WO2014096498A1 - Sales de tungstato como agentes antiplaquetarios - Google Patents

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WO2014096498A1
WO2014096498A1 PCT/ES2013/070905 ES2013070905W WO2014096498A1 WO 2014096498 A1 WO2014096498 A1 WO 2014096498A1 ES 2013070905 W ES2013070905 W ES 2013070905W WO 2014096498 A1 WO2014096498 A1 WO 2014096498A1
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WO
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platelet
tungstate
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salt
sodium tungstate
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PCT/ES2013/070905
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English (en)
French (fr)
Inventor
M. Isabel DÍAZ RICART
Marcos PINO FERRER
Ginés ESCOLAR ALBALADEJO
Ramon GOMIS DE BARBERÀ
Rebeca FERNÁNDEZ RUIZ
Original Assignee
Universitat De Barcelona
Hospital Clínic De Barcelona
Institut D'investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer
Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciber)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the invention relates to tungstate salts that show an antiplatelet effect, in particular, to its use to reduce platelet reactivity.
  • Atherothrombosis remains the major cause of morbidity and mortality in Western society. Platelets play a key role in hemostasis, but they are also responsible for the pathological formation of thrombi underlying the clinical manifestations of acute atherothrombotic vascular disease (myocardial infarction, stroke and vascular death). Therefore, reducing the prothrombotic tendency related to an excessive platelet response to damaged vascular surfaces is one of the main objectives in the development of pharmacological strategies to prevent the development of cardiovascular accidents. Platelet activation takes place through multiple pathways and current antiplatelet agents do not interfere in all of them.
  • Inhibition of platelet aggregation can be achieved by blocking membrane receptors or by interfering with intracellular pathways.
  • the inhibition of arachidonic acid metabolism by aspirin and the blocking of ADP receptors by thienopyridines, such as clopidogrel (marketed under the name of Plavix and described in EP 281459-A) are the antiplatelet strategies used with More frequently today.
  • Antiplatelet agents for patients with ACS after PCI show a high risk of associated bleeding and a high acquisition cost compared to clopidogrel.
  • tungstate salt with a pharmaceutically acceptable cation in particular the tungstate sodium salt (Na 2 W0 4 )
  • sodium tungstate regulates partial aspects of platelet function and, therefore, leads to a more moderate and manageable platelet function inhibitory effect.
  • the main concern when using antiplatelet therapies is to find the appropriate conditions to inhibit platelet reactivity without causing
  • sodium tungstate shows a moderate and consistent effect on the adhesive and cohesive properties of platelets. This behavior is more similar to that observed with ADP receptor inhibitors than aspirin inhibitors, since inhibition of arachidonic acid metabolism results in a significant decrease in thrombus formation while individual platelet interaction with the Damaged subendothelium tends to increase.
  • the effect of tungstate on the hemostatic properties of platelets was detected in the PFA-100 system using Col / Epi cartridges similar to aspirin treatment. The effect of tungstate on hemostasis is directed at platelet function since no action on coagulation has been detected.
  • sodium tungstate offers an interesting antiplatelet strategy.
  • Sodium tungstate is a compound with a drug-toxicological profile
  • EP1400246-A describes a pharmaceutical composition of a tungsten compound (VI) for the reduction of glycemia in humans with type 1 diabetes ("Insulin dependent diabetes mellitus", IDDM) or type 2 ("Non-insulin dependent diabetes mellitus” , NIDDM).
  • IDDM Insulin dependent diabetes mellitus
  • NIDDM Non-insulin dependent diabetes mellitus
  • EP 755681 -A shows that tungsten compounds (VI) are also effective for Treatment of obesity / overweight in non-diabetic humans.
  • Sodium tunsbate has also been proposed for the treatment of Alzheimer's disease or schizophrenia (cf. WO2007014970-A). However, the effect of sodium tungstate on the modulation of the adhesive and cohesive functions of platelets has not been previously described.
  • one aspect of the present invention is related to the use of a pharmaceutically acceptable tungstate salt or a solvate thereof, for the preparation of a medicament for reducing the reactivity of platelets in a subject.
  • tungstate salt refers to a tungstate salt with a pharmaceutically acceptable cation. Both terms have been used interchangeably.
  • the tungstate salt is formed by tungsten (VI) and a pharmaceutically acceptable cationic part.
  • This aspect of the invention can also be formulated as a pharmaceutically acceptable tungstate salt or a solvate thereof for use to reduce the reactivity of platelets in a subject.
  • the invention also relates to a method for decreasing platelet reactivity in a subject, which comprises administering to this subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutically acceptable tungstate salt or a solvate thereof, together with excipients or pharmaceutically acceptable vehicles.
  • Plate reactivity means platelet activation in response to a chemical stimulus and / or injury. Platelet aggregation is the most common measure of platelet reactivity. Thus, the term platelet reactivity mostly refers to platelet aggregation in response to platelet activators, for example, thrombin or collagen.
  • the reduction in platelet reactivity refers to the decrease in the hemostatic capacity of platelets in a subject, which is the ability of an organism to cause blood in the liquid state to remain in the blood vessels . Haemostasis allows blood to circulate freely through the vessels and when one of these structures is damaged, it allows the formation of platelet clusters to stop bleeding, subsequently repair the damage and finally dissolve the hemostatic plug.
  • the reduction in platelet reactivity occurs by inhibition of the adhesive and cohesive properties of platelets in a damaged vessel under flow conditions.
  • terapéuticaally effective amount refers to the amount of a compound that, when administered, is sufficient to prevent the development, or to improve to some degree, one or more of the symptoms of the disease. to which it is addressed.
  • the particular dose of the compound administered according to this invention will of course be determined by the particular circumstances surrounding the case, including the compound administered, the route of administration, the particular condition to be treated and other similar considerations.
  • pharmaceutically acceptable excipients or vehicles refers to pharmaceutically acceptable materials, compositions or vehicles. Each component must be pharmaceutically acceptable in the sense of being compatible with other ingredients of the pharmaceutical composition. It should also be appropriate for use in contact with human and animal tissue or organs without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogeneicity or other problems or complications commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.
  • the subject to be treated is a mammal. More preferably, the mammal is a human.
  • the subject to be treated suffers from or is susceptible to a platelet-associated vascular disease.
  • the subject's platelet-associated vascular disease is an atherothrombosis.
  • platelet-associated vascular disease is a complication of platelet-associated atherothrombosis selected from the group consisting of stroke, cerebral arteriosclerosis, myocardial infarction, angina pectoris, cardiac arrhythmias, peripheral arterial dysfunction and Burger's disease. .
  • the tungstate salt is selected from the group consisting of an alkali metal salt and an alkaline earth metal salt. In another more preferred embodiment, the tungstate salt is selected from the group consisting of sodium, potassium, magnesium and calcium tungstate salt.
  • the tungstate salts of the present invention may be in the form of crystalline, both in the form of solvation free compounds and solvates (for example hydrates) and it is intended that both forms are within the scope of the present invention.
  • Solvation methods are generally known in the state of the art.
  • the most preferred salt is sodium tungstate (Na 2 W0 4 ) and its dihydrate.
  • the latter is commercially available.
  • Sodium tungstate dihydrate is a white, odorless salt with a fine and crystalline texture, and easily dissolved in water.
  • the use of a pharmaceutically acceptable tungstate salt or solvate thereof for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a platelet-associated vascular disease is also considered part of the invention.
  • This aspect can be formulated as a pharmaceutically acceptable tungstate salt or solvate thereof for use in the prevention and / or treatment of a platelet-associated vascular disease.
  • the invention also refers to a method for the prevention and / or treatment of a platelet-associated vascular condition or disease comprising administration to a subject suffering from or susceptible to suffering from this condition or disease, of a therapeutically effective amount of a pharmaceutically acceptable tungstate salt or solvate thereof as defined above, together with pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • Platelet-associated vascular disease can be stroke, cerebral arteriosclerosis, myocardial infarction, angina pectoris, cardiac arrhythmias, peripheral arterial dysfunction or Burger's disease.
  • the pharmaceutically acceptable tungstate salt or a solvate thereof is in the form of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the pharmaceutically acceptable tungstate salt or a solvate of the same, in combination with pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the pharmaceutically acceptable tungstate salt or solvate thereof can be administered by any conventional oral administration system, with the tablet format being preferred. This system has been used in human participants in Phase I clinical trials of this compound for the treatment of obesity in non-diabetic humans (EP 755681-A).
  • Topical compositions of the present invention can be prepared according to well established methods. Suitable excipients and / or carriers, and their amounts can be easily determined by those skilled in the art according to the type of formula to be prepared.
  • FIG 1 is a bar chart showing the effect of incubating human blood with sodium tungstate (200 ⁇ ) on occlusion times using the PFA-100 device using collagen / epinephrine (Col / Epi) and collagen / ADP cartridges
  • FIG 2 shows optical microscopy images illustrating the effect of incubating human blood with sodium tungstate (200 ⁇ ) on platelet adhesion on subendothelial surfaces.
  • the bar chart shows that in the presence of sodium tungstate both the surface covered by platelets ("surface coverage",%) and thrombus formation ("thrombus formation",%) decreased
  • FIG 3 shows the effect of treatment with sodium tungstate for 1 week on platelet function in mice. Occlusion times in the PFA-100 were evaluated using coded blood samples. After oral treatment with sodium tungstate, occlusion times were prolonged by analyzing the hemostatic capacity of control animals (WT) in Col / ADP cartridges (A), remaining unchanged when using Col / Epi cartridges (B). No changes were observed in knock-out animals (KO).
  • FIG 4 shows the effect of treatment with sodium tungstate for 1 week of control animals (WT) and knock-out (KO) on different parameters measured in a viscometer. Treatment with sodium tungstate of WT animals resulted in an increase in the covered area and in the number of platelet clusters, although the size of the thrombi decreased. The decrease in thrombus size was also observed in KO animals.
  • FIG 5 shows the effect of sodium tungstate on platelet adhesion on a collagen surface under flow conditions.
  • FIG 6 shows the effect of incubating samples of encrypted human blood with different concentrations of sodium tungstate at (A) occlusion times (s) in the PFA-100 when using Col / Epi (black bars) and Col / ADP cartridges (gray bars); and (B) platelet adhesion in dendothelized vascular segments (perfused at 800s-1 for 10 min).
  • Blood was taken from healthy volunteers who had not ingested any drug that could affect platelet function during the previous 10 days. Informed consent was obtained from all patients or volunteers. The blood was anticoagulated with 10 mM 1: 10 trisodium citrate (vol / vol) and incubated with different concentrations of sodium tungstate (0, 100, 200 and 400 ⁇ ).
  • Platelet rich plasma was obtained by centrifugation of whole blood (120 g, 15 min). PRP aliquots were incubated with sodium tungstate by gentle agitation in a conventional aggregometer (Aggrecorder PA 3210 aggregometer Menarini Diagnostic, Firenze). After 1 hour of incubation, platelets were activated with arachidonic acid (AA, 1, 6mM), ADP (4 and 2 ⁇ ), collagen (Col, 5 ⁇ g / ml) and ristocetin (R, 1 mg / ml), during 10 min and 37 ° C under stirring. Changes in the turbidimetric profile were recorded and the result of these changes was expressed as% of maximum aggregation. Hemostatic capacity through platelet function analyzer (Platelet Function Analvzer, PFA-100)
  • Platelet function was also analyzed using the PFA-100 system.
  • the system monitors the interaction of platelets with membranes coated with collagen / ADP (COL / ADP) or collagen-epinephrine (COL-Epi).
  • Samples of coded blood were aspirated by flow conditions controlled by an opening of 150 ⁇ in the membrane.
  • the hemostatic capacity of platelets (“platelet hemostatic capacity", PHC) of blood samples is indicated as the time required for platelets to block and occlude the opening (occlusion time, expressed in seconds).
  • the Cone P ⁇ ate Analyzer was used as described in B. Shenkman et ai, "Testing of platelet deposition on polystyrene surface under flow conditions by the cone and platelet analyzer: role of platelet activation, fibrinogen and von Willebrand factor", Thromb Res. 2000; 99: 353-61. Three parameters were evaluated: the surface covered by platelets is expressed as a percentage (% SC), the average size of the groups of platelets bound to polystyrene or platelet aggregates (AS, ⁇ 2), and the number of platelet groups (OB, n).
  • mice platelets with collagen 100 ⁇ g / coverslip
  • collagen 100 ⁇ g / coverslip
  • a peristaltic pump Renal systems, Minneapolis, MN
  • the perfused surfaces were fixed (2.5% glutaraldehyde in PBS 0.15 M, 4 ° C, 24 h), stained with toluidine blue (0.02%) and platelet interactions were evaluated by optical microscopy.
  • a morphometric analysis was performed using a computerized system (Image J), and platelet interactions were expressed globally as the percentage of platelet covered area (% SC).
  • Adhesion studies under rheological conditions were performed using annular perfusion chambers. Enzyme dendotized New Zealand rabbit aorta segments were placed inverted, exposing the damaged surface, in the central axis of the perfusion chamber. 20 ml of anticoagulated citrate blood sample was recirculated for 10min by the perfusion chamber with shear rates of 800 s-1 and 1200 s-1 adjusted by a peristaltic pump (Renal systems, Minneapolis, MN). The precast surfaces were washed with 0.15 M PBS and fixed with 2.5% glutaraldehyde (in 0.15 M PBS) at 4 ° C for 24 hours.
  • the fixed surfaces of dehydrated in a gradient of increasing ethanol, were included in the plastic compound JB-4, fine cuts were made for optical microscopy and subsequently stained with methylene blue. Platelet interactions were evaluated under an optical microscope and using software that automatically classifies and quantifies the surface covered by platelets. Platelet interactions were expressed globally as the percentage or the average area ( ⁇ 2) of the platelet covered surface (SC). In addition, the software used allowed us to classify platelet interactions in contact (C), adhesion (A) and thrombus (T). In fact,% SC % C +% A +% T.
  • exTEM uses tissue factor as an activator and is sensitive to the extent of changes in the extrinsic coagulation pathway, fibrin and fibrinogen polymerization and platelet function.
  • platelet function is eliminated by the cytochalasin D platelet inhibitor. While the clots obtained in exTEM are composed of platelets and fibrin, the clots obtained in the fibTEM test are primarily fibrin clots.
  • the inTEM test contains ellagic acid to measure changes in the intrinsic coagulation pathway.
  • CT and CFT indicate the dynamics of clot formation.
  • the amplitude of the clot gives information about the resistance and stability of the clot, which depends mainly on fibrinogen and platelets, and MaxV and MaxV-t express the rate of clot formation.
  • mice C57BL6 / SV129 male mice were housed under standard conditions of light (12 h light / dark cycles) and temperature (21 ° C). The animals were fed ad libitum with a standard feed diet (type A04 from Panlab, Barcelona, Spain), and received tungstate in the drinking water at a concentration of 2 g / l, for one week. The studies were approved by the Ethical Committee of the University of Barcelona, complying with current Spanish legislation.
  • the animals were anesthetized with an intraperitoneal injection of ketamine-xylazine, and a cardiac puncture was performed to obtain approximately 800 ⁇ of blood, anticoagulated with 110 mM trisodium citrate 1: 10 (vol / vol).
  • Perfusion tests were performed with the vascular segments de-bottled at a moderate shear flow.
  • the% SC was significantly reduced to 30.7 ⁇ 3.9%, 18.0 ⁇ 2, 4% (p ⁇ 0.001), and 27.0 ⁇ 2.7% (p ⁇ 0.05) (see FIG 6B).

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Abstract

Las sales de tungstatode metales farmacéuticamente aceptables, o sus solvatos,son útiles para reducir la reactividad de las plaquetas en un mamífero, incluido un humano, y se pueden utilizar para tratar a sujetos que padecen una condición o enfermedad vascular asociada a plaquetas.

Description

Sales de tungstato como agentes antiplaquetarios
La invención se refiere a sales de tungstato que muestran un efecto antiplaquetario, en particular, a su uso para reducir la reactividad de las plaquetas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La aterotrombosis continúa siendo la mayor causa de morbilidad y mortalidad en la sociedad occidental. Las plaquetas juegan un papel clave en la hemostasia, pero también son responsables de la formación patológica de trombos subyacente en las manifestaciones clínicas de la enfermedad vascular aterotrombótica aguda (infarto de miocardio, accidente cerebro vascular y muerte vascular). Por ello, la reducción de la tendencia protrombótica relacionada con una respuesta excesiva de las plaquetas a superficies vasculares dañadas es uno de los objetivos principales en el desarrollo de estrategias farmacológicas para prevenir el desarrollo de accidentes cardiovasculares. La activación de las plaquetas tiene lugar a través de múltiples vías y los agentes antiplaquetarios actuales no interfieren en todas ellas.
En pacientes que padecen síndromes coronarios agudos o expuestos a una intervención coronaria percutánea, se administran tratamiento antiplaquetarios orales de forma rutinaria con el fin de inhibir la formación de trombos plaquetarios y la subsiguiente oclusión abrupta de vasos sanguíneos. Hasta ahora, la mayor parte de fármacos desarrollados como agentes antiplaquetarios basan su efecto en la inhibición de los receptores de la membrana plaquetaria así como de las vías metabólicas intraplaquetarias, teniendo un gran impacto en la función de dichas células. Aunque muchos de ellos han mostrado tener eficacia clínica reduciendo la morbilidad y la mortalidad de pacientes con enfermedad aterotrombótica, estos agentes se asocian a un riesgo residual de sucesos trombóticos o, por el contrario, de hemorragia y una elevada variabilidad en la respuesta de los pacientes. Las complicaciones trombóticas atribuibles a las plaquetas requieren casi invariablemente de una formación previa de un trombo mural. El trombo mismo, o porciones embolizadas, pueden ser los responsables de posteriores complicaciones isquémicas.
La inhibición de la agregación plaquetaria se puede lograr mediante el bloqueo de receptores de membrana o por interferencia de las vías intracelulares. La inhibición del metabolismo del ácido araquidónico mediante aspirina y el bloqueo de receptores de ADP por tienopiridinas, tales como el clopidogrel (comercializado con el nombre de Plavix y descrito en EP 281459-A) son las estrategias antiplaquetarias utilizadas con más frecuencia en la actualidad.
La variabilidad individual de la respuesta a la aspirina y especialmente al clopidogrel hacen difícil encontrar un balance adecuado entre el riesgo de trombosis y hemorragia asociados al tratamiento con estos compuestos.
De hecho, el tratamiento estándar actual en la prevención de la trombosis tras intervención coronaria percutánea ("percutaneous coronary intervention", ICP) en pacientes con síndrome coronario agudo ("acute coronary síndrome", SCA) consiste en una terapia dual antiplaquetaria con aspirina y la tienopiridina clopidogrel. Sin embargo, la elevada reactividad plaquetaria y los polimorfismos genéticos afectan a la respuesta del paciente al tratamiento antiplaquetario.
Aunque los nuevos compuestos de tienopiridinas desarrollados, tales como prasugrel (descrito en JP06041 139-A), han demostrado ser efectivos como agentes
antiplaquetarios para los pacientes con SCA tras ICP, muestran un elevado riesgo de hemorragia asociado y un elevado coste de adquisición comparados con clopidogrel.
A pesar de todos los esfuerzos realizados en investigación en el pasado, la
disponibilidad de agentes antiplaquetarios orales está lejos de ser satisfactoria. Por ello, la investigación en busca de nuevos agentes con menor variabilidad en la actividad antiplaquetaria y con un menor riesgo de hemorragia asociado continúa activa. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado que la presencia de una sal de tungstato con un catión farmacéuticamente aceptable, en particular la sal sódica de tungstato (Na2W04), en la sangre reduce la reactividad plaquetaria por inhibición de las propiedades adhesiva y cohesiva bajo condiciones de flujo. Así, se ha encontrado que el tungstato sódico regula aspectos parciales de la función plaquetaria y, por tanto, conduce a un efecto inhibitorio de la función plaquetaria más moderado y manejable. La principal preocupación cuando se utilizan terapias antiplaquetarias consiste en encontrar las condiciones apropiadas para inhibir la reactividad plaquetaria sin causar
complicaciones hemorrágicas. Los estudios in vivo e in vitro incluidos en los Ejemplos demuestran que el tungstato sódico inhibe significativamente la interacción plaquetaria sobre superficies subendoteliales bajo condiciones de flujo, disminuyendo tanto la propiedad adhesiva como la cohesiva de las plaquetas sin interferir en las propiedades tromboelastométricas del coágulo sanguíneo.
En los estudios de adhesión en superficies vasculares bajo condiciones de flujo, el tungstato sódico muestra un efecto moderado y consistente en las propiedades adhesiva y cohesiva de las plaquetas. Este comportamiento es más similar al observado con los inhibidores del receptor para el ADP que al de la aspirina, ya que la inhibición del metabolismo del ácido araquidónico resulta en una disminución significativa de la formación del trombo mientras que la interacción individual de las plaquetas con el subendotelio dañado tiende a aumentar. En contraste con el tratamiento con clopidogrel, el efecto del tungstato sobre las propiedades hemostáticas de las plaquetas fue detectado en el sistema PFA-100 utilizando cartuchos de Col/Epi de manera similar al tratamiento con aspirina. El efecto del tungstato sobre la hemostasia está dirigido a la función plaquetaria ya que no se ha detectado ninguna acción sobre la coagulación. En los estudios in vivo con ratones (antes y después de iniciar el tratamiento con tungstato) se observaron tiempos de oclusión prolongados cuando se utilizaron los cartuchos Col/ADP en el grupo tratado. No se detectaron diferencias cuando se utilizaron cartuchos Col/Epi, probablemente debido al hecho de que los tiempos de cierre en el grupo no tratado ya eran muy prolongados. En ausencia de PTP1 B, el tiempo de cierre fue aumentado significativamente, tal y como ocurría en muestras de sangre procedente de animales control con tratamiento de tungstato sódico. PTP1 B es una fosfatasa fosfotirosina importante en la función plaquetaria, involucrada en la formación del trombo tras el daño en un vaso. De hecho, el tratamiento con tungstato sódico del ratón knockout para PTP1 B no modifica esta respuesta.
Considerando que la carga socioeconómica de la aterotrombosis está creciendo en nuestra sociedad y que los actuales tratamientos antiplaquetarios están asociados con riesgo trombótico y/o hemorrágico, el tungstato sódico ofrece una interesante estrategia antiplaquetaria.
El tungstato sódico es un compuesto con un perfil fármaco-toxicológico
razonablemente delimitado que ha superado tres estudios diferentes de fase clínica I. Ha demostrado ser efectivo en la normalización de los niveles de glucosa así como en la disminución de la ganancia de peso corporal y adiposidad. EP1400246-A describe una composición farmacéutica de un compuesto de tungsteno (VI) para la disminución de la glicemia en humanos afectos de diabetes tipo 1 ("Insulin dependent diabetes mellitus", IDDM) o tipo 2 ("Non-insulin dependent diabetes mellitus", NIDDM). EP 755681 -A muestra que los compuestos de tungsteno (VI) son también eficaces para el tratamiento de la obesidad/sobrepeso en humanos no diabéticos. El tunsgato sódico también ha sido propuesto para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o la esquizofrenia (cf. WO2007014970-A). Sin embargo, el efecto del tungstato sódico sobre la modulación de las funciones adhesiva y cohesiva de las plaquetas no ha sido descrito previamente.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención está relacionado con el uso de una sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o de un solvato de la misma, para la preparación de un medicamento para reducir la reactividad del las plaquetas en un sujeto.
La expresión "sal de tungstato farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de tungstato con un catión farmacéuticamente aceptable. Ambos términos se han utilizado indistintamente. La sal de tungstato está formada por tungsteno (VI) y una parte catiónica farmacéuticamente aceptable.
Este aspecto de la invención puede ser también formulado como una sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o un solvato de la misma para uso para reducir la reactividad de las plaquetas en un sujeto.
La invención también se refiere a un método para disminuir la reactividad de las plaquetas en un sujeto, que comprende la administración a este sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o de un solvato de la misma, junto con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Por "reactividad de las plaquetas" se entiende la activación plaquetaria en respuesta a un estímulo químico y/o herida. La agregación plaquetaria es la medida más común de reactividad plaquetaria. Así, el término reactividad plaquetaria mayoritariamente se refiere a la agregación plaquetaria en respuesta a activadores plaquetarios, por ejemplo, trombina o colágeno.
La reducción de la reactividad de las plaquetas (exceso de reactividad) se refiere a la disminución de la capacidad hemostática de las plaquetas en un sujeto, que es la capacidad que tiene un organismo de hacer que la sangre en estado líquido permanezca en los vasos sanguíneos. La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos y cuando una de estas estructuras se ve dañada, permite la formación de agrupaciones plaquetarias para detener la hemorragia, posteriormente reparar el daño y finalmente disolver el tapón hemostático. En el caso particular de las sales de tungstato de la presente invención, la reducción de la reactividad plaquetaria se produce por inhibición de las propiedades adhesiva y cohesiva de las plaquetas en un vaso dañado bajo condiciones de flujo.
La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" tal y como se utiliza aquí, se refiere a la cantidad de un compuesto que, al ser administrado, es suficiente para prevenir el desarrollo, o mejorar en algún grado, uno o más de los síntomas de la enfermedad a la que se dirige. La dosis particular del compuesto administrada de acuerdo con esta invención será por supuesto determinada por las circunstancias particulares que rodeen al caso, incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, la condición particular a tratar y otras consideraciones similares.
La expresión "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser aceptable farmacéuticamente en el sentido de ser compatible con otros ingredientes de la composición farmacéutica. Asimismo debe ser apropiado para su uso en contacto con tejido u órganos humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogeneicidad u otros problemas o complicaciones conmensurado con una relación beneficio/riesgo razonable.
Preferiblemente, el sujeto a tratar es un mamífero. Más preferiblemente, el mamífero es un humano. En una realización preferida, el sujeto a tratar padece o es susceptible de padecer una enfermedad vascular asociada a plaquetas. En otra realización más preferida, la enfermedad vascular asociada a plaquetas del sujeto es una aterotrombosis. En otra realización aún más preferida, la enfermedad vascular asociada a plaquetas es una complicación de aterotrombosis asociada a plaquetas seleccionada del grupo que consiste en ictus, arteriesclerosis cerebral, infarto de miocardio, angina de pecho, arritmias cardíacas, disfunción arterial periférica y enfermedad de Burger.
En otra realización preferida, la sal de tungstato está seleccionada del grupo que consiste en una sal de metal alcalino y una sal de metal alcalinotérreo. En otra realización más preferida, la sal de tungstato está seleccionada del grupo que consiste en sal de tungstato de sodio, potasio, magnesio y calcio.
Las sales de tungstato de la presente invención pueden estar en forma de cristalina, tanto en forma de compuestos libres de solvatacion como de solvatos (por ejemplo hidratos) y se pretende que ambas formas estén dentro del ámbito de la presente invención. Los métodos de solvatacion son generalmente conocidos en el estado de la técnica.
La sal más preferida es el tungstato sódico (Na2W04) y su dihidrato. Este último está disponible comercialmente. El tungstato sódico dihidratado es una sal blanca, inodora con una textura fina y cristalina, y de fácil disolución en agua. El uso de una sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o un solvato de la misma para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad vascular asociada a plaquetas se considera también parte de la invención. Este aspecto puede ser formulado como una sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o de un solvato de la misma para su uso en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad vascular asociada a plaquetas. La invención también hace referencia a un método para la prevención y/o tratamiento de una condición o enfermedad vascular asociada a plaquetas que comprende la administración a un sujeto que padece o es susceptible de padecer esta condición o enfermedad, de una cantidad terapéuticamente efectiva de una sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o de un solvato de la misma tal y como se define anteriormente, junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. La enfermedad vascular asociada a plaquetas puede ser ictus, arteriosclerosis cerebral, infarto de miocardio, angina de pecho, arritmias cardíacas, disfunción arterial periférica o la enfermedad de Burger. En una realización particular de los aspectos previos de la invención, la sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o de un solvato de la misma está en forma de composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o de un solvato de la misma, en combinación con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
La sal de tungstato farmacéuticamente aceptable o un solvato de la misma se puede administrar mediante cualquier sistema de administración oral convencional, siendo el formato de comprimido el preferido. Este sistema ha sido utilizado en humanos participantes en ensayos clínicos de Fase I de este compuesto para el tratamiento de la obesidad en humanos no diabéticos (EP 755681 -A).
Las composiciones tópicas de la presente invención pueden ser preparadas de acuerdo con métodos bien establecidos. Los excipientes y/o portadores adecuados, y sus cantidades, pueden ser fácilmente determinados por los expertos en la técnica según el tipo de fórmula a preparar.
Al menos que se indique lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en este documento, tienen el significado comúnmente entendido por el experto medio de la técnica al cual la invención pertenece.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG 1 es un diagrama de barras que muestra el efecto de incubar sangre humana con tungstato sódico (200 μΜ) sobre los tiempos de oclusión mediante el dispositivo PFA-100 utilizando cartuchos de colágeno/epinefrina (Col/Epi) y colágeno/ADP
(Col/ADP). El tungstato sódico prolonga el tiempo de oclusión en los cartuchos Col/Epi. Los datos se expresan como mean±SEM, n=10, *p<0,05. La FIG 2 muestra imágenes de microscopía óptica que ilustran el efecto de incubar sangre humana con tungstato sódico (200 μΜ) sobre la adhesión plaquetaria sobre superficies subendoteliales. El diagrama de barras muestra que en presencia de tungstato sódico tanto la superficie cubierta por plaquetas ("surface coverage", %) como la formación de trombos ("thrombus formation", %) disminuyeron
significativamente (p<0,005).
La FIG 3 muestra el efecto del tratamiento con tungstato sódico durante 1 semana sobre la función plaquetaria en ratones. Se evaluaron los tiempos de oclusión en el PFA-100 utilizando muestras de sangre cifrada. Tras el tratamiento oral con tungstato sódico, los tiempos de oclusión se prolongaron al analizar la capacidad hemostática de animales control (WT) en cartuchos Col/ADP (A), permaneciendo invariable al utilizar cartuchos Col/Epi (B). No se observaron cambios en animales knock-out (KO). La FIG 4 muestra el efecto del tratamiento con tungstato sódico durante 1 semana de animales control (WT) y knock-out (KO) sobre diferentes parámetros medidos en un viscosímetro. El tratamiento con tungstato sódico de animales WT resultó en un aumento de la superficie cubierta y del número de agrupaciones plaquetarias, aunque disminuyó el tamaño de los trombos. La disminución en el tamaño de los trombos también se observó en los animales KO.
La FIG 5 muestra el efecto del tungstato sódico sobre la adhesión plaquetaria sobre una superficie de colágeno en condiciones de flujo. Los experimentos se realizaron con sangre de animales control o knock-out, tratados y no tratados con tungstato. En presencia de tungstato sódico, la superficie cubierta por plaquetas ("surface coverage", %) disminuyó significativamente cuando se utilizó sangre de animales WT (p<0,05). Resultados similares fueron obtenidos en sangre de animales KO no tratados, aunque el tungstato sódico no modificó la superficie cubierta por plaquetas al utilizar sangre de estos animales KO.
La FIG 6 muestra el efecto de incubar muestras de sangre humana cifrada con diferentes concentraciones de tungstato sódico en (A) los tiempos de oclusión (s) en el PFA-100 cuando se utilizan cartuchos Col/Epi (barras negras) y Col/ADP (barras grises); y (B) la adhesión plaquetaria en los segmentos vasculares desendotelizados (perfundidos a 800s-1 durante 10 min). SC = Superficie Cubierta (%) (barras negras) y T = Formación de trombos (% respecto del total de SC (barras grises). Los datos se expresan como medía ± SEM, * p <0,01 , ** p <0,001 , y # p <0.005 vs el
correspondiente valor de la muestra no tratada.
EJEMPLOS
Se incubaron alícuotas de sangre total humana y plasma rico en plaquetas (PRP) se incubaron con tungstato sódico 200 μΜ, durante 1 hora a 37°C, para evaluar su efecto sobre la función plaquetaria, utilizando i) agregometría, con PRP, ii) el analizador de función plaquetaria (PFA-100), iii) cámara de perfusión anular, y iv) tromboelastometría, para determinar su potencial efecto en la coagulación sanguínea. Además, se obtuvieron muestras de sangre de ratones control y knockout para la fosfatasa fosfotirosina -1 B (PTP-1 B), en antecedente genético mezclado de C57BL/6Jx129/svJ. Estos animales se trataron o no, durante 1 semana con Na2W04 a una concentración de 2 g/l en agua de bebida, para estudiar la función plaquetaria mediante PFA-100 y un viscosímetro ("cone-plate analyzet", CPA). Recolección de sangre humana
La sangre se extrajo a voluntarios sanos que no habían ingerido ningún fármaco que pudiera afectar la función plaquetaria durante los 10 días previos. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes o voluntarios. La sangre se anticoaguló con citrato trisódico 1 10 mM 1 : 10 (vol/vol) y se incubó con diferentes concentraciones de tungstato sódico (0, 100, 200 y 400 μΜ).
Estudios de agregación usando técnicas tu rbid i métricas
El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtuvo por centrifugación de sangre total (120 g, 15 min). Las alícuotas de PRP se incubaron con tungstato sódico mediante agitación suave en un agregometro convencional (Aggrecorder PA 3210 aggregometer Menarini Diagnostic, Firenze). Tras 1 hora de incubación, las plaquetas se activaron con ácido araquidónico (AA, 1 ,6mM), ADP (4 y 2 μΜ), colágeno (Col, 5 μg/ml) y ristocetina (R, 1 mg/ml), durante 10 min y 37 °C bajo agitación. Se registraron los cambios en el perfil turbidimétrico y se expresó el resultado de estos cambios como % de la agregación máxima. Capacidad hemostática mediante el analizador de función plaquetaria (Platelet Function Analvzer, PFA-100)
La función plaquetaria se analizó también mediante el sistema PFA-100.
Básicamente, el sistema monitoriza la interacción de las plaquetas con membranas recubiertas de colágeno/ADP (COL/ADP) o colágeno-epinefrina (COL-Epi). Muestras de sangre cifrada se aspiraron mediante condiciones de flujo controladas por una apertura de 150 μηι en la membrana. La capacidad hemostática de las plaquetas ("platelet hemostatic capacity", PHC) de las muestras de sangre se indica como el tiempo requerido para que las plaquetas tapen y ocluyan la apertura (tiempo de oclusión, expresado en segundos).
Cone Píate Analvzer
Se utilizó el Cone Píate Analyzer (CPA) como se describe en B. Shenkman et ai, "Testing of platelet deposition on polystyrene surface under flow conditions by the cone and platelet analyzer: role of platelet activation, fibrinogen and von Willebrand factor", Thromb Res. 2000; 99:353-61. Se evaluaron tres parámetros: la superficie cubierta por las plaquetas se expresa en porcentaje (% SC) , el tamaño medio de los grupos de plaquetas unidos a poliestireno o agregados de plaquetas (AS, μηι2) , y el número de grupos de plaquetas (OB, n) .
Experimentos en sistemas de perfusión en cámara plana
Se estudió la interacción de las plaquetas de ratón con colágeno (100 μg/cubreobjecto) en un sistema de perfusión en cámara plana de bajo volumen. Muestras de sangre cifrada se perfundieron durante 5 minutos a un flujo de cizallamiento de 1200 s-1 ajustada con una bomba peristáltica (Renal systems, Minneapolis, MN). Las superficies perfundidas fueron fijadas (2,5% glutaraldehído en PBS 0, 15 M , 4 °C , 24 h ), teñidas con azul de toluidina ( 0,02%) y se evaluaron las interacciones plaquetarias por microscopía óptica. Se realizó un análisis morfométrico utilizando un sistema computerizado (Image J), y las interacciones de plaquetas se expresaron globalmente como el porcentaje de superficie cubierta por plaquetas (% SC).
Experimentos en sistemas de perfusión anular
Los estudios de adhesión bajo condiciones reológicas se realizaron utilizando cámaras de perfusión anular. Segmentos de aorta de conejo New Zealand desendotelizados enzimáticamente se colocaron de forma invertida, exponiendo la superficie dañada, en el eje central de la cámara de perfusión. Se recircularon 20 mi de muestra de sangre anticoagulada con citrato, durante 10min por la cámara de perfusión con índices de cizalladura de 800 s-1 y 1200 s-1 ajustados mediante una bomba peristáltica (Renal systems, Minneapolis, MN). Las superficies prefundidas se lavaron con PBS 0,15 M y se fijaron con glutaraldehído al 2,5% (en PBS 0,15 M) a 4 °C durante 24 horas. Las superficies fijadas de deshidrataron en un gradiente de etanol creciente, se incluyeron en el compuesto plástico JB-4, se realizaron cortes finos para microscopía óptica y posteriormente se tiñeron con azul de metileno. Las interacciones plaquetarias se evaluaron al microscopio óptico y mediante un software que clasifica y cuantifica automáticamente la superficie cubierta por plaquetas. Las interacciones plaquetarias se expresaron globalmente como el porcentaje o el área media (μηι2) de la superficie cubierta por plaquetas (surface covered, SC). Además, el software utilizado nos permitió clasificar las interacciones plaquetarias en contacto (C), adhesión (A) y trombos (T). De hecho, %SC = %C + %A + %T.
Estudios de tromboelastometría
El potencial efecto del tungstato en la tromboelastografia dinámica que mide parámetros de la coagulación de sangre total se estudió mediante el sistema ROTEM Thromboelastometry Analyser (PentapharmGmbH, Munich, Germany). La técnica se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Nos centramos en el análisis de los tests exTEM, inTEM y fibTEM. Brevemente, exTEM usa factor tisular como activador y es sensible a la medida de cambios en la vía extrínseca de coagulación, polimerización de fibrina y fibrinógeno y función plaquetaria. En el test fibTEM la función plaquetaria se elimina por el inhibidor de plaquetas citocalasina D. Mientras que los coágulos obtenidos en exTEM están compuestos de plaquetas y fibrina, los coágulos obtenidos en el ensayo fibTEM son fundamentalmente coágulos de fibrina. El test inTEM contiene ácido elágico para medir los cambios en la vía intrínseca de coagulación.
Se evaluaron parámetros estándar como tiempo de coagulación ("clotting time", CT), tiempo de formación del coágulo ("clot formation time", CFT), amplitud del coágulo tras 10min ("clotting amplitude after 10 min", A10), velocidad máxima (MaxV), y tiempo de velocidad máxima de formación del coágulo (MaxV-t). CT y CFT indican la dinámica de la formación del coágulo. La amplitud del coágulo da información sobre la resistencia y estabilidad del coágulo, la cual depende principalmente del fibrinógeno y las plaquetas, y MaxV y MaxV-t expresan la velocidad de formación del coágulo. Estudios en ratones
Ratones macho C57BL6/SV129 se estabularon bajo condiciones estándar de luz (ciclos de 12 h luz/oscuridad) y temperatura (21°C). Los animales se alimentaron ad libitum con una dieta de pienso estándar (tipo A04 de Panlab, Barcelona, España), y recibieron tungstato en el agua de bebida a una concentración de 2 g/l, durante una semana. Los estudios recibieron la aprobación del Comité Ético de la Universidad de Barcelona, cumpliendo con la legislación vigente española.
Los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina-xilacina, y se les practicó una punción cardíaca para obtener aproximadamente 800μΙ de sangre, anticoagulada con citrato 110 mM trisódico 1 : 10 (vol/vol).
Efecto del tungstato sódico sobre plaquetas humanas Efecto del tungstato sódico en la agregación plaquetaria mediante técnicas
turbidimétricas.
Se activaron muestras de PRP antes y después de ser incubadas con tungstato sódico durante 1 hora, con AA, ADP 4, ADP 2, Col, y R durante 5 minutos. Los resultados expresados como % de agregación máxima (Mean±SEM, n=10) fueron
respectivamente 82.5±3.3%, 86,4±3,6%, 78,0±8, 1 %, 91 ,5±2,8%, and 71 , 1 ±6,8% respectivamente. En presencia de tungstato sódico, el % máximo de agregación fue de 81.2±7,0%, 82,8±5,4%, 54,3±9,0%, 84,7±6,4%, y 72,7±6,2% respectivamente. Aunque los resultados no son diferentes significativamente, se detectó una disminución de la respuesta de agregación a ADP en la mínima concentración ensayada (54,3±9,0% vs. 78,0±8, 1 %, p=0,06). Efecto del tungstato sódico en la función plaquetaria mediante el sistema PFA-100
La función plaquetaria se midió en muestras de sangre antes y después de incubación con tungstato sódico mediante el sistema PFA-100 (n=7). Los tiempos de oclusión en ausencia de tungstato fueron de 141 ±6,6 y 102±5,3 sec utilizando cartuchos Col/Epi y Col/ADP respectivamente. En presencia de tungstato, el tiempo de oclusión fue significativamente prolongado sólo en los cartuchos Col/Epi, hasta 193±23,29 sec (p<0,05), y permaneció en el rango control en el cartucho Col/ADP (100±6,2 sec) (ver FIG 1). La función plaquetaria también se midió en muestras de sangre después de incubarlas con diferentes dosis de tungstato sódico (100, 200 y 400 μΜ) (n=10). Los tiempos de oclusión se prolongaron de manera dependiente de la concentración a 182,3 ± 5.5s (p <0,01), 203.6 ± 17.9s (p <0,01) y 198,3 ± 7.8s (p <0,001) en los cartuchos de Col-Epi (ver FIG 6). En los cartuchos de Col-ADP, sólo la concentración más alta utilizada de tungstato sódico (400 μΜ) dio como resultado un tiempo de oclusión retrasado de forma significativa (a 175,7 ± 36, p <0,005) (ver FIG 6 A).
Efecto del tungstato sódico sobre la interacción plaquetaria con superficies
subendoteliales bajo condiciones de flujo
Se realizaron ensayos de perfusión con los segmentos vasculares desendotelizados a un flujo de cizallamiento moderado. En ausencia de tungstato sódico, el análisis morfométrico de las superficies perfundidas a 800s-1 mostró que % SC en muestras control después de 10 minutos de perfusión fue de 33,0 ± 1 ,0% (media ± SEM, n = 9) (ver FIG 2). En presencia de 100 (n = 4), 200 (n = 9) y 400 mM (n = 4) de tungstato sódico, el % SC se redujo significativamente a 30,7 ± 3,9%, 18,0 ± 2,4% (p <0,001), y 27,0 ± 2,7% (p <0,05) (ver FIG 6B). Se encontraron agregados de más de 5 μηι (% T) cubriendo 56,3 ± 4,4% de la SC en ausencia de tungstato sódico (ver FIG 2), Mientras que en aquellas superficies perfundido con muestras de sangre preincubadas con 100, 200 y 400 M de este compuesto se produjo una disminución significativa en el porcentaje de la más grande trombos a 38, 1 ± 12,7%, 32, 1 ± 4,0% (p <0,005), y 38,2 ± 9,4%, respectivamente (ver FIG 6B).
Tabla 1 :
Figure imgf000014_0001
Efecto del tungstato sódico en las propiedades tromboelastrométricas del coágulo sanguíneo
En presencia de tungstato sódico, no se observaron diferencias significativas en los parámetros medidos en los tres tests aplicados. El efecto del tungstato sobre las propiedades viscoelásticas de los coágulos se resume en la Tabla 1. Los datos están expresados como media ±S.E.M (n=4). El tungstato sódico no mostró ningún efecto sobre las propiedades tromboelastométricas del coágulo sanguíneo.
Efecto del tungstato sódico en la función palquetaria del ratón Función plaquetaria en PFA-100
Se midió la función plaquetaria en muestras de sangre de n=8 ratones control, antes y tras tratamiento con tungstato sódico, mediante el PFA-100 (ver FIG 3). Los tiempos de oclusión en ausencia de tungstato sódico fueron de 148±17,4 y 211 ±18 s al utilizar cartuchos Col/ADP y Col/Epi, respectivamente. En presencia de tungstato sódico, los tiempos de oclusión fueron significativamente prolongados sólo en el cartucho Col/ADP, hasta 272,8±12,4 s (p<0,01), y permanecieron similares a los obtenidos en ausencia de tungstato sódico en el cartucho Col/Epi (227±10 s).
La función plaquetaria se midió en muestras de sangre de n=8 ratones knockout para PTP1 B, tras tratamiento con tungstato sódico, mediante el PFA-100. Los tiempos de oclusión en ausencia de tungstato sódico fueron de 292,9±4,5 y 256±10 s al utilizar cartuchos Col/ADP y Col/Epi, respectivamente. En presencia de tungstato sódico, los tiempos de oclusión no fueron significativamente diferentes, ni en el cartucho Col/ADP (258,6±13,3 s) ni en el cartucho Col/Epi (196,6±61 s).
Interacción plaquetaria en Cone Platelet Analyzer
También se evaluó el efecto del tungstato sódico en la interacción plaquetaria con el viscosímetro Cone Píate Analyzer (ver FIG 4). La adhesión plaquetaria a una superficie plástica se midió utilizando muestras de sangre de n=8 ratones control, antes y después de tratamiento con tungstato sódico. La superficie cubierta por plaquetas ("suríace covered by platelets" , SC), el tamaño medio de los agregados ("average size", AS), y el número de objetos adheridos ("objects", OB) en ausencia de tungstato sódico fue de 1 ,40±0,39; 32,9±1 ,82 y 47,96±11 ,75 respectivamente. Tras el tratamiento con tungstato sódico, tanto SC como OB aumentaron significativamente hasta 4,48±1 ,37 y 783,1 ±229,39 respectivamente (p<0,05); AS disminuyó a 22,2±0,79.
Los mismos parámetros se midieron utilizando muestras de sangre de n=8 ratones knockout para PTP1 B antes y después de tratamiento con tungstato sódico. No se observaron diferencias significativas en ninguno de estos parámetros en sangre de ratones KO en respuesta al tratamiento con tungstato sódico. La superficie cubierta por plaquetas (SC), el tamaño medio de los agregados (AS), y el número de objetos adheridos (OB) en ausencia de tungstato sódico fueron de 1 ,75±0,79; 32, 1 ±2,8 y 100,1 ±25,28, respectivamente. Tras el tratamiento con tungstato, SC se encontraba disminuida ligeramente pero no de manera significativa hasta 0,64±0, 14; AS se encontraba disminuida ligeramente pero no de manera significativa hasta 26, 13±02, 1 y OB se encontraban ligeramente aumentados a 146,5±33,87.
Interacción plaquetaria con colágeno bajo condiciones de flujo
Además, se analizó el efecto del tungstato sódico en la interacción plaquetaria con una proteína adhesiva de la matriz extracelular, como es el colágeno, bajo condiciones de flujo (ver FIG 5). La perfusión de sangre total cifrada en ausencia de tungstato sódico resultó en la formación de trombos plaquetarios. El análisis morfométrico de las superficies prefundidas a 1200s-1 mostró que el %CS en sangre de ratones control tras 5min de perfusión era de 45,49±13,43% (Mean±SEM, n=5). Tras el tratamiento con tungstato sódico, el % SC en muestras de sangre de ratones control se redujo a 30, 71 ±1 ,26%, aunque esta disminución no fue estadísticamente significativa.
Al realizar estos experimentos en sangre de ratones knockout, el % SC fue de
13,86±0,35 y 16,23±0,74, sin y con tratamiento con tungstato respectivamente. El tratamiento con tungstato en el ratón knockout no modificó la interacción de las plaquetas con el colágeno.
En resumen, en presencia de Na2W04 ni la respuesta de agregación máxima ni las propiedades tromboelastográficas del coágulo sanguíneo estaban afectadas. Sin embargo, el tiempo de oclusión medido con el PFA-100 estaba significativamente prolongado en el cartucho Col/Epi y permanecía en el rango control en el cartucho Col/ADP. En los estudios de adhesión sobre segmentos vasculares desendotelizados bajo condiciones de flujo, la superficie cubierta por plaquetas y la formación de trombos disminuyó en presencia de Na2W04. En estudios con ratones, el tratamiento con Na2W04 prolongó los tiempos de oclusión medidos con el sistema PFA-100 utilizando el cartucho Col/ADP. Además, la presencia de Na2W04 disminuyó el tamaño de los trombos en estudios de adhesión en condiciones de flujo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de una sal de tungstato de un metal farmacéuticamente aceptable, o de un solvato de la misma, para la preparación de un medicamento para reducir la reactividad de las plaquetas en un sujeto.
2. Uso según la reivindicación 1 , donde el sujeto es un mamífero.
3. Uso según la reivindicación 2, donde el mamífero es un humano.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la reducción de la reactividad plaquetaria es producida por inhibición de sus propiedades adhesivas y cohesivas.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el sujeto padece o es susceptible de padecer una condición o enfermedad vascular asociada a plaquetas.
6. Uso según la reivindicación 5, donde la condición o enfermedad vascular asociada a plaquetas es aterotrombosis.
7. Uso según la reivindicación 6, donde la enfermedad vascular asociada a plaquetas es una complicación de la aterotrombosis asociada a plaquetas y se selecciona del grupo que consiste en: ictus, arteriesclerosis cerebral, infarto de miocardio, angina de pecho, arritmias cardíacas, disfunción arterial periférica y enfermedad de Burger.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la sal de tungstato se selecciona del grupo que consiste en una sal de metal alcalino y una sal de metal alcalinotérreo.
9. Uso según la reivindicación 8, donde la sal de tungstato está seleccionada del grupo que consiste en tungstato de sodio, de potasio, de magnesio y de calcio.
10. Uso según la reivindicación 9, donde la sal de tungstato es tungstato sódico.
1 1. Uso según la reivindicación 10, donde el solvato de la sal es un dihidrato.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-1 1 , donde de la sal de tungstato, en cantidad terapéuticamente efectiva, está combinada con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, formando una composición farmacéutica.
13. Uso según la reivindicación 12, donde la composición farmacéutica es para uso oral.
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