将核移植到接受体牡蛎的珍珠囊袋中，以及移植根据本发明的具有高生物矿化能力的供体牡蛎的外套膜的上皮的一部分。
根据本发明的一个实施方案，所述珍珠生产方法包括第一步骤，所述第一步骤包括采集和养殖珍珠牡蛎以获得根据本发明的供体珍珠牡蛎和接受体珍珠牡蛎；有利地，然后对根据本发明的供体珍珠牡蛎进行清洁以去除任何可能的寄生物；然后，将接受体珍珠牡蛎养殖优选地10至24个月、优选地12至20个月、甚至更优选地16至18个月的时间段。在养殖期的期间，移植物的矿化外部上皮边缘增殖并且内衬于珍珠囊袋，以产生珍珠囊，所述珍珠囊含有核并且将使珍珠母层沉积在核周围，从而引起珍珠的产生。
本发明还涉及通过如上文所述的用于获得珍珠的方法，使用根据本发明的具有高生物矿化能力的牡蛎作为移植物供体牡蛎所获得的珍珠。
附图说明
图1：所建立的实验方法的图示。
图2：用于验证黑蝶珠母贝(P.margaritifera)中的珍珠的生长和品质的候选生物标志物的方案。
实施例
鉴于以下实施例，本发明将更容易被理解和解释。
这项研究的目的在于研发所收集的珍珠的品质的预测标志，以选择具有“高矿化品质”的移植物供体牡蛎。
实验方法
所使用的方法在于研发一种整体方法来分析转录组以鉴定在引起壳(外套膜)和珍珠(珍珠囊袋中所含的移植物和珍珠囊)的生物矿化的组织的上皮细胞中差异性表达的核苷酸序列(图1)。这种方法在于开发对黑蝶珠母贝的矿化组织(外套膜、移植物以及珍珠囊)进行的两种互补转录组学方法以及对黑蝶珠母贝的被矿化的组织(壳和珍珠)并行地进行的整体蛋白质组学方法。建立针对珍珠矿化组织、移植物和珍珠囊袋的四个SAGE数据库，以鉴定潜在地与对比鲜明的珍珠品质相关的随不同的移植物供体珍珠牡蛎而差异性表达的核苷酸序列。还通过对外套膜即壳的生物矿化组织进行焦磷酸测序并行地建立了外套膜EST库。最终，并行地开发了对黑蝶珠母贝的被矿化的组织进行的整体蛋白质组学方法以鉴定构成壳和珍珠的蛋白质。整体转录组学方法和蛋白质组学方法的建立使得有可能通过“候选方法”或“盲法”实现对黑蝶珠母贝中编码参与生物矿化过程的蛋白质的候选珍珠品质的生物标志物进行选择。通过进行实验性移植来对生物标志物进行验证，所述实验性移植一方面使得有可能评价所收集的珍珠的品质以及鉴定“供体效应”，并且另一方面，使得有可能提供产生具有对比鲜明的品质的珍珠的起源处的生物材料(移植物和珍珠囊袋)。然后通过高速定量PCR对候选生物标志物进行验证并且所述验证涉及通过统计学使候选生物标志物的表达水平与生物学事实(珍珠品质)相关联。对供体珍珠牡蛎的移植物和接受体珍珠牡蛎的珍珠囊袋中与供体效应相关的候选预测性生物标志物的表达水平的分析使得鉴定出预测珍珠品质的生物标志物。
材料和方法
牡蛎
在整体转录组分析、整体蛋白质组分析以及实验性移植的背景下使用黑蝶珠母贝珍珠牡蛎，以验证预测珍珠品质的生物标志物。
实验性移植(G1)
使用来自法属波利尼西亚的约3岁的四十个黑蝶珠母贝珍珠牡蛎作为移植物供体牡蛎。从每一个供体珍珠牡蛎的每一个壳瓣的外套膜切下大约三十个移植物。保存来自每一个供体的最少2个移植物。将来自每一个供体珍珠牡蛎的每一个壳瓣的其余移植物移植到接受体珍珠牡蛎中。用2.4生物核对总共1978个接受体珍珠牡蛎进行移植。在8个时间点采集珍珠囊袋和珍珠样品：1天、7天、21天、2个月、3个月、6个月、12个月以及18个月。
RNA提取、cDNA合成以及定量PCR方案
提取总RNA
将RNA从来自实验性移植的外套膜、移植物或珍珠囊袋的样品中分离并且保存在(Ambion公司)中。将组织用1mLPBS冲洗，在冰上在皮氏培养皿(Petridish)中用解剖刀撕开，然后放在1mL的(英杰公司(Invitrogen))中。在4℃在搅拌器上进行提取过夜。然后在30℃将管在双层锅中孵育5分钟，然后涡旋30秒。将经过研磨的材料在环境温度下以12000g离心10分钟，并且采集1mL上清液并且将其转移到新的管中。通过每管添加200μL的氯仿，并且通过倒置混合进行核酸和蛋白质的分离。在环境温度下孵育15分钟之后，在4℃将管以12000g离心10分钟。将约500μL并且含有RNA的上层相转移到新的管中。在-80℃通过250μL的异丙醇和250μL的“高盐”盐水溶液(0.8M的柠檬酸三钠；1.2M的氯化钠)使RNA沉淀过夜。将样品以15000g离心30分钟。将上清液倒掉，将RNA沉淀在涡旋混合器中用1mL的70％乙醇洗涤两次，之后是在4℃以15000g离心15分钟的步骤。然后将沉淀在通风柜下在环境温度下干燥10分钟，然后放在50μL的无核糖核酸酶的水中。然后在55℃将管在双层锅中孵育10分钟，之后用手均质化。将RNA储存在-80℃。通过在100mV在于TAE(0.5×)中的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，以及通过使用NanodropND1000和Agilent2100生物分析仪(RNA6000Nano试剂盒)进行分光光度法测定来评价所获得的RNA的品质和量。
逆转录
使用SuperScriptTMII逆转录酶试剂盒(InvitrogenTM，目录号：18064-014)，根据供应商的说明书，使用800ng的移植物和珍珠囊袋RNA进行移植物和珍珠囊袋的cDNA合成，以确定预测珍珠品质的候选生物标志物的相对表达水平。
定量PCR
使用用于预扩增步骤的2XTaqManPreAmp主混合物试剂盒(MasterMixkit)(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，P/N4384266)以及用于扩增步骤的2XTaqMan基因表达主混合物试剂盒(GeneExpressionMasterMixkit)(应用生物系统公司，P/N4369016)，根据供应商的说明书，通过在BioMarkTMHD系统(Fluidigm公司)上进行高速qPCR来对预测珍珠品质的候选生物标志物的表达水平进行测量。使用四个Fluidigm96.96动态阵列实时(DynamicArrayRealTime)PCR芯片(BMK-M-96.96)。所使用的扩增程序如下：在50℃下2分钟，然后在95℃变性10分钟，35个扩增循环(在95℃变性15秒，杂交1分钟以及在60℃延长)，在每一个循环结束时进行荧光测量，并且通过每1℃的连续荧光测量来获得60℃至95℃的解离曲线。使用Fluidigm实时分析软件(Fluidigm公司)和Biomark解链曲线分析(Fluidigm公司)来提取和分析数据。基因的相对表达水平是通过2^-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)根据下式来确定的：倍数＝2^-ΔΔCt＝^-[DCt目标-DCt校准物]。DCt目标对应于在目标组“A”的移植物样品或珍珠囊袋的预测性生物标志物与参考基因18S和SAGE1之间Ct的差值的平均值。DCt校准物对应于在校准物组“B”的移植物样品或珍珠囊袋的预测性生物标志物与参考基因18S和SAGE1之间Ct的差值的平均值，如本发明中所述。
评价珍珠品质
在对在实验性移植的背景下所收集的珍珠进行评价之前，将它们用粗盐洗涤，在淡水中冲洗，使用干净的抹布擦拭并且使它们有光泽。
为了对珍珠品质进行整体评价，将珍珠品质参数细分为如下不同的变量：“珍珠表面的珍珠母厚度”变量、“珍珠表面的缺陷数目”变量、以及“商业品质”变量。
“珍珠表面的珍珠母厚度”变量对应于在核的表面上存在的最小珍珠母厚度的测量值(以毫米计)。这是通过用珍珠的最小直径减去核的直径并且将直径的差值除以2而获得的。使用珍珠和核的扫描图像(300像素/厘米，EpsonPerfection4990照片扫描仪)并且使用图像分析软件ImageJ(第1.44版)处理来测量珍珠和核的直径。
“珍珠表面的缺陷数目”变量对应于将每一个珍珠基于在它们的表面所观测到的缺陷数目而分类到4个品质类别中(没有缺陷的珍珠、具有1至5个缺陷的珍珠、具有多于5个缺陷的珍珠以及完全被缺陷覆盖的珍珠)。所考虑的缺陷是凹坑、泡疤以及斑点。在第二个阶段中，基于每一个珍珠所属的缺陷类别将每一个珍珠指定在0级至3级范围内的等级(0级(被缺陷覆盖的珍珠)至3级(没有缺陷的珍珠))。
“商业品质”变量对应于将珍珠分成5个品质类别(A类、B类、C类、D类、以及不合格类)。这种分类是在两个阶段中根据由2005年2月4日的第2005-42号审议(法属波利尼西亚的官方公报)所确定的标准来进行的。在第二个阶段中，基于每一个珍珠所属的类别将每一个珍珠指定在0级至4级范围内的等级(0级(属于“不合格”类的珍珠)至4级(属于“A”类的珍珠))。
为了鉴定供体效应，基于每一个变量将移植物供体珍珠牡蛎按品质递增的顺序分类。这种分类是通过基于对在实验性移植的背景下在18个月所收集的珍珠的品质的评价对每一个供体珍珠牡蛎指定等级来进行的。对于“珍珠表面的珍珠母厚度”变量，这种等级对应于所收集的珍珠的厚度的平均值/供体。对于“珍珠表面的缺陷数目”变量和“商业品质”变量，每一个供体珍珠牡蛎的等级对应于所收集的珍珠的等级的平均值/供体。
制定移植物和珍珠囊袋采样方案以验证珍珠生长和品质的生物标志 物
为了由用于产生具有对比鲜明的品质的珍珠的供体珍珠牡蛎形成用于对移植物和珍珠囊袋进行采样的组，基于在实验性移植背景下在18个月所收集的珍珠的供体效应和品质，针对“厚度”、“品质”以及“缺陷”变量中的每一个形成两组移植物供体珍珠牡蛎。“组A”(目标)对应于平均来说产生更高品质的珍珠(高珍珠母厚度、少数的表面缺陷和/或更好的品质分类)的供体珍珠牡蛎。“组B”(对照或校准物)对应于代表可由珍珠养殖专业人员获得的并且用于针对商业目的的移植的背景下的天然(野生)供体珍珠牡蛎群体的一组移植物供体珍珠牡蛎。
通过对珍珠品质和移植物供体珍珠牡蛎的分类的原始数据进行分析，通过配对程序进行邓恩氏多重比较(Dunn'smultiplecomparison)以及进行上升层次分类来形成“组A”(目标)。供体珍珠牡蛎的这些组的形成然后使得有可能针对每一个变量确定在产生对比鲜明的珍珠的起源处对移植物和珍珠囊袋进行采样的两种方案：用于对来自构成组A和组B的供体珍珠牡蛎的移植物进行采样的方案；以及用于对来自构成组A和组B的供体珍珠牡蛎移植物的移植的珍珠囊袋进行采样的方案。
统计分析
使用针对夏皮罗-威尔克检验(Shapiro-Wilktest)、克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskall-Wallistest)、邓恩氏多重比较程序以及上升层次分类的Xlstat软件(第2009.4.02版)以及针对威氏检验(Wilcoxontest)的R软件(第2.10.0版)在验证预测珍珠品质的生物标志物的背景下进行所有统计分析。以5％的阈值α使用夏皮罗-威尔克正态性检验。以5％的阈值α进行克鲁斯卡尔-沃利斯检验。通过对显著性水平应用邦费罗尼校正(Bonferronicorrection)(校正的阈值α＝0.01％)来进行邓恩氏多重比较程序。使用χ2的距离作为相异指数并且使用沃德法(Wardmethod)作为聚合法来进行上升层次分类。没有指定类别号并且自动地限定截断水平。以5％的阈值α并且以单侧方式使用威氏检验。
结果
分析转录组的整体法使得有可能鉴定出在引起壳和珍珠的生物矿化的组织中表达的大量核苷酸序列。外套膜EST库的建立允许我们鉴定出黑蝶珠母贝中编码潜在地参与壳的生物矿化的蛋白质的82个核苷酸序列。移植物和珍珠囊袋SAGE库的建立使得有可能鉴定出所注明的并且在引起珍珠的生物矿化过程的组织中表达的超过5000个基因序列。最终，针对壳和珍珠的成分所建立的整体蛋白质组学方法使得有可能鉴定出构成黑蝶珠母贝中被矿化的结构的130个蛋白质序列。最终，使用这些蛋白质组和转录组数据库使得有可能选择出一组268种预测珍珠品质的候选生物标志物，并且其中205种编码黑蝶珠母贝中目前未知的蛋白质。在所鉴定出的这268种生物标志物当中，已鉴定出224对具有有效性和特异性的引物并且对188种候选预测性生物标志物进行了选择和测试。
对作为预测珍珠品质的生物标志物的候选预测性生物标志物的验证涉及使所述预测性生物标志物的表达水平与在移植背景下所获得的珍珠的商业品质、厚度以及缺陷数目具有相关性(图2)。
因此在珍珠的生物矿化组织中对候选生物标志物的表达水平进行分析，并且该分析使得有可能鉴定出基于所收集的珍珠的品质而差异性表达的核苷酸序列。如果组A中的核苷酸序列的相对表达是组B中同一核苷酸序列的表达的大于或等于2倍(factor/fold)或小于或等于1/2，那么所述核苷酸序列被认为是差异性表达的，如本发明中所述。
对与珍珠品质具有相关性的核苷酸序列的表达水平的分析的组合分析使得验证了黑蝶珠母贝中一组42种预测珍珠的生长和品质的生物标志物(表11)。
表11：黑蝶珠母贝中珍珠品质的生物标志物(具有大于或等于2倍的倍数)的数目。
预测所获得的珍珠的品质的42种生物标志物的完整列表呈现于表1和表12中。
表12：黑蝶珠母贝中预测珍珠品质的生物标志基因的列表(结果对应于在组A牡蛎与组B牡蛎之间表达的差异)。
这项研究因此使得有可能鉴定出预测供体珍珠牡蛎的生物矿化能力的标志。
然后基于由独立于上文所述的计划的两项另外的移植计划产生的数据集对42种生物标志物SEQIDNO:1至42中的15种进行评价。
实验性移植
在移植G2中，使用67个移植物供体牡蛎。在移植G3中，使用来自除G2牡蛎的批次以外的批次的64个移植物供体牡蛎。从每一个供体珍珠牡蛎的每一个壳瓣的外套膜切下五十个移植物。保存来自每一个供体的两个移植物(每个壳瓣1个移植物)以根据本发明中所述的方法测定42种生物标志物SEQIDNO:1至42中的15种的表达水平。将来自每一个供体珍珠牡蛎的每一个壳瓣的其余移植物移植到接受体珍珠牡蛎中，G2有3208个牡蛎，G3有3051个牡蛎，使用具有相同直径的核。在移植后15个月时收集G2的珍珠并且在移植后16个月时收集G3的珍珠。
用于移植G2和移植G3的移植物供体的分类
基于对所收集的珍珠品质的评价并且根据本发明中所述的计算方法对每一个供体珍珠牡蛎指定等级。基于以下3个变量中的每一个对分别来自移植G2和移植G3的总共2074个珍珠和1879个珍珠进行了分析：“珍珠表面的珍珠母厚度”、“珍珠表面的缺陷数目”以及“商业品质”。对于移植G2和移植G3中的每一轮移植，选择了平均来说产生更高品质的珍珠(高珍珠母厚度、少数表面缺陷和/或更好的品质分类)并且构成组A(目标)的4个供体珍珠牡蛎(表13)。组B(对照或校准物)对应于一组23个代表移植G2和移植G3中所使用的珍珠牡蛎群体的移植物供体珍珠牡蛎。
表13：根据移植G2和移植G3中所使用的供体牡蛎的组，变量“珍珠表面的珍珠母厚度”、“珍珠表面的缺陷数目”以及“商业品质”的平均值的比较。以百分比形式表示的由组A的供体所产生的珍珠的品质相对于由组B的供体所产生的珍珠的品质的提高以粗体形式并且在括号内指示。
结果
对于对移植G2的珍珠的分析，基于变量“珍珠表面的珍珠母厚度”、“珍珠表面的缺陷数目”以及“商业品质”中的每一个，由组A的供体所产生的珍珠的品质相对于由组B的供体所产生的珍珠的品质的提高分别是30％、47％以及52％(表13)。对于移植G3，由组A的供体所产生的珍珠品质的提高分别是28％、42％以及66％。在组B和由在移植中所使用的所有供体组成的组中所获得的每一个变量的平均值是相似的，而与被考虑的是移植G2还是移植G3无关。这些结果表明了选自在两轮独立的移植G2和G3中所使用的供体群体的组B供体的代表性。
通过实时PCR，根据本发明中所述的方法确定黑蝶珠母贝中预测珍珠品质的15种生物标志物的相对表达水平。因此，针对移植G2和移植G3中的每一轮移植以及以下3个目标变量中的每一个计算供体组A和组B的表达水平：厚度/商业品质/缺陷。
将所测量的表达水平与在第一轮移植(G1)中所获得的表达水平相比较并且确认了先前获得的结果。在移植G1、移植G2以及移植G3中所获得的具有高生物矿化能力的15种生物标志物中的每一种的有意义的过表达水平或低表达水平(大于或等于2倍，分别用“+”和“-”表示)示于表14中。
表14：根据所考虑的移植，组A的供体珍珠牡蛎的具有高生物矿化能力的生物标志物相对于对照样品的过表达或低表达水平的比较。
标识号 名称 所影响的变量 过表达/低表达
SEQ ID NO:3 CALC-1 商业品质 -
SEQ ID NO:4 CLEC3-1 商业品质 -
SEQ ID NO:5 DERM-2 商业品质 -
SEQ ID NO:8 MUCO-2 厚度 +
SEQ ID NO:11 shem7-2 商业品质 +
SEQ ID NO:14 C18 商业品质 -
SEQ ID NO:18 C46 厚度 -
SEQ ID NO:23 PIF-2 厚度 +
SEQ ID NO:26 C26bis 厚度 +
SEQ ID NO:27 C54(C53bis) 厚度 +
SEQ ID NO:28 mp11-2 缺陷数目 +
SEQ ID NO:36 C75bis 厚度 +
SEQ ID NO:39 2 厚度 -
SEQ ID NO:40 mp2-2 厚度 -
SEQ ID NO:42 Protinh2-1 缺陷数目 -
对与在三轮独立的实验性移植中所获得的珍珠的品质具有相关性的42种生物标志物SEQIDNO:1至42中的15种的表达水平的分析的组合分析因此使得确定了黑蝶珠母贝中预测珍珠的生长和品质的15种生物标志物的精确列表(表14)。

Claims (12)

1.一种标志，所述标志预测使用供体牡蛎所获得的珍珠的商业品质和/或使用所述供体牡蛎的在核周围的珍珠母沉积速率，所述标志包含至少一种生物标志物在所述供体牡蛎的外套膜中的表达谱，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1、4、5、8、11、14、18、23、26、27、28、36、39、40和42、其变体以及片段。
2.根据权利要求1所述的预测标志，所述标志包含至少一个核苷酸序列在所述供体牡蛎的外套膜中的表达谱，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:3、4、5、11和14、其变体以及片段，并且所述标志预测使用所述供体牡蛎所获得的珍珠的商业品质。
3.根据权利要求1或2所述的预测标志，所述标志包含至少一个核苷酸序列在所述供体牡蛎的外套膜中的所述表达谱，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:8、18、23、26、27、36、39或40、其变体以及片段，并且所述标志预测使用所述供体牡蛎的在所述核周围的珍珠母沉积速率。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的预测标志，所述标志包含至少一个核苷酸序列在所述供体牡蛎的外套膜中的表达谱，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:28或42、其变体以及片段，并且所述标志还预测使用所述供体牡蛎所获得的珍珠的表面缺陷数目。
5.一种鉴定和/或选择具有高生物矿化能力的移植物供体牡蛎的方法，其中：
(a)在所述牡蛎的生物样品中，测定如权利要求1至4中任一项中所述的至少两种预测性生物标志物的表达水平，以及
(b)将在步骤(a)中所获得的表达水平与对照表达水平相比较。
6.一种试剂盒，所述试剂盒使得能够实施根据权利要求5所述的方法，所述试剂盒包含用于测定如权利要求1至4中任一项中所述的至少一种生物标志物的表达谱的工具，其中所述工具使得有可能通过RT-PCR、RT-qPCR或高速定量PCR在转录组水平上测定所述表达谱。
7.一种试剂盒，所述试剂盒使得能够实施根据权利要求5所述的方法，所述试剂盒包含用于测定如权利要求1至4中任一项中所述的至少一种生物标志物的表达谱的工具，其中所述工具使得有可能在蛋白质水平上测定所述表达谱。
8.一种用于生产至少一种更高品质的珍珠的方法，所述方法包括养殖至少一种接受体牡蛎，所述接受体牡蛎包含根据权利要求1至4中任一项所述的预测标志或是依据根据权利要求5所述的鉴定方法来鉴定的。
9.至少一种生物标志物用于确定移植物供体牡蛎的生物矿化能力的用途，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自由以下各项组成的清单：SEQIDNO:1、4、5、8、11、14、18、23、26、27、28、36、39、40和42、其变体以及片段。
10.至少一种生物标志物用于预测移植物供体牡蛎生产具有高商业品质的珍珠的能力的用途，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自序列SEQIDNO:3、4、5、11以及14，优选地序列SEQIDNO:4。
11.至少一种生物标志物用以预测移植物供体牡蛎生产具有少数表面缺陷的珍珠的能力的用途，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自序列SEQIDNO:28和SEQIDNO:42，优选地序列SEQIDNO:28。
12.至少一种生物标志物用以预测移植物供体牡蛎生产具有少数表面缺陷的珍珠的能力的用途，所述生物标志物包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自序列SEQIDNO:8、18、23、26、27、36、39以及40。
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