WO2014092609A1 - Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека - Google Patents

Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека Download PDF

Info

Publication number
WO2014092609A1
WO2014092609A1 PCT/RU2013/001108 RU2013001108W WO2014092609A1 WO 2014092609 A1 WO2014092609 A1 WO 2014092609A1 RU 2013001108 W RU2013001108 W RU 2013001108W WO 2014092609 A1 WO2014092609 A1 WO 2014092609A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
telomeric
cells
cell
seq
sequences
Prior art date
Application number
PCT/RU2013/001108
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Елена Андреевна ЧИРЯСОВА
Original Assignee
Chiryasova Elena Andreyevna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiryasova Elena Andreyevna filed Critical Chiryasova Elena Andreyevna
Priority to EP13862657.7A priority Critical patent/EP2960340A4/en
Publication of WO2014092609A1 publication Critical patent/WO2014092609A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C12N2310/151—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs more than 3 strands, e.g. tetrads, H-DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular genetics and cell biology, and is intended to affect cell division using single-stranded terminations of the G-chain of human telomeric DNA (telomeric overhangs).
  • the claimed method is used to draw up a corrective effect on the proliferative status of cells in order to suppress or activate cell division.
  • the effect is based on the specific effect of various sequences of telomeric repeat of human DNA and their endings on the advancement of the phases of the cell cycle.
  • the use of telomeric overhang endings responsible for the suppression or stimulation of cell division opens up new prospects for the use of synthetic analogues of telomeric DNA sequences to control the proliferative status of cells and tissues.
  • the invention is a new kind of DNA therapy and can be used in medicine in the field of cancer treatment, in immunology to control the body’s immune status, in gerontology, dermatology and cosmetology to maintain the ability of cells and tissues to regenerate and rejuvenate the body as a whole.
  • T-oligos synthetic analogues of telomeric overhangs
  • synthetic analogues of the G-chain of telomeric DNA are active and act as open (not looped) forms of native overhangs. They are signals for the cell to damage telomeric DNA, which trigger the processes of repair and stop the cell cycle.
  • synthetic analogues of telomeric overhangs to suppress cell division is based on this principle.
  • telomere-based DNA damage responses a new approach to melanoma (2004) FASEB J. Vol. 18, N ° 12, pp.
  • telomeric sequences which are the closest prototypes of the proposed method. It is important to emphasize that they were most often used as the basis for anticancer therapy in the form of the 11-membered oligonucleotide pGTTAGGGTTAG ending in the TAG terminal triplet (Puri N. et al., 2004; Eller MS et al., 2006; Aoki H. et a!., 2007; Yaar M. et al., 2007).
  • Other ending variants for example, the rTT dimer and the 16-membered variant pGTTAGGGTTAGGGTTA endings, did not show a pronounced effect on cell division.
  • the rTT dimer which has a very low degree of homology with telomeric DNA due to its very short length, caused increased pigmentation of hair follicles (Atoyan RY, Sharov A.A., Eller MS, Sargsyan A., Botchkarev VA, Gilchrest BA Oligonucleotide treatment increases eumelanogenesis, hair pigmentation and melanocortin-1 receptor expression in the hair follicle. Experimental Dermatology (2007) Vol.16, NQ8, pp. 671-677).
  • the non-hydrolyzable phosphotioate form (PS-T-oligos) with the blocked 3'-end turned out to be ineffective.
  • processing completely hydrolyzed form of T-oligos led to the accumulation of cells in the S-phase of the cell cycle.
  • a study of the half-life of telomeric oligonucleotides showed that the phosphothioate form (PS-T-oligos) had a longer half-life, in contrast to the unblocked form. This indicated that the latter form is an active substrate for cleavage by nucleases in contrast to the phosphotioate form.
  • blocking by the phosphotioate groups of the 5 'end was not significant.
  • T-oligos were used only as molecular signals, indicating a violation of the telomeric DNA loop structure and leading to the arrest of the cell cycle. In this case, no attention was paid to the specific sequence of telomeric oligonucleotides. Most often, the TAG version of the termination of telomeric overhangs was used, which was added at a final concentration of 40 ⁇ M in the kuligural medium, which significantly exceeded its physiological amounts in the cells. Such an overabundance led to toxic effects for the cell associated with the arrest of the cell cycle, and formed the basis of the old concept of using synthetic analogues of telomeric overhangs to influence cell division. Moreover, T-oligos were most often used in anti-cancer therapy as anti-fission agents and have never been used as stimulators of proliferation or as factors controlling the onset of certain phases of the cell cycle.
  • the main technical task of the claimed invention is to develop a method for using telomeric overhang sequences within physiologically non-toxic concentrations based on an understanding of the role of differences in their nucleotide sequences and especially endings in cell division.
  • the technical result of the invention is to reduce toxicity and increase the degree of specificity of the effects of synthetic analogues of telomeric overhangs on cells in order to influence their proliferative status and achieve a variety of therapeutic effects.
  • the essence of the invention consists in the use of aqueous solutions of specific nucleotide sequences of the G-chain of human telomeric DNA in a final concentration of less than 40 ⁇ m in the environment surrounding the cell.
  • the principles of using the claimed invention are based on the establishment of a polymorphism of the ends of telomeric overhangs, depending on the phase of the cell cycle.
  • An activated cell division state associated with the trigger moment of the transition of the G 0 phase to the G1 phase is characterized by an unbalanced nonequilibrium profile of the telomere overhang terminal nucleotides. It is associated with a sharp increase in the number of overhang endings per TTA triplet (up to 70%). In this case, the percentage of terminal triplets TAG and AGG drops to zero.
  • a balanced equilibrium profile of terminal nucleotides is characteristic. It is characterized by a high AGG content of the terminal triplet, approximately equal to the number of GTT endings (25-27%). The number of TTA triplets is approximately equal to the content of the TAG of the termination variant (16-20%), and the GGT of the triplet is equal to the number of GGG termination (5-7%).
  • Each telomeric overhang in a cell is represented by the sequence of one of the six variants of the telomeric repeat presented in SEQ ID NO: 1-6, which ends with a specific combination of nucleotides that make up its terminal triplet.
  • the terminal triplet of nucleotides, with which telomeric overhangs end plays a special role in the cell.
  • a terminal triplet may be represented by one of the options presented in SEQ ID NO: 7-12.
  • the TAG terminal triplet which was previously used to influence dividing cells, is only one of the variants of telomere overhang endings that occurs in the cycle of ponucleotide displacements: AGG- "TAG-" TTA- "GTT->GGT—>GGG—> AGG. Its function of suppressing division, widely used earlier in anticancer therapy, is based on the fact that it is one of the triplets characteristic of the non-dividing state of the cell. It was shown that the end of TAG is absent in malignantly transformed lymphocytes in the mitosis phase, in which it must be present as a criterion for the normal implementation of division. A reduction in the number or complete absence of AGG and TAG terminal triplets in all phases of the cell cycle, with the exception of the moment of transition from G 0 to the early d phase, can be a criterion for cell malignancy.
  • AGG (SEQ ID NO: 8), a variant of termination of terminal overhangs specific for the non-dividing state of the cell, a balanced profile of terminal DNA nucleotides and a tissue-specific program for cell development, is the basis for influencing the proliferative status of cells in order to suppress cell division and disable the embryospecific program development. This determines its more effective use in anticancer therapy compared to the TAG ending option.
  • the termination variant of telomeric overhangs based on the TTA (SEQ ID NO: 12) of the terminal triplet in physiologically adapted concentrations that are non-toxic and non-arresting the cell cycle can form the basis of the effect stimulating cell division.
  • the effectiveness of its use is determined by the fact that it is associated with the establishment of an unbalanced profile of the terminal nucleotides of telomeric DNA in the cell upon activation of division. It, in turn, is associated with activation of embryospecific and suppression of tissue-specific development programs. and the emergence of a nonequilibrium quantum state of the cell with a predominance of red fluorescence of telomeric overhangs.
  • the latest concept of using telomeric overhangs to correct the proliferative status of a cell is based on the fact that each variant of the nucleotide sequence of the telomeric repeat and its terminal triplet plays the role of a molecular and quantum signal.
  • the ratio of these signals is very important for the regulation of cell division.
  • the basis of the patented method of influencing the proliferative status of the cell is various variations of the nucleotide sequences of telomeric overhangs and especially their endings. In this case, not only individual oligonucleotide sequences can be used, but also mixtures with a certain quantitative ratio of different sequences.
  • a separate area of use of the proposed method is the use of modified synthetic analogues of telomeric overhangs.
  • the introduction of such groups in the repeating sequences G S G S G (SEQ ID NO: 9), A S G S G (SEQ ID NO: 8) and TA S G (SEQ ID NO: 7) may interfere with the GGG- transitions > AGG- + TAG — TTA.
  • a TTA triplet that activates fission will not occur again, which is very important in anticancer therapy.
  • the introduction of phosphotioate groups into the sequence of the terminal triplet TsTsA will also protect it from transformation in the cycle of ponucleotide displacements and preserve its stimulating effect.
  • the second direction of modification of synthetic analogues of telomeric overhangs is the use of fluorescent labels and absorbers. They allow you to enhance or weaken the natural fluorescence of synthetic analogues of telomeric overhangs in a certain spectrum.
  • fluorescence labeling of an AGG terminal oligonucleotide with dyes in the green fluorescence spectrum in the range 520-540 nm for example, using carboxyfluorescein.
  • red fluorescence absorbers of the RTQ-2 or BHQ-3 type can be used together.
  • TTA-terminal oligonucleotide To activate cell division and launch an embryospecific development program, a modification of the TTA-terminal oligonucleotide using a combination of dyes of orange-red and red spectra (ROX, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, TexasRed) with green spectrum absorbers (RTQ1, BHQ1).
  • a blue spectrum is similar to the green spectrum for the development of photoreactions in the cell. In this case, it is possible to use fluorescent dyes and blue spectrum absorbers.
  • the third area of modification is the use of photodisorbable groups, which can provide time-controlled destruction of telomeric oligonucleotides under the influence of light of a certain wavelength.
  • the introduction of such groups will allow us to regulate the cleavage of terminal nucleotides and thereby control the mutual transitions of terminal triplets into each other in accordance with the cycle of their ponucleotide displacements during the cell cycle.
  • telomeric overhang fraction in the cell is a population heterogeneous in length and termination, physiologically adapted to perform functions at certain stages of the cell cycle.
  • this embodiment of the method is a mechanism for transmitting proliferative information from one cell to another via a molecular substrate.
  • donor cell cultures are used that synchronize at certain stages of the cell cycle and are used to obtain fractions of native telomeric overhangs.
  • the difficulty of using these fractions lies in the impossibility of preventing their inclusion in the cycle of ponucleotide displacements of the endings due to exonuclease effects in the recipient cells.
  • the effect of their exposure may be shorter than when using modified synthetic analogues of telomeric overhangs with blocking groups that prevent hydrolysis.
  • Regulation of cell division is carried out by proliferative information recorded in variations of the sequence of telomeric DNA repeats and regulated by their nucleotide endings.
  • the regulation mechanism is carried out at the level of gene expression according to the principle of long-range action and superposition of soliton waves of various nature, including optical.
  • An ideal testing ground for the formation of rotational-vibrational soliton waves is single-stranded telomeric overhangs, the nucleotides of which have a maximum degree of freedom compared to double-stranded DNA. It was established that the dynamics of solitons is sensitive to the place initiation and depends on the nucleotide sequence of DMC.
  • telomeric repeats Reflecting the specific nucleotide sequence of telomeric repeats, the dynamics of soliton perturbations is a referent for reading proliferative information and is capable of exercising a long-range effect on the expression of genes responsible for division.
  • a specific source of photon pumping for the formation of optical solitons on telomeric overhangs may be their specific fluorophore-bound fluorescence.
  • telomeric overhangs of various nature that make up corrective wave patterns based on the claimed nucleotide sequences and endings.
  • Such waveforms in the form of electromagnetic, sound vibrations, torsion and other fields of vacuum and quantum nature, including holographic or soliton origin, can be used to rejuvenate and extend the life of the human body, adjust its proliferative and immune status, treat cancer and other diseases .
  • Their action is based on the directed effect of patentable telomeric sequences on the proliferative status of wave information recipient cells. This determines the immediate prospects for using the claimed telomeric overhang sequences in biology, biotechnology and medicine.
  • telomere division is controlled by proliferative information recorded in variations of the sequence of the hexanucleotide repeat of the G-chain of telomeric DNA and regulated by their nucleotide endings.
  • the inventive method allows to compose specific nucleotide sequences of human telomeric DNA based on six variations of the basic telomeric repeat sequence presented in the sequences: GGTTAG, GTTAGG, TTAGGG, TAGGGT, AGGGTT, GGGTTA (SEQ ID NO: 1-6).
  • Sequences can consist of l-th number of one of the basic sequences shown in SEQ ID NO: 1-6 and end with a full-sized or incomplete-sized repeat.
  • a specific combination of the terminal nucleotides of the telomeric sequence constituting its terminal triplet of TAG, AGG, GGG, GGT, GTT and TTA plays a special role in influencing the proliferative status of cells.
  • Figure 1 Dynamics of expression of genes associated with the division of lymphocytes after treatment of cells with synthetic analogues of telomeric overhangs, differing in the nucleotide sequences of the telomeric repeat and triplet endings (on the example of oligonucleotides in a final concentration of 20 ⁇ M). Displays the dynamics of changes in gene expression over time for 24 hours with an interval of 4 hours.
  • Figure 2 Dynamics of the level of cyclins and interleukin-2 mRNA after treatment of human lymphocytes with AGG-terminal analogues of telomeric overhangs (for example (AGGGTT) 2 AGG oligonucleotide at a final concentration of 10 ⁇ M). Displays the dynamics of changes in gene expression over time for 15 hours with an interval of 5 hours. The maxima of gene expression are indicated by the dash-dot line, and the minima by the dashed line.
  • AGG-terminal analogues of telomeric overhangs for example (AGGGTT) 2 AGG oligonucleotide at a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Figure 3 Diagram of cyclin mRNA level after 0 hours of lymphocyte treatment with (AGGGTT) 2 AGG oligonucleotide at a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Figure 4 Dynamics of the cyclin and interleukin-2 mRNA level after treatment of human lymphocytes with GGT-terminal analogues of telomeric overhangs (for example (GGTTAG) 2 GGT oligonucleotide at a final concentration of 10 ⁇ M). Displays the dynamics of changes in gene expression over time for 26 hours with an interval of 4 hours. The maxima of gene expression are indicated by the dash-dot line, and the minima by the dashed line.
  • GGT-terminal analogues of telomeric overhangs for example (GGTTAG) 2 GGT oligonucleotide at a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Figure 5 The relationship of the expression of cyclin B1 and interlekin-2 under the influence of treatment of human lymphocytes with various sequences of synthetic analogues of telomeric overhangs at a concentration of 20 ⁇ m. Conjugated maxima of gene expression are indicated by a dash-dot line.
  • Figure 8 Diagram of FAM-linked fluorescence levels in the green spectrum of human telomeric DNA G chain sequences.
  • telomeric sequence consisting of two full-length hexanucleotide repeats.
  • telomeric sequence consisting of two full-sized hexanucleotide repeats ending in an incomplete repeat in the form of a triple presented in SEQ ID NO: 7-12.
  • sequence formula is 2p + 1 / 2p, where n is the telomeric repeat shown in SEQ ID NO: 1-6.
  • the claimed invention is illustrated by examples that demonstrate the possibility of using variations of the nucleotide sequences of the G-chain of human telomeric DNA to affect the proliferative status of cells.
  • Human peripheral blood lymphocytes were taken as a basic model for studying their effect.
  • To control their proliferative status we used the study of the expression of marker genes that control cell division.
  • For lymphocyte-stimulated lymphocytes specific expression of cyclins A, B, E, and D is shown, which is characteristic for a certain phase of the cell cycle.
  • telomeric overhang sequences were selected.
  • the cyclin genes A2, B1, E1 and D2 as well as the interleukin-2 gene (IL-2), coupled with the active proliferation of lymphocytes, were selected.
  • Example 1 The impact on the proliferative status of human lymphocytes using telomeric DNA sequences that differ in variations of the nucleotide sequence of the telomeric repeat and triplet endings.
  • lymphocytes of the peripheral blood of a donor who had ARVI disease which were characterized by natural activation of division during 2 weeks of the study period, were taken.
  • Oligonucleotides synthesized by the standard phosphoramidite synthesis method at Eurogen ( Russian) were used. Oligonucleotides were sequences of the G-chain of human telomeric DNA, imitating its single-stranded overhangs, length 15 acting:
  • Each sequence consisted of a variation of two full-length telomeric repeats presented in SEQ ID NO: 1-6 and ended with six possible variations of the terminal triplet from SEQ ID N0 -12.
  • oligonucleotides were added to the RPMI-1640 culture medium at a final concentration of 20 ⁇ M.
  • a cell culture sample was used in which the oligonucleotide solution was replaced with sterile distilled water.
  • consecutive sampling of part of the cells was carried out for 24 hours with an interval of 4 hours.
  • Selected cells were used to isolate RNA and set up the standard RT-PCR procedure.
  • To analyze gene expression we used densitometric analysis of electrophoretic separation in agarose gel of amplification products of mRNA sequences of the studied genes in the presence of ethidium bromide. The level of expression of each gene was determined as the ratio of its mRNA level to the mRNA level of the normalizing GAPDH gene and was evaluated in fractions of unity.
  • the graphs indicate that the variants of telomeric oligonucleotides used have caused cyclic changes in the expression of genes associated with cell division. Moreover, each variant of the sequence led to specific changes in the dynamics of cyclins and interleukin-2.
  • the terminal triplet AGG sharply differed in its effect from the rest and was a kind of antagonist of all other variants of telomeric overhang endings.
  • the nature of its effect on the dynamics of the main cyclins was in antiphase compared with the action of all other variants of endings, including the control sample.
  • a decline in the sample processed by the AGG variant of termination.
  • the growth of gene expression following this stage under the influence of the AGG termination of the oligonucleotide was accompanied by a decrease in gene expression in the remaining samples.
  • Such a wave-like character of cyclin dynamics associated with the antiphase effect of the AGG variant of the end of the telomeric sequence was especially pronounced for cyclins A2, B1 and E1 (Fig. 1 AB).
  • Cyclin E1 under the influence of the AGG-teriminal variant of the sequence was characterized by delayed upset expression (Fig. 1 B). Moreover, at the moment when the mRNA level of this cyclin began to fall under the influence of other variants of endings, a sample containing an AGG-terminal oligonucleotide revealed a steady increase in the mRNA level with a peak at 12-16 hours. It is known that expression of cyclin E1 provides the advancement of the Gi phase into the early synthetic S phase and appears after 18 hours from the moment of stimulation of lymphocytes to division by means of PHA.
  • cyclin D2 On the expression of cyclin D2, the AGG-terminal analogue of the overhang did not have a pronounced effect (Fig. 1 G). Apparently, this is due to the fact that cells in the G 0 phase of the cell cycle, when expression of this cyclin is possible, are characterized by the predominance of the AGG variant of the termination of telomeric overhangs (the main state of non-dividing cells in the resting phase). It is known that cyclin D2 is expressed in G 0 and early d phases of the cell cycle of lymphocytes, and cyclin D3 is absent in the G 0 phase and increases in the late phase. In this regard, we suggested that the termination of AGG will have a stronger effect on the expression of cyclin D3, which unambiguously indicates the advancement of the cell in the Gi phase of preparation for division.
  • the TTA sequence variant (SEQ ID NO: 12) of the ending variant resembled the effect of the TAG ending with some specific differences. This confirms the similarity of the action of telomeric overhangs, the endings of which differ by a shift of the sequence by one nucleotide.
  • this concerns the trigger moment of activation of cell division, which occurs when the G 0 phase goes into phase. It was shown that exactly at this moment the content of TTA of the variant of termination of telomeric overhangs in the cell sharply increases.
  • the effect of this termination in other phases of the cell cycle, not related to the moment of division activation is determined by the effect on the time of their onset through regulation of cyclin expression.
  • GGT SEQ ID NO: 10
  • GGT an end variant similar to the others in the general form of the graphs, was also out of phase with the AGG terminal triplet, but was characterized by the latest onset of expression maxima and minima of the studied genes.
  • the onset of the primary maximum, as well as the secondary one was shifted. It occurred at 12 hours for cyclin A2 and at 10 hours for cyclin B1 (Fig.1 A and B).
  • the primary minimum of gene expression occurred, as in GGT and TTA terminal triplets, at 16 hours.
  • the secondary expression maximum for all cyclins was delayed in time and occurred after 24 hours of exposure to GGT termination.
  • GGTTAG ⁇ GGT 10 ⁇ M concentration of oligonucleotide
  • the position average between the TTA and GGT variants of the termination of telomeric sequences was occupied by the GTT terminal triplet (SEQ ID NO: 11). This confirms their proximity and difference by a shift of only one nucleotide to the right or left along the telomeric sequence.
  • GGG SEQ ID NO: 9
  • the terminal variant of the termination occupied an intermediate position between the antiphase AGG variant of termination and the rest of the terminal triplets. Under its influence, there was a surge in the mRNA level in the 16-hour period for cyclins B1 and E1, which coincided with the maximum for the AGG variant of termination (Fig. 1 B and C).
  • the effect of the GGG termination variant was similar to the effect of the terminal triplets TAG, TTA, GTT and GGT, and then became similar to the effect of the AGG termination.
  • This observation confirms the existence of a cycle of ponucleotide displacement of telomeric endings, during which the transition of terminal triplets GGG -> AGG occurs as a result of exonuclease cleavage of the 3'-terminal nucleotide.
  • telomeric sequences and their endings on the expression of cyclins and interleukin-2 show that they all cause shifts in the dynamics of their mRNA levels.
  • a control sample of cell culture in which water was added instead of the oligonucleotide, occupied an intermediate position between them by the nature of the effect.
  • This fact indicates that in the native culture of lymphocytes there are all variants of the endings of telomeric overhangs in a certain balanced ratio.
  • the addition of additional synthetic analogs of overhangs to this initial ratio caused shifts in the expression of cyclins and interleukin-2, and, thus, affected the passage of phases of cell division.
  • Example 2 The inhibitory effect of AGG (SEQ ID NO: 8) of the variant ending of the nucleotide sequence of telomeric DNA on the proliferative status of human lymphocytes.
  • the experiment used two times less, compared with the first example, the amount of oligonucleotide (AGGGTT) 2 AGG in a final concentration of 10 ⁇ M in order to evaluate the possible dose-dependent effect of exposure.
  • the results are presented in graphs (Fig. 2), showing mRNA levels of cyclins A2, B1, D2 and E1 and interleukin-2 after 15 hours of exposure to telomeric oligonucleotides.
  • the dashed line indicates the minima of gene expression, and the dash-dot line indicates the expression maxima.
  • the AGG-terminal variant of the termination of telomeric overhangs which predominates in terms of quantity and quantum emission among other non-dividing cells in the ground quantum state, plays an important role, restraining cyclin expression and cell progression to division.
  • the restraining role of this variant of the terminal triplet which has an antagonistic effect in relation to other variants responsible for the advancement of the phases of the cell cycle, can be effectively used in the regulation of cell proliferation for therapeutic purposes. It has been shown that the use of T-oligos AGG-terminal variants to suppress division by several orders of magnitude is more effective than using the popular TAG ending. In this case, the phosphotioate derivatives of this terminus, which protect it from degradation and prolong its suppressive division action, will be of particular importance.
  • Example 3 The effect of GGT (SEQ ID NO: 10) of the termination variant of the nucleotide sequence of telomeric DNA on the proliferative status of human lymphocytes.
  • oligonucleotide GGTTAG 2 GGT was used.
  • the decrease in the concentration of oligonucleotide slightly affected the nature of its effect, despite the fact that the density of the culture remained the same as in the first experiment, and each cell received a smaller amount of oligonucleotide.
  • cyclin D2 For cyclin D2, an additional minimum of expression was revealed at 10 hours, as well as a less pronounced decline at 18 hours, which, apparently, was a continuation of the 16-hour decline observed when exposed to 20 ⁇ M oligonucleotide in example 1 (Fig. 4B). The secondary maximum of cyclin D2 expression was observed at 22 hours, as for cyclin E1.
  • the primary maximum occurs earlier than the others, already at 4 hours, and for variants of TTA, GGG, GTT endings and control at 8 hours.
  • the GGT-terminal oligonucleotide the onset of the primary maximum of cyclin gene expression is shifted in time and occurs only at 12 o’clock.
  • the primary minimum occurs between 12 and 16 hours, and for TTA, GTT and GGT endings - later, at 16 hours.
  • the mRNA level of the studied genes drops to zero against the background of a more gradual decrease in the control sample.
  • sequences with terminal triplets TAG and GGT are as different as possible from each other and are antagonists with respect to telomeric repeat variation with a shift by a whole triplet (TAG GGT and GGT TAG).
  • the AGG termination variant differs sharply from all other variants and has an antiphase dynamics of action with respect to them.
  • the expression minima of all the studied genes under its influence corresponded to the maxima for the other ending variants and vice versa.
  • the 12-hour minimum of expression for cyclin A2 under the influence of the terminal triplet AGG coincided with the maximum for the GGT variant of the termination
  • the 8-hour minimum for cyclin B1 coincided with the maxima for the TAG, GGG, GTT terminal triplets and the control sample.
  • the 16-hour period of the minimum expression of cyclins A2 and B1 for the TAG, GGT, GTT, and TTA variants of terminations and controls coincided with the maximum for the AGG terminal triplet.
  • Example 2 under the influence of AGG termination for most cyclins (A2, B1, D3 and E1), a 10-hour decline was confirmed compared to the control sample (Fig. 2). At the same time, an increase in the expression of cyclin D2 was observed against the background of a decrease in the level of cyclin D3, which may indicate a delay of some cells in the G 0 phase under the influence of the AGG variant of telomere overhang termination (Fig. 3).
  • the expression of the interleukin-2 AGG variant of the end of the telomeric sequence had a similar antiphase effect compared to the action of other variants. Despite the visible inhibitory effect that was observed for the first 12 hours in the first example (Fig. 1 D), the maximum expression of interleukin-2 at 5 hours was found in Example 2 (Fig. 2 D). This once again proves the fact that each terminal nucleotide in the telomeric overhang determines the onset of a specific maximum expression of genes that control cell division. In this case, a shift of the end by one nucleotide leads to a shift in the onset maximum expression. For interleukin-2 under the influence of the AGG variant of the termination, a 5-hour expression maximum was characteristic.
  • the GTT variant of the ending occupies an intermediate position between them.
  • the estimated minimum expression of interleukin-2 is between 8 and 10 hours, that is, at 9 hours.
  • the AGG variant of telomere overhang termination (5 hours) is characterized by the earliest occurrence of the primary maximum of its expression. Then, a series of ponukpeotid end shifts due to cleavage of terminal nucleotides causes a prolongation of the onset of maximum gene expression up to 10 hours, which corresponds to the GGT variant of termination. It was characterized by the latest onset of the primary maximum expression of interleukin-2. The whole process of shifting the onset of the maximum expression of interleukin-2, depending on the variant of the end of the telomeric overhang, is reflected schematically:
  • GGG version of the overhang termination which, despite being different by a whole triple from the TTA termination variant, has the same maximum expression of interleukin-2.
  • the exclusivity of the GGG variant of the overhang termination is most likely due to its unique fluorescent characteristics. It was found that, along with the AGG termination, it has the maximum FAM-linked fluorescence in the green spectrum. This is important, since these variants of the end of telomeric overhangs are the maximum donors of light energy in the green spectrum. Fluorescence of such a spectrum is characteristic of the equilibrium quantum state of a non-dividing cell.
  • telomeric overhangs Due to the fact that AGG and GGG of the end of telomeric overhangs are spectrally close, they have more maximally closer expression times of the genes responsible for cell division than according to the calculations of the ponucleotide bias scheme. Expression maxima similar to interleukin-2 were also found for the cyclin B1 gene. The conjugation of gene expression of interleukin-2 and cyclin B1 is of great importance for understanding the mechanisms of cell cycle progression and the process of cell malignancy.
  • the mechanism of the antagonistic action of the AGG variant of the overhang termination option is revealed in comparison with other termination variants. It is most likely due to the fact that the maximum for the AGG variant of the end occurs and ends earlier than the others (about 5 hours) and falls into antiphase with the action of the remaining terminal triplets. Moreover, the antiphase dynamics of the AGG of the terminal triplet, as compared to the action of other terminal triplets, is clearly visible in the graphs of FIG. 1. The identified feature of this the variant of the ending to counterbalance with other endings, including the TTA ending characteristic of cell state activated to division, underlies its use to suppress proliferation.
  • group B cyclins are responsible for the passage of the late synthetic phase, activating the activity of the cyclin-dependent kinase Cdk2, and most importantly, they ensure the formation of a complex with Cdk1 (mitosis-stimulating factor), which ensures cell entry into mitosis.
  • Cdk1 mitosis-stimulating factor
  • a control sample containing only native overhangs in a physiological ratio occupied an intermediate position in the dynamics of changes in the expression of cyclin and interleukin-2 genes (Fig. 1).
  • the introduction into the cells of artificial analogues of telomeric overhangs of different sequences with different terminal endings caused shifts in the dynamics of the genes that control proliferation.
  • the expression maxima of the studied genes under the influence of various sequences did not overlap. For each hour, there was one peak in the mRNA level of cyclin and interleukin-2 genes under the influence of one variant of the nucleotide sequence of the telomeric overhang.
  • telomeric DNA in the content of terminal nucleotides into the diagnostic practice of medical institutions and the study of the fluorescence and spectral characteristics of telomeric overhangs. Carrying out such diagnostic measures will allow to obtain the greatest therapeutic effect from the effects of synthetic analogues of telomeric sequences using the proposed method.
  • corrective profiles of its endings are compiled in order to create trigger conditions for the activation of cell division or, conversely, to suppress proliferation.
  • An example of compiling such corrective profiles in anti-cancer therapy is Example 4.
  • Example 4 The preparation of the corrective profile of the triplet endings of human telomeric DNA in order to suppress cell division of the leukemic cultures of Jurkat and K-562.
  • the profiles of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA were obtained after synchronization in the mitosis phase under the influence of colchicine (Fig. BA - Jurkat, Fig. BB - K-562). They testified that in both cell cultures there were serious disturbances in the processes that control the ponucleotide transitions of the telomere overhang terminations.
  • Normal lymphocytes are characterized by the presence of an equilibrium balanced profile of telomere overhang terminal nucleotides in all phases of the cell cycle, except for the initial G1 phase, which marks the trigger process of activation of cell division.
  • specific ratios of synthetic analogs of telomeric DNA endings were calculated, which were necessary to replenish the equilibrium balanced profile of terminal nucleotides in an average quantitative ratio: TAG (18%), AGG (26%), GGG (7%), GGT (5%), GTT (26%), TTA (18%).
  • the obtained corrective profiles are presented by diagrams of the percentage of terminal triplets (figa - Jurkat, figb - K-562).
  • the optimal concentration of oligonucleotides for exposure in accordance with the established percentage should be selected empirically and determined by the quantitative content of the TTA variant of the termination of telomeric overhangs in recipient cells.
  • the optimal concentration of oligonucleotides for exposure in accordance with the established percentage should be selected empirically and determined by the quantitative content of the TTA variant of the termination of telomeric overhangs in recipient cells.
  • the initial excess content of the TTA terminal triplet in the resulting profile is taken as the norm of 18%, with respect to which the added concentration ratios of other triplet endings of overhangs are calculated.
  • the content of TTA triplets in the initial profile was 82.3%.
  • the TTA content of the triplet was 18%.
  • the total concentration amount of synthetic analogs of overhangs added to the cells is 3.6 times greater than the initial number of native overhangs.
  • the amount of TTA completion which was 57.5% in the original profile, was also taken as 18% in the resulting profile. Based on this, the added amounts of triplet terminations of oligonucleotides were 2.2 times greater than the initial number of telomeric overhangs in cells and correspond to the percentage shown in FIG. 7B.
  • telomeric overhangs in cells within the indicated limits does not lead to cytotoxic effects associated with their overabundance.
  • concentration of introduced oligonucleotides one should proceed from the limit of the final total concentration of all ending variants, equal to not more than 10-20 micromoles. Increasing the concentration of more than 40 ⁇ mol can cause cytotoxic effects associated with their overabundance.
  • the impact of mixtures of telomeric oligonucleotides in the present method is not associated with multiple excesses of their physiological concentrations and is not a signal of DNA damage, leading to the arrest of the cell cycle.
  • Mixtures of oligonucleotides are designed to correct the profile of the terminal nucleotides of the telomeric DNA of the treated cells and return them to a controlled division mode.
  • phosphothioate groups in the oligonucleotide sequence, blocking the cleavage of terminal nucleotides and prolonging its therapeutic effect.
  • the use of various modifications of AGG-terminal oligonucleotides allows not only to prolong their therapeutic effect, but also increases its specificity.
  • a distinctive feature of the proposed method is the ability to design a variety of telomeric sequences that differ not only in the endings, but also in the sequence of the telomeric repeat. This is important to achieve the maximum therapeutic effect.
  • the basis of the proposed method is an understanding of the role of differences in telomeric repeat sequences for regulation cell division. Depending on the variation of the nucleotide termination of the 3 'and 5' ends of telomeric DNA, the totality of its G-overhangs is a heteromorphic population that differs in the nucleotide composition of telomeric repeats.
  • each single-stranded overhang of the G-chain is the l-th number of one of the six full-length repeat variants from the sequence of SEQ ID NO: 1-6.
  • overhangs can end with an incomplete repeat and differ in their triplet endings presented in SEQ ID NO: 7-12.
  • the basis of the proposed method is the use of various variations of the telomeric repeat sequence and its endings, which have a specific effect on the expression of genes that regulate cell division.
  • terminal nucleotides play a huge role in regulating the onset of expression maxima of the main cyclins, and they in turn regulate the onset of the phases of the cell cycle.
  • telomeric oligonucleotides when designing telomeric oligonucleotides, one should take into account not only their end, but also the initial nucleotides. They determine the sequence of the telomeric repeat, which determines their basic spectral properties.
  • telomeric repeat of human DNA possess unique spectral characteristics associated with the specific balance of red and green colors of their resulting fluorescence.
  • the main specificity of the fluorescence of the telomeric oligonucleotide is determined by the telomeric repeat sequence determined by the first six nucleotides, starting from the 5'-end. This is evidenced by the study of the spectral characteristics of the telomeric sequences used in the examples in the green spectrum of FAM-coupled fluorescence (Fig. 8 B).
  • the diagrams of figure 8 show the increase in fluorescence of a solution of free carboxyfluorescein dye after adding telomeric oligonucleotide samples. Moreover, a comparison of the diagrams of FIG.
  • the main functions in the cell genome that suppress its division should be provided by the telomeric repeat GTTAGG, which has a high level of green fluorescence characteristic of the non-dividing state of the cell.
  • GTTAGG telomeric repeat
  • AGGGTT sequence 2 AGG
  • SEQ ID NO: 5 the sequence retained its antiphase effect with respect to other variants of the endings of telomeric oligonucleotides and showed an inhibitory effect on the expression of cyclins in the first 10-12 hours of exposure to lymphocytes.
  • analysis of the effect of sequences ending in incomplete repetition showed the predominant role of terminal endings in the regulation of cell division.
  • the main telomeric repeat is the TTAGGG sequence (SEQ ID NO: 3), which determines its main spectral characteristics associated with high fluorescence in the green range. Moreover, the end of TTA caused a slight decrease in the level of green fluorescence of this sequence compared to an oligonucleotide consisting of two full-length repeats.
  • GGGTTA sequence (GGGTTA) 2 GGG, represented by two full-length repeats of GGGTTA (SEQ ID NO: 6), revealed the same 8-hour maximum expression of interleukin-2.
  • the leading role was played by the sequence of the main telomeric repeat GGGTTA, responsible for the activation of cell division.
  • the termination of GGG is also associated with the division-activated state of the cell. This is evidenced by cyclic periods of an increase in its content in cells after the trigger moment of activation of division, associated with the maximum predominance of TTA at the end of telomeric overhangs.
  • oligonucleotides consisting of full-length telomeric repeats will be more effective than the sequences used in the embodiments of the invention. They retain the most pronounced differences in the spectral properties of nucleotide endings, corresponding to the goals of influencing the proliferative status of cells.
  • sequences consisting of the ⁇ th amount of a full-length GTTAGG repeat SEQ ID NO: 2.
  • sequences consisting of the ⁇ th amount of a full-sized GGGTTA repeat SEQ ID NO: 6).
  • sequences on the one hand, will provide a stimulating effect of TTA termination on cell division, and on the other hand, due to the predominance of red fluorescence, they will fully correspond to the quantum state of the activated cell division.
  • sequence (TTAGGG) 2 TTA used in the exemplary embodiments is less efficient than the full-length GGGTTA repeat sequences.
  • a special role is played by the establishment of antiphase dynamics of the AGG of the terminal ending of overhangs in comparison with other variants of endings. It is this variant of the termination of telomeric oligonucleotides when using the full-length sequences of the telomeric repeat GTTAGG (SEQ ID NO: 2) that forms the basis for influencing the proliferative status of cells in order to suppress division.
  • GTTAGG telomeric repeat
  • telomeric DNA terminal nucleotides After the trigger moment of activation of division, when an equilibrium balanced profile of telomeric DNA terminal nucleotides is established in the cells, the addition of various variants of telomeric sequences leads to shifts in the onset of the phases of preparation for division and cell division itself.
  • the specificity of the effect of various endings and nucleotide variations of the telomeric repeat on the onset of the maximum expression of genes associated with cell division was shown in the first three examples of the invention.
  • the possibility of the influence of specific telomeric DNA sequences on the time of the onset of cell division phases and the duration of the entire cell cycle through regulation of cyclin gene expression was shown for the first time.
  • the AGG ending affects its course. It was shown that it determines the most prolonged onset of the synthetic phase of preparation for division after 16-18 hours from the start of a new cell cycle. This was evidenced by the dynamics of expression of cyclins A2 and E1 in example 1 (Fig.1 A and B). The full correspondence of this fact to the normal duration of the cell cycle of lymphocytes determines the enormous role of the AGG-terminal end of telomeric overhangs in ensuring this process. In this regard, the strategy of malignant cells associated with the reduction or complete reduction of this end, to achieve a reduction in the duration of the cell cycle, becomes clear.
  • the invention may find application in the field of healthcare and science.
  • the description of the use cases of the invention shows the possibility of applying the claimed method in laboratory conditions in medical and research institutions to control the proliferative status of human cells.
  • telomeric overhangs are perceived not only as a signal about damage to the loop organization of DNA, which starts reparative processes that block the cell cycle, but primarily as special signals of molecular and quantum-optical nature that control the cell. It is important to use a carefully selected concentration of telomeric oligonucleotides, which is in accordance with the physiological level of telomeric overhangs in cells.
  • physiologically adapted concentrations of synthetic telomeric oligonucleotides lower than the previously used 40 ⁇ M concentration, avoids their toxic overabundance, leading to arrest of the cell cycle.
  • synthetic sequences interact with native overhangs, forming a single system of quantum-optical regulation of the genome and processes of cell activity, including its division.
  • telomeric repeat and triplet endings of telomeric sequences allows us to use them not only to suppress cell division, but also to stimulate proliferation and control the time of onset of certain phases of the cell cycle, including the resting phase, which is characterized by the implementation of tissue-specific cell functions and tissues.
  • the specific nucleotide sequences of the G-chain of human telomeric DNA can be used as part of drugs in oncology, immunology, gerontology, transplantology, medical and cosmetic or cosmetic products in cosmetology, dermatology, which are designed to control cell division and maintain their tissue-specific functions .

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии. Предложен способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических олигонуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека, имитирующих открытые формы теломерных оверхенгов в клетках, причем в отличие от традиционной концепции их цитостатического использования, они рассматриваются не как сигналы повреждения ДНК, а как молекулярные и квантово-оптические сигналы, регулирующие прохождение фаз клеточного цикла. Изобретение позволяет существенно повысить специфичность и эффективность теломерной ДНК-терапии за счет использования специфических нуклеотидных последовательностей на основе шести вариаций триплетных окончаний (SEQ ID NO: 7-12). При этом окончание SEQ ID NO: 8 составляет основу подавляющего деление воздействия, а окончание SEQ ID NO: 12 лежит в основе стимуляции пролиферации клеток. Эффективность воздействия окончаний регулируется подбором длины и начальных нуклеотидов последовательностей, определяющих базовые вариации теломерного повтора (SEQ ID NO: 1-6). Составление корректирующих смесей триплетных окончаний теломерных олигонуклеотидов на основе предварительного определения терминальных нуклеотидов теломерной ДНК в клетках позволяет скомпенсировать недостающие окончания на определенных этапах клеточного цикла. Для злокачественных клеток это обеспечивает нормальную прогрессию и продолжительность деления. Изобретение предназначено для воздействия на пролиферативный статус клеток с целью подавления или стимуляции деления, а также для контролирования времени наступления определенных фаз клеточного цикла, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний, в иммунологии для контролирования иммунного статуса организма, в трансплантологии, геронтологии и косметологии для поддержания способности клеток к регенерации и омоложению организма.

Description

Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей G-цепи
теломерной ДНК человека Область техники
Изобретение относится к области молекулярной генетики и клеточной биологии и предназначено для воздействия на деление клеток с помощью однонитевых окончаний G- цепи теломерной ДНК человека (теломерных оверхенгов). Заявленный способ применяется для составления корректирующего воздействия на пролиферативный статус клеток с целью подавления или активации клеточного деления. Воздействие основывается на специфическом влиянии различных последовательностей теломерного повтора ДНК человека и их окончаний на продвижение фаз клеточного цикла. Использование окончаний теломерных оверхенгов, ответственных за подавление или стимуляцию деления клетки, открывает новые перспективы использования синтетических аналогов теломерных ДНК- последовательностей для контролирования пролиферативного статуса клеток и тканей. Изобретение является новой разновидностью ДНК-терапии и может найти применение в медицине в области лечения онкологических заболеваний, в иммунологии для контролирования иммунного статуса организма, в геронтологии, дерматологии и косметологии для поддержания способности клеток и тканей к регенерации и омоложению организма в целом.
Предшествующий уровень техники
Из различных источников известно, что обработка клеток синтетическими аналогами теломерных оверхенгов (T-oligos) вызывает развитие в них процессов, подобных ответу на повреждение ДНК. При этом олигонуклеотиды, не связанные с теломерными последовательностями, не активны, а синтетические аналоги G-цепи теломерной ДНК активны и выполняют роль открытых (не уложенных в петлю) форм нативных оверхенгов. Они являются для клетки сигналами повреждения теломерной ДНК, которые запускают процессы репарации и остановки клеточного цикла. На этом принципе основывается традиционная концепция использования синтетических аналогов теломерных оверхенгов для подавления клеточного деления.
Было установлено, что синтетические теломерные последовательности быстро накапливаются в ядре и активируют ряд регуляторных протеинов (ATM, р53, p95/Nbs1 , р16, pRb, E2F1), что составляет основу противораковой терапии. При этом T-oligos вызывают гибель раковых клеток различными путями. Воздействие с их помощью привело к развитию апоптоза со стабилизацией в суб-Go-d фазах для клеток меланомы кожи (Puri N., Eller M.S., Byers H.R. Dykstra S., Kubera J., Gilchrest B.A. Telomere-based DNA damage responses: a new approach to melanoma (2004) FASEB J. Vol. 18, N°12, pp. 1373-1381), карциномы груди (Yaar M., Eller M.S., Panova I., Kubera J., Wee L.H., Cowan K.H., Gilchrest B.A. Telomeric DNA induces apoptosis and senescence of human breast carcinoma cells. Breast Cancer Research (2007) Vol.9, N21 , 13 pages, PMID: 17257427), клеток яичника (Sarkar S., Falter D.V. T-oligos inhibit grows and induce apoptosis in human ovarian cancer cells. Oligonucleotides (2011) Vol.21 , Ns1 , pp. 47-53). У клеток глиомы воздействие T-oligos вызывало автофагию, не связанную с апоптозом через ингибирование транскрипционного фактора STAT3 и регулятора автофагии mTOR (Aoki Н., Iwado Е., Eller M.S., Kondo Y., Fujiwara К., Li G.Z., Hess K.R., Siwak D.R., Sawaya R., Mills G.B., Gilchrest B.A., Kondo S. Telomere 3'-overhang- specific DNA oligonucleotides induce autophagy in malignant glioma cells. FACEB J. (2007) Vol. 21. N211, pp. 2918-2930).
В нормальных фибробластах синтетические аналоги G-оверхенгов вызывают арест в синтетической фазе и развитие сенесенизированного фенотипа, связанные с активацией р53 р21 , р16, и pRb путей (Eller M.S., Liao X., Liu S., Hanna K., Backvall H., Opresko P.L., Bohr V.A., Gilchrest B.A. A role for WRN in telomere-based DNA damage responses. PNAS (2006) Vol.103, No. 41: 15073-15078).
Таким образом, в научной литературе описано несколько примеров использования синтетических теломерных последовательностей, которые являются ближайшими прототипами заявляемого способа. Важно акцентировать внимание на том, что чаще всего они использовались в качестве основы противораковой терапии в виде 11 -членного олигонуклеотида pGTTAGGGTTAG, оканчивающегося терминальным триплетом TAG (Puri N. et al., 2004; Eller M.S. et al., 2006; Aoki H. et a!., 2007; Yaar M. et al., 2007). Другие варианты окончаний, например, димер рТТ и 16-членный вариант pGTTAGGGTTAGGGTTA окончания не показали выраженного действия на деление клеток. Однако, обработка клеток меланомы 16-членным вариантом олигонуклеотида с окончанием ТТА вызвала торможение ангиогенеза (Coleman С, Levine D., Kishore R., Qin G., Thorne Т., Lambers E., Sasi S.P., Yaar M., Gilchrest B.A., Goukassian D.A. Inhibition of melanoma angiogenesis by telomere homolog oligonucleotides. J. Oncology (2010), 14 pages, PMID: 20652008).
Димер рТТ, который имеет очень низкую степень гомологии с теломерной ДНК из-за своей очень короткой длины, вызвал усиление пигментации волосяных фолликул (Atoyan R.Y., Sharov А.А., Eller M.S., Sargsyan A., Botchkarev V.A., Gilchrest B.A. Oligonucleotide treatment increases eumelanogenesis, hair pigmentation and melanocortin-1 receptor expression in the hair follicle. Experimental Dermatology (2007) Vol.16, NQ8, pp. 671-677).
Важные результаты были получены при сравнении способной к гидролизу фосфодиэстерной формы и негидролизирущейся фосфотиоатной формы 11 -членного варианта с окончанием TAG (Eller M.S., Liao X., Liu S., Hanna K., Backvall H., Opresko P.L., Bohr V.A., Gilchrest B.A. A role for WRN in telomere-based DNA damage responses. PNAS (2006). V.103, pp.15073-15078). Только фосфодиэстерная форма, которая полностью соответствовала физиологическим условиям существования G-оверхенга в клетке, вызвала апоптоз у клеток меланомы человека в течение 4-х дней со стабилизацией в суб- Go-G! фазах. Не способная к гидролизу фосфотиоатная форма (PS-T-oligos) с блокированным З'-концом оказалась не эффективной. У нормальных клеток обработка полностью гидролизирующейся формой T-oligos привела к накоплению клеток в S-фазе клеточного цикла. Изучение продолжительности полураспада теломерных олигонуклеотидов показало, что фосфотиоатная форма (PS-T-oligos) обладала более долгим периодом полураспада в отличие от неблокированной формы. Это свидетельствовало о том, что последняя форма является активным субстратом для расщепления нуклеазами в противовес фосфотиоатной форме. При этом блокирование фосфотиоатными группами 5' -конца не имело значения.
Таким образом, была показана необходимость открытой формы З'-конца синтетических аналогов G-оверхенгов, которая предполагает возможность её гидролиза экзонуклеазами и появления новых окончаний, отличных от TAG. Несмотря на это, до сих пор нет ни одного литературного источника, исследующего влияние на деление клеток человека специфических теломерных последовательностей на основе различных вариаций теломерного повтора и всех возможных вариантов его окончания. В связи с этим по указанному отличительному признаку теломерных последовательностей для заявляемого изобретения не существует прямого аналога.
Ранее T-oligos использовались только как молекулярные сигналы, свидетельствующие о нарушении петлевой структуры теломерной ДНК и ведущие к аресту клеточного цикла. При этом не уделялось никакого внимания специфической последовательности теломерных олигонуклеотидов. Чаще всего применялся TAG вариант окончания теломерных оверхенгов, который добавлялся в конечной концентрации 40 мкМ в кулыгуральной среде, что значительно превышало его физиологические количества в клетках. Такой переизбыток приводил к токсическим для клетки эффектам, связанным с арестом клеточного цикла, и составлял основу старой концепции использования синтетических аналогов теломерных оверхенгов для воздействия на деление клеток. При этом чаще всего T-oligos применялись в противораковой терапии как подавляющие деления агенты и ни разу не использовались как стимуляторы пролиферации или как факторы, контролирующие наступление определённых фаз клеточного цикла.
Раскрытие изобретения
Главной технической задачей заявляемого изобретения является разработка способа использования последовательностей теломерных оверхенгов в пределах физиологически нетоксических концентраций на основе понимания роли различий их нуклеотидных последовательностей и особенно окончаний в делении клетки. Техническим результатом изобретения является снижение токсичности и повышение степени специфичности воздействия синтетических аналогов теломерных оверхенгов на клетки с целью воздействия на их пролиферативный статус и достижения разнообразных терапевтических эффектов.
Сущность изобретения заключается в использовании водных растворов специфических нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека в конечной концентрации менее 40 мкМ в среде, окружающей клетки. При этом происходит свободное проникновение теломерных последовательностей в клетки, где они выполняют роль сигналов, контролирующих прохождение фаз клеточного цикла, и осуществляют регуляцию пролиферативного статуса клеток с целью стимулирования или подавления их деления.
Принципы использования заявляемого изобретения основаны на установлении полиморфизма окончаний теломерных оверхенгов, зависящего от фазы клеточного цикла. Для активированного к делению состояния клетки, связанного с триггерным моментом перехода G0 фазы в G1 фазу, характерен несбалансированный неравновесный профиль терминальных нуклеотидов теломерных оверхенгов. Он связан с резким увеличением количества окончаний оверхенгов на триплет ТТА (до 70%). При этом процентное содержание терминальных триплетов TAG и AGG падает до нуля. Для неделящегося состояния клетки в G0 фазе, а также для активированного к делению состояния клетки после 10-12 часов от начала воздействия стимула, характерен сбалансированный равновесный профиль терминальных нуклеотидов. Для него характерно высокое содержание AGG терминального триплета, приблизительно равное количеству GTT окончания (25-27%). При этом количество ТТА триплета приблизительно равно содержанию TAG варианта окончания (16-20%), a GGT триплета равно количеству GGG окончания (5-7%).
Условия существования описанных профилей обеспечиваются механизмами рендомизации окончаний теломерных оверхенгов за счёт экзонуклеазного отщепления концевых нуклеотидов. При этом осуществляется цикл понуклеотидных смещений окончаний оверхенгов в сторону образования следующих терминальных триплетов: AGG— >TAG— >TTA->GTT— >GGT-» GGG-»AGG.
Применение способа изучения флуоресцентных свойств и спектральных характеристик нуклеотидных последовательностей ДНК с помощью квантово-связанного спектра излучения красителей со свободными флуорофорными группами позволило установить специфические спектральные характеристики вариаций теломерного повтора, которыми могут оканчиваться теломерные оверхенги. Они составляют основу спектрального кодирования пролиферативной информации в клетке и определяют цветовые маркеры результирующей флуоресценции оверхенгов, характерные для неделящегося и активированного к делению состояния. Для неделящегося состояния клетки, в котором характерно присутствие терминальных триплетов AGG и TAG, наблюдается увеличение зелёного спектра флуоресценции. При активации деления преобладает флуоресценция в красном спектре, что связано с ростом содержания ТТА варианта окончания оверхенгов. Таким образом, современное представление о роли нуклеотидной последовательности теломерных повторов, входящих в состав теломерных оверхенгов, и их терминальных окончаний основывается на понимании их как субстратов световой энергии, регулирующей деление клетки. Механизмом, сочетающим различные варианты теломерного повтора с его различными триплетными окончаниями, достигается существование в клетке многоликого семейства теломерных оверхенгов, каждый из которых обладает специфическими характеристиками и уникальным действием. В связи с указанными фактами была сформулирована новая концепция использования синтетических аналогов теломерных оверхенгов, которая легла в основу заявляемого способа. Каждый теломерный оверхенг в клетке представлен последовательностью одного из шести вариантов теломерного повтора, представленного в SEQ ID NO: 1-6, который оканчивается специфическим сочетанием нуклеотидов, составляющих его терминальный триплет. При окончании теломерного оверхенга неполноразмерным повтором его терминальный триплет изменяется в зависимости от его длины. В связи с этим особую роль в клетке приобретает терминальный триплет нуклеотидов, которым оканчиваются теломерные оверхенги. Терминальный триплет может быть представлен одним из вариантов, представленных в SEQ ID NO: 7-12.
Терминальный триплет TAG, который ранее применялся для воздействия на делящиеся клетки, представляет собой лишь один из вариантов окончаний теломерных оверхенгов, возникающий в цикле понуклеотидных смещений: AGG-»TAG-»TTA-»GTT-> GGT— >GGG— >AGG. Его подавляющая деление функция, широко используемая ранее в противораковой терапии, основана на том, что он является одним из триплетов, характерных для неделящегося состояния клетки. При этом было показано, что окончание TAG отсутствует у злокачественно-трансформированных лимфоцитов в фазе митоза, в которой он обязательно должен присутствовать как критерий нормального осуществления деления. Сокращение количества или полное отсутствие AGG и TAG терминальных триплетов во всех фазах клеточного цикла за исключением момента перехода из G0 в раннюю d фазу может являться критерием злокачественности клеток.
В связи с этим AGG (SEQ ID NO:8) вариант окончания терминальных оверхенгов, специфичный для неделящегося состояния клетки, сбалансированного профиля терминальных нуклеотидов ДНК и тканеспецифической программы развития клеток, составляет основу воздействия на пролиферативный статус клеток с целью подавления деления и отключения эмбриоспецифической программы их развития. Этим обуславливается его более эффективное использование в противораковой терапии по сравнению с TAG вариантом окончания.
Вариант окончания теломерных оверхенгов на основе ТТА (SEQ ID NO: 12) терминального триплета в физиологически адаптированных концентрациях, нетоксичных и не вызывающих арест клеточного цикла, может составлять основу воздействия, стимулирующего деление клетки. Эффективность его использования определяется тем, что с ним связано установление несбалансированного профиля терминальных нуклеотидов теломерной ДНК в клетке при активации деления. Он в свою очередь связан с активацией эмбриоспецифической и подавлением тканеспецифической программ развития и возникновением неравновесного квантового состояния клетки с преобладанием красной флуоресценции теломерных оверхенгов.
Таким образом, новейшая концепция применения теломерных оверхенгов для коррекции пролиферативного статуса клетки исходит из того, что каждый вариант нуклеотидной последовательности теломерного повтора и его терминальный триплет играет роль молекулярного и квантового сигнала. Соотношение этих сигналов очень важно для регуляции деления клетки. В связи с этим основу патентуемого способа воздействия на пролиферативный статус клетки составляют различные вариации нуклеотидных последовательностей теломерных оверхенгов и особенно их окончаний. При этом могут использоваться не только отдельные олигонуклеотидные последовательности, но и смеси с определённым количественным соотношением различных последовательностей.
При составлении корректирующих смесей синтетических теломерных олигонуклеотидов в противораковой терапии рекомендуется проводить предварительное исследование профилей терминальных нуклеотидов теломерной ДНК клеток-реципиентов. Это позволяет установить оптимальное соотношение терминальных триплетов TAG.AGG:GGG (SEQ ID NO:7,8,9) в корректирующей смеси, которое зависит от их нативных концентраций в клетках.
Отдельным направлением использования заявляемого способа является применение модифицированных синтетических аналогов теломерных оверхенгов. Модификация может заключаться во введении фосфотиоатных групп (P=S), препятствующих гидролизу и отщеплению определённых терминальных нуклеотидов. Например, введение таких групп в последовательности повторов GSGSG (SEQ ID NO:9), ASGSG (SEQ ID NO:8) и TASG (SEQ ID NO:7) может препятствовать осуществлению переходов GGG->AGG-+TAG—ТТА. При этом в цикле понуклеотидных смещений не будет вторично возникать ТТА триплет, активирующий деление, что очень важно в противораковой терапии. Введение фосфотиоатных групп в последовательность терминального триплета TsTsA (SEQ ID NO: 12) также защитит его от трансформации в цикле понуклеотидных смещений и сохранит его стимулирующее действие.
Вторым направлением модификации синтетических аналогов теломерных оверхенгов является использование флуоресцентных меток и гасителей. Они позволяют усилить или ослабить естественную флуоресценцию синтетических аналогов теломерных оверхенгов в определённом спектре. Для подавления деления клетки и активации тканеспецифической программы развития перспективно использование флуоресцентного мечения AGG- терминального олигонуклеотида красителями зелёного спектра флуоресценции в диапазоне 520-540 нм, например, с помощью карбоксифлуоресцеина. При этом совместно можно использовать гасители красного спектра флуоресценции типа RTQ-2 или BHQ-3.
Для активации деления клетки и запуска эмбриоспецифической программы развития перспективна модификация ТТА-терминального олигонуклеотида с использованием комбинации красителей оранжево-красного и красного спектров (ROX, Су3.5, Су5, Су5.5, TexasRed) с гасителями зелёного спектра (RTQ1 , BHQ1). Сходное с зелёным спектром значение для развития фотореакций в клетке имеет синий спектр. В этом случае возможно использование флуоресцентных красителей и гасителей синего спектра.
Следует отметить, что применение широко используемых для мечения ДНК флуоресцентных красителей частично ограничивается слишком большим квантовым выходом, не соответствующим физиологическому уровню фотореакций в клетке. Известно, что клетки имеют определённый порог насыщения фотонами, выше которого достичь положительные реакции, например, стимулировать деление митогенетическим излучением, не возможно. В связи с этим перспективна разработка специальных флуорофоров с подходящим квантовым выходом, в том числе представленных естественными флуоресцирующими метаболитами клеток.
Третьим направлением модификации является использование фотоотщепляемых групп, которые могут обеспечить регулируемое по времени разрушение теломерных олигонуклеотидов под воздействием света определённой длины волны. Введение таких групп позволит регулировать отщепление концевых нуклеотидов и тем самым контролировать взаимные переходы терминальных триплетов друг в друга в соответствии с циклом их понуклеотидных смещений в ходе клеточного цикла.
Одним из вариантов осуществления заявляемого способа является использование нативных фракций теломерных оверхенгов. Особенностью этого варианта является то, что фракция теломерных оверхенгов в клетке представляет собой гетерогенную по длине и окончаниям популяцию, физиологически адаптированную для выполнения функций на определённых этапах клеточного цикла. Фактически этот вариант осуществления способа представляет собой механизм передачи пролиферативной информации от одних клеток к другим посредством молекулярного субстрата. Для этих целей используют культуры клеток-доноров, которые синхронизируют на определённых этапах клеточного цикла и используют для получения фракций нативных теломерных оверхенгов. Трудность использования этих фракций заключается в невозможности предотвращения их включения в цикл понуклеотидных смещений окончаний, происходящих за счёт экзонуклеазных воздействий в клетках-реципиентах. В связи с этим эффект их воздействия может быть более кратковременным, чем при использовании модифицированных синтетических аналогов теломерных оверхенгов с блокирующими группами, препятствующими гидролизу.
Регулирование деления клетки осуществляется пролиферативной информацией, записанной в вариациях последовательности теломерных повторов ДНК и регулируемой их нуклеотидными окончаниями. Механизм регулирования осуществляется на уровне генной экспрессии по принципу дальнодействия и суперпозиции солитонных волн различной природы, в том числе и оптической. Идеальным полигоном для образования вращательно-колебательных солитонных волн служат однонитевые теломерные оверхенги, нуклеотиды которых обладают максимальной степенью свободы по сравнению с двухнитевой ДНК. Установлено, что динамика солитонов чувствительна к месту инициации и зависит от нуклеотидной последовательности ДМК. Отражая специфическую нуклеотидную последовательность теломерных повторов, динамика солитонных возмущений является референтом чтения пролиферативной информации и способна осуществлять дальнодействующее влияние на экспрессию генов, ответственных за деление. При этом необходимым источником фотонной накачки для образования оптических солитонов на теломерных оверхенгах может являться их специфическая флуорофор-связанная флуоресценция.
Поэтому в рамках развития волновой и биорезонансной медицины возможно использование волновых эквивалентов (реплик) теломерных оверхенгов различной природы, составляющих корректирующие волновые паттерны на основе заявляемых нуклеотидных последовательностей и окончаний. Подобные волновые отображения в виде электромагнитных, звуковых колебаний, торсионных и других полей вакуумной и квантовой природы, в том числе голографического или солитонного происхождения, могут использоваться с целью омоложения и продления жизни организма человека, корректировки его пролиферативного и иммунного статуса, лечения раковых и других заболеваний. В основе их действия лежит направленное воздействие патентуемых теломерных последовательностей на пролиферативный статус клеток-реципиентов волновой информации. Это определяет ближайшие перспективы использования заявляемых последовательностей теломерных оверхенгов в области биологии, биотехнологии и медицины.
Свободный текст перечня последовательностей
Контролирование деления клетки осуществляется пролиферативной информацией, записанной в вариациях последовательности гексануклеотидного повтора G-цепи теломерной ДНК и регулируемой их нуклеотидными окончаниями. Заявляемый способ позволяет составлять специфические нуклеотидные последовательности теломерной ДНК человека на основе шести вариаций базовой последовательности теломерного повтора, представленной в последовательностях: GGTTAG, GTTAGG, TTAGGG, TAGGGT, AGGGTT, GGGTTA (SEQ ID NO: 1-6).
Последовательности могут состоять из л-ого количества одной из базовых последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-6 и оканчиваться полноразмерным или неполноразмерным повтором. При этом особую роль для воздействия на пролиферативный статус клеток имеет специфическое сочетание концевых нуклеотидов теломерной последовательности, составляющих её терминальный триплет из числа TAG, AGG, GGG, GGT, GTT и ТТА (SEQ ID NO: 7-12).
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Динамика экспрессии генов, связанных с делением лимфоцитов, после обработки клеток синтетическими аналогами теломерных оверхенгов, различающимися нуклеотидными последовательностями теломерного повтора и триплетными окончаниями (на примере олигонуклеотидов в конечной концентрации 20 мкМ). Отображает динамику изменений экспрессии генов во времени на протяжении 24 часов с интервалом 4 часа.
А - уровни мРНК циклина А2; Б - уровни мРНК циклина В1 ; В - уровни мРНК циклина Е1 ; Г - уровни мРНК циклина D2; Д - уровни мРНК интерлейкина-2.
Фигура 2. Динамика уровня мРНК циклинов и интерлейкина-2 после обработки лимфоцитов человека AGG-терминальными аналогами теломерных оверхенгов (на примере (AGGGTT)2AGG олигонуклеотида в конечной концентрации 10 мкМ). Отображает динамику изменений экспрессии генов во времени на протяжении 15 часов с интервалом 5 часов. Максимумы экспрессии генов отмечены штрихпунктирной линией, а минимумы - штриховой линией.
Фигура 3. Диаграмма уровня мРНК циклинов после 0 часов обработки лимфоцитов с помощью (AGGGTT)2AGG олигонуклеотида в конечной концентрации 10 мкМ.
Фигура 4. Динамика уровня мРНК циклинов и интерлейкина-2 после обработки лимфоцитов человека GGT-терминальными аналогами теломерных оверхенгов (на примере (GGTTAG)2GGT олигонуклеотида в конечной концентрации 10 мкМ). Отображает динамику изменений экспрессии генов во времени на протяжении 26 часов с интервалом 4 часа. Максимумы экспрессии генов отмечены штрихпунктирной линией, а минимумы - штриховой линией.
Фигура 5. Взаимосвязь экспрессии циклина В1 и интерлекина-2 под влиянием обработки лимфоцитов человека различными последовательностями синтетических аналогов теломерных оверхенгов в концентрации 20 мкМ. Сопряжённые максимумы экспрессии генов отмечены штрихпунктирной линией.
Фигура 6. Профили терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК лейкемических культур Jurkat (А) и К-562 (Б), синхронизированных с помощью колхицина в митотической фазе.
Фигура 7. Корректирующие профили триплетных окончаний теломерных оверхенгов, составленные для формирования равновесного сбалансированного профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК для культур Jurkat (А) и К-562 (Б).
Фигура 8. Диаграмма уровней FAM-связанной флуоресценции в зелёном спектре последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека.
А - вариации теломерной последовательности, состоящей из двух полноразмерных гексануклеотидных повторов. Формула последовательности: 2п, где п - теломерный повтор, представленный в SEQ ID N0.1-6;
Б - вариации теломерной последовательности, состоящей из двух полноразмерных гексануклеотидных повторов, оканчивающихся неполноразмерным повтором в виде триплета, представленного в SEQ ID NO: 7-12.
Формула последовательности: 2п+1/2п, где п - теломерный повтор, представленный в SEQ ID NO: 1-6. Лучший вариант осуществления изобретения
Заявленное изобретение иллюстрируется примерами, демонстрирующими возможность применения вариаций нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека для воздействия на пролиферативный статус клеток. В качестве базовой модели для изучения их влияния были взяты лимфоциты периферической крови человека. Для контроля их пролиферативного статуса использовалось исследование экспрессии маркерных генов, контролирующих деление клетки. Для стимулированных к делению лимфоцитов показана специфическая экспрессия циклинов А, В, Е и D, характерная для определённой фазы клеточного цикла. В связи с этим для изучения влияния специфических последовательностей теломерных оверхенгов на клеточный цикл лимфоцитов были выбраны гены циклинов А2, В1 , Е1 и D2, а также ген интерлейкина-2 (IL- 2), сопряжённый с активной пролиферацией лимфоцитов.
Установление прямой зависимости экспрессии циклинов от вариации последовательности теломерного повтора и триплетных окончаний теломерных последовательностей указывает на их бесспорное влияние на продвижение фаз клеточного цикла.
Пример 1. Воздействие на пролиферативный статус лимфоцитов человека с помощью теломерных последовательностей ДНК, различающихся вариациями нуклеотидной последовательности теломерного повтора и триплетными окончаниями.
Для получения культуры клеток были взяты лимфоциты периферической крови донора, переболевшего ОРВИ заболеванием, которые характеризовались естественной активацией деления в течение 2-х недель исследуемого периода.
Для воздействия на культуру клеток использовались синтетические олигонуклеотиды, синтезированные стандартным фосфорамидитным способом синтеза в компании «Евроген» (Россия). Олигонуклеотиды представляли собой последовательности G-цепи теломерной ДНК человека, имитирующие её однонитевые оверхенги, длиной 15 и.о.:
1. (TAGGGT)2TAG;
2. (AGGGTT)2AGG;
3. (GGGTTA)2GGG;
4. (GGTTAG)2GGT;
5. (GTTAGG)2GTT;
6. (TTAGGG)2TTA.
Каждая последовательность состояла из вариации двух полноразмерных теломерных повторов, представленных в SEQ ID NO:1-6 и оканчивалась шестью возможными вариациями терминального триплета из числа SEQ ID N0 -12.
Стерильные водные растворы олигонуклеотидов добавлялись в культуральную среду RPMI-1640 в конечной концентрации 20 мкМ. В качестве контроля использовался образец культуры клеток, в котором раствор олигонуклеотида был замещён стерильной дистиллированной водой. Для оценки результатов влияния олигонуклеотидов на пролиферативный статус клеток осуществляли последовательные заборы части клеток на протяжении 24 часов с интервалом в 4 часа. Отобранные клетки использовали для выделения РНК и постановки стандартной процедуры ОТ-ПЦР. Для анализа экспрессии генов использовался денситометрический анализ электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов амплификации последовательностей мРНК исследуемых генов в присутствии бромистого этидия. Уровень экспрессии каждого гена определялся как отношение уровня его мРНК к уровню мРНК нормировочного гена GAPDH и оценивался в долях от единицы.
Были получены следующие графики изменений уровня мРНК циклинов и интерлейкина- 2 под воздействием теломерных последовательностей (фиг. 1).
Графики свидетельствуют о том, что используемые варианты теломерных олигонуклеотидов вызвали циклические изменения экспрессии генов, связанных с делением клетки. При этом каждый вариант последовательности приводил к специфическим изменениям в динамике циклинов и интерлейкина-2.
Наибольшие изменения динамики циклинов вызывал второй вариант последовательности, представленный двумя теломерными повторами AGGGTT (SEQ ID NO:5) с терминальным триплетом AGG (SEQ ID NO:8).
В дальнейшем при рассмотрении действия каждой последовательности мы будем акцентировать внимание на разновидности триплетного окончания. При этом будем иметь в виду, что специфическое действие оказывает вся последовательность, в том числе и уникальная вариация нуклеотидного повтора, а не только терминальный триплет.
Терминальный триплет AGG резко отличался по своему воздействию от остальных и являлся своеобразным антагонистом всех других вариантов окончаний теломерного оверхенга. Характер его воздействия на динамику основных циклинов находился в противофазе по сравнению с действием всех других вариантов окончаний, в том числе и контрольного образца. В интервалах, где наблюдалось увеличение экспрессии генов под влиянием других вариантов терминальных триплетов (выпуклая форма графика), в образце, обработанном AGG вариантом окончания, наблюдался спад (вогнутая форма графика). И, наоборот, следующий за этим этапом рост экспрессии генов под влиянием AGG окончания олигонуклеотида сопровождался падением экспрессии генов в остальных образцах. Такой волнообразный характер динамики циклинов, связанный с противофазным влиянием AGG варианта окончания теломерной последовательности, особенно чётко проявлялся для циклинов А2, В1 и Е1 (фиг. 1 А-В).
Циклин Е1 под воздействием AGG-териминального варианта последовательности характеризовался запаздывающим разгоранием экспрессии (фиг. 1 В). При этом в тот момент, когда уровень мРНК этого циклина начинал падать под влиянием других вариантов окончаний, образец, содержащий AGG-терминальный олигонуклеотид, выявил стойкое возрастание мРНК уровня с пиком в 12-16 часов. Известно, что экспрессия циклина E1 обеспечивает продвижение Gi фазы в раннюю синтетическую S фазу и появляется после 18 часов с момента начала стимуляции лимфоцитов к делению с помощью ФГА.
Этот факт имеет большое значение для понимания хода деления, так как именно AGG окончание теломерных оверхенгов преобладает в неделящемся состоянии клетки. Постепенное разрушение AGG окончания в клетке, связанное с его пошаговыми экзонуклеазными превращениями в другие окончания, приводит к снятию его подавляющего действия и последовательному переходу клетки сначала в фазу, а затем в синтетический период. Это сопровождается разгоранием экспрессии циклина Е1 в течение 16-18 часового периода. В связи с этим становится понятной роль этого окончания в определении времени наступления синтетической фазы подготовки к делению клетки.
На экспрессию интерлейкина-2, по сравнению с другими окончаниями, AGG вариант терминального триплета оказал общее угнетающее действие, проявляющееся в первые 12 часов (фиг. 1 Д). Однако, более поздний эксперимент с использованием других временных интервалов выявил 5-часовой максимум интерлейкина-2 (пример 2, фиг. 2Д). Подобные максимумы экспрессии наблюдались также в 8-часовой период для вариантов ТТА и GGG окончаний и в 10-часовой период для GGT терминального триплета.
На экспрессию циклина D2 AGG-терминальный аналог оверхенга не оказал ярко выраженного влияния (фиг.1 Г). Видимо, это связано с тем, что клетки в G0 фазу клеточного цикла, когда возможна экспрессия этого циклина, характеризуются преобладанием AGG варианта окончания теломерных оверхенгов (основное состояние неделящейся клетки в фазе покоя). Известно, что циклин D2 экспрессируется в G0 и ранней d фазах клеточного цикла лимфоцитов, а циклин D3 отсутствует в G0 фазе и возрастает в поздней фазе. В связи с этим мы предположили, что окончание AGG будет оказывать более сильное влияние на экспрессию циклина D3, который однозначно свидетельствует о продвижении клетки в G-i фазу подготовки к делению.
Для подтверждения общего характера воздействия AGG варианта окончания теломерных олигонуклеотидов, а именно его подавляющего действия в первые 10-12 часов на экспрессию большинства циклинов, был проведён дополнительный эксперимент. В нём изучалось влияние последовательности (AGGGTT)2AGG на уровень мРНК циклинов А2, В1 , Е1 , D2, в том числе и циклина D3 (пример 2).
Для 4-часового периода воздействия последовательности с TAG (SEQ ID NO:7) терминальным триплетом было характерно некоторое превышение уровня циклинов А2 и В1 по сравнению с остальными образцами, включая контрольный, которые группировались вокруг близких значений (фиг.1 А и Б). В 8-часовой период наблюдался максимальный уровень мРНК (первый максимум) для циклинов В1 и Е1 (фиг. 1 Б и В). Для циклина А2 первый максимум пришёлся на 4 часа (фиг. 1А). Следующий 12-часовой период характеризовался снижением экспрессии генов для TAG варианта окончания, как и для большинства остальных образцов, включая контрольный, для которого снижение было более плавным. После 16 часов наблюдалось минимальное падение экспрессии циклинов A2, B1 , E1 и интерлейкина-2. Однако, значения уровня мРНК этих генов под воздействием TAG-терминального триплета не достигли нулевого значения, как для ТТА, GTT и GGT вариантов окончания теломерных олигонуклеотидов. После 16-часового минимума экспрессии наблюдался рост уровня мРНК с вторичным максимумом в 20 часов для циклинов А2 и В1 и незначительным всплеском для интерлейкина-2. Особенно ярко вторичный максимум экспрессии под воздействием TAG-терминального олигонуклеотида проявился для циклина А2 на фоне его отсутствия для других вариантов (фиг. 1А). Для циклина Е1 вторичный максимум наступил после 24 часов воздействия (фиг. 1 В).
Вариант последовательности с ТТА (SEQ ID NO: 12) вариантом окончания напоминал действие TAG окончания с некоторыми специфическими отличиями. Это подтверждает близость действия теломерных оверхенгов, окончания которых различаются сдвигом последовательности на один нуклеотид. Тот факт, что ТТА вариант не показал существенного возрастания экспрессии циклинов, ответственных за продвижение фаз клеточного цикла, таких как циклины А2, Е1 и В1 , свидетельствует о его преимущественном влиянии в другие фазы. Прежде всего, это касается триггерного момента активации деления клетки, осуществляемого при переходе G0 фазы в фазу. Было показано, что именно в этот момент резко возрастает содержание ТТА варианта окончания теломерных оверхенгов в клетке. В связи с этим действие этого окончания в другие фазы клеточного цикла, не связанные с моментом активации деления, определяется влиянием на время их наступления через регуляцию экспрессии циклинов.
Особое значение имеет 8-часовой максимум экспрессии интерлейкина-2 под воздействием ТТА окончания, который более чем в 2,5 раза превышал значения контрольного образца (фиг. 1 Д). Это подтверждает перспективность использования ТТА окончания синтетических аналогов оверхенгов для стимуляции деления клетки.
GGT (SEQ ID NO:10) вариант окончания, подобный остальным по общему виду графиков, также находился в противофазе с AGG терминальным триплетом, но характеризовался самым поздним наступлением максимумов и минимумов экспрессии изучаемых генов. В динамике циклинов А2 и В1 наступление первичного максимума, как и вторичного, было сдвинуто. Оно наступало в 12 часов для циклина А2 и в 10 часов для циклина В1 (фиг.1 А и Б). Первичный минимум экспрессии генов наступал, как у GGT и ТТА терминальных триплетов, в 16 часов. Вторичный максимум экспрессии для всех циклинов затягивался во времени и наступал после 24 часов воздействия GGT окончания.
Данные по влиянию теломерных оверхенгов, оканчивающихся GGT триплетом, были уточнены дополнительным экспериментом, в котором использовалась 10 мкМ концентрация олигонуклеотида (GGTTAG^GGT (пример 3).
Среднее по своему воздействию положение между ТТА и GGT вариантами окончания теломерных последовательностей занимал GTT терминальный триплет (SEQ ID NO:11). Это подтверждает их близость и различие сдвигом всего на один нуклеотид вправо или влево по ходу теломерной последовательности. GGG (SEQ ID NO: 9) терминальный вариант окончания занимал промежуточное положение между антифазным AGG вариантом окончания и остальными терминальными триплетами. Под его воздействием наблюдался всплеск уровня мРНК в 16-часовой период для циклинов В1 и Е1 , что совпало с максимумом для AGG варианта окончания (фиг. 1 Б и В). Таким образом, в первые 12 часов воздействие GGG варианта окончания было подобно влиянию терминальных триплетов TAG, ТТА, GTT и GGT, а затем стало похожим на воздействие AGG окончания. Это наблюдение подтверждает существование цикла понуклеотидного смещения теломерных окончаний, в ходе которого осуществляется переход терминальных триплетов GGG— >AGG в результате экзонуклеазного отщепления З'-концевого нуклеотида.
При общем рассмотрении влияния рассматриваемых теломерных последовательностей и их окончаний на экспрессию циклинов и интерлейкина-2 видно, что все они вызывают сдвиги в динамике уровней их мРНК. При этом контрольный образец культуры клеток, в котором вместо олигонуклеотида добавлялась вода, по характеру воздействия занимал промежуточное положение между ними. Этот факт указывает на то, что в нативной культуре лимфоцитов присутствуют все варианты окончаний теломерных оверхенгов в определённом уравновешенном соотношении. Добавление к этому исходному соотношению дополнительных синтетических аналогов оверхенгов вызвало сдвиги в экспрессии циклинов и интерлейкина-2, и, таким образом, влияло на прохождение фаз клеточного деления.
Пример 2. Подавляющее воздействие AGG (SEQ ID NO:8) варианта окончания нуклеотидной последовательности теломерной ДНК на пролиферативный статус лимфоцитов человека.
В эксперименте использовалось в два раза меньшее, по сравнению с первым примером, количество олигонуклеотида (AGGGTT)2AGG в конечной концентрации 10 мкМ для того, чтобы оценить возможный дозозависимый эффект воздействия. Результаты представлены графиками (фиг. 2), отображающими уровни мРНК циклинов А2, В1 , D2 и Е1 и интерлейкина-2 после 15 часов воздействия теломерных олигонуклеотидов. Штриховой линией обозначены минимумы экспрессии генов, а штрихпунктирной линией - максимумы экспрессии.
Было установлено, что обработка культуры лимфоцитов с помощью синтетических аналогов теломерных оверхенгов имеет дозозависимый эффект. Однако, общий характер изменений в экспрессии изучаемых генов, связанный с 10-12 часовым минимумом, сохранился не зависимо от концентрации (отмечен штриховой линией на графиках фиг. 2). Исключение составляет циклин D2, который напротив характеризовался превышением уровня мРНК над контрольным образцом в 10 часовой период (фиг. 2В).
Так как 10 часовой период наиболее ярко демонстрировал эффект воздействия AGG- терминального олигонуклеотида, был проведён повторный анализ экспрессии циклинов с использованием того же образца кДНК с включением циклина D3. Результат исследования демонстрирует диаграмма фиг. 3, из которой видно, что для большинства циклинов (А2, В1 , D3 и Е1) подтвердился 10 часовый спад уровня мРНК по сравнению с контрольным образцом. При этом наблюдалось возрастание экспрессии циклина D2 на фоне снижения уровня циклина D3, что возможно свидетельствует о задержке части клеток в G0 фазе.
Бесспорно, что 10 мкМ концентрация менее эффективно подавляла экспрессию циклинов, чем 20 мкМ концентрация, использованная в примере 1. График уровней мРНК циклинов (фиг. 2) сохранял выпуклую форму в первые 5 часов, повторяя динамику контрольного образца. Даже на фоне сниженной концентрации олигонуклеотида наблюдался выраженный 10-12 часовой минимум экспрессии циклинов А2 В1 и Е1 , что свидетельствовало о сдерживающей функции AGG-терминального триплета. Конечная концентрация 20 мкМ для AGG-терминального олигонуклеотида обладает большим подавляющим действием, чем 10 мкМ. Однако, дальнейшее увеличение концентрации свыше 30 мкМ в терапевтических целях не целесообразно. Из анализа литературных данных следует, что использование 40 мкМ концентрации TAG-терминального олигонуклеотида уже токсично для клетки и вызывает задержку роста культуры.
Важно также учитывать плотность клеток в культуре, в связи с чем рекомендуется рассчитывать показатель количества T-oligos, приходящийся на одну клетку. В эксперименте по влиянию 10 мкМ концентрации T-oligos использовалось суммарно 8 тыс. пикомоль олигонуклеотида на 6 млн. клеток, что составляло приблизительно 1 ,33 фемтомоль на клетку. Учитывая не сильно выраженное подавляющее действие, которое наблюдалось при воздействии этой концентрации, такое количество можно считать минимальным для терапевтического эффекта. Лучше использовать 20 мкМ конечную концентрацию олигонуклеотида с количеством не менее 2,7-3 фемтомоль на клетку. Однако следует помнить, что эти величины теоретические и предполагают беспрепятственное проникновение всего количества олигонуклеотидов в клетки. В действительности поступление олигонуклеотидов в клетки зависит от скорости мембранной диффузии, в результате чего не всё их количество поглощается клетками. Кроме того, влияние введённого синтетического аналога всегда накладывается на характеристики нативных теломерных оверхенгов в клетках и зависит от фазы клеточного цикла, в которой они находятся.
В заключении обзора влияния AGG (SEQ ID NO:8) варианта окончания теломерных олигонуклеотидов хочется отметить, что его характерной особенностью является волнообразный характер изменения динамики экспрессии основных циклинов, сопровождающийся угнетением в первые 10-12 часов. Исходя из анализа всех полученных графиков в ходе двух экспериментов, можно сделать вывод о том, что минимальный уровень мРНК для циклина А2 приходился на 10-12 часов, для циклина В1 немного ранее, в 8-10 часов, для циклина D3 в районе 10 часов, а для IL-2 - в 12 часов. Для циклина Е1 , не во всех случаях, наблюдался минимум в 10 часов. Для циклина D2 уровень мРНК незначительно снизился в 8 часов. После периода первичного минимума экспрессии генов наблюдался последующий рост с максимумом практически в один период (в 16 часов) для большинства циклинов (А2, В1 , Е1) и интерлейкина-2. Уже в 15 часов для циклинов А2 и Е1 , а также для IL-2, наблюдалось превышение уровня мРНК над контрольным образцом (фиг. 2А,Г и Д). Это свидетельствовало о том, что эти циклины ранее всех других освободились от угнетающего воздействия AGG окончания T-oligos и дали возможность клетке перейти из фазы в синтетическую. Предположительно это связано с общим характером нукпеазных воздействий, происходящих с олигонуклеотидом в клетке, которые приводят к его деградации и потери подавляющих свойств. Поэтому к 16 часам после начала воздействия AGG-терминального олигонуклеотида экспрессия разгорается практически одинаково для всех исследуемых генов. Только циклин D2, отличающийся слабовыраженными изменениями всей динамики экспрессии под воздействием AGG окончания, характеризовался незначительным максимумом экспрессии в 16 часов.
AGG-терминальный вариант окончания теломерных оверхенгов, преобладающий по своему количеству и квантовой эмиссии среди других в основном квантовом состоянии неделящейся клетки, играет важную роль, сдерживая экспрессию циклинов и продвижение клетки к делению. Сдерживающая роль этого варианта терминального триплета, который обладает антагонистическим действием по отношению к другим вариантам, ответственным за продвижение фаз клеточного цикла, может эффективно использоваться в регулировании пролиферации клетки в терапевтических целях. Показано, что использование AGG-терминальных вариантов T-oligos для подавления деления на несколько порядков эффективнее, чем использование популярного TAG окончания. При этом особое значение будут иметь фосфотиоатные производные этого окончания, защищающие его от деградации и продлевающие его подавляющее деление действие.
Пример 3. Воздействие GGT (SEQ ID NO:10) варианта окончания нуклеотидной последовательности теломерной ДНК на пролиферативный статус лимфоцитов человека.
В эксперименте использовалась 10 мкМ концентрация олигонуклеотида (GGTTAG)2GGT. Уменьшение концентрации олигонуклеотида, по сравнению с первым примером, незначительно отразилось на характере его воздействия, несмотря на то, что плотность культуры оставалась такой же, как и в первом эксперименте, и каждая клетка получила меньшее количество олигонуклеотида.
Результаты представлены графиками фиг. 4, где штриховой линией обозначены минимумы экспрессии генов, а штрихпунктирной линией - максимумы их экспрессии. В период между 2-6 часами воздействия наблюдалось незначительное падение экспрессии для циклина В1 и более выраженное снижение для циклина А2 (фиг. 4 А и Б). Скорее всего, это связано с естественным уровнем колебания циклинов, так как оно происходило синхронно с контрольным образцом. Поэтому более правомерным будет сравнение этих данных с результатами, полученными в примере 1 (фиг. 1 А и Б), начиная с 6 часов воздействия. Для циклина А2 также наблюдался сдвиг максимума экспрессии с 10 часов в 12 часов по сравнению с контролем, о чём свидетельствовала форма графика фиг. 4А. Пик уровня мРНК в 12 часов, отмечен выпуклой штриховой линией на графике. В 18 часов наблюдался минимум значения экспрессии циклина А2, который был аналогичен таковому в 16 часов на графике фиг. 1А.
Для циклина В1 наблюдался пик в 10 часов, что соответствовало данным, полученным при 20 мкМ воздействии GGT окончания в примере 1 (фиг. 4 Б). Однако минимум наступил гораздо позже, не в 16 часов, как раньше, а в 22 часа, и совпал с контрольным образцом.
Для циклина D2 выявился дополнительный минимум экспрессии в 10 часов, а также менее выраженный спад в 18 часов, который, по-видимому, являлся продолжением 16- часового спада, наблюдавшегося при воздействии 20 мкМ олигонуклеотида в примере 1 (фиг. 4 В). Вторичный максимум экспрессии циклина D2 наблюдался в 22 часа, как и для циклина Е1.
Не обычно было превышение уровня циклина Е1 над контрольными значениями (фиг. 4 Г). Однако, несмотря на это общий вид графика сохранился и соответствовал таковому при воздействии 20 мкМ GGT-терминального олигонуклеотида в примере 1 (фиг. 1 В). Наблюдался характерный минимум между 14 и 18 часами, который совпал с 16 часовым отсутствием детектируемого сигнала в примере 1. Также наблюдался пик экспрессии циклина Е1 в 22 часа, который соответствовал возрастанию экспрессии после 20 часов воздействия в примере 1.
Для интерлейкина-2, как и для циклина А2, имело место некоторое падение экспрессии в первые 6 часов (фиг. 4 Д). Но затем наблюдался рост уровня мРНК вплоть до максимума в 10 часов, который был более чем в два раза выше по сравнению с контрольным образцом. Таким образом, был обнаружен ранее не выявленный максимум экспрессии интерлейкина-2 под воздействием GGT-терминального варианта оверхенга. Он подобен 8- часовому максимуму экспрессии интерлейкина-2, наблюдавшемуся для ТТА и GGG вариантов окончания синтетической теломерной последовательности (фиг. 1 Д).
В завершении обзора влияния изучаемых последовательностей олигонуклеотидных аналогов теломерных оверхенгов можно сделать вывод о том, что каждый из них специфически влияет на динамику экспрессии основных циклинов, определяя наступление максимумов и минимумов уровней их мРНК. В обобщении следует отметить, что для TAG (SEQ ID NO:7) варианта окончания наступление максимумов и минимумов (первичных и вторичных) происходит раньше по сравнению со всеми другими образцами, включая контрольный. Это вполне согласуется с представлениями о том, что TAG вариант является первичным в цепи циклических переходов терминального триплета AGG в другие окончания под воздействием экзонуклеазного отщепления концевых нуклеотидов. В динамике циклина А2 под воздействием TAG-терминального олигонуклеотида первичный максимум наступает ранее других, уже в 4 часа, а для вариантов ТТА, GGG, GTT окончаний и контроля в 8 часов. Для GGT-терминального олигонуклеотида наступление первичного максимума экспрессии генов циклинов сдвинуто во времени и наступает только в 12 часов. Для TAG варианта окончания первичный минимум наступает между 12 и 16 часами, а для ТТА, GTT и GGT окончаний - позже, в 16 часов. Причём уровень мРНК изучаемых генов падает до нуля на фоне более плавного снижения в контрольном образце. Таким образом, последовательности с терминальными триплетами TAG и GGT по своему действию максимально отличаются друг от друга и являются антагонистами в отношении вариации теломерного повтора со сдвигом на целый триплет (TAG GGT и GGT TAG).
Особого внимания заслуживает влияние изученных синтетических аналогов теломерных оверхенгов на экспрессию интерлейкина-2. Максимум экспрессии этого гена для GGT (и возможно для GTT) терминальных триплетов отодвигается и наступает в 10 часов, в то время как для GGG и ТТА окончаний он наступает раньше, в 8 часов.
AGG вариант окончания, как было подробно рассмотрено, резко отличается от всех других вариантов и имеет антифазную по отношению к ним динамику действия. Минимумы экспрессии всех изучаемых генов под его влиянием соответствовали максимумам для остальных вариантов окончаний и наоборот. 12-часовой минимум экспрессии для циклина А2 под воздействием AGG терминального триплета совпал с максимумом для GGT варианта окончания, а 8-часовой минимум для циклина В1 совпал с максимумами для TAG, GGG, GTT терминальных триплетов и контрольного образца. И, наоборот, 16-часовой период минимума экспрессии циклинов А2 и В1 для вариантов TAG, GGT, GTT и ТТА окончаний и контроля совпал с максимумом для AGG терминального триплета.
В этот период воздействие терминального триплета GGG и контрольного образца напоминали динамику действия AGG окончания. Для циклина Е1 постепенное возрастание уровня мРНК под влиянием AGG варианта окончания наблюдалось на фоне падения его экспрессии в 16-часовой период для всех остальных вариантов окончаний. И только GGG терминальный триплет снова напоминал в этот период динамику AGG варианта.
В примере 2 под влиянием AGG окончания для большинства циклинов (А2, В1 , D3 и Е1) подтвердился 10 часовый спад по сравнению с контрольным образцом (фиг. 2). При этом наблюдалось возрастание экспрессии циклина D2 на фоне снижения уровня циклина D3, что возможно свидетельствует о задержке части клеток в G0 фазе под воздействием AGG варианта окончания теломерного оверхенга (фиг. 3).
На экспрессию интерлейкина-2 AGG вариант окончания теломерной последовательности оказывал аналогичный антифазный эффект по сравнению с действием других вариантов. Несмотря на видимый угнетающий эффект, который наблюдался первые 12 часов в первом примере (фиг.1 Д), обнаружился максимум экспрессии интерлейкина-2 в 5 часов в примере 2 (фиг. 2 Д). Это ещё раз доказывает тот факт, что каждый терминальный нуклеотид в составе теломерного оверхенга определяет наступление специфического максимума экспрессии генов, контролирующих деление клетки. При этом сдвиг окончания на один нуклеотид приводит к сдвигу в наступлении максимума экспрессии. Для интерлейкина-2 под воздействием AGG варианта окончания был характерен 5-часовой максимум экспрессии. Учитывая связь между смещением на один нуклеотид в окончании теломерного олигонуклеотида и сдвигом в наступлении максимума экспрессии генов, для TAG варианта окончания, скорее всего, он наступил на час позже (в 6 часов). Об этом свидетельствует форма графика фиг. 1 Д, где кривая соответствующая TAG терминальному триплету не такая пологая по сравнению с кривой, соответствующей AGG окончанию. Это свидетельствует в пользу того, что максимум экспрессии интерлейкина-2 под воздействием TAG окончания теломерного оверхенга наступает несколько позже, чем для AGG окончания.
Следующий максимум экспрессии интерлейкина-2 в 8 часов наблюдался для ТТА и
GGG вариантов окончания теломерной последовательности, а в 10 часов - для GGT окончания. Исходя из закономерностей сдвига окончаний на один нуклеотид, промежуточное положение между ними занимает GTT вариант окончания. Для него предположительный минимум экспрессии интерлейкина-2 находится в промежутке между 8 и 10 часами, то есть в 9 часов.
Таким образом, на примере экспрессии гена интерлейкина-2 было установлено, что наиболее ранним наступлением первичного максимума его экспрессии характеризуется AGG вариант окончания теломерного оверхенга (5 часов). Затем серия понукпеотидных смещений окончания за счёт отщепления концевых нуклеотидов вызывает удлинение наступления максимума экспрессии гена вплоть до 10 часов, что соответствует GGT варианту окончания. Он характеризовался самым поздним наступлением первичного максимума экспрессии интерлейкина-2. Весь процесс сдвига наступления максимума экспрессии интерлейкина-2 в зависимости от варианта окончания теломерного оверхенга отражён схематично:
AGG (5 ч.) -* TAG (6 ч.) -» ТТА (8 ч.) -> GTT (9 ч.) -> GGT (10 ч.) -» GGG (8 ч.)
Исключением из описанной схемы является GGG вариант окончания оверхенга, который, несмотря на то, что отличается на целый триплет от ТТА варианта окончания, обладает одинаковым с ним максимумом экспрессии интерлейкина-2. Однако, по расчётам нуклеотидного смещения он должен иметь ещё более пролонгированный максимум, чем GGT вариант окончания. Исключительность GGG варианта окончания оверхенга, скорее всего, связана с его уникальными флуоресцентными характеристиками. Было установлено, что он, наряду с AGG окончанием, обладает максимальной FAM-связанной флуоресценцией в зелёном спектре. Это имеет важное значение, так как эти варианты окончания теломерных оверхенгов являются максимальными донорами световой энергии в зелёном спектре. Флуоресценция такого спектра характерна для равновесного квантового состояния неделящейся клетки. В связи с тем, что AGG и GGG окончания теломерных оверхенгов близки спектрально, они обладают более сближенными во времени максимумами экспрессии генов, ответственных за деление клетки, чем по расчётам схемы понуклеотидного смещения. Сходные с интерлейкином-2 максимумы экспрессии были установлены и для гена циклина В1. Сопряжение экспрессии генов интерлейкина-2 и циклина В1 имеет большое значение для понимания механизмов прогрессии клеточного цикла и процесса малигнизации клеток. Установлено, что в клетках карциномы уровень IL-2 в 5-10 раз выше в М фазу, когда высока экспрессия циклина В1 (Reichert Т.Е., Nagashima S., Kashii Y., Stanson J., Gao G., Dou Q.P., Whiteside T.L lnterleukin-2 expression in human carcinoma cell lines and its role in cell cycle progression. Oncogene (2000) Vol.19, pp. 514-525). Для нормальных лимфоцитов и кератиноцитов эта связь не была продемонстрирована. Однако, на основе данных по влиянию 20 мкМ концентрации синтетических оверхенгов в примере 1 , была установлена синхронность динамики экспрессии этих генов для естественно стимулированных лимфоцитов (фиг. 5). Данные, полученные для других временных интервалов, а именно интерлейкиновые максимумы для AGG варианта окончания в 5 часов, для TAG окончания в 6 часов и для GGT окончания в 10 часов, на рисунке не отображены.
Так как для TAG, AGG, GGT и GTT (SEQ ID NO:7,8,10,1 ) терминальных триплетов теломерных олигонуклеотидов максимумы экспрессии циклина В1 и IL-2 приходились на другие интервалы времени, чем отображённые на графике, то их синхронность проявлялась только в общем виде кривых. В связи с этим синхронного повышение уровня мРНК интерлейкина-2, сопоставимого с ростом циклина В1 , на графиках не наблюдалось. Только для GGG и ТТА вариантов окончаний оверхенга, максимумы которых приходились на точку построения графиков (8 часов), наблюдались синхронизированные максимумы для этих двух генов (фиг. 5). Возможно, для других вариантов терминальных окончаний оверхенгов экспрессии этих двух генов сопряжены в другие промежутки времени.
Таким образом, в условиях эксперимента примера 1 экспрессия циклина В1 и IL-2 были максимально сопряжены друг с другом после 8-часов воздействия ТТА и GGG вариантов окончаний теломерных оверхенгов. Из этого следует, что сопряжение экспрессии этих двух генов, характерное для многих злокачественных клеток, связано с преобладанием в них ТТА-терминального окончания теломерной ДНК. Это было продемонстрировано в экспериментах по изучению профилей терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК в лейкемических культурах лимфоцитов человека. Выявление этой закономерности важно для понимания процесса автостимуляции малигнизированных клеток к безудержному делению посредством активации в них интерлейкинового пути.
Исходя из схемы максимумов сопряжённой экспрессии циклина В1 и IL-2 выясняется механизм антагонистического действия AGG варианта окончания оверхенга по сравнению с другими вариантами окончаний. Он вероятнее всего связан с тем, что максимум для AGG варианта окончания наступает и завершается раньше других (около 5 часов) и попадает в противофазу с действием остальных терминальных триплетов. При этом антифазная динамика AGG терминального триплета по сравнению с действием других терминальных триплетов хорошо просматривается на графиках фиг. 1. Выявленная особенность этого варианта окончания вступать в противовес по отношению к другим окончаниям, в том числе и к ТТА окончанию, характерному для активированного к делению состояния клеток, лежит в основе его использования для подавления пролиферации.
Важно отметить, что циклины группы В ответственны за прохождение поздней синтетической фазы, активируя деятельность циклинзависимой киназы Cdk2, и что самое главное, обеспечивают формирование комплекса с Cdk1 (митоз-стимулирующего фактора), обеспечивающего вход клетки в митоз. В связи с этим становится ясным бесспорное влияние окончаний теломерных оверхенгов не только на подготовку клеточного деления в фазы G1 , S и G2 через регулирование экспрессии циклинов групп D, А и Е, но и на определение времени наступления самого митоза посредством контроля экспрессии циклинов группы В. Эти факты свидетельствуют о том, что варианты терминальных окончаний теломерных оверхенгов находятся в клетке в определённом соотношении, которое изменяется в ходе клеточного цикла. Оно контролирует, таким образом, прохождение фаз клеточного цикла, в частности, наступление митоза через регуляцию экспрессии генов, связанных с делением клетки.
Контрольный образец, содержащий только нативные оверхенги в физиологическом соотношении, занимал промежуточное положение по динамике изменений экспрессии генов циклинов и интерлейкина-2 (фиг.1). Внесение в клетки искусственных аналогов теломерных оверхенгов различной последовательности с различными терминальными окончаниями вызвало сдвиги в динамике генов, контролирующих пролиферацию. При этом максимумы экспрессии изученных генов под воздействием различных последовательностей не перекрывались. Для каждого часа существовал один пик уровня мРНК генов циклинов и интерлейкина-2 под воздействием одного варианта нуклеотидной последовательности теломерного оверхенга. В этом заключается глубокий смысл и уникальность каждого варианта окончания оверхенга, который определяет свой уникальный максимум экспрессии генов, ответственных за прохождение фаз клеточного цикла и контролирующих деление клетки. Исключение составляют одинаковые по времени максимумы экспрессии интерлейкина-2 под воздействием ТТА и GGG терминальных окончаний теломерных оверхенгов.
Таким образом, чёткий подбор нуклеотидной последовательности синтетических аналогов теломерных оверхенгов, лежащий в основе заявляемого способа, позволяет специфически влиять на экспрессию контролирующих деление генов и направленно регулировать, таким образом, пролиферативный статус клеток. Всё это создаёт новые перспективы в понимании механизмов запуска и контроля клеточного деления, а также злокачественного перерождения клетки, связанного с сокращением продолжительности клеточного цикла. Было доказано, что малигнизированные клетки характеризуются нарушенным механизмом регуляции соотношения вариантов нуклеотидных окончаний теломерных оверхенгов, что приводит к сокращению периода наступления митоза. В связи с этим в диагностическую практику медицинских учреждений целесообразно ввести профилирование теломерной ДНК по содержанию терминальных нуклеотидов и исследование флуоресцентных и спектральных характеристик теломерных оверхенгов. Проведение подобных диагностических мероприятий позволит получить наибольший терапевтический эффект от воздействия синтетических аналогов теломерных последовательностей с помощью заявляемого способа. Исходя из того, что для клетки при определении её пролиферативного статуса важно соотношение между определёнными терминальными триплетами теломерной ДНК, составляются корректирующие профили её окончаний с целью создания триггерных условий активации деления клетки или, наоборот, подавления пролиферации. Примером составления таких корректирующих профилей в противораковой терапии может служить пример 4.
Пример 4. Составление корректирующего профиля триплетных окончаний теломерной ДНК человека с целью подавления деления клеток лейкемических культур Jurkat и К-562.
Для клеток культур были получены профили терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК после синхронизации в фазе митоза под воздействием колхицина (фиг.бА - Jurkat, фиг.бБ - К-562). Они свидетельствовали о том, что в обеих культурах клеток присутствовали серьёзные нарушения процессов, контролирующих понуклеотидные переходы окончаний теломерных оверхенгов.
Для нормальных лимфоцитов характерно присутствие равновесного сбалансированного профиля терминальных нуклеотидов теломерных оверхенгов во всех фазах клеточного цикла, кроме начальной G1 фазы, знаменующей триггерный процесс активации деления клетки. В связи с этим для каждой лейкемической культуры были рассчитаны специфические соотношения синтетических аналогов окончаний теломерной ДНК, необходимые для восполнения равновесного сбалансированного профиля терминальных нуклеотидов в усреднённом количественном соотношении: TAG(18%), AGG(26%), GGG(7%), GGT(5%), GTT(26%), TTA(18%). Полученные корректирующие профили представлены диаграммами процентного содержания терминальных триплетов (фиг.7А - Jurkat, фиг.7Б - К-562).
Оптимальные для воздействия концентрации олигонуклеотидов в соответствии с установленным процентным содержанием должны подбираться эмпирически и определяться количественным содержанием ТТА варианта окончания теломерных оверхенгов в клетках-реципиентах. При составлении корректирующих профилей следует исходить из общего правила, согласно которому исходное избыточное содержание терминального триплета ТТА в результирующем профиле принимается за норму, составляющую 18%, по отношению к которой рассчитываются добавляемые концентрационные соотношения других триплетных окончаний оверхенгов. Для культуры Jurkat содержание ТТА триплета в исходном профиле составило 82,3%. При формировании результирующего профиля, образующегося при добавлении концентраций олигонуклеотидов в процентном соотношении, представленном на фиг. 7А, содержание ТТА триплета составило 18%. При этом суммарное концентрационное количество синтетических аналогов оверхенгов, добавляемых к клеткам, больше исходного количества нативных оверхенгов в 3,6 раза. Для культуры К-562 количество окончания ТТА, которое составляло 57,5% в исходном профиле, также принималось за 18% в результирующем профиле. На основании этого добавляемые количества триплетных окончаний олигонуклеотидов были в 2,2 раза больше исходного количества теломерных оверхенгов в клетках и соответствуют процентному содержанию, представленному на фиг. 7Б.
Увеличение количества теломерных оверхенгов в клетках в указанных пределах не приводит к цитотоксическим эффектам, связанным с их переизбытком. Однако при расчёте концентрации вводимых олигонуклеотидов следует исходить из предела конечной суммарной концентрации всех вариантов окончаний, равного не более 10-20 микромолям. Увеличение концентрации более 40 мкМоль может вызвать цитотоксические эффекты, связанные с их переизбытком. Воздействие смесей теломерных олигонуклеотидов в заявляемом способе не связано с многократным превышением их физиологических концентраций и не является сигналом повреждения ДНК, приводящим к аресту клеточного цикла. Смеси олигонуклеотидов предназначены для коррекции профиля терминальных нуклеотидов теломерной ДНК обрабатываемых клеток и возвращения их к контролируемому режиму деления.
При невозможности проведения индивидуального профилирования терминальных нуклеотидов теломерной ДНК злокачественных клеток рекомендуется использовать воздействие олигонуклеотидами с AGG (SEQ ID NO:8) вариантом окончания, как наиболее важным для нуклеотидного профиля неделящихся клеток. Перспективно использование последовательностей на основе полноразмерного повтора GTTAGG (SEQ ID NO:2), так как они обладают максимальной флуоресценцией в зелёном спектре. Это очень важно для создания условий квантового состояния неделящейся клетки, для которого характерно одновременное присутствие зелёного и красного каналов флуоресценции теломерных оверхенгов. Кроме того, этот квантовый эффект можно усилить включением метки, флуоресцирующей в зелёном диапазоне, и гасителя красной флуоресценции. Возможно также включение в последовательность олигонуклеотида фосфотиоатных групп, блокирующих отщепление концевых нуклеотидов и продлевающих его терапевтическое действие. Применение различных модификаций AGG-терминальных олигонуклеотидов позволяет не только продлевать их терапевтическое действие, но и повышает его специфичность.
Отличительной чертой заявляемого способа является возможность конструирования разнообразных теломерных последовательностей, различающихся не только окончаниями, но и последовательностью теломерного повтора. Это важно для достижения максимального терапевтического эффекта. В основе заявляемого способа лежит понимание роли различий последовательностей теломерного повтора для регулирования деления клетки. В зависимости от вариации нуклеотидного окончания 3' и 5'-концов теломерной ДНК совокупность её G-оверхенгов представляет собой гетероморфную популяцию, различающуюся по нуклеотидному составу теломерных повторов. В зависимости от 5'-окончания С-цепи теломерной ДНК последовательность каждого однонитевого оверхенга G-цепи представляет собой л-ое число одного из шести вариантов полноразмерного повтора из числа последовательностей SEQ ID NO: 1-6. При этом оверхенги могут оканчиваться неполноразмерным повтором и различаться своими триплетными окончаниями, представленными в SEQ ID NO:7-12.
Таким образом, в основе заявляемого способа лежит использование различных вариаций последовательности теломерного повтора и его окончаний, которые обладают специфическим действием на экспрессию генов, регулирующих деление клетки. В примерах осуществления изобретения было показано, что терминальные нуклеотиды играют огромную роль в регуляции наступления максимумов экспрессии основных циклинов, а они в свою очередь регулируют наступление фаз клеточного цикла. В связи с вышесказанным при конструировании теломерных олигонуклеотидов следует учитывать не только их окончание, но и начальные нуклеотиды. Именно они определяют последовательность теломерного повтора, который определяет их основные спектральные свойства.
Показано, что различные варианты теломерного повтора ДНК человека обладают уникальными спектральными характеристиками, связанными со специфическим балансом красного и зелёного цветов их результирующей флуоресценции. Основную специфику флуоресценции теломерного олигонуклеотида определяет последовательность теломерного повтора, определяемая первыми шестью нуклеотидами, начиная с 5'-конца. Об этом свидетельствует проведённое исследование спектральных характеристик использованных в примерах теломерных последовательностей в зелёном спектре FAM- связанной флуоресценции (фиг. 8 Б). Диаграммы фигуры 8 демонстрируют прирост флуоресценции раствора свободного карбоксифлуоресцеинового красителя после добавления образцов теломерных олигонуклеотидов. При этом сравнение диаграмм фиг. 8 показало различие значений флуорофор-связанной флуоресценции последовательностей, состоящих из двух полноразмерных повторов (А), и последовательностей, оканчивающихся третьим неполноразмерным повтором в виде триплета (Б). В связи с этим становится понятна особая роль терминальных триплетов теломерных оверхенгов в регулировании деления клетки через регулирование интенсивности зелёного канала их результирующей флуоресценции в клетках.
Основные функции в геноме клетки, подавляющие её деление, должен обеспечивать теломерный повтор GTTAGG, обладающий высоким уровнем зелёной флуоресценции, характерной для неделящегося состояния клетки. Для последовательности (AGGGTT)2AGG её основные спектральные свойства, связанные с невысоким уровнем зелёной флуоресценции, определил повтор AGGGTT (SEQ ID NO:5). Тем не менее, эта последовательность сохранила своё антифазное действие по отношению к другим вариантам окончаний теломерных олигонуклеотидов и показала подавляющее влияние на экспрессию циклинов в первые 10-12 часов воздействия на лимфоциты. Таким образом, анализ влияния последовательностей, оканчивающихся неполноразмерным повтором, показал преимущественную роль терминальных окончаний в регуляции деления клетки.
Для последовательности (TTAGGG^TTA основным теломерным повтором является последовательность TTAGGG (SEQ ID NO:3), которая определяет его основные спектральные характеристики, связанные с высокой флуоресценцией в зелёном диапазоне. При этом окончание ТТА вызвало некоторое снижение уровня зелёной флуоресценции этой последовательности по сравнению с олигонуклеотидом, состоящим из двух полноразмерных повторов. В связи с этим становится понятной роль нуклеотидных окончаний полноразмерных теломерных повторов, входящих в состав последнего неполноразмерного повтора. Последовательность (TTAGGG)2TTA не выявила выраженного влияния на стимуляцию деления клеток. С одной стороны, это может быть связано с её флуоресценцией в зелёном спектре и несоответствием квантовому режиму активированной к делению клетки, связанному с преобладанием красной флуоресценции. С другой стороны, может определяться воздействием этой последовательности, происходящим не в момент перехода G0-Gi фаз при активации клеточного деления, когда она оказывает максимальное стимулирующее воздействие. Тем не менее использование этой последовательности доказало принципиальную роль ТТА окончания теломерных оверхенгов в стимуляции деления клетки через наступление оверэкспрессии интерлейкина-2 после 8-ми часов воздействия олигонуклеотида (пример 1).
Интересен тот факт, что последовательность (GGGTTA)2GGG, представленная двумя полноразмерными повторами GGGTTA (SEQ ID NO:6), выявила такой же 8-ми часовой максимум экспрессии интерлейкина-2. Видимо, в этом случае ведущую роль сыграла последовательность основного теломерного повтора GGGTTA, ответственного за активацию деления клетки. Кроме того окончание GGG также связано с активированным к делению состоянием клетки. Об этом свидетельствуют циклические периоды увеличения его содержания в клетках после триггерного момента активации деления, связанного с максимальным преобладанием ТТА окончания теломерных оверхенгов.
В связи с этим было установлено, что более эффективными по сравнению с использовавшимися в примерах осуществления изобретения последовательностями будут являться разновидности олигонуклеотидов, состоящие из полноразмерных теломерных повторов. Они сохраняют максимально выраженные различия спектральных свойств нуклеотидных окончаний, соответствующих целям воздействия на пролиферативный статус клеток. В частности, для подавления деления лучше использовать последовательности, состоящие из η-ого количества полноразмерного повтора GTTAGG (SEQ ID NO:2). Для активации деления клеток целесообразно использовать последовательности, состоящие из η-ого количества полноразмерного повтора GGGTTA (SEQ ID NO:6). Эти последовательности, с одной стороны, обеспечат стимулирующее влияние окончания ТТА на деление клетки, а с другой стороны, благодаря преобладанию красной флуоресценции, будут полностью соответствовать квантовому состоянию активированной к делению клетки. В связи с этим использовавшаяся в примерах осуществления изобретения последовательность (TTAGGG)2TTA менее эффективна по сравнению с последовательностями на основе полноразмерного повтора GGGTTA.
Вышеизложенные критерии принципиально отличают заявляемый способ от использовавшейся ранее концепции применения синтетических аналогов теломерной ДНК, которая исходила из понимания их роли только как сигналов повреждения ДНК, ведущих к аресту деления. Особое значение для заявляемого способа имеет понимание взаимоотношений между отдельными теломерными оверхенгами в клетке как элементами общей квантово-резонансной системы. При этом воздействие на клетки с помощью синтетических аналогов оверхенгов понимается как внесение изменения в сложившуюся систему сложных связей. Таким образом, особое значение имеет момент внесения корректирующих олигонуклеотидов, что связано с установлением специфических для конкретной фазы клеточного цикла профилей терминальных нуклеотидов теломерных оверхенгов.
Особую роль играет установление антифазной динамики AGG терминального окончания оверхенгов по сравнению с другими вариантами окончаний. Именно этот вариант окончания теломерных олигонуклеотидов при использовании полноразмерных последовательностей теломерного повтора GTTAGG (SEQ ID NO:2) составляет основу воздействия на пролиферативный статус клетки с целью подавления деления. В связи с этим в противораковой терапии подобные аналоги теломерных последовательностей будут более эффективными по сравнению с использовавшейся ранее 11 -членной формой GTTAGGGTTAG. При этом эффективность действия будет зависеть от того, в какие фазы клеточного цикла оно осуществляется.
Внесение последовательностей на основе теломерного повтора GTTAGG (SEQ ID NO:2), обладающих характерным терминальным триплетом AGG (SEQ ID NO:8) в момент активации деления будет носить блокирующее действие. Это связано с антифазным действием этого варианта окончания, наряду с TAG (SEQ ID NO:7) и GGG (SEQ ID NO:9) окончаниями, на неравновесный несбалансированный профиль терминальных нуклеотидов теломерных оверхенгов, связанный с преобладанием ТТА варианта их окончания. В здоровых клетках этот процесс приводит к торможению процесса триггерного перехода из G0 в d фазу клеточного цикла и накоплению клеток в фазе покоя.
В злокачественных клетках воздействие AGG, TAG и GGG окончаниями в определённом соотношении вызывает не только блокирование G0— >G-\ перехода при активации деления, но и способствует формированию равновесного сбалансированного профиля окончаний теломерных оверхенгов и осуществлению нормального хода клеточного цикла. Кроме того, это воздействие обеспечивает отключение эмбриоспецифической программы развития раковых клеток и осуществляет их возврат к тканеспецифической специализации.
После триггерного момента активации деления, когда в клетках устанавливается равновесный сбалансированный профиль терминальных нуклеотидов теломерной ДНК, добавление различных вариантов теломерных последовательностей приводит к сдвигам в наступлении фаз подготовки к делению и самого деления клеток. Специфичность воздействия различных окончаний и нуклеотидных вариаций теломерного повтора на наступление максимумов экспрессии генов, связанных с делением клетки, была показана в первых трёх примерах осуществления изобретения. Таким образом, впервые была показана возможность влияния специфических последовательностей теломерной ДНК на время наступления фаз деления клетки и продолжительность всего клеточного цикла через регуляцию экспрессии генов циклинов.
Важно отметить, что в ходе прогрессии клеточного деления, связанной с установившимся равновесным профилем терминальных нуклеотидов теломерной ДНК, воздействие AGG варианта окончания, как и других вариантов терминальных триплетов, связано с влиянием на прохождение фаз митоза. На этом этапе функции AGG- терминального окончания отличаются от таковых при активации деления, так как это окончание способно предотвратить, но не прекратить уже начавшийся цикл деления.
Если подготовка к делению уже началась AGG окончание, как и другие варианты окончаний, влияет на его ход. Было показано, что оно определяет наиболее пролонгированное наступление синтетической фазы подготовки к делению через 16-18 часов от начала нового клеточного цикла. Об этом свидетельствовала динамика экспрессии циклинов А2 и Е1 в примере 1 (фиг.1 А и В). Полное соответствие этого факта нормальной продолжительности клеточного цикла лимфоцитов определяет огромную роль AGG-терминального окончания теломерных оверхенгов в обеспечении этого процесса. В связи с этим становится понятной стратегия злокачественных клеток, связанная с уменьшением или полной редукцией этого окончания, для достижения сокращения продолжительности клеточного цикла. Возмещение недостатка AGG-терминального окончания теломерных оверхенгов составляет основу нового направления ДНК-терапии онкологических заболеваний. Подавление пролиферации клеток связано с антифазной динамикой воздействия этого окончания на экспрессию генов циклинов и интерлейкина-2 по отношению к действию других теломерных окончаний. Это связано с тем, что все другие окончания представляют собой определённые этапы превращения исходного окончания AGG в цепи понуклеотидных переходов терминальных триплетов: AGG- rAG->TTA->GTT->GGT->GGG. При этом каждый сдвиг и каждое окончание характеризуются своим временем наступления максимумов экспрессии генов, контролирующих деление клетки. Промышленная применимость
Изобретение может найти применение в сфере здравоохранения и науки. Описание вариантов использования изобретения показывает возможность применения заявленного способа в лабораторных условиях в медицинских и научно-исследовательских учреждениях для контролирования пролиферативного статуса клеток человека.
В заявляемом способе открытые формы теломерных оверхенгов воспринимаются не только как сигнал о повреждении петлевой организации ДНК, запускающей репаративные процессы, блокирующие клеточный цикл, а прежде всего как особые сигналы молекулярной и квантово-оптической природы, управляющие клеткой. При этом важно использование тщательно подобранной концентрации теломерных олигонуклеотидов, находящейся в соответствии с физиологическим уровнем теломерных оверхенгов в клетках. Применение физиологически адаптированных концентраций синтетических теломерных олигонуклеотидов, меньше использовавшейся ранее 40 мкМ концентрации, позволяет избежать их токсического переизбытка, приводящего к аресту клеточного цикла. При этом синтетические последовательности вступают во взаимодействие с нативными оверхенгами, образуя единую систему квантово-оптического регулирования работы генома и процессов жизнедеятельности клетки, включая её деление.
Внесение в клетки чрезмерного количества синтетических аналогов теломерных оверхенгов, как это было принято ранее, приводит к поломке тонкого механизма работы генома. Конечно, и в этом случае эксперименты имеют свой результат, но далёкий от того, что может дать точное оперирование концентрациями, нуклеотидными вариациями теломерных повторов и окончаниями теломерных оверхенгов. Именно на этих новых принципах базируется патентуемый способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека. Они позволяют существенно повысить специфичность и эффективность использования теломерной ДНК-терапии с помощью заявляемых последовательностей и открывают широкие перспективы её использования в различных областях медицины.
Уникальные сочетания вариаций теломерного повтора и триплетных окончаний теломерных последовательностей впервые позволяет использовать их не только для подавления клеточного деления, но и для стимуляции пролиферации и контролирования времени наступления определённых фаз клеточного цикла, в том числе и фазы покоя, для которой характерна реализация тканеспецифических функций клеток и тканей. В связи с этим специфические нуклеотидные последовательности G-цепи теломерной ДНК человека могут использоваться в составе лекарственных средств в онкологии, иммунологии, геронтологии, трансплантологии, лечебно-косметологических или косметических продуктов в косметологии, дерматологии, которые предназначены для контролирования деления клеток и поддержания их тканеспецифических функций.

Claims

Формула изобретения
1. Способ воздействия на пролиферативный статус клеток, включающий внесение в среду, окружающую клетки, и последующее проникновение в них специфических нуклеотидных последовательностей однонитевых участков (оверхенгов) G-цепи теломерной ДНК человека, отличающийся тем, что указанные последовательности различаются вариациями нуклеотидной последовательности теломерного повтора ДНК и триплетными окончаниями, и применяются с целью: а) подавления или стимуляции деления клеток, б) контролирования времени наступления определённых фаз клеточного цикла, в) активации или подавления эмбриоспецифической, тканеспецифической программ развития клеток, в том числе для достижения контролируемого профиля экспрессии генов, связанного с их реализацией.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве специфических нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека используются нативные теломерные оверхенги, выделенные из клеток, синхронизированных на определённом этапе клеточного цикла и являющихся донорами пролиферативной информации по отношению к клеткам-реципиентам.
3. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека используются синтетические дезоксирибоолигонуклеотиды различной длины, фосфорилированные или дефосфорилированные по 5'-концу, применяемые в физиологически адаптированных концентрациях, не приводящих к аресту клеточного цикла, связанному с их переизбытком.
4. Способ по п.З, отличающийся тем, что синтетические аналоги нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека состоят из л-ого количества полноразмерных последовательностей теломерных повторов человека из числа вариаций, представленных в SEQ ID NO: 1-6.
5. Способ по п.З, отличающийся тем, что синтетические аналоги нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека состоят из л-ого количества полноразмерных последовательностей теломерных повторов, указанных в SEQ ID NO: 1-6 и оканчивающихся неполноразмерным повтором с различными терминальными триплетами, представленными в SEQ ID NO: 7-12.
6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что указанные синтетические аналоги применяются для контролирования времени наступления определённых фаз клеточного цикла через регулирование наступления максимумов и минимумов экспрессии генов, связанных с прогрессией клеточного цикла и делением клетки.
7. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что указанные синтетические аналоги применяются в составе корректирующей смеси, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 7-12 окончаний G-цепи теломерной ДНК человека, составленной на основе предварительного определения терминальных нуклеотидов теломерных оверхенгов в клетках и предназначенной для коррекции их нативного профиля, соответствующего определённой фазе клеточного цикла.
8. Способ по п.З, отличающийся тем, что для воздействия на пролиферативный статус клеток с целью подавления деления используются нуклеотидные последовательности G-цепи теломерной ДНК человека, состоящие из л-ого количества полноразмерной последовательности теломерного повтора SEQ ID NO: 2 или последовательности других вариаций теломерного повтора из числа SEQ ID NO:1 , 3,4,5,6, оканчивающейся неполноразмерным повтором с терминальным триплетом SEQ ID NO:8.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанные последовательности используются для подавления деления клеток в составе корректирующей смеси, состоящей из различных триплетных окончаний последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека, представленных в SEQ ID NO: 7,9,10,11 ,12, и составленной на основе предварительного определения терминальных нуклеотидов нативных окончаний теломерных оверхенгов в клетках.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что указанные нуклеотидные последовательности используются для подавления эмбриоспецифической и активации тканеспецифической программ развития клеток, в том числе для достижения контролируемого профиля экспрессии генов, связанного с их реализацией.
11. Способ по п.З, отличающийся тем, что для воздействия на пролиферативный статус клеток с целью стимуляции деления используются нуклеотидные последовательности G-цепи теломерной ДНК человека, состоящие из л-ого количества полноразмерной последовательности теломерного повтора SEQ ID NO: 6 или последовательности других вариаций теломерного повтора из числа SEQ ID NO: 1-5, оканчивающейся неполноразмерным повтором с терминальным триплетом SEQ ID NO:12.
12. Способ по п.11 , отличающийся тем, что указанные последовательности используются для стимуляции деления клеток в составе корректирующей смеси, состоящей из различных триплетных окончаний последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека, представленных в SEQ ID NO: 7-11 , и составленной на основе предварительного определения терминальных нуклеотидов нативных окончаний теломерных оверхенгов в клетках.
13. Способ по п.11 или 12, отличающийся тем, что указанные нуклеотидные последовательности применяются с целью подавления тканеспецифической и активации эмбриоспецифической программ развития клеток, в том числе для достижения контролируемого профиля экспрессии генов, связанного с их реализацией.
14. Способ по п.З, отличающийся тем, что синтетические аналоги нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека содержат модификации, представленные концевым или внутренним включением флуоресцентной метки и/или молекулы гасителя, предназначенные для усиления и/или подавления флуоресценции определённого спектра и коррекции естественного квантового насыщения теломерных оверхенгов в клетках с целью квантово-оптического регулирования деления.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что для подавления деления клеток и активации в них тканеспецифической генетической программы развития используются флуорофоры синего или зелёного спектра флуоресценции и/или гасители флуоресценции оранжево- красного или фасного спектра поглощения.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что для активации деления клеток и запуска эмбриоспецифической программы развития используются флуорофоры оранжево-красного или красного спектра флуоресценции и/или гасители флуоресценции синего или зелёного спектра поглощения.
17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что указанные флуорофоры и гасители представлены синтетическими или природными молекулами, в том числе и естественными метаболитами клеток человека.
18. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что указанные флуорофоры и гасители не используются для химической модификации нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека, а вводятся в клетки в виде свободных компонентов и осуществляют коррекцию общего квантового насыщения клеток.
19. Способ по п.З, отличающийся тем, что синтетические аналоги нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека содержат модификации, представленные фосфотиоатными или аналогичными группами, предназначенными для предотвращения их нуклеазной деградации, концевого отщепления нуклеотидов, связанного с переходом в другие формы окончаний, и обеспечивающими продление их терапевтического действия.
20. Способ по п.З, отличающийся тем, что синтетические аналоги нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека содержат модификации, представленные фотоотщепляемыми группами (спейсерами), предназначенными для направленного гидролиза определённых межнуклеотидных связей под воздействием света специфической длины волны и контролированного во времени появления определённых триплетных окончаний теломерных оверхенгов в соответствии с их нуклеотидными изменениями в ходе клеточного цикла.
21. Способ по п.1 , отличающийся тем, что специфические нуклеотидные последовательности G-цепи теломерной ДНК человека используются в составе: а) лекарственных средств в онкологии, иммунологии, геронтологии, трансплантологии и других областях медицины, б) лечебно-косметологических или косметических продуктов в косметологии и дерматологии, которые предназначены для контролирования деления клеток и поддержания их тканеспецифических функций.
22. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве специфических нуклеотидных последовательностей G-цепи теломерной ДНК человека используются их волновые эквиваленты (репликативные отображения) в виде: а) волн электромагнитного происхождения, включая спектр световых и радиоволн, б) звуковых колебаний, в) полей, образованных колебательными или вращательными движениями частиц материальной среды, включая торсионные и другие поля вакуумной и квантовой природы, в том числе топографического и нелинейного солитонного типа, состоящие из определённых резонансных частот, обладающих воздействием на клетки-реципиенты и организм в целом.
PCT/RU2013/001108 2012-12-12 2013-12-11 Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека WO2014092609A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13862657.7A EP2960340A4 (en) 2012-12-12 2013-12-11 METHOD FOR ACHIEVING THE PROLIFERATIVE STATUS OF CELLS USING NUCLEOTIDE SEQUENCES SPECIFIC TO THE G-CHAIN OF TELOMERIC HUMAN DNA

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012153541 2012-12-12
RU2012153541/10A RU2550267C2 (ru) 2012-12-12 2012-12-12 Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014092609A1 true WO2014092609A1 (ru) 2014-06-19

Family

ID=48701252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2013/001108 WO2014092609A1 (ru) 2012-12-12 2013-12-11 Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2960340A4 (ru)
RU (1) RU2550267C2 (ru)
WO (1) WO2014092609A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3124609A1 (en) 2015-07-29 2017-02-01 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare Therapeutics oligonucleotides
EP3650546A1 (en) 2015-07-29 2020-05-13 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare Therapeutic oligonucleotides

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2763992C1 (ru) * 2020-10-08 2022-01-12 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ бесконтактной стимуляции транскрипционной активности гена ингибитора циклинзависимой киназы 2 в опухолевых клетках предстательной железы

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060052323A1 (en) * 1995-06-06 2006-03-09 Gilchrest Barbara A Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
US20060269924A1 (en) * 2003-04-11 2006-11-30 Trustees Of Boston University Modulation of telomere-initiated cell signaling
US20100286247A1 (en) * 2005-04-04 2010-11-11 Trustees Of Boston University Methods of Protection from Oxidative Stress

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004262828A (ja) * 2003-02-28 2004-09-24 Japan Science & Technology Agency テロメア等に結合し得る分子およびその利用法
RU2006144817A (ru) * 2004-05-19 2008-06-27 Трастиз Оф Бостон Юниверсити (Us) Модуляция wrn-опосредованной теломера-инициированной клеточной передачи сигнала

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060052323A1 (en) * 1995-06-06 2006-03-09 Gilchrest Barbara A Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
US20090209747A1 (en) * 1995-06-06 2009-08-20 Trustees Of Boston University Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
US20060269924A1 (en) * 2003-04-11 2006-11-30 Trustees Of Boston University Modulation of telomere-initiated cell signaling
US20100286247A1 (en) * 2005-04-04 2010-11-11 Trustees Of Boston University Methods of Protection from Oxidative Stress

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AOKI H.; IWADO E.; ELLER M.S.; KONDO Y.; FUJIWARA K.; LI G.Z.; HESS K.R.; SIWAK D.R.; SAWAYA R.; MILLS G.B.: "Telomere 3 '-overhang-specific DNA oligonucleotides induce autophagy in malignant glioma cells", FACEB J, vol. 21, no. 11, 2007, pages 2918 - 2930
ATOYAN R.Y.; SHAROV A.A.; ELLER M.S.; SARGSYAN A.; BOTCHKAREV V.A.; GILCHREST B.A: "Oligonucleotide treatment increases eumelanogenesis, hair pigmentation and melanocortin-1 receptor expression in the hair follicle", EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, vol. 16, no. 8, 2007, pages 671 - 677
ELLER M.S., X.; LIU S.; ANNA K.; BACKVALL H.; OPRESKO P.L.; BOHR V.A.; GILCHREST B.A.: "A role for WRN in telomere-based DNA damage responses", PNAS, vol. 103, no. 41, 2006, pages 15073 - 15078
ELLER M.S.; LIU S.; HANNA K.; BACKVALL H.; OPRESKO P.L.; BOHR V.A.; GILCHREST B.A: "A role for WRN in telomere-based DNA damage responses", PNAS, vol. 103, 2006, pages 15073 - 15078
PURI N.; ELLER M.S.; BYERS H.R.; DYKSTRA S.; KUBERA J.; GILCHREST B.A.: "Telomere-based DNA damage responses: a new approach to melanoma", FASEB J., vol. 18, no. 12, 2004, pages 1373 - 1381
REICHERT T.E; NAGASHIMA S.; KASHII Y.; STANSON J.; GAO G.; DOU Q.P.; WHITESIDE T.L.: "Interleukin-2 expression in human carcinoma cell lines and its role in cell cycle progression", ONCOGENE, vol. 19, 2000, pages 514 - 525
SARKAR S.; FALLER D.V.: "T-oligos inhibit grows and induce apoptosis in human ovarian cancer cells", OLIGONUCLEOTIDES, vol. 21, no. 1, 2011, pages 47 - 53
See also references of EP2960340A4 *
YAAR M.; ELLER M.S., I.; KUBERA J.; WEE L.H.; COWAN K.H.; GILCHREST B.A.: "Telomeric DNA induces apoptosis and senescence of human breast carcinoma cells", BREAST CANCER RESEARCH, vol. 9, no. 1, 2007, pages 13

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3124609A1 (en) 2015-07-29 2017-02-01 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare Therapeutics oligonucleotides
EP3650546A1 (en) 2015-07-29 2020-05-13 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare Therapeutic oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
EP2960340A4 (en) 2016-06-29
RU2550267C2 (ru) 2015-05-10
RU2012153541A (ru) 2013-06-27
EP2960340A1 (en) 2015-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2187895B1 (en) Composition containing microrna-21 inhibitor for enhancing radiation sensitivity
RU2018113709A (ru) Модуляторы экспрессии kras
la Iglesia et al. STAT3 regulation of glioblastoma pathogenesis
MX2021012126A (es) Composiciones y métodos para inhibir la expresión génica en el sistema nervioso central.
EP2345718A3 (en) Compositions and methods for siRNA inhibition of angiogenesis
WO2014092609A1 (ru) Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека
EP1357184B1 (en) Novel cis-element decoys useful as anti-tumor therapeutics
JP6607870B2 (ja) Ｈｓｐ７０モジュレーターならびにその作製および使用方法
KR101960592B1 (ko) Jak1 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물
Das et al. Binding studies of aloe-active compounds with G-quadruplex sequences
KR20070101610A (ko) Ａｎｔ２ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 ｒｎａ를이용한 암 유전자 치료 및 항암제 내성 극복방법
CN101418293A (zh) 微小rna-21的反义寡聚核苷酸及其应用
US20140336371A1 (en) Sirna molecule for inhibiting growth of melanin and application thereof
Ba et al. Investigation of human flap structure-specific endonuclease 1 (FEN1) activity on primer-template models and exploration of a substrate-based FEN1 inhibitor
Seike MicroRNA expression profiles in lung cancer cooperated with drug sensitivity to EGFR tyrosine kinase inhibitor
HUP0300923A2 (hu) RAF és RAS protein kinázt tartalmazó készítmények és alkalmazásuk angiogenezis módosítására
CN103320444A (zh) 针对微小rna-21种子序列的反义寡聚核苷酸及应用
ATE218372T1 (de) Antisense oligonnukleotide die mit der mrna cap aktivität interferieren und die translation inhibieren
Hinds A confederacy of kinases: Cdk2 and Cdk4 conspire to control embryonic cell proliferation
CN102697759B (zh) N,n’-双（3,4-二羟基苯亚甲基）-邻苯二胺在制备治疗黑色素肿瘤药物中的应用
Bailly et al. A novel B‐ring modified homocamptothecin, 12‐Cl‐hCPT, showing antiproliferative and topoisomerase I inhibitory activities superior to SN‐38
Athans The Effect of Solar Ultraviolet Induced Activation of Constitutive Nitric Oxide Synthase on Primary Fibroblast Cells
ATE391777T1 (de) Verwendung von prohibitin-rns in krebsbehandlung
Patutina et al. Rationally combined cocktail of anti-miRNA N-mesylphosphoramidate oligonucleotides for efficient antitumor therapy
Kaluzhny et al. Novel Indolocarbazole Derivative 12-(α-L-arabinopyranosyl) indolo [2, 3-a] pyrrolo [3, 4-c] carbazole-5, 7-dione Is a Preferred c-Myc Guanine Quadruplex Ligand

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13862657

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013862657

Country of ref document: EP