WO2014083201A1 - Verfahren zur bestimmung einer verträglichkeit zwischen einem spender und einem empfänger mittels durchflusszytometrischer detektion alloreaktiver t-zellen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung einer verträglichkeit zwischen einem spender und einem empfänger mittels durchflusszytometrischer detektion alloreaktiver t-zellen Download PDF

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Ferdinand Hermann Bahlmann
Danilo Fliser
Martina Sester
Urban Sester
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the invention relates to a method for determining a compatibility between a donor and a recipient by means of flow cytometric detection of alloreactive T cells.
  • the cell-mediated immune response to donations of tissues or organs plays an important role in both acute and chronic transplant rejection. It is of great importance to assess the risk of rejection of the donation by the recipient.
  • labeled sample a blood sample obtained from a donor / recipient pair to be analyzed
  • labeled sample the label being suitable for distinguishing from a sample from the recipient
  • non-labeled sample the other blood sample obtained from the donor / recipient pair to be analyzed
  • step d) of claim 1 stimulation of antigen-presenting cells (APC) in the mixture of labeled and unlabelled sample according to step d) of claim 1 by adding anti-CD28 or anti-CD28 and anti-CD49d antibodies followed by
  • the sample or both samples may be derived from whole blood.
  • the label is a labeled CD45 antibody, CFDA-SE or CFSE.
  • the first medium used in step b) of the method according to the invention can be independent of the second medium mentioned in step c) of claim 1.
  • the first medium and the second medium may be any cell culture media, especially those selected from the group consisting of phosphate buffered saline, RPMI.
  • the separation of cellular constituents of the samples from the liquid phase can take place by means of centrifugation.
  • the secretion inhibitor is brefeldin A (BFA) or monesin.
  • the added prior to the flow cytometric detection of cell membrane permeator is a saponin, Tween ®.
  • the cytokine in the method of the invention is ⁇ -IFN.
  • the activation marker can be CD69.
  • step m) case a. show alloreactive CD4 T cells of the labeled partner of the donor / recipient pair against the unlabeled partner from the donor / recipient pair.
  • step m) case b. Alloreactive CD4 T cells of the non-labeled partner of the donor / recipient pair show up against the labeled partner of the donor / recipient pair.
  • step m) case c. show alloreactive CD8 T cells of the labeled partner of the donor / recipient pair against the unlabeled partner of the donor / recipient pair. If the result is given, step m) case b. Alloreactive CD8 T cells of the non-labeled partner of the donor / recipient pair show up against the labeled partner of the donor / recipient pair.
  • the supernatant is removed and the Falcons are filled to their original weight with medium. Then 500 ⁇ of the recipient's blood (unstained blood sample) is pipetted over to the donor's blood ( ⁇ lml). For stimulation, a mixture of anti-CD28 and anti-CD49d is added by pipette and incubated for 2 h in the incubator. Subsequently, BFA is added to the sample and incubated for 4 h in the incubator (curved arrows added).
  • the MFI of the stained cell population increases with increasing concentration and that of the unstained cell population remains at a zero level (A) or increases slightly (B and C).
  • the anti-CD45-FITC from Sigma shows the highest MFI ratio.
  • the anti-CD45 APC of BD shows a better ratio of MFIs, such as the CD45-FITC of BD (green).
  • the red circles represent those concentrations which were decided in the further course of the experiment.
  • Evaluation of the FACS Measurement Part 1. The evaluation strategy is applied to whole blood samples and PBMC samples with essentially the same algorithm. First, by representing two unoccupied channels (V-450 and V-500) against each other (dot blot at the top right), nonspecific events shown in the gate P5 are removed. In the dot blot below, CD8 is applied against CD4. Here, the cells lying in the gate P3 are cut out.
  • the cell Those located in the gate PI are backgated, ie the left-side dot blot image (FSC vs. SSC) shows only cells that are visible in the gate PI (middle dot blot, right side) second backgating of the lymphocytes occurs through gate P2 (density blot, bottom left), which gated on a population between CD45 positive and CD45 negative cells (blue gate). Since these cells are localized in the Densityblot (top left, shown in blue) are not lymphocytes, Gaten was aimed at this not to include in the evaluation. For the density blot (top left), where the two backgating strategies were applied, the forward scatter (FSC) is displayed against the side-to-side (SSC).
  • FSC forward scatter
  • lymphocytes are further subdivided into CD45 positive (frame, top) and CD45 negative (frame, bottom) cells by means of a density blot representation (bottom right). Evaluation of the FACS Measurement Part 2.
  • CD45 positive and CD45 negative lymphocytes from part 1 are further subdivided into CD4 positive (the two left squares) and CD8 positive (the two right squares) cells which are plotted against IFNy ( upper four density blots). In the underlying four dot blots, only the positive T cells of the overlying density blots, ie only the cells that are in the yellow frame, are displayed.
  • the two left dot plots again represent CD4 positive T cells, the two right CD8 positive. These cells are further subdivided into four subpopulations based on their expression of the activation marker CD69 and the cytokine IFNy, with the T cells lying in the upper right quadrant (frame) lying as alloreactive T cells.
  • CD45 + CD4 + CD4 T cells of the donor.
  • the events in the upper right quadrant correspond to the donor's alloreactive CD4 T cells, which react against the recipient's cells.
  • CD45-CD4 + CD4 T cells of the recipient.
  • the events in the upper right quadrant correspond to the recipient's alloreactive CD4 T cells, which react against cells of the donor.
  • CD45 + CD8 + CD8 T cells of the donor.
  • the events in the upper right quadrant correspond to the allo-reactive CD8 T cells of the donor, which react against cells of the recipient.
  • CD45-CD8 + CD8 T cells of the recipient.
  • the events in the upper right quadrant correspond to the recipient's alloreactive CD8 T cells, which respond to cells of the donor.
  • FIG. 6 Shown in each case are the y-IFN / CD69 dotplos of the unstained CD8 T
  • Fig. 7 Represented are CD4 T-cells of the cytomegalovirus (CMV) seronegative
  • Subject a and the CMV seropositive subject b The dot plots show the ⁇ -IFN expression of the CD45-proportionally stained (*) or unstained autologous stimulations and the Allo measurements from subjects a and b (from left to right) in Figure (A) after stimulation with a control antigen and in Figure (B) after stimulation with CMV-Ag.
  • Fig. 8 Shown are 590 pairs combinations of 47 subjects, with a
  • the subject is undyed as a "recipient” and the same subject, once in the same pair combination as before, is pre-stained as a "donor” for CD4 (A) and CD8 (B) T cells.
  • Fig. 9 590 independent pairs of 47 subjects were screened for the presence of alloreactive CD4 T cells (A) and alloreactive CD8 T cells (B) in the whole blood assay.
  • the calculated detection limit (NG, dashed line) is 0.0081% for alloreactive CD4 T cells and 0.0145% for alloreactive CD8 T cells.
  • C) Ratio of the different pair combinations of the Allo measurements above and below the detection limit (Fisher's exact Test, p 0.4149). The data are presented as median ⁇ IR.
  • heparinized whole blood was needed by two subjects each ("recipient and donor"). Similar to using isolated PBMC, the donor blood sample was pre-stained with CD45 antibody to later, after collection of donor and recipient blood - be able to differentiate the cells of the two individuals in the flow cytometer.
  • Pretreatment of recipient and donor cells was done in a 15 ml Falcon. Similar to the use of PBMC, the recipient sample remained unstained and was added to the anti-CD45 pre-stained donor sample ( Figure 1). Since pipetting was lost in the pre-treatment wash procedures, 700 ⁇ whole blood was used in the recipient samples, of which 500 ⁇ was added to 500 ⁇ whole blood of the donor. Whole blood falcons were initially weighed and the starting weights noted (6.9 g for the recipient samples and 6.7 g for the donor samples). To stain the donor samples, 5 ⁇ of the CD45 antibody was pipetted directly into each tube, mixed and incubated for 30 min in the dark.
  • both the recipient and the donor samples were washed with 14 ml PBS (centrifugation: 353 g, 10 min).
  • the supernatant was removed and the sample washed with 14 ml of medium (RPMI + 0.5% HSA + 1% P / S) (centrifugation: 353 g, 10 min).
  • the individual washing steps were necessary in order to remove the isoagglutinins (blood group antibodies), which could cause a disturbance of the alloreactivity during the measurement.
  • the 15 ml Falcons were weighed once again and filled up to their original weight with medium. Only then 500 ⁇ of the recipient sample of one batch was transferred to the corresponding donor sample of the same batch. The total amount of cell suspension or whole blood in one batch is now 1 ml (FIG. 1).
  • a mixture of co-stimulatory antibodies (1 ⁇ g / ml anti-CD28 and 1 ⁇ g / ml anti-CD49d) was added. The stimulation mixtures were mixed and then incubated for 2 h in the incubator (37 ° C, 6% C0 2 , with loose screwed lid).
  • FACS staining For flow cytometric staining (FACS staining), in each case 200 ⁇ l of the cell suspension to be analyzed were transferred into FACS tubes and incubated in 2 ml of saponin buffer for 10 min. The incubation was carried out at RT in the dark, since the samples were already pre-stained with a fluorochrome-coupled OberfizzenantiISE that would fade in the light. The cells were permeabilized by the saponin, so that the subsequently added AK could enter the cells. After incubation, the tubes were centrifuged for 10 min at 353 g and then the supernatant was removed. 50 ⁇ AK mixture per sample was added by pipette (see Table 1), mixed and incubated for 30 to 45 min.
  • the cells were washed with 3 ml of FACS buffer to remove free unbound fluorochrome-coupled AK. To centrifugation of the samples at 353 g for 7 min, the supernatant was aspirated and finally the cells were taken up in 400 ⁇ 1% PFA, mixed and analyzed by flow cytometer.
  • Table 1 Composition of the antibody mix for different stains
  • CD69 PerCP 2 CD69 PE 2
  • Flow-activated cell sorting is a laser-assisted method for determining the specific light scattering and fluorescence properties of cells previously labeled with appropriate antibodies.
  • the cell suspension is introduced by overpressure into a measuring cuvette.
  • the cells are strongly accelerated by a surrounding carrier liquid, so that individual cells sequentially pass the laser beam at the analysis point, where they are recorded, analyzed and classified.
  • the size and granularity characteristics of each cell can be displayed in a two-dimensional diagram and used to identify cell subpopulations.
  • individual cells of a population or subpopulation can be more accurately identified and characterized. be siert. This can be done by staining cell-type-specific surface molecules (membrane-bound receptors such as CD3, CD4 or CD8) or after permeabilization of the cell membrane by detecting intracellularly localized antigens.
  • the fluorochromes are excited by the laser and emit the light in the form of longer wavelength photons that can be measured by an optical system. Since different fluorochromes have different characteristic emission wavelengths despite the same excitation wavelength, it is possible to discriminate several differently coupled AKs with one laser and thereby simultaneously investigate different cell properties.
  • the fluorochrome FITC fluorescein isothiocyanate
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • argon laser blue
  • PE phycoerythrin
  • PerCP perCP
  • PE-Cy7 phycoerythrin cyanine 7
  • Allophycocyanin (APC) is excited by a helium-neon laser (red) at 635 nm wavelength. The emission maximum of this dye is 660 nm.
  • a flow cytometer (FACS Canto Tl) and the software program FACS Diva Software Version 6.1.3 were used for measurement and analysis and computerized data processing.
  • the classification of the individual cells was carried out by means of "dot plot” and “density plot” representation of scattered light signals in the forward (FSC) and side scattered light (SSC).
  • CD4 and CD8 T cells were detected by flow cytometry in whole blood as well as in PBMCs per sample and evaluated using a fixed gating strategy. In order to ensure a sufficient number of cells, the aim was to capture as many as 100,000 CD8 T cells per measurement.
  • lymphocytes were divided into CD45 precolored (“donor” or CD45 +) and unstained (“recipient” or CD45) cells, respectively ( Figure 3). These were each further subdivided into CD8 and CD4 positive T cells ( Figure 4).
  • the four cell populations (CD4 + CD45 +, CD4 + CD45-, CD8 + CD45 +, CD8 + CD45-) were divided into four subpopulations based on the expression of the activation marker CD69 and the cytokine IFNy. By dividing into quadrants, the percentage of the respective fluorescence signals in each quadrant could be determined. Alloreactive T cells were defined by coexpression of CD69 and IFNy and thus appeared in the upper right quadrant ( Figures 5 and 6).

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung einer Verträglichkeit zwischen einem Spender und einem Empfänger mittels durchflusszytometrischer Detektion alloreaktiver T-Zellen umfassend die folgenden Schritte: a) Zugabe einer Markierung, zu einer gewonnen Blutprobe aus einem zu analysierenden Spender/Empfänger Paar, im folgenden markierte Probe genannt, wobei die Markierung zur Unterscheidung von einer Probe aus dem Empfänger geeignet ist; die andere aus dem zu analysierenden Spender/Empfänger Paar gewonnene Blutprobe wird im folgenden nichtmarkierte Probe genannt, b) mindestens einmaliges Verdünnen der beiden Proben mit einem ersten Medium, Abtrennung von zellulären Bestandteilen der Proben von der flüssigen Phase, c) jeweilige getrennte Wiederaufnahme der zellulären Bestandteile, insbesondere in gleichem Volumen, des Blutprobenrückstands der markierten Probe Blutprobenrückstands der nicht-markierten Probe in einem zweiten Medium, d) Mischen eines Anteils aus der nicht-markierten Probe und eines Anteil der markierte Probe, insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 1:1, unter Erhalt einer Mischung, e) Stimulation von antigenpräsentierenden Zellen (APC) in der Mischung aus markierter und nicht-markierter Probe gemäß Schritt d) des Anspruchs durch Zugabe von anti-CD28- oder anti-CD28- und anti-CD49d-Antikörpern gefolgt von f) einer ersten Inkubation der Mischung für die Dauer von 1,5h bis 2,5h, vorzugsweise 2h, bei einer Temperatur von 35-39°C, vorzugsweise 37°C, optional unter Schutzgasatmosphäre, CO2-Atmosphäre, g) Zugabe eines Sekretionsinhibitors, h) Durchmischen der Probe aus Schritt d) des Anspruch 1, i) gefolgt von einer zweiten Inkubation für eine Zeitdauer von mindestens 2,5h bei einer Temperatur von 35-39°C, vorzugsweise 37°C, optional unter Schutzgasatmosphäre, CO2 -Atmosphäre, j) gegebenenfalls lysieren von Erythrozyten, k) durchflusszytometrische Erfassung von Lymphozyten mittels der Markierung und durchflusszytometrische Erfassung von CD4 oder CD8 Lymphozyten z. B. durch markierte Anti CD4 und/oder Anti CD8 Antikörper, l) durchflusszytometrische Erfassung von mit einem intrazellulären Zytokin aktivierten Lymphozyten und einen Aktivierungsmarker exprimierenden Lymphocyten, m) wobei eine vorliegende Alloreaktivität zwischen dem Individuum, aus dem die markierte Probe und demjenigen, aus dem die nicht-markierte Probe gewonnen wurde, festgestellt wird, wenn bei der durchflusszytometrischen Erfassung die folgenden Resultate auftreten: a. Markierung pos/ CD4 pos/CD69 pos/INFgamma pos, b. Markierung neg/ CD4 pos/CD69 pos/INFgamma pos, c. Markierung pos/ CD8 pos/CD69 pos/INFgamma pos, d. Markierung neg/ CD8 pos/CD69 pos/INFgamma pos.

Description

Verfahren zur Bestimmung einer Verträglichkeit zwischen einem Spender und einem Empfänger mittels durchflusszytometrischer Detektion alloreaktiver T-
Zellen
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Verträglichkeit zwischen einem Spender und einem Empfänger mittels durchflusszytometrischer Detektion alloreaktiver T-Zellen .
Die zellvermittelte Immunreaktion gegen Spenden von Geweben oder Organen spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der akuten als auch chronischen Transplan- tatabstoßung . Es ist von großer Bedeutung das Risiko einzuschätzen, ob eine Abstoßung der Spende beim Empfänger eintritt.
Urban Sester et al . beschreiben in Transplantation, Vol. 78 (4), 607 614, (2004) eine Methode zur Identifikation von alloreaktiven T-Zellen zur Anwendung in der klinischen Praxis. Nachteilig daran ist die relativ aufwändige Methodik unter Einsatz peripherer mononukleärer Blutzellen.
Es ist daher wünschenswert einen einfacheren Test zur Verfügung zu haben, der eine schnelle und sichere Verträglichkeitsrisikoabschätzung, insbesondere aus dem Vollblut erlaubt.
Die wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung einer Verträglichkeit zwischen einem Spender und einem Empfänger mittels durchflusszytometrischer Detektion alloreaktiver T-Zellen ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte :
a) Zugabe einer Markierung, zu einer gewonnen Blutprobe aus einem zu ana- lysierenden Spender/Empfänger Paar, im folgenden markierte Probe genannt, wobei die Markierung zur Unterscheidung von einer Probe aus dem Empfänger geeignet ist; die andere aus dem zu analysierenden Spender/Empfänger Paar gewonnene Blutprobe wird im folgenden nichtmarkierte Probe genannt,
b) mindestens einmaliges Verdünnen der beiden Proben mit einem ersten Medium, Abtrennung von zellulären Bestandteilen der Proben von der flüssigen Phase,
c) jeweilige getrennte Wiederaufnahme der zellulären Bestandteile, insbesondere in gleichem Volumen, des Blutprobenrückstands der markierten Probe Blutprobenrückstands der nicht-markierten Probe in einem zweiten Medium,
d) Mischen eines Anteils aus der nicht- markierten Probe und eines Anteil der markierte Probe, insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 1, un- ter Erhalt einer Mischung,
e) Stimulation von antigenpräsentierenden Zellen (APC) in der Mischung aus markierter und nicht-markierter Probe gemäß Schritt d) des Anspruchs 1 durch Zugabe von anti-CD28- oder anti-CD28- und anti-CD49d- Antikörpern gefolgt von
f) einer ersten Inkubation der Mischung für die Dauer von 1,5h bis 2,5h, vorzugsweise 2h, bei einer Temperatur von 35-39°C, vorzugsweise 37°C, optional unter Schutzgasatmosphäre, C02-Atmosphäre,
g) Zugabe eines Sekretionsinhibitors,
h) Durchmischen der Probe aus Schritt d) des Anspruch 1,
i) gefolgt von einer zweiten Inkubation für eine Zeitdauer von mindestens 2,5h bei einer Temperatur von 35-39°C, vorzugsweise 37°C, optional unter Schutzgasatmosphäre, C02-Atmosphäre,
j) gegebenenfalls lysieren von Erythrozyten,
k) durchflusszytometrische Erfassung von Lymphozyten mittels der Markie- rung und durchflusszytometrische Erfassung von CD4 oder CD8 Lymphozyten z. B. durch markierte Anti CD4 und/oder Anti CD8 Antikörper,
I) durchflusszytometrische Erfassung von mit einem intrazellulären Zytokin aktivierten Lymphozyten und einen Aktivierungsmarker exprimierenden Lymphocyten,
m) wobei eine vorliegende Alloreaktivität zwischen dem Individuum, aus dem die markierte Probe und demjenigen, aus dem die nicht-markierte Probe gewonnen wurde, festgestellt wird, wenn bei der durchflusszytometrischen Erfassung die folgenden Resultate auftreten :
a. Markierung pos/ CD4 pos/CD69 pos/INFgamma pos,
b. Markierung neg/ CD4 pos/CD69 pos/INFgamma pos,
c. Markierung pos/ CD8 pos/CD69 pos/INFgamma pos,
d. Markierung neg/ CD8 pos/CD69 pos/INFgamma pos.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Probe oder beide Proben aus Vollblut stammen. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Markierung ein markierter CD45 Antikörper, CFDA-SE oder CFSE.
Insbesondere kann das im Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte erste Medium unabhängig vom im Schritt c) des Anspruchs 1 genannten zweiten Mediums sein. Das erste Medium und das zweite Medium können beliebige Zellkulturmedien sein, insbesondere solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, RPMI.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Abtrennung von zellulären Bestandteilen der Proben von der flüssigen Phase mittels Zentrifugation erfolgen.
Typischerweise ist der Sekretionsinhibitor Brefeldin A (BFA) oder Monesin.
In noch einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der vor der durchflusszytometrischen Erfassung zugegebene Zellmembran- permeator ein Saponin, Tween®.
Typischerweise ist das Zytokin im erfindungsgemäßen Verfahren γ-IFN . Als Aktivierungsmarker kann CD69 verwendet werden.
Bei Vorliegen des Resultats Schritt m) Fall a. zeigen sich alloreaktive CD4 T- Zellen des markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den nichtmarkierten Partner aus dem Spender/Empfänger Paar.
Bei Vorliegen des Resultats Schritt m) Fall b. zeigen sich alloreaktive CD4 T- Zel- len des nicht-markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den markierten Partner des Spender/Empfänger Paars.
Bei Vorliegen des Resultats Schritt m) Fall c. zeigen sich alloreaktive CD8 T- Zellen des markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den nichtmarkierten Partner des Spender/Empfänger Paars. Bei Vorliegen des Resultats Schritt m) Fall b. zeigen sich alloreaktive CD8 T- Zellen des nicht-markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den markierten Partner des Spender/Empfänger Paars.
In diesen Fällen besteht jeweils ein erhöhtes Abstoßungsrisiko.
Fig. 1 : Skizzenhafte Darstellung der Vorfärbung und Stimulation im Voll- blut-Assay. Ausgehend von 500 μΙ Vollblut (VB) des Spenders und 700 μΙ Vollblut des Empfängers wird das Ausgangsgewicht des Falcons bestimmt. Anschließend wird zum Spenderblut 5 μΙ CD45-APC Antikörper hinzugefügt und für 30 min im Dunkeln (bei Raumtemperatur) inkubiert. Im nächsten Schritt wird sowohl die Empfänger- als auch die Spenderblutprobe mit 15 ml PBS gewaschen (Zentrifugation bei 353 g für 10 min). Nach Abnahme des Überstandes wird mit 15 ml Medium (RPMI; 1% Gin; 1% P/S; 0,5% HSA) gewaschen. Nach der Zentrifugation (353 g; 10 min) wird der Überstand abgenommen und die Falcons auf ihr Ausgangsgewicht mit Medium aufgefüllt. Dann wird 500 μΙ des Empfängerblutes (ungefärbte Blutprobe) zu dem Spenderblut überpipettiert (~ lml). Zur Stimulation wird ein Gemisch aus anti-CD28 und anti-CD49d hinzupipettiert und für 2 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird BFA zu der Probe hinzugefügt und für 4 h im Brutschrank inkubiert (Gebogene Pfeile hinzugefügt). Es ist jeweils die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der CD45 gefärbten (runde Symbole) und CD45 ungefärbten Zellpopulation (viereckige Symbole) des jeweiligen AK A) CD45-FITC von Sigma (blau), B) CD45-APC von BD (braun) und C) CD45-FITC von BD (grün) in Abhängigkeit der Herstellerkonzentrationen und entsprechenden Verdünnungen (Vi, 1A und Vfe der jeweiligen Konzentration) aufgetragen. Die MFI der gefärbten Zellpopulation steigt mit zunehmender Konzentration an und die der ungefärbten Zellpopulation bleibt auf einem Nullniveau (A) bzw. nimmt leicht zu (B und C). In Abbildung D) ist das Verhältnis der MFI der CD45 positiven zur MFI der CD45 negativen Zellpopulation aufgetragen. Der anti-CD45-FITC von Sigma (blau) zeigt das höchste MFI Verhältnis. Der anti-CD45-APC von BD (braun) zeigt noch ein besseres Verhältnis der MFIs, wie der CD45-FITC von BD (grün). Die roten Kreise stellen, diejenigen Konzentrationen dar, für die sich im weiteren Versuchsablauf entschieden wurde. Auswertung der FACS-Messung Teil 1. Die Auswertstrategie wird bei Vollblutproben und PBMC-Proben im Wesentlichen nach dem gleichen Algorhitmus angewendet. Zunächst wird durch die Darstellung von zwei nicht besetzten Kanälen (V-450 und V-500) gegeneinander (Dotblot oben rechts) unspezifische Events, die in dem Gate P5 dargestellt sind, entfernt. In dem Dotblot darunter wird CD8 gegen CD4 aufgetragen. Hier werden die Zellen, die im Gate P3 liegen, ausgeschnitten. Die Zel- len, die im Gate PI liegen, werden „back gegatet", d.h. in der Dotblot-Darstellung auf der linken Seite (FSC gegen SSC) sind nur Zellen dargestellt, die in dem Gate PI (mittlerer Dotblot, rechte Seite) sichtbar sind. Ein zweites „backgaten" auf die Lymphozyten erfolgt durch das Gate P2 (Densityblot, unten links), bei dem auf eine Population zwischen CD45 positiven und CD45 negativen Zellen gegatet wurde (blaues Gate). Da es sich bei diesen Zellen laut Lokalisation in dem Densityblot (oben links, blau dargestellt) nicht um Lymphozyten handelt, wurde beim Gaten angestrebt diese nicht in die Auswertung mit ein zu beziehen. Bei dem Densityblot (oben links), auf dem die beiden Backgating-Strategien angewandt wurden, wird der Vorwärtsscatter (FSC) gegen den Seitwärtsscatter (SSC) dargestellt. Dadurch kann auf die Lymphozytenpopulation (Rahmen) gegatet werden. Die Lymphozyten werden wiederum mittels einer Densityblotdarstellung (rechts unten) weiter unterteilt in CD45 positive (Rahmen, oben) und CD45 negative (Rahmen, unten) Zellen. Auswertung der FACS-Messung Teil 2. Im nächsten Schritt werden die CD45 positiven und CD45 negativen Lymphozyten aus Teil 1 weiter unterteilt in CD4 positive (die zwei linken Quadrate) und CD8 positive (die zwei rechten Quadrate) Zellen, die gegenüber IFNy aufgetragen werden (obere vier Densityblots). In den darunterliegenden vier Dotblots werden nur die positiven T-Zellen der darüberliegenden Densityblots, also nur die Zellen, die sich in den gelben Rahmen befinden, dargestellt. Hierbei stellen die beiden linken Dotplots wiederum CD4 positive T-Zellen dar, die beiden rechten CD8 positive. Diese Zellen werden im weiterem noch anhand ihrer Expression des Aktivierungsmarkers CD69 und des Zytokins IFNy in vier Subpopulationen unterteilt, wobei im jeweils oberen rechten Quadrant (Rahmen) die als alloreaktiv definierten T-Zellen zu liegen kommen.
CD45+CD4+ : CD4 T Zellen des Spenders. Die events im rechten oberen Quadranten entsprechen den alloreaktiven CD4 T Zellen des Spenders, welche gegen Zellen des Empfängers reagieren. CD45-CD4+ : CD4 T Zellen des Empfängers. Die events im rechten oberen Quadranten entsprechen den alloreaktiven CD4 T Zellen des Empfängers, welche gegen Zellen des Spenders reagieren.
CD45+CD8+ : CD8 T Zellen des Spenders. Die events im rechten oberen Quadranten entsprechen den alloreaktiven CD8 T Zellen des Spenders, welche gegen Zellen des Empfängers reagieren.
CD45-CD8+ : CD8 T Zellen des Empfängers. Die events im rechten oberen Quadranten entsprechen den alloreaktiven CD8 T Zellen des Empfängers, welche gegen Zellen des Spenders reagieren.
Fig. 5 : Dargestellt sind jeweils die IFNg/CD69-Dotplos der ungefärbten CD4 T
Zellen aus vier verschiedenen, parallel durchgeführten Ansätzen (je zwei Alloreaktivitäsproben und die korrespondierenden Autokontrollen). Die Alloreaktivitätsproben sind in der rechten Spalte dargestellt, die korrespondierenden Autokontrollen sind in der linken Spalte dargestellt. Dabei zeigen 0,015% der CD4 T Zellen von Proband A eine Alloreaktivität gegenüber dem Proband B (Autokontrolle abgezogen). Hingegen weisen 0,362% der CD4 T Zellen von Proband B eine Alloreaktivität gegenüber Proband A auf (Autokontrolle abgezogen).
Fig. 6: Dargestellt sind jeweils die y-IFN/CD69-Dotplos der ungefärbten CD8 T
Zellen aus vier verschiedenen, parallel durchgeführten Ansätzen (je zwei Alloreaktivitäsproben und die korrespondierenden Autokontrollen). Die Alloreaktivitätsproben sind in der rechten Spalte dargestellt, die korrespondierenden Autokontrollen sind in der linken Spalte dargestellt. Dabei zeigen 0,277% der CD8 T Zellen von Proband C eine Alloreaktivität gegenüber dem Proband D (Autokontrolle abgezogen). Hingegen weisen 0,018% der CD8 T Zellen von Proband D eine Alloreaktivität gegenüber Proband C auf (Autokontrolle abgezogen).
Fig. 7 : Dargestellt sind CD4 T-Zellen des Cytomegalievirus (CMV)-seronegativen
Proband a und des CMV- seropositiven Proband b. Die Dotplots zeigen die γ-IFN-Expression der CD45- anteilig gefärbten (*) bzw. ungefärbten autologen Stimulationen und der Allo- Messungen aus Proband a und b (von links nach rechts) in Abbildung (A) nach Stimulation mit einem Kontroll-Antigen und in Abbildung (B) nach Stimulation mit CMV- Ag . (A) Nach unspezifischer Stimulation findet keine γ-IFN Expression statt. (B) Nach Stimulation mit CMV-Ag wird nur bei dem CMV-seropositiven Probanden b eine γ-IFN Expression nachgewiesen. Unspezifischer Zelldebris (graues Gate) wurde in der Auswertung nicht berücksichtigt. Die Zellfrequenzen sind in den einzelnen Quadranten in % angegeben.
Basierend auf einem Vorexperiment scheint auch eine Kombination von Blutproben mit verschiedenen Blutgruppen nicht zu einem Verlust an Alloreaktivität oder verfälschten T- Zell Frequenzen zu führen, da sich sowohl bei Kombinationen mit gleichen ABO- Blutgruppen als auch bei Probanden mit unterschiedlichen Blutgruppen alloreaktive T- Zellen nachweisen ließen. Dies weist darauf hin, dass Isoagglutinine im Vollblut-Assay keine Rolle spielen bzw. auch durch die Waschschritte entfernt werden
Fig. 8: Dargestellt sind 590 Paarkombinationen aus 47 Probanden, wobei ein
Proband als„Empfänger" ungefärbt und derselbe Proband, einmal in der gleichen Paarkombination wie zuvor, als„Spender" vorgefärbt für CD4 (A) und CD8 (B) T-Zellen vorliegt. In beiden Abbildungen ist eine signifikante Korrelation zwischen dem Einsetzen des einen Probanden als ungefärbt und des anderen als vorgefärbt zu erkennen (CD4 : Spearman Test, r=0,2576, p<0,0001; CD8: Spearman Test; r=0,4541, p<0,0001).
Fig. 9 : Es wurden 590 unabhängige Paarkombinationen aus 47 Probanden auf das Vorhandensein von alloreaktiven CD4 T-Zellen (A) und alloreaktiven CD8 T-Zellen (B) im Vollblut-Assay überprüft. Dabei liegt die errechnete Nachweisgrenze (NG, gestrichelte Linie) bei 0,0081% für alloreaktive CD4 T-Zellen und bei 0,0145% für alloreaktive CD8 T- Zellen. C) Verhältnis der verschiedenen Paarkombinationen der Allo-Messungen über bzw. unter der Nachweisgrenze (Fishers exact Test, p=0,4149). Die Daten sind dargestellt als Median ± IR.
Zum Nachweis alloreaktiver T-Zellen im Vollblut wurde von jeweils zwei Probanden ("Empfänger und Spender") heparinisiertes Vollblut benötigt. Ähnlich wie bei Verwendung isolierter PBMC wurde die Spenderblutprobe mit CD45 Antikörper vorgefärbt, um später- nach Zusammengabe von Spender- und Empfänger- Blut - die Zellen der beiden Individuen im Durchflusszytometer differenzieren zu können .
Die Vorbehandlung der Zellen von Empfänger und Spender erfolgte jeweils in einem 15 ml Falcon. Ähnlich wie bei der Verwendung von PBMC blieb die Emp- fängerprobe ungefärbt und wurde zu der mit anti-CD45 vorgefärbten Spenderprobe hinzugefügt ( Fig . 1 ). Da bei den Wasch Prozeduren der Vorbehandlungen ein Pipettierverlust aufgetreten war, wurden bei den Empfängerproben 700 μΙ Vollblut verwendet, wovon 500 μΙ zu 500 μΙ Vollblut des Spenders hinzugefugt wurden. Die Falcons mit Vollblut wurden initial gewogen und das jeweilige Ausgangsgewicht (6,9 g bei den Empfängerproben und 6,7 g bei den Spenderproben) notiert. Zur Färbung der Spenderproben wurde direkt in jedes Tube 5 μΙ des CD45 Antikörpers hinzupipettiert, durchmischt und für 30 min im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden sowohl die Empfänger- als auch die Spenderproben mit je 14 ml PBS gewaschen (Zentrifugation : 353 g; 10 min). Der Überstand wurde abgenommen und die Probe mit 14 ml Medium ( RPMI + 0,5% HSA + 1% P/S) gewaschen (Zentrifugation : 353 g ; 10 min).
Die einzelnen Waschschritte waren notwendig um die Isoagglutinine (Blutgruppenantikörper) zu entfernen, die bei der Messung eine Störung der Alloreaktivität bewirken könnten. Nach dem vorsichtigen Entfernen des Überstandes wurden die 15 ml Falcons noch einmal gewogen und auf ihr Ausgangsgewicht mit Medium aufgefüllt. Erst danach wurden 500 μΙ der Empfängerprobe eines Ansatzes zu der entsprechenden Spenderprobe des gleichen Ansatzes überführt. Die Gesamtmenge an Zellsuspension bzw. Vollblut in einem Ansatz beträgt nun 1 ml (Fig. 1). Zu jedem Stimulationsansatz wurde ein Gemisch kostimulatorisch wirkender Antikörper ( 1 μg/ml anti-CD28 und 1 μg/ml anti-CD49d) hinzugefügt. Die Stimulationsansätze wurden durchmischt und anschließend für 2 h im Brutschrank (37°C, 6% C02, mit lose angeschraubtem Deckel) inkubiert.
Dann wurde 10 μg/ml Brefeldin A hinzugefügt, durchmischt und für weitere vier Stunden im Brutschrank inkubiert (37°C, 6% C02, mit lose angeschraubtem Deckel) . Im Anschluss erfolgte die Fixierung der Vollblutansätze.
Bei ausgewählten Experimenten, die zur Methodencharakterisierung und - etablierung beitrugen, wurde zusätzlich zur Alloreaktion eine Stimulation mit Kontroll-(Ko)-, CMV- Antigenen jeweils 32 μ/ml) oder mit Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB, 2,5 pg/ml) durchgeführt. Diese wurden nach Zugabe der kostimulatorisch wirkenden Antikörper hinzugefügt und im Weiteren erfolgte, wie oben bereits beschrieben, eine zweistündige Inkubation im Brutschrank, mit darauffolgender BFA-Zugabe und weiteren 4 h Inkubation im Brutschrank. Bei Sti- mulation mit CMV zeigt ein Proband eine entsprechende Immunreaktion, falls er zuvor Kontakt mit CMV hatte und infolgedessen eme spezifische T-Zell- Immunantwort ausgebildet hat. Die Stimulation mit Kontrollantigen diente als Negativ-, die mit SEB als Positivkontrolle. Bei SEB handelt es sich um ein Superantigen, das bereits bei geringer Konzentration zu einer starken Stimulation führt. Dabei werden die T-Zellen unabhängig von ihrer Antigenspezifität stimuliert. Durch die Positivkontrolle wurde überprüft, ob die Stimulationsbedingungen korrekt sind bzw. ob die T-Zellen eines Probanden grundsätzlich stimuliert werden konnten.
Zur Fixierung der Vollblutansätze wurden zunächst 2 mM EDTA, welches den Zell-Zell-Kontakt löst, zugegeben und die Röhrchen jeweils 10 s auf einem Schüttelmixer durchmischt Nach 15 min Inkubation bei RT im Dunkeln wurden 9 ml Lysingsolution pro ml Vollblut zur Erythrozytenlyse und zur Fixierung der Leukozyten hinzugefügt und nach weiteren 10 min Inkubation (im Dunkeln, bei RT) und anschließender Zentrifugation ( 10 min bei 353 g) wurde der Überstand ab- gesaugt und die Zellen in 2 ml FACS-Puffer resuspendiert. Es erfolgte ein zweiter Zentrifugationsscbritt ( 10 min bei 353 g) und ein anschließendes Abnehmen des Überstandes. Dann wurde das Pellet in 400 μΙ/Probe FACS-Puffer aufgenommen. Im Anschluss wurden die Zellen entweder direkt gefärbt oder über Nacht bei 4°C Im Kühlschrank aufbewahrt.
Zur durchflusszytometrischen Färbung (FACS-Färbung) wurden jeweils 200 μΙ der zu analysierenden Zellsuspension in FACS-Röbrchen überführt und in 2 ml Saponinpuffer für 10 min inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei RT im Dunkeln, da die Proben bereits mit einem Fluorochrom-gekoppelten Oberfiächenantikörper vorfärbt waren, der im Licht ausbleichen würde. Durch das Saponin wurden die Zellen permeabilisiert, so dass die im Folgenden zugegebenen AK in die Zellen gelangen konnten. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen für 10 min bei 353 g zentrifugiert und anschließend der Überstand entfernt. Es wurde 50 μΙ AK- Mischung pro Probe hinzupipettiert (siehe Tabelle 1 ), durchmischt und für 30 bis 45 min inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer gewa- sehen, um freie nicht gebundene Fluorochrom-gekoppelte AK zu entfernen. Nach der Zentrifugation der Proben bei 353 g für 7 min wurde der Überstand abgesaugt und schließlich die Zellen in 400 μΙ 1% PFA aufgenommen, durchmischt und im Durchflusszytometer analysiert.
Tabelle 1 : Zusammensetzung des Antikörper-mixes für verschiedene Färbungen
Färbung 1 Färbung 2
Antikörper Konjugat Menge [μΐ] Antikörper Konjugat Menge [μΐ]
CD8 APC 0,5 CD 8 PerCP 4
CD4 PE-Cy7 0,5 CD4 PE-Cy7 0,5
CD69 PerCP 2 CD69 PE 2
IFNy PE 0,3 IFNy FITC 0,5
SAP 5% 1 SAP 5% 1
FACS-Puffer 45,7 FACS-Puffer 42
Summe 50 Summe 50
Die Durchflusszytometrie (FACS, fluorescence activated cell sorting) ist eine lasergestützte Methode zur Bestimmung der spezifischen Lichtstreuungs- und Fluoreszenzeigenschaften von Zellen, die zuvor mit geeigneten Antikörpern markiert wurden.
Über eine Kapillare wird die Zellsuspension durch Überdruck in eine Messküvette eingebracht. Durch hydrodynamische Fokussierung werden die Zellen, durch eine sie umgebende Trägerflüssigkeit, stark beschleunigt, so dass einzelne Zellen se- quenziell am Analysepunkt den Laserstrahl passieren, wo diese erfasst, analysiert und klassifiziert werden . Wenn eine Zelle mit Laserlicht interagiert, kommt es zu einer Für eine Zellpopulation typischen Beugung oder Streuung des Lichtstrahls, die von Fotodetektoren erfasst wird. Das sogenannte Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter) liefert dabei Informationen über die Größe der Zellen und wird durch Beugung des Lichtes hervorgerufen. Das Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter) vermittelt Informationen über Granularität der Zellen und wird durch Brechung des Lichtes hervorgerufen. Die so ermittelten Größen- und Granularitätseigenschaften jeder Zelle können in einem zweidimensionalen Diagramm wiedergegeben werden und dienen der Identifizierung von Zellsubpopulationen.
Durch zusätzlich mit einem Fluorochrom gekoppelte Antikörper können einzelne Zellen einer Population oder Subpopulation genauer identifiziert und charakteri- siert werden. Dies kann über Anfärben Zelltyp-spezifischer Oberflächenmoleküle (membranständige Rezeptoren wie zum Beispiel CD3, CD4 oder CD8) oder aber nach Permeabilisierung der Zellmembran durch Detektion intrazellulär lokalisierter Antigene erfolgen, Die Fluorochrome werden durch den Laser angeregt und emittieren das Licht in Form von Photonen längerer Wellenlänge, die durch ein optisches System gemessen werden können. Da verschiedene Fluorochrome trotz gleicher Anregungswellenlänge unterschiedliche charakteristische Emissionswellenlängen besitzen, ist es möglich, mit einem Laser mehrere verschieden gekoppelte AK zu diskriminieren und dadurch simultan unterschiedliche Zellei- genschaften zu untersuchen.
Es wurde unter anderem das Fluorochrom FITC (Fiuoresceinisothiocyanat) verwendet, das, angeregt durch einen Argon-Laser (blau) im Wellenlängenbereich von 488 nm, Fluoreszenzen von maximal 520 nm emittiert. Ebenso wurden Phycoerythrin (PE) mit einer maximalen Emission von 576 nm verwendet. PerCP (Peridinin Chlorophyll Proteinkomplex) wird bei 678 nm sichtbar und PE-Cy7 (Phycoerythrin-Cyanin 7) bei 785 nm. Allophycocyanin (APC) hingegen wird durch einen Helium-Neon-Laser (rot) bei 635 nm Wellenlänge angeregt. Das Emissionsmaximum dieses Farbstoffs liegt bei 660 nm.
Für die Messung und Analyse und zur computergestützten Datenverarbeitung wurde ein Durchflusszytometer (FACS Canto Tl) und das Softwareprogramm FACS Diva Software Version 6.1.3 verwendet. Die Klassifizierung der einzelnen Zellen erfolgte mütels "Dotplot"- und " Density plot"- Darstellung von Streulichtsignalen im Vorwärts- (FSC) und Seitwärtsstreulicht (SSC). Dabei wurden sowohl im Vollblut, als auch bei den PBMCs pro Probe CD4 und CD8 T-Zellen durchflusszytometrisch erfasst und mittels einer festgelegten Gating-Strategie ausgewertet. Um eine ausreichende Zellzahl zu gewährleisten wurde angestrebt möglichst 100.000 CD8 T-Zellen pro Messung zu erfassen.
Demzufolge wurden zunächst alle Zellen nach ihrer Granularität (SSC) und ihrer Größe (FSC) graphisch dargestellt und die Lymphozytenregion eingegrenzt ("gegatet"). Ein Punkt entspricht in der "Dotplot"- Darstellung einer einzelnen Zelle bzw. die Dichtegradienten in der "Densityplot"- Darstellung der Häufigkeit von Zellen einer bestimmten Eigenschaft. Im Folgenden wurden die Lymphozyten in CD45 vorgefärbte ("Spender" bzw. CD45+) und ungefärbte ("Empfänger" bzw. CD45-) Zellen eingeteilt ( Fig . 3) . Diese wurden jeweils weiter in CD8 und CD4 positive T-Zellen unterteilt (Fig. 4) . Zur weiteren Erfassung funktioneller Eigen- Schäften wurden die vier Zellpopulationen (CD4+CD45+; CD4+CD45-; CD8+CD45+; CD8+CD45-) noch anhand der Expression des Aktivierungsmar- kers CD69 und des Zytokins IFNy in jeweils vier Subpopulationen unterteilt. Durch die Unterteilung in Quadranten konnte der prozentuale Anteil der jeweiligen Fluoreszenzsignale in den einzelnen Quadranten ermittelt werden. Alloreaktive T- Zellen wurden definiert durch Koexpression von CD69 und IFNy und erschienen demzufolge im oberen rechten Quadranten (Fig. 5 und Fig . 6).
Die statistische Analyse in dieser Arbeit erfolgte mit Hilfe des GraphPad Prism- Programms. Der nicht parametrische Mann-Withney-Test wurde verwendet wenn kontinuierliche Variablen zweier Gruppen miteinander verglichen wurden. Für entsprechende Analysen von mehr als zwei Gruppen wurde der Kruskal-Wallis Test verwendet und falls eine Signifikanz auftrat, wurden die einzelnen Kollektive untereinander mittels des Dunn's Multiple Comparison Test vergleichen. Die Abhängigkeit Für zwei oder mehr kategorieller Variablen wurde mittels des Fisher 's exact Test bzw. Chi- Quadrat Test ermittelt. Für Korrelationsanalysen wurde der Spearman Test verwendet. Alle p-Werte unter 0,05 werden als signifikant angesehen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung einer Verträglichkeit zwischen einem Spender und einem Empfänger mittels durchflusszytometrischer Detektion alloreaktiver T-Zellen umfassend die folgenden Schritte :
a) Zugabe einer Markierung, zu einer gewonnen Blutprobe aus einem zu analysierenden Spender/Empfänger Paar, im folgenden markierte Probe genannt, wobei die Markierung zur Unterscheidung von einer Probe aus dem Empfänger geeignet ist; die andere aus dem zu analysierenden Spender/Empfänger Paar gewonnene Blutprobe wird im folgenden nichtmarkierte Probe genannt,
b) mindestens einmaliges Verdünnen der beiden Proben mit einem ersten Medium, Abtrennung von zellulären Bestandteilen der Proben von der flüssigen Phase,
c) jeweilige getrennte Wiederaufnahme der zellulären Bestandteile, insbesondere in gleichem Volumen, des Blutprobenrückstands der markierten Probe Blutprobenrückstands der nicht-markierten Probe in einem zweiten Medium, d) Mischen eines Anteils aus der nicht- markierten Probe und eines Anteil der markierte Probe, insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 1, unter Erhalt einer Mischung,
e) Stimulation von antigenpräsentierenden Zellen (APC) in der Mischung aus markierter und nicht-markierter Probe gemäß Schritt d) des Anspruchs 1 durch Zugabe von anti-CD28- oder anti-CD28- und anti-CD49d-Antikörpern gefolgt von
f) einer ersten Inkubation der Mischung für die Dauer von 1,5h bis 2,5h, vorzugsweise 2h, bei einer Temperatur von 35-39°C, vorzugsweise 37°C, optional unter Schutzgasatmosphäre, C02-Atmosphäre,
g) Zugabe eines Sekretionsinhibitors,
h) Durchmischen der Probe aus Schritt d) des Anspruch 1,
i) gefolgt von einer zweiten Inkubation für eine Zeitdauer von mindestens 2,5h bei einer Temperatur von 35-39°C, vorzugsweise 37°C, optional unter Schutzgasatmosphäre, C02- Atmosphäre,
j) gebebenenfalls lysieren von Erythrozyten, k) durchflusszytometrische Erfassung von Lymphozyten mittels der Markierung und durchflusszytometrische Erfassung von CD4 oder CD8 Lymphozyten z.
B. durch markierte Anti CD4 und/oder Anti CD8 Antikörper,
I) durchflusszytometrische Erfassung von mit einem intrazellulären Zytokin aktivierten Lymphozyten und einen Aktivierungsmarker exprimierenden
Lymphocyten,
m) wobei eine vorliegende Alloreaktivität zwischen dem Individuum, aus dem die markierte Probe und demjenigen, aus dem die nicht-markierte Probe gewonnen wurde, festgestellt wird, wenn bei der durchflusszytometrischen Erfassung die folgenden Resultate auftreten :
a. Markierung pos/ CD4 pos/CD69 pos/INFgamma pos,
b. Markierung neg/ CD4 pos/CD69 pos/INFgamma pos,
c. Markierung pos/ CD8 pos/CD69 pos/INFgamma pos,
d . Markierung neg/ CD8 pos/CD69 pos/INFgamma pos.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung ein markierter CD45 Antikörper, CFD-SE oder CFSE ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das im Schritt b) des Anspruchs 1 genannte erste Medium unabhängig vom im Schritt c) des Anspruchs 1 genannten zweiten Mediums ist und das erste Medium und das zweite Medium ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, RPMI.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Abtrennung von zellulären Bestandteilen der Proben von der flüssigen Phase mittels Zentrifugation erfolgt.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Sekretionsinhibitor Brefeldin A ,(BFA) oder Monesin ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der vor der durchflusszytometrischen Erfassung zugegebene Zellmembranpermeator ein Saponin ist.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Zytokin γ-IFN ist.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Aktivierungsmarker CD69 ist.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Anspruch 1 Fall a. alloreaktive CD4 T- Zellen des markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den nicht- markierten Partner aus dem Spender/Empfänger Paar anzeigt.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Anspruch 1 Fall b. alloreaktive CD4 T- Zellen des nicht-markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den markierten Partner des Spender/Empfänger Paars anzeigt.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Anspruch 1 Fall c. alloreaktive CD8 T- Zellen des markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den nicht- markierten Partner des Spender/Empfänger Paars anzeigt.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Anspruch 1 Fall d. alloreaktive CD8 T- Zellen des nicht-markierten Partners des Spender/Empfänger Paars gegen den markierten Partner des Spender/Empfänger Paars anzeigt.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei wobei die Spender- und Empfängerblutproben aus Vollblut stammen.
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