WO2014080060A1 - Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer - Google Patents

Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer Download PDF

Info

Publication number
WO2014080060A1
WO2014080060A1 PCT/ES2013/070808 ES2013070808W WO2014080060A1 WO 2014080060 A1 WO2014080060 A1 WO 2014080060A1 ES 2013070808 W ES2013070808 W ES 2013070808W WO 2014080060 A1 WO2014080060 A1 WO 2014080060A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chemotherapy
genes
response
kit
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2013/070808
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Laura VERA RAMÍREZ
Pedro SÁNCHEZ ROVIRA
César Luis RAMÍREZ TORTOSA
José Luis QUILES MORALES
María del Carmen RAMÍREZ TORTOSA
José Antonio LORENTE ACOSTA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fundacion Publica Andaluza Para La Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental Alejandro Otero (fibao)
Universidad de Granada
Servicio Andaluz de Salud
Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Original Assignee
Fundacion Publica Andaluza Para La Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental Alejandro Otero (fibao)
Universidad de Granada
Servicio Andaluz de Salud
Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundacion Publica Andaluza Para La Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental Alejandro Otero (fibao), Universidad de Granada, Servicio Andaluz de Salud, Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud filed Critical Fundacion Publica Andaluza Para La Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental Alejandro Otero (fibao)
Publication of WO2014080060A1 publication Critical patent/WO2014080060A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention is within the field of biomedicine and medical diagnosis and prognosis, more specifically in the field of cancer prognosis, in particular, breast cancer.
  • the invention relates to a method of obtaining useful data to predict the response to the treatment of breast cancer, as well as to evaluate the response to the treatment of said disease, which allows the establishment of an individual pattern of recognition (qualitative). and quantitative) specific, which is modified after treatment, allowing the establishment of patient groups.
  • Cancer is a disease characterized by uncontrolled cell growth, as it increases its proliferation and / or processes of cell death or apoptosis are inhibited; and subsequently, by the acquisition of invasive and metastatic capacity that allows cells to colonize and proliferate in other tissues.
  • the tumor cells acquire the ability to degrade the ECM (extracellular matrix) and invade the tissues and finally the blood or lymphatic vessels.
  • ECM extracellular matrix
  • This invasive process involves an interactive series of events. between malignant cells and many components of the MEC. Subsequently, circulating cells can leave the vessels and colonize other organs, what we know as metastases.
  • breast cancer treatment has undergone significant changes characterized by less aggressive strategies for both diagnosis and treatment. Mammography and ultrasound or stereotactic biopsies have replaced surgical biopsy, and in many cases, conservative surgery of the breast and sentinel lymph node biopsy have successfully replaced the more aggressive radical mastectomy and axillary lymph node dissection .
  • the authors of the present invention have detected a series of genes that act as biomarkers for predicting the response to breast cancer treatment. They have developed a method of obtaining useful data for the prediction of response to treatment in breast cancer, as well as for monitoring the response to treatment of said disease, allowing the establishment of groups of patients.
  • a first aspect of the invention relates to the use of at least one gene that is selected from the list consisting of AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6 , HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 or any of their combinations to predict Response to chemotherapy treatment in individuals diagnosed with breast cancer.
  • Another aspect of the invention relates to the simultaneous use of the genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OG, 1 PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and ZFHX4 to predict or predict the response to chemotherapy treatment in individuals diagnosed with breast cancer
  • the independent use of any of them or any of their combinations could be sufficient for the prediction of response or follow-up of said disease.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict the response to chemotherapy treatment in individuals diagnosed with breast cancer, hereinafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining a isolated biological sample comprising cells of an individual diagnosed with breast cancer, and
  • the first method of the invention further comprises: c) Comparing the expression levels of the AP1M2, CCDC80, CDC42 genes,
  • Another aspect of the invention relates to a method of predicting or predicting the response to chemotherapy treatment in individuals diagnosed with breast cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) - (c) of the first method of the invention, and further comprises including the individual in the positive response group (GR) when the expression levels of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6 genes, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 respectively expressed in comparison respectively a reference sample (sample from a patient who registered a good response to chemotherapy, GR-good respond).
  • GR positive response group
  • steps (b) and / or (c) of the methods described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the quantity in step (b) or the computerized comparison in step (c).
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample comprises biopsy cells. More preferably, the biological sample is a recent tissue, paraffin embedded tissue or RNA extracted from a tissue of a breast cancer patient.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is obtained from breast tissue.
  • Another aspect of the invention relates to a method for predicting or forecasting the response to chemotherapy treatment in individuals diagnosed with breast cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) - (c) according to The first method of the invention, and further comprises including the individual in the group of bad response or negative response (BR-bad responding) when the expression of AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN genes 1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN or ZAKX on ZAK4 on ZAK4 on ZAK4 comparison with a reference sample (sample from a patient who registered a good response to chemotherapy, GR-good respond).
  • a reference sample sample from a patient who registered
  • overexpression is defined as an expression level greater than or equal to 3.16 times the maximum score achieved by each of the genes in tumor breast biopsies of patients responding to the treatment (sample of reference) before chemotherapy.
  • overexpression is defined as a level of expression greater than or equal to the maximum score achieved in tumor breast biopsies of patients responding to the treatment (positive control) as defined in Table 1.
  • FC fold change
  • FDR false discovery rate
  • the detection of the amount of the gene expression product can be performed by any means known in the state of the art.
  • the authors of the present invention have shown that the detection of the quantity or concentration of these expression products in a semi-quantitative or quantitative manner allows differentiating between the patient with breast cancer responding to the treatment of a non-respondent.
  • the amount of gene expression product detected at different stages of the disease could establish a differential diagnosis in individuals affected by breast cancer, which allows them to subclassify them.
  • the measurement of the amount or concentration preferably semiquantitatively or quantitatively, can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of the gene expression product, based on a signal that is obtained directly from the transcripts of said genes, or from the proteins to which they are translated, and which is directly correlated with the number of molecules of RNA or protein produced by genes.
  • Said signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tags” or enzymatic reaction products).
  • quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of gene expression products, as well as any other value or parameter related thereto or that can be derived from these.
  • Said values or parameters comprise signal intensity values obtained from any of the physical or chemical properties of said expression products obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • comparison refers to, but is not limited to, the comparison of the amount of expression products of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN genes.
  • Gene expression profile means the gene profile obtained after quantification of the mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12 , ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4, in an isolated biological sample.
  • the expression profile of the genes is preferably performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA present in the isolated biological sample, which can be performed by protocols known in the state of the art.
  • the determination of the level of mRNA derived from the transcription of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIPG, NDFIPG , PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4, can be performed, for example, but not limited to, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), back transcription combination with polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative RT-PCR, back transcription in combination with ligase chain reaction (RT-LCR), or any
  • the gene expression profile could also be obtained by the detection and / or quantification of the proteins resulting from the translation of the mRNA derived from the transcription of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1 genes , GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 but not limited, for example Western blot immunodetection.
  • Quantitative detection of the expression of AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDG, PDG, PDG PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 can be performed more preferably by real-time PCR (RT-PCR or RTqPCR). Real-time detection of amplified products can be carried out through the use of molecules fluorescents that are embedded in the double stranded DNA or by hybridization with different types of probes.
  • the detection of the amount of expression product is performed by: a.
  • a genetic profile procedure such as a microarray, and / or b.
  • a microarray method comprising the isolation of RNA and / or
  • a method comprising PCR, such as a real-time PCR, and / or
  • the detection of the expression product of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIPG, OGN, PDGF , PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 is performed by quantitative real-time PCR.
  • the detection of the expression product of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3 genes , NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 are performed using microarrays.
  • the detection of the expression product of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3 genes , NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 is performed by a massive gene sequencing procedure.
  • the procedure is carried out in vitro using a sample originating from the human subject, where said sample is obtained after chemotherapy treatment and the reference sample is taken before chemotherapy treatment.
  • Another aspect of the invention relates to a method for monitoring the evolution of breast cancer in an individual, hereinafter third method of the invention, which comprises performing at least twice the sequence of steps (a) - ( b) according to the first or second method of the invention, in biological samples from the same individual, and isolated at different times.
  • the standard chemotherapy treatment comprises the administration of anthracyclines and taxanes.
  • other subclassifications could be established within this principal, thus facilitating the choice and establishment of appropriate therapeutic regimens.
  • This discrimination is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly. The amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools, for example, but not limited, by determining confidence intervals, determining the significance value P, Student test or discriminant functions. Fisher, non-parametric measurements of Mann Whitney, Spearman correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC curve (AUC).
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially by at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 80%, or even much more preferably at least 90%. of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • the reference amount is obtained from the constitutive expression values of the genes, in a group of individuals before being subjected to treatment.
  • the reference amount will be, for example, in the case of differentiation between patients affected by breast cancer responders to the treatment of non-responders, the constitutive expression of the gene in a control group of responding individuals.
  • the control group will consist of a group of patients with breast cancer who did not respond to treatment.
  • the reference samples are obtained in tumor breast biopsies of patients responding to the treatment (reference sample) before chemotherapy.
  • the sample or reference samples can be, for example, obtained from the biopsy cells of a patient with breast cancer, in a certain clinical phase.
  • the reference amount is obtained from a reference sample.
  • the reference amount can also be obtained, for example, from the limits of normal distribution of an amount found in samples obtained from a population of individuals with breast cancer at different stages, and from responding and non-responding patients, by well-known statistical techniques .
  • the reference sample is obtained from patients before and after treatment.
  • the expression levels of one or more of these genes may be indicative of a lack of response, or of a subject's response to treatment.
  • the response is established based on histopathological parameters, fundamentally based on the percentage reduction in the number of tumor cells after chemotherapy.
  • the response is the absence of change in the histopathological characteristics and cellularity of the tumor.
  • the response is a clinical outcome, such as progression-free survival or overall survival.
  • the biological sample is a recent tissue, which is embedded in paraffin or from which the RNA is attracted. Recent tissue is obtained during diagnosis and / or surgical remains that are obtained after mastectomies or surgical resection.
  • the evaluation of the complete response and / or the partial response is an important factor in determining the status of an individual patient. In this way, it is necessary to estimate the total tumor load at the initial value and use it as a comparator for the subsequent measurements that are carried out according to the Miller and Payne gradation system (Ogston et al., Breast 2003 Oct; 12 (5): 320-7), which resulted in a good response group -GR (Miller & Payne grades 4 and 5) -, a medium response group -MR- (Miller & Payne grade 3) - and a bad response group -BR (Miller & Payne grades 1 and 2) -.
  • GR Miller et al., Breast 2003 Oct; 12 (5): 320-7
  • Another aspect of the invention relates to a method for assigning an individual suffering from breast cancer to one of two groups, in which group 1 comprises individuals who develop chemotherapy resistance identifiable by the above method, characterized by presenting an amount of expression product greater than the reference amount; and in which group 2 represents the rest of the subjects.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a modulating agent of at least one of the genes that are selected from AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6 , HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4, to be developed by a group 1 individual Chemotherapy resistance, as defined in the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to an antibody for treating a group 1 individual who develops resistance to chemotherapy, identifiable by a method of the invention, wherein the antibody is selected from among anti-AP1 M2, anti-CCDC80, anti- CDC42, anti-COL1A1, anti-CTNNB1, anti-CXCL12, anti-ELN, anti-FBLNI, anti-FLRT2, anti-FLT1, anti-GAS6, anti-HIF1A, anti-HMCN1, anti-KIT, anti-MAPK1, anti- NAP1 L3, anti-NDFIP1, anti-OGN, anti-PDGFD, anti-PER1, anti-PRKG1, anti-RASGRF2, anti-SFRP4, anti-SMAD9, anti-SOCS5, anti-SPARC, anti-SPON1, anti-SSPN , anti-ZAK and / or anti-ZFHX4.
  • the antibody is selected from among anti-AP1 M2, anti-CCDC80, anti- CDC42, anti-COL1A1, anti-CTNNB1, anti-CX
  • kit or device of the invention comprising the elements necessary to analyze the amount of the expression product of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1 genes , CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARCN1, SPARCN1, SPARCN1, SPARCN1, SPARCN1 or ZFHX4.
  • the kit may include a sample or reference that is a breast biopsy sample of a patient responding to the treatment that is obtained before treatment.
  • Said kit may contain all those reagents necessary to analyze the amount of the expression product of the AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1 genes. NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK and / or ZFHX4 by any of the methods described earlier in this document.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • kits or devices of the invention for obtaining useful data for predicting the response to treatment and / or monitoring of breast cancer.
  • the kit can contain all the reagents and elements necessary to analyze the expression of the target genes, as well as the tools necessary to establish a useful clinical prediction, for example, a mathematical algorithm that integrates clinical information and gene information to establish the prediction of a patient's response to treatment or detect the development of chemoresistance throughout the treatment.
  • AP1 M2 (NM_005498) encodes a subunit of heterotetrameric adapter-related protein comlex 1 (AP-1), which belongs to the family of adapter complexes medium subunits and is capable of interacting with tyrosine-based classification signals.
  • AP1 M2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 1.
  • CCDC80 (NM_199512.1) whose decrease in expression is regulated by oncogenic protein 1 and whose increase is regulated in homologous mice deficient in BRS-3.
  • CCDC80 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 2.
  • CDC42 or "cell division cycle 42" encodes a small GTPase of the Rho subfamily, which regulates transductional signaling that controls various cellular functions including cell morphology, endocytosis and cell cycle progression.
  • This protein is very similar to Saccharomyces cerevisiae Cdc 42, and is capable of complementing the yeast mutant cdc42-1 and it is believed that it could regulate actin polymerization by binding to the N-WASP protein.
  • CDC42 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 3.
  • COL1A1 (NM_000088.3) encodes the major component of type one collagen, the fibrillar collagen found in most connective tissues, including cartilage as well as bone, cornea or tendom. Mutations in this gene are associated with osteogenesis imperfecta type l-IV or osteoporosis among others.
  • COL1A1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 4.
  • CTNNB1 (NM_001098209.1) encodes a protein that is part of the group of proteins that encode the junctions of cadherins, which are necessary for the maintenance of epithelial cell layers by regulating cell growth and adhesion between cells. Mutations in this gene cause colorectal cancer, pilomatrixoma, medulloblastoma and ovarian cancer.
  • CTNNB1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 5.
  • CXCL12 (NM_000609.5) is a gene that encodes an alpha chemokine derived from stromal cells that belongs to the intercrine family.
  • CXCL12 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 6.
  • ELN (NM_000501.2) encodes a protein that is one of the two components in elastic fibers. Mutations of this gene are also related to aortic supravalvular stenosis (SVAS) and autosomal dominant cutis laxa.
  • ELN is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 7.
  • FBLN 1 (NM_001996.3) encodes a protein that is incorporated into the fibrillar extracellular matrix. Calcium binding could mediate its binding with laminin and entactin that are part of the basal laminae. This protein also mediates platelet adhesion through its binding with fibrinogen.
  • FBLN1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 8.
  • FLRT2 (NM_013231.4) encodes a member of the transmembrane protein family rich in fibronectin and leucine, which are related to cell adhesion and receptor signaling.
  • FLRT2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 9.
  • FLT1 (NM_001 159920.1) codes for a member of the family of vascular endothelial growth factor (VEGFR) receptors. This protein binds to VEGFR-A and VEGFR-B and to placental growth factors and has an important role in angiogenesis and vasculogenesis.
  • FLT1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 10.
  • GAS6 (NM_000820.2) encodes the protein containing gamma carboxyglutamic acid that is believed to be involved in stimulating cell proliferation and may have a role in thrombosis.
  • GAS6 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 1 1.
  • HI F1A (NM_001243084.1) is a gene that codes for hypoxia-inducible transcription factor H IF1, which is composed of an alpha and beta subunit. HIF1 regulates the cellular and homeostatic response to hypoxia by activating many genes involved in energy metabolism, angiogenesis, apoptosis etc, and also has an important role in vascularization.
  • HIF1A is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 12.
  • HMCN1 (NM_031935.2), which encodes a large extracellular member of the immunoglobulin family. Mutations of this gene are related to macular degeneration that occurs at advanced ages.
  • HMCN1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 13.
  • KIT (NM_000222.2) encodes the transmembrane receptor protein type 3 of mast cell growth factors (FGM). Mutations in this gene are associated with gastrointestinal stromal tumors, mast cell diseases, acute myelogenous leukemia and piebaldism.
  • KIT is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 14.
  • MAPK1 (NM_002745.4) encodes a member protein of the MAP kinase family. This family acts as a point of integration to various biochemical signals and is involved in a wide variety of cellular processes such as proliferation, differentiation, transcription regulation, and development.
  • MAPK1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 15.
  • NAP1 L3 (NM_004538.5) encodes a protein that is a member of the family of nucleosome assembly proteins and is linked to a region of genes that is responsible for several X-fragile mental retardation syndromes.
  • NAP1 L3 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 16.
  • NDFIP1 (NM_030571.3), which encodes a protein that belongs to a small group of conserved proteins in evolution with three transmembrane domains. This protein is also a target of the Nedd4 family of proteins and is also thought to be part of the family of integral Golgi membrane proteins.
  • NDFI P1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 17.
  • OGN (NM_014057.3) encodes a protein that induces ectopic bone formation and studies have been found that relate the expression of this gene in the cochlea and the auditory phenotype of OGN-deficient mice.
  • OGN is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 18.
  • PDGFD (NM_025208.4) encodes a protein that is a member of the family of platelet-derived growth factors, which are mitogenic factors for cells of mesenchymal origin.
  • PDGFD is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 19.
  • PER1 (NM_002616.2) is a gene of the PER gene family that is expressed in a pattern circadian in the suprachiasmatic nucleus, which is the primary center of regulation of circadian rhythms in the brain in mammals.
  • PER1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 20.
  • PRKG1 (NM_001098512.2) encodes PRKG I alpha and I beta isoforms that act as mediators of oxide / cGMP transductional signaling and are important components for many such processes in many cell types.
  • PRKG1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 21.
  • RASGRF2 (NM_006909.2) that belongs to the RASGTP family that are GDP / GTP exchange factors for the Ras GTPases family that perform functions in the development of T lymphocytes.
  • RASGRF2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 22.
  • SFRP4 (NM_003014.3) is a member gene of the SPRF family that contains a cysteine-rich domain homologous to that of the WNT gene family. The SPRF family acts as soluble modulators of WNT signaling, involved in embryological development, cell differentiation and cancer.
  • the expression of SFRP4 in the ventricular micardium is related to apoptosis derived from gene expression.
  • SFRP4 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 23.
  • SMAD9 (NM_001 127217.2) encodes a protein that is a member of the SMAD family, which transduces signals from members of the TGF-beta family. This protein is activated by bone morphogenetic proteins and interacts with SMAD4.
  • SMAD9 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 24.
  • SOCS5 (NM_014011.4) encodes a protein that contains an SH2 domain and one SOCS BOX. Although its specific function is not known, this protein belongs to the family of suppressors of cytokine-dependent signaling SOCs.
  • SOCS5 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 25.
  • SPARC (NM_0031 18.3) encodes a protein associated with the cysteine-rich matrix. This protein is required by bone collagen for calcification, but it is also involved in the synthesis of the extracellular matrix and in the promotion of changes in the cellular form. This protein is also associated with tumor suppression and also related to metastasis based on such changes in cell form that can promote cell invasion of tumors.
  • SPARC is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 26.
  • SPON1 (NM_006108.3) encodes a protein that is secreted by soil plate cells or " floor-plate "that could be involved in the axon guide.
  • SPON1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 27.
  • SSPN (NM_001 135823.1) encodes a member of the dystrophin-glycoprotein dystrophin-glycoprotein (DGC) complex that provides a structural union between the subsarcolemmal cytoskeleton and extracellular matrix of muscle cells.
  • DGC dystrophin-glycoprotein dystrophin-glycoprotein
  • ZAK NM_016653.2 This gene is a member of the MAPKK family. This protein acts as a control point for cell cycle regulation.
  • ZAK is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 29.
  • ZFHX4 (NM_024721.4) also called zinc finger homeodomain protein 4, which has been found expressed in neuronal differentiation and contained in muscle differentiation.
  • ZFHX4 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence collected in SEQ ID No. 30.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence referring to polymeric forms of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • FIG. 1 Experimental design and main results of the "Discovery Assay”
  • Figure 2 Main results derived from the comparison Post-QT vs Pre-QT in the validation test.
  • A) Representation of Log 10 of the order of magnitude change parameter of the relative abundance of mRNA of each of the differentially overexpressed genes after chemotherapy, considering all experimental groups (Post-QT vs. Pre-QT) and each of the Experimental groups individually -GR (Post-QT vs. Pre-QT), Her2G (Post-QT vs. Pre-QT), MRH (Post-QT vs. Pre-QT) and MRL (Post-QT vs. Pre-QT) - .
  • B) Venn diagram highlighting differentially expressed genes after chemotherapy in each experimental group in relation to differentially expressed genes after chemotherapy considering all experimental groups.
  • FIG. 3 Chemoresistance genes.
  • A) Log 10 of the order of magnitude change parameter of the relative abundance of mRNA of each of the differentially overexpressed genes after chemotherapy, considering the GR and BR groups before chemotherapy.
  • B) Log 10 Log 10 of the order of magnitude change parameter of the relative abundance of mRNA of each of the differentially expressed genes after chemotherapy in the GR group - GR comparison (Post-QT vs. Pre-QT) - and those differentially expressed before chemotherapy between groups GR and BR -Pre-QT (GR vs BR) comparison-
  • breast cancer patients were distributed in experimental groups, according to the pathological response to the treatment with chemotherapy based on anthracyclines and taxanes they presented, and according to the grading system of Miller and Payne (Ogston et al., Breast 2003 Oct; 12 (5): 320-7), which resulted in a good response group -GR (Miller & Payne grades 4 and 5) -, a medium response group -MR- (Miller & Payne grade 3) - and a bad response group -BR (Miller & Payne grades 1 and 2) -.
  • the validation test was performed on a set of 170 paired samples (pre and post treatment) corresponding to 85 cases of breast cancer.
  • the pairs of pre and post treatment samples were examined by a pathologist who classified the response to chemotherapy according to the Miller and Payne classification.
  • the specimens were classified into 4 groups according to their pathological response to chemotherapy and their Her2 receptor expression.
  • Samples that did not express Her2 were distributed in BR ("Bad answer” - bad responder), MR ("Mild respond” - middle responder) and GR ("Good Answer” - good responder).
  • the MR group was subdivided into 2 more groups according to the percentage of tumor cell removal after treatment and they were called MRH ("Mild respond high" - MRL responder medium and "MRL” - Mild responder low). an additional group that expressed Her2.
  • RNA isolation and microarray analysis Sample processing, microarray hybridization and gene expression analysis was carried out with the Affymetrix Genechip System (Affymetrix, Santa Clara, CAUSE). Briefly, the total RNA was extracted and purified for microarray analysis using the QIAshredder columns and the RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. From ⁇ g of total RNA, complementary DNA (cDNA) was synthesized using the One-Cycle cDNA Synthesis kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). The biotinylated complementary RNA was synthesized by YVT labeling kit (Affymetrix) and purified with the GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix).
  • Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module
  • the biotinylated cRNA was fragmented and hybridized to the Genechip Human Genome U133 Plus 2.0 microarray (Affymetrix). After hybridization, washes and staining protocol were performed according to GeneChip Scanner 2000 (Affymetrix). The fluorescent signal corresponding to the hybridization intensity of each transcript was quantified and normalized by the Gene Chip Operating Software (GCOS 1.4, Affymetrix). Finally, a set of measurements was generated from the quantified image files sAffymetrix mediant the Robust Multichip Average method (RMA) of the Affy Bioconductor package (http: / www.bioconductor.org).
  • RMA Robust Multichip Average method
  • the Bonferroni test was used to correct multiple trials, being considered significant when P ⁇ 0.05 and calculating the FC (Fold-change "- change of order of magnitude) values for all comparisons.
  • Genes differentially expressed between the different conditions analyzed were identified using a linear regression model that included the pathological response to chemotherapy as variables, if the sample was obtained before or after systemic treatment and the pairing of pre and post-treatment samples were derived from the same patient.
  • the supervised PCA analysis and the clustering were performed with processed data
  • the Partek Genomics Suite v7.3.1 software Partek, St.
  • the set of genes which contain the control genes, GADPH, HPRT1, MRPL19, RPLP0, TBP and TFRC, were selected according to the literature (Drury et al. Diagn Mol Pathol. 2009 Jun; 18 (2): 103-7). The six genes were considered for normalization. Threshold cycle values (Ct values) were determined using SDS software 2.2.2 software (Applied Biosystems). DCt values were used as independent variables in the statistical analysis. A linear regression model (LIMMA) was used to detect changes between differentially expressed groups and the method of Benjamini and Hochberg's was used to control the rate of false discoveries.
  • Ct values Threshold cycle values
  • Pairs of pre-chemotherapeutic and post-chemotherapy tissue samples were obtained from each patient and we performed a gene expression analysis of the entire genome using an oligonucleotide microarray platform. After comparing the samples before and after chemotherapy, 47 overexpressed genes were identified after chemotherapy, considering all the experimental groups (Figure 1 B).
  • a functional analysis using ontological databases revealed that the proteins encoded by these genes are involved in extracellular matrix metabolism, cell proliferation and adhesion, the response to oxidative stress, angiogenesis and the processes involved in development. All these are key for the development of chemoresistance and for the progression of the disease, since they play a central role during cell invasion and its connection with cell de-differentiation (Figure 1 C).
  • Tables 2-7 included at the end of this document show the different genes differentially expressed within each experimental pre-chemotherapy and post-chemotherapy group, as detailed in the results presented below.
  • Table 2 Selected genes of interest from validation tests. The genes were selected according to the result of the discovery test and the bibliographic criteria focused on the functional relationships between genes significantly overexpressed after chemotherapy.
  • CDC42 binding protein kinase alpha DMPK-like
  • CDC42BPA coiled-coil domain containing 80 CCDC80 collagen.
  • type I alpha 1 COL1A1 collagen.
  • RAB11 family interacting protein 2 (class I)
  • RAB11 FIP2 RAB11 FIP2
  • ATP-binding cassette sub-family G (WHITE). member 2 ABCG2 catenin (cadherin-associated protein). beta 1. 88kDa CTNNB1
  • CDP-diacylglycerol synthase (phosphatidate CDS1 cytidylyltransferase) 1
  • beta 1 fibronectin receptor, beta polypeptide. antigen
  • CD29 includes MDF2. MSK12)
  • beta 3 platelet glycoprotein Illa, antigen CD61 ITGB3 integrin.
  • NOTCH1 Notchl nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-
  • VEGF-A165 vascular endothelial growth factor C VEGF-C
  • VEGFR1 vascular endothelial growth factor receptor 2
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor 3
  • VEGFR3 v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (avian) REL A
  • RQ describes the magnitude of change of each target gene after chemotherapy with respect to its expression before chemotherapy.
  • BR bad response group
  • GR good response group
  • Her2G Her2-positive group
  • Her2-positive group Her2-positive group
  • MRH (mid-response high group) medium high response group
  • MRL (mid-response low group) medium low response group
  • Post-QT (after chemotherapy) after chemotherapy
  • Pre-QT (before chemotherapy) before chemotherapy
  • RQ (relative quantity) relative quantity.
  • Post-QT vs. Pre-GR gene Post-QT vs. Pre-Her2G (Post-QT vs. MRH (Post-QT vs. MRL (Post-QT vs.
  • Post-QT vs. Pre-GR gene Post-QT vs. Pre-Her2G (Post-QT vs. MRH (Post-QT vs. MRL (Post-QT vs.
  • GALNTL2 4.2099271 1 8.90195973 - - - - -
  • Post-QT vs Pre-GR gene Post-QT s Pre-Her2G (Post-QT vs. MRH (Post-QT vs MRL (Post-QT vs
  • the relative-relative quantity - (RQ) describes the magnitude of change of each target gene after chemotherapy with respect to its expression after chemotherapy.
  • GR (good response group) post-QT good response group, (after chemotherapy) after chemotherapy; Pre-QT, (before chemotherapy) before chemotherapy; RQ, (relative quantity) relative quantity.
  • Table 5 Comparison of genes differentially on expressed chemotherapy between the GR and BR groups -Pre-QT (GR vs BR) comparison-.
  • the RQ, (relative quantity) relative quantity describes the magnitude of change of each gene targeting chemotherapy in the GR group with respect to the bad response group BR (bad response group) group; GR, (good response group) good response group; Pre-QT, (before chemotherapy) before chemotherapy; RQ, (relative quantity) relative quantity.
  • RQ describes the magnitude of change of each of the Diana genes with respect to their expression in the experimental group that corresponds to the second comparison term.
  • BR bad response group
  • GR good response group
  • Her2G Her2-positive group
  • Her2-positive group Her2-positive group
  • MRH (mid-response high group) medium high response group
  • MRL (mid-response low group) medium low response group
  • Post-QT (after chemotherapy) after chemotherapy
  • Pre-QT (before chemotherapy) before chemotherapy
  • RQ (relative quantity) relative quantity.
  • RQ describes the magnitude of change of each of the target genes with respect to their expression in the experimental group that corresponds to the second comparison term.
  • BR bad response group
  • GR good response group
  • Her2G Her2-positive group
  • Her2-positive group Her2-positive group
  • MRH (mid-response high group) medium high response group
  • MRL (mid-response low group) medium low response group
  • Post-QT (after chemotherapy) after chemotherapy
  • Pre-QT (before chemotherapy) before chemotherapy
  • RQ (relative quantity) relative quantity.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta al tratamiento de cáncer de mama, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, mediante el análisis de la expresión de un conjunto de genes. Dicho método permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico que se ve modificado post- tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes.

Description

MÉTODO PARA PREDECIR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON QUIMIOTERAPIA EN PACIENTES CON CÁNCER.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y del diagnóstico y pronóstico médico, más específicamente al campo del pronóstico del cáncer, en particular, del cáncer de mama. Específicamente, la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta al tratamiento de cáncer de mama, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que se ve modificado posttratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer es una enfermedad caracterizada por el crecimiento descontrolado de las células, ya que aumenta su proliferación y/o se inhiben los procesos de muerte celular o apoptosis; y posteriormente, por la adquisición de la capacidad invasiva y metastática que le permite a las células colonizar y proliferar en otros tejidos.
Para que una célula se transforme en tumoral, esta debe perder el control de la proliferación permitiendo a las células crecer a densidades elevadas (pérdida de la inhibición por contacto) e independientemente de los factores de crecimiento (tanto estimulantes como inhibitorios).
El cáncer de mama es la causa más frecuente de muerte por cáncer entre las mujeres de todo el mundo. La tasa de incidencia es más elevada en los países desarrollados, mientras que en los países en proceso de desarrollo es más baja, aunque en aumento. Gracias a la investigación, la mortalidad por cáncer de mama en Europa ha disminuido un 13% en los últimos años debido tanto a la detección precoz como a los tratamientos con antiestrógenos y quimioterapia.
Durante la progresión del tumor, las células tumorales adquieren la capacidad para degradar la MEC (matriz extracelular) e invadir los tejidos y finalmente la sangre o los vasos linfáticos. Este proceso invasivo conlleva una serie interactiva de sucesos entre las células malignas y muchos componentes de la MEC. Posteriormente, las células circulantes pueden dejar los vasos y colonizar otros órganos, lo que conocemos como metástasis. Durante las últimas décadas, el tratamiento del cáncer de mama ha experimentado cambios significativos caracterizados por estrategias menos agresivas tanto para el diagnóstico como para el tratamiento. La mamografía y la ecografía o las biopsias esterotáxicas han reemplazado a la biopsia quirúrgica, y en muchos casos, la cirugía conservadora de la mama y la biopsia del ganglio linfático centinela han reemplazado satisfactoriamente a la mastectomía radical más agresiva y la disección de ganglios linfáticos axilares.
Sin embargo, la reaparición o recaída de la enfermedad después del tratamiento antineoplásico continua siendo un gran problema que amenaza a estos pacientes de por vida (l_0nning et al. Mol Oncol. 2010, 4, 284-300).
Por ello, la búsqueda de marcadores predictivos tumorales en el tratamiento de cáncer de mama ha sido un tópico importante para los investigadores durante décadas. De hecho, la comunidad científica es consciente de que es necesario un sistema mejor y más preciso para identificar individuos con riesgo de recaída ya que evita un tratamiento insuficiente o exagerado en los pacientes y mejora su índice de supervivencia a largo plazo (Walther et al. Cáncer J. 201 1 , 17, 71-79) Por ello, durante la última década, la comunidad científica se ha centrado en identificar firmas de expresión génica que permitan predecir la prognosis en pacientes y/o la respuesta al tratamiento estándar de quimioterapia (l_0nning et al. Mol Oncol. 2010, 4, 284-300; Vera-Ramirez, L, et al. Cáncer Treat Rev. 2010, 36, 477-484).
Los importantes avances tecnológicos y científicos en el campo de la genómica han permitido el desarrollo de ensayos multi-gen que se han aprobado y comercializado para guiar las decisiones clínicas según las características particulares de los tumores (Galanina et al. Cáncer J. 2011, 17, 96-103; Cardoso et al. J Clin Oncol. 2008, 26, 729-735; Sparano et al. Clin Breast Cáncer 2006, 7, 347-350; Parker et al. J Clin Oncol. 2009. 27, 1160-1 167; Ma X.J., et al. Cáncer Cell. 2004, 5:607-616).
A pesar de las mejoras en el tratamiento de cáncer de mama, alrededor de un 30% de los pacientes con cáncer de mama en fase primaria sufren recaída tras un periodo impredecible, incluso si presentaron una respuesta terapéutica buena (González-Angulo et al. Adv Exp Med Biol. 2007, 608, 1-22; Galanina et al. Cáncer J. 2011, 17, 96-103). Este y otros descubrimientos científicos, como la detección de células tumorales circulantes (CTCs) en el torrente sanguíneo de pacientes en tratamiento, ha implicado a la quimioresistencia tumoral como uno de los principales procesos implicados en la progresión del cáncer de mama (Gazzaniga, P., et al. Int J Cáncer. 2010, 126, 2437-2447; Gradilone, A., et al. Ann Oncol. 2011 , 22, 86-92).
Es importante, por tanto, encontrar biomarcadores que puedan emplearse para predecir la prognosis en pacientes y/o la respuesta al tratamiento estándar en cáncer de de mama
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han detectado una serie de genes que actúan como biomarcadores de la predicción de la respuesta al tratamiento del cáncer de mama. Han desarrollado un método de obtención de datos útiles para la predicción de respuesta al tratamiento en cáncer de mama, así como para el seguimiento de la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes.
USOS DE LOS BIOMARCADORES Y MÉTODOS DE LA INVENCIÓN
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de de al menos un gen que se selecciona de la lista que consiste en AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 o cualquiera de sus combinaciones para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso simultáneo de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y ZFHX4 para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama. Sin embargo, el uso independiente de cualquiera de ellos o cualquiera de sus combinaciones podrían ser suficientes para la predicción de respuesta o seguimiento de dicha enfermedad. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada que comprende células de un individuo diagnosticado con cáncer de mama, y
b) detectar simultáneamente la cantidad de producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2,
FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG 1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o
ZFHX4 en la muestra aislada de (a).
En una realización preferida, el primer método de la invención comprende además: c) Comparar los niveles de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42,
COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 en la muestra obtenida en (a) con el nivel de expresión detectada para dichos genes en una muestra de referencia de respuesta patológica conocida.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a)-(c) del primer método de la invención, y además comprende incluir al individuo en el grupo de respuesta positiva (GR) cuando los niveles de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 están sobreexpresados respectivamente en comparación de una muestra de referencia (muestra procedente de un paciente que registró una buena respuesta a la quimioterapia, GR-good responder).
Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada comprende células de biopsias. Más preferiblemente, la muestra biológica es un tejido reciente, tejido embebido en parafina o ARN extraído de un tejido de un paciente con cáncer de mama.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de de tejido de mama.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) - (c) según el primer método de la invención, y además comprende incluir al individuo en el grupo de mala respuesta o respuesta negativa (BR-bad responder) cuando la expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN 1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 está sobreexpresada en comparación con una muestra de referencia (muestra procedente de un paciente que registró una buena respuesta a la quimioterapia, GR-good responder).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la sobreexpresión se define como un nivel de expresión mayor o igual a 3, 16 veces la puntuación máxima alcanzada por cada uno de los genes en biopsias de mama tumorales de pacientes respondedores al tratamiento (muestra de referencia) antes de la quimioterapia. En otra realización preferida la sobreexpresión se define como un nivel de expresión mayor o igual que la puntuación máxima alcanzada en biopsias de mama tumorales de pacientes respondedores al tratamiento (control positivo) según se define en la tabla 1.
Tabla 1. Genes diferencialmente sobre expresados tras la quimioterapia cogiendo todos los grupos de respuesta patológica.
Símbolo génico P-valor P-valor
AFFY ID FC
(UniGene) (Bonferroni) (FDR)
209189_ at FOS 0.0202462 0.00040492 6.57593
228750_ at Transcribed locus 0.00024893 0.00012446 5.31614
210764. _s_ at CYR61 0.00238832 0.00012814 4.65884
222722_ .at OGN 0.00306971 0.00012814 4.42838
218730_ _s_ at OGN 0.00145993 0.00012808 4.34352
227404. _s_ at EGR1 0.00868799 0.00023481 3.89088
204052_ _s_ at SFRP4 0.00277324 0.00012814 3.79333
204051_ _s_ at SFRP4 0.00152836 0.00012808 3.75937
201041_ _s_ at DUSP1 0.00192122 0.00012808 3.72945
204359_ .at FLRT2 0.00190595 0.00012808 3.69542
201289_ .at CYR61 0.00439729 0.00015705 3.69293
202995_ _s_ at FBLN1 0.00266352 0.00012814 3.63798
212865_ _s_ at COL14A1 0.00999944 0.00023808 3.57203
CDNA clone
227061_ at 0.0338457 0.00057366 3.35518
UTERU2015653
214321_ at NOV 0.00144675 0.00012808 3.33679
201694_ _s_ at EGR1 0.00142338 0.00012808 3.32085
202994_ _s_ at FBLN1 0.00159841 0.00012808 3.07057
243864_ at CCDC80 0.0174462 0.0003712 2.9816
1552289_a i_at CILP2 0.00264886 0.00012814 2.97854
212670_ at ELN 0.00469104 0.00016176 2.95438
213993_ at SPON1 0.00301975 0.00012814 2.85407
213994_ _s_ at SPON1 0.0065725 0.00020539 2.83318
227209_ at CNTN1 0.0002148 0.00012446 2.73998
204472_ at GEM 0.00865131 0.00023481 2.68147
204749 at NAP1 L3 0.00106731 0.00012808 2.5979 Símbolo génico P-valor P-valor
AFFY ID FC
(UniGene) (Bonferroni) (FDR)
204457_s_at GAS1 0.00307532 0.00012814 2.49752
219304_s_at PDGFD 0.00118699 0.00012808 2.47087
209436_at SPON1 0.0128952 0.00029989 2.46483
236361_at GALNT13 0.00364759 0.0001459 2.45128
205226_at PDGFRL 0.00085271 0.00012808 2.44452
227719_at SMAD9 0.0164003 0.00035653 2.42699
201787_at FBLN1 0.0150154 0.00033368 2.40659
222288_at Transcribed locus 0.0416578 0.00064898 2.39995
228640_at PCDH7 0.0345477 0.00057579 2.35056
235944_at HMCN1 0.0309136 0.00054234 2.32914
219779_at ZFHX4 0.00137216 0.00012808 2.28599
217430_x_at COL1A1 0.0279861 0.00051826 2.18803
223235_s_at SMOC2 0.0185218 0.00038587 2.18388
CDNA clone
1554007_at 0.00505853 0.00016862 2.16721
IMAGE:5303689
229331_at S PATA 18 0.0300625 0.00054234 2.1614
225871_at STEAP2 0.00678533 0.00020562 2.13988
228109_at RASGRF2 0.00960666 0.000235 2.06216
205880_at PKD1 0.00701634 0.00020636 2.02661
219628_at ZMAT3 0.00403645 0.0001495 1.96759
202177_at GAS6 0.00391723 0.0001495 1.95287
226522_at PODN 0.0137785 0.00031315 1.93665
212667_at SPARC 0.0210836 0.00041341 1.93369
226932_at SSPN 0.0244706 0.00046171 1.93173
CDNA clone
225725_at 0.00725772 0.00020736 1.87481
IMAGE:5261213
1598_g_at GAS6 0.00244952 0.00012814 1.77547
228396_at PRKG1 0.00963514 0.000235 1.76529
CDNA clone
227221_at 0.00922199 0.000235 1.71563
IMAGE:5261213
204797_s_at EMAP 0.00208889 0.00012814 1.65215
227620_at SLC44A1 0.00938248 0.000235 1.64053
209648_x_at SOCS5 0.024051 0.00046171 1.61098
208127 s at SOCS5 0.0317073 0.00054668 1.60624 Símbolo génico P-valor P-valor
AFFY ID FC
(UniGene) (Bonferroni) (FDR)
210102_ at VWA5A 0.00189508 0.00012808 1.57861
222423_ at NDFIP1 0.0304418 0.00054234 1.48207
203794. at CDC42BPA 0.0198818 0.00040492 1.45802
23031 1_ _s_ at PRDM6 0.0408996 0.00064898 1.44695
203884_ _s_ at RAB11 FIP2 0.00524894 0.00016932 1.40706
204020_ at PURA 0.0384826 0.00062069 1.40121
226538_ at MAN2A1 0.00152848 0.00012808 1.37054
204021_ _s_ at PURA 0.0421837 0.00064898 1.34598
205105_ at MAN2A1 0.0383403 0.00062069 1.32745
FC , (fold change) veces de cambio; FDR, (false discovery rafe) tasa de falso descubrimiento.
Los estudios de los autores de la presente invención han permitido obtener información sobre los patrones de expresión de genes en pacientes afectos de cáncer de mama que responden al tratamiento de quimioterapia frente a sujetos que no responden. El estudio mediante técnicas informáticas de los resultados obtenidos, ha permitido obtener un modelo de las modificaciones que son significativas en este tipo de patología.
La detección de la cantidad del producto de expresión de los genes puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la concentración de estos productos de expresión de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre el paciente con cáncer de mama respondedor al tratamiento de uno no respondedor. La cantidad del producto de expresión de los genes detectada en distintas estadios de la enfermedad podría establecer un diagnóstico diferencial en individuos afectados por cáncer de mama, que permite subclasificarlos. La medida de la cantidad o la concentración , preferi blemente de manera semicuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas a las que se traducen, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de RNA o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 de una o varias muestras de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema.
Los productos de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.
Así, en otra realización preferida, la detección de la cantidad de producto de expresión se realiza mediante: a. Un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o b. Un procedimiento de microarrays que comprende el aislamiento de ARN y/o
c. Un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real, y/o
d. Transferencia Northern, y/o
e. Un procedimiento histoquímico, y/o
f. Un procedimiento de secuenciación génica masiva ó "Next Generation Sequencing" (NGS)
Más preferentemente, la detección del producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 se realiza mediante PCR cuantitativa a tiempo real.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la detección del producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 se realiza mediante microarrays.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la detección del producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 se realiza mediante un procedimiento de secuenciación génica masiva. En otra realización preferida del primer método de la invención, el procedimiento se lleva a cabo in vitro usando una muestra originaria del sujeto humano, donde dicha muestra se obtiene después del tratamiento con quimioterapia y la muestra de referencia se toma antes del tratamiento con quimioterapia.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el seguimiento de la evolución del cáncer de mama en un individuo, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (b) según el primer o el segundo método de la invención, en muestras biológicas procedentes de un mismo individuo, y aisladas en momentos diferentes.
En otra realización preferida, el tratamiento de quimioterapia estándar comprende la administración de antraciclinas y taxanos. A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0, 1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión constitutiva de los genes, en un grupo de individuos antes de ser sometidos al tratamiento. La cantidad de referencia será, por ejemplo, en el caso de la diferenciación entre los pacientes afectados por cáncer de mama respondedores al tratamiento de los no respondedores, la expresión constitutiva del gen en un grupo control de individuos respondedores. Sin embargo, en el caso de la subclasificación de los pacientes afectados por cáncer de mama en función de sus manifestaciones, el grupo control estará formado por un grupo de enfermos con cáncer de mama que no tuvieron respondieron al tratamiento. También, en el caso de la predicción de la respuesta al tratamiento, las muestras de referencia se obtienen en biopsias de mama tumorales de pacientes respondedores al tratamiento (muestra de referencia) antes de la quimioterapia.
Así pues, la muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, obtenidas a partir de las células de biopsias de un paciente con cáncer de mama, en una determinada fase clínica. En otra realización preferida de este aspecto de la presente invención, la cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse también, por ejemplo, de los límites de distribución normal de una cantidad encontrada en muestras obtenidas de una población de individuos con cáncer de mama en distintas fases, y de pacientes respondedores y no respondedores, mediante técnicas estadísticas bien conocidas. En otra realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de los pacientes antes y después del tratamiento.
Los inventores han demostrado que los niveles de expresión de uno o más de estos genes pueden ser indicativos de una falta de respuesta, o de la respuesta de un sujeto al tratamiento. En una realización preferida, la respuesta se establece en función de parámetros histopatológicos, fundamentalmente basados en el porcentaje de reducción del número de células tumorales tras la quimioterapia. En una realización alternativa, la respuesta es la ausencia de cambio en cuanto a las características histopatológicas y celularidad del tumor. En otra realización, la respuesta es un resultado clínico, tal como la supervivencia exenta de progresión o la supervivencia global. En otra realización preferida, la muestra biológica es un tejido reciente, que se embebe en parafina o del que se atrae el ARN. El tejido reciente se obtiene durante el diagnostico y/o de restos quirúrgicos que se obtienen después de mastectomías o resección quirúrgicas.
La evaluación de la respuesta completa y/o la respuesta parcial es un factor importante para determinar el estado de un paciente individual. De esta manera, es necesario estimar la carga total del tumor en el valor inicial y usar ésta como elemento comparador para las posteriores medidas que se llevan a cabo según el sistema de gradación de Miller y Payne (Ogston et al., Breast 2003 Oct; 12(5):320- 7), lo que resultó en un grupo de buena respuesta -GR (Miller & Payne grados 4 y 5)-, un grupo de respuesta media -MR-(Miller & Payne grado 3)- y un grupo de mala respuesta -BR (Miller & Payne grados 1 and 2)-. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar un individuo que padece cáncer de mama a uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende individuos que desarrollan resistencia a la quimioterapia identificables por el método anterior, caracterizados por presentar una cantidad de producto de expresión superior a la cantidad de referencia; y en el que el grupo 2 representa el resto de los sujetos.
COMPOSICIONES Y KIT PARA PREDECIR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4, para tratar un individuo del grupo 1 que desarrolle resistencia a la quimioterapia, según se define en los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo para tratar un individuo del grupo 1 que desarrolle resistencia a la quimioterapia , identificable por un método de la invención, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-AP1 M2, anti-CCDC80, anti-CDC42, anti-COL1A1 , anti-CTNNB1 , anti-CXCL12, anti-ELN, anti-FBLNI , anti- FLRT2, anti-FLT1 , anti-GAS6, anti-HIF1A, anti-HMCN1 , anti-KIT, anti-MAPK1 , anti- NAP1 L3, anti-NDFIP1 , anti-OGN, anti-PDGFD, anti-PER1 , anti-PRKG1 , anti- RASGRF2, anti-SFRP4, anti-SMAD9, anti-SOCS5, anti-SPARC, anti-SPON1 , anti- SSPN, anti-ZAK y/o anti-ZFHX4. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de aquí en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad del producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4.
Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia. Preferiblemente el kit puede incluir una muestra o de referencia que es una muestra de biopsia de mama de un paciente respondedor al tratamiento que es obtenida antes del tratamiento.
Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar la cantidad del producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para la predicción de la respuesta al tratamiento y/o el seguimiento del cáncer de mama. En ese caso el kit puede contener todos los reactivos y elementos necesarios para analizar la expresión de los genes diana, así como las herramientas necesarias para establecer una predicción clínica útil, por ejemplo, un algoritmo matemático que integre información clínica e información génica para establecer la predicción de la respuesta al tratamiento de un paciente o detectar el desarrollo de quimioresistencia a lo largo del tratamiento. AP1 M2 (NM_005498) codifica una subunidad de heterotetrameric adaptor-related protein comlex 1 (AP-1), que pertenece a la familia de adaptor complexes médium subunits y es capaz de interaccionar con señales de clasificación basadas en tirosina. En el contexto de la presente invención, AP1 M2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 1.
CCDC80 (NM_199512.1) cuyo descenso en la expresión está regulado por la proteína oncogénica 1 y cuyo aumento está regulado en ratones homólogos deficientes en BRS-3. En el contexto de la presente invención, CCDC80 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 2.
CDC42 o "cell división cycle 42" (NM_001039802.1) codifica una GTPasa pequeña de la subfamilia Rho, la cual regula la señalización transduccional que controla diversas funciones celulares incluyendo la morfología celular, la endocitosis y la progresión del ciclo celular. Esta proteína es muy similar a Saccharomyces cerevisiae Cdc 42, y es capaz de complementar el muíante de levadura cdc42-1 y se cree que podría regular la polimerización de actina mediante su unión a la proteína N-WASP. En el contexto de la presente invención, CDC42 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 3.
COL1A1 (NM_000088.3) codifica el componente mayoritario del colágeno tipo uno, el colágeno fibrilar que se encuentra en la mayoría de los tejidos conectivos, incluido el cartílago así como en hueso, cornea o tendom. Mutaciones en este gen están asociadas con osteogenesis imperfecta tipo l-IV o osteoporosis entre otras. En el contexto de la presente invención, COL1A1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 4.
CTNNB1 (NM_001098209.1) codifica una proteína que forma parte del grupo de proteínas que codifican las uniones de cadherinas, que son necesarias para el mantenimiento de las capas de células epiteliales mediante la regulación del crecimiento celular y de la adhesión entre células. Mutaciones en este gen causan cáncer colorrectal, pilomatrixoma, meduloblastoma y cáncer de ovario. En el contexto de la presente invención, CTNNB1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 5. CXCL12 (NM_000609.5) es un gen que codifica una quimiocina alfa derivada de células de estroma que pertenece a la familia intercrina. El producto de este gen y su receptor pueden activar linfocitos y están implicados en la metástasis de algunos cánceres, como cáncer de mama. Mutaciones en este gen están asociadas con resistencia a infecciones por VIH. En el contexto de la presente invención, CXCL12 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 6.
ELN (NM_000501.2) codifica una proteína que es uno de los dos componentes en fibras elásticas. Mutaciones de este gen también están relacionadas con estenosis supravalvular aórtica (SVAS) y cutis laxa autosómico dominante. En el contexto de la presente invención, ELN se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 7. FBLN 1 (NM_001996.3) codifica para una proteína que se incorpora en la matriz extracelular fibrilar. La unión con calcio podría mediar su unión con laminina y entactina que forman parte de las láminas básales. Esta proteína también media la adhesión plaquetaria a través de su unión con fibrinógeno. En el contexto de la presente invención, FBLN1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 8.
FLRT2 (NM_013231.4) codifica un miembro de la familia de proteína transmembrana rica en fibronectina y leucina, que están relacionados con la adhesión celular y la señalización de receptores. En el contexto de la presente invención, FLRT2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 9.
FLT1 (NM_001 159920.1) codifica para un miembro de la familia de receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR). Esta proteína se une a VEGFR-A y VEGFR-B y a factores de crecimiento de placenta y tiene un papel importante en la angiogenesis y vasculogenesis. En el contexto de la presente invención, FLT1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 10.
GAS6 (NM_000820.2) codifica para la proteína que contiene acido gamma carboxigl utamico que se cree que está i mpl icada en la estim ulación de la proliferación celular y podría tener un papel en la trombosis. En el contexto de la presente invención, GAS6 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotidos recogida en la SEQ ID No. 1 1.
HI F1A (NM_001243084.1) es un gen que codifica para el factor de transcripción inducible por hipoxia H IF1 , el cual está compuesto por una subunidad alfa y beta. HIF1 regula la respuesta celular y homeostática a la hipoxia mediante la activación de muchos genes implicados en la energía del metabolismo, angiogénesis, apoptosis etc, y también tiene un papel importante en la vascularización. En el contexto de la presente invención, HIF1A se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotidos recogida en la SEQ ID No. 12.
HMCN1 (NM_031935.2), que codifica un miembro extracelular grande de la familia de las inmunoglobulinas. Mutaciones de este gen están relacionadas con la degeneración macular que sucede a edades avanzadas. En el contexto de la presente invención, HMCN1 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotidos recogida en la SEQ ID No. 13.
KIT (NM_000222.2) codifica la proteína receptor transmembrana tipo 3 de factores de crecimiento de mastocitos (MGF). Mutaciones en este gen están asociadas con tumores de estroma gastrointestinales, enfermedades de mastocitos, leucemia aguda mielogena y piebaldismo. En el contexto de la presente invención, KIT se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotidos recogida en la SEQ ID No. 14.
MAPK1 (NM_002745.4) codifica una proteína miembro de la familia MAP kinasa. Esta familia, actúa como punto de integración a diversas señales bioquímicas y está implicado en una gran variedad de procesos celulares como proliferación, diferenciación, regulación de la transcripción, y desarrollo. En el contexto de la presente invención, MAPK1 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotidos recogida en la SEQ ID No. 15.
NAP1 L3 (NM_004538.5) codifica a una proteína que es miembro de la familia de proteínas de ensamblaje de nucleosomas y está ligado a una región de los genes que es responsable de varios síndromes de retardo mental X-frágil. En el contexto de la presente invención, NAP1 L3 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotidos recogida en la SEQ ID No. 16. NDFIP1 (NM_030571.3), que codifica una proteína que pertenece a un grupo pequeño de proteínas conservadas en la evolución con tres dominios transmembrana. Esta proteína también es diana de la familia de proteínas Nedd4 y también se piensa que es parte de la familia de proteínas de membrana del Golgi integrales. En el contexto de la presente invención, NDFI P1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 17.
OGN (NM_014057.3) codifica una proteína que induce la formación de hueso ectópica y se han encontrado estudios que relaciona la expresión de este gen en la clóclea y el fenotipo auditivo de ratones deficientes en OGN. En el contexto de la presente invención, OGN se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 18.
PDGFD (NM_025208.4) codifica una proteína que es miembro de la familia de factores de crecimiento derivados de plaquetas, los cuales son factores mitogenicos para células de origen mesenquimal. En el contexto de la presente invención, PDGFD se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 19. PER1 (NM_002616.2) es un gen de la familia de los genes PER que se expresa en un patrón circadiano en el núcleo supraquiasmatico, que es el centro primario de regulación de los ritmos circadianos en el cerebro en mamíferos. En el contexto de la presente invención, PER1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 20.
PRKG1 (NM_001098512.2) codifica las isoformas I alfa y I beta de PRKG que actúan como mediadores de la señalización transduccional de oxide/cGMP y son componentes importantes para muchos procesos este tipo en muchos tipos de células. En el contexto de la presente invención, PRKG1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 21.
RASGRF2 (NM_006909.2) que pertenece a la familia de las RASGTP que son factores de intercambio GDP/GTP para la familia de Ras GTPasas que desempeñan funciones en el desarrollo de linfocitos T. En el contexto de la presente invención, RASGRF2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 22. SFRP4 (NM_003014.3) es un gen miembro de la familia SPRF que contiene un dominio rico en cisteína homólogo al de la familia de genes WNT. La familia SPRF actúa como moduladores solubles de la señalización de WNT, implicados en el desarrollo embriológico, la diferenciación celular y el cáncer. La expresión de SFRP4 en el micardio ventricular está relacionado con apoptosis derivada de la expresión génica. En el contexto de la presente invención, SFRP4 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 23.
SMAD9 (NM_001 127217.2) codifica una proteína que es miembro de la familia SMAD, que transduce señales de los miembros de la familia TGF-beta. Esta proteína es activada por proteínas morfogenéticas de hueso e interacciona con SMAD4. En el contexto de la presente invención, SMAD9 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 24. SOCS5 (NM_014011.4) codifica una proteína que contiene un dominio SH2 y uno SOCS BOX. Aunque su función específica no se conoce, esta proteína pertenece a la familia de supresores de la señalización dependiente de citocinas SOCs. En el contexto de la presente invención, SOCS5 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 25.
SPARC (NM_0031 18.3) codifica una proteína asociada a la matriz rica en cisteína. Esta proteína es requerida por el colágeno en hueso para la calcificación, pero también esta implicado en la síntesis de la matriz extracelular y en la promoción de cambios de la forma celular. Esta proteína también está asociada con la supresión de tumores y además relacionada con metástasis basada en dichos cambios de forma celular que pueden promover la invasión celular de tumores. En el contexto de la presente invención, SPARC se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 26. SPON1 (NM_006108.3) codifica para una proteína que se secreta por células de la placa del suelo o "floor-plate" que podría estar implicada en la guía de axones. En el contexto de la presente invención, SPON1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 27. SSPN (NM_001 135823.1) codifica un miembro del complejo dystrophin-glycoprotein distrofin-glicoprotein (DGC) que proporciona una unión estructural entre el citoesqueleto subsarcolemmal y la matriz extracelular de células musculares. En el contexto de la presente invención, SSPN se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 28. ZAK (NM_016653.2) Este gen es un miembro de la familia MAPKK. Esta proteína actúa como punto de control de la regulación del ciclo celular. La proteína también tiene actividad pro-apoptótica. Se han caracterizado distintas variantes transcripcionales, que codifican diferentes isoformas. En el contexto de la presente invención, ZAK se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 29.
ZFHX4 (NM_024721.4) también llamada zinc finger homeodomain protein 4, que se ha encontrado expresada en la diferenciación neuronal y contenida en la diferenciación muscular. En el contexto de la presente invención, ZFHX4 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos recogida en la SEQ ID No. 30.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo y para complementar esta descripción, se acompaña como parte integrante de la misma un juego de dibujos, cuyo carácter es ilustrativo y no limitativo. En estos dibujos:
Figura 1. Diseño experimental y principales resultados del "Discovery Assay" A) Diseño experimental del "Discovery assay". B) Genes diferencialmente sobrexpresados tras la quimioterapia. C) Términos ontológicos representados por los genes diferencialmente sobrexpresados tras la quimioterapia (P<0.05). El gráfico debe ser leído en dirección de las agujas del reloj y la leyenda de izquierda a derecha y de arriba a abajo. Los números en la figura corresponden al número de genes clasificados en cada categoría.
Figura 2. Principales resultados derivados de la comparación Post-QT vs Pre-QT en el ensayo de validación. A) Representación del Log10 del parámetro cambio de orden de magnitud de la abundancia relativa de mRNA de cada uno de los genes diferencialmente sobrexpresados tras la quimioterapia, considerando todos los grupos experimentales (Post-QT vs Pre-QT) y cada uno de los grupos experimentales de forma individual -GR (Post-QT vs Pre-QT), Her2G (Post-QT vs Pre-QT), MRH (Post-QT vs Pre-QT) and MRL (Post-QT vs Pre-QT)-. B) Diagrama de Venn resaltando los genes diferencialmente expresados tras la quimioterapia en cada grupo experimental en relación a los genes diferencialmente expresados tras la quimioterapia considerando todos los grupos experimentales. C) Diagrama de Venn resaltando los genes diferencialmente expresados tras la quimioterapia en los 4 grupos experimentales. D) Log10 del parámetro cambio de orden de magnitud de la abundancia relativa de mRNA de cada uno de los genes diferencialmente sobrexpresados tras la quimioterapia, considerando todos los grupos experimentales (Post-QT vs Pre-QT) y GR -GR (Post-QT vs Pre-QT)-.
Figura 3. Genes de quimiorresistencia. A) Log10 del parámetro cambio de orden de magnitud de la abundancia relativa de mRNA de cada uno de los genes diferencialmente sobrexpresados tras la quimioterapia, considerando los grupos GR y BR antes de la quimioterpia. B) Log10 Log10 del parámetro cambio de orden de magnitud de la abundancia relativa de mRNA de cada uno de los genes diferencialmente expresados tras la quimioterapia en el grupo GR -comparación GR (Post-QT vs Pre-QT)- y aquellos diferencialmente expresados antes de la quimioterapia entre los grupos GR y BR -Pre-QT (GR vs BR) comparison- C) Diagrama de Venn resaltando los genes diferencialmente expresados considerando las comparaciones GR (Post-QT vs Pre-QT) y Pre-QT (GR vs BR).
Figura 4. Diseño experimental de los "Discovery Assay" y "Validation Assay", y principales resultados derivados de los mismos.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los métodos de la invención para obtener datos útiles para predecir la respuesta al tratamiento y el pronóstico de cáncer de mama, así como para el seguimiento de dicha enfermedad.
MATERIAL Y MÉTODOS
Población de estudio
Para investigar los procesos biológicos que rigen la quimioresistencia en el cáncer de mama, diseñamos un estudio que incluyó dos sets de muestras independientes, incluyendo un total de 1 18 casos de cáncer de mama. Todas las pacientes se clasificaron según su examen médico y los resultados radiológicos y patológicos de sus biopsias tumorales. Inicialmente, se reclutaron 46 pacientes con un diagnostico histológico de cáncer de mama los cuales se planificaron para recibir tratamiento neoadyuvante basado en antraciclinas y taxanos tal y como el equipo médico determinó. De esta cohorte, 33 pacientes cumplieron con los requisitos de inclusión para el análisis de expresión génica de todo el genoma mediante microarrays de oligonucleótidos ("Discovery Assay"), pero 5 de estos se desecharon por presentar valores estadísticos anormales tras realizar dicho análisis. Globalmente, 33 casos y 61 muestras se procesaron finalmente. Para validar los resultados del análisis de expresión génica, se realizo un ensayo de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) ("Validation Assay") con muestras tumorales de 85 casos de cáncer de mama que recibieron un tratamiento neoadyuvante equivalente.
De cada paciente se obtuvieron, antes y después del tratamiento neoadyuvante con quimioterapia, varias muestras de una biopsia de tejido. Las muestras pre- tratamiento se obtuvieron durante el diagnostico mediante biopsias con aguja gruesa guiada por ultrasonido. Las muestras post-tratamiento se obtuvieron de restos quirúrgicos de masectomias o resección quirúrgica. Para casa caso, se obtuvieron dos muestras o biopsias, pre y post-tratamiento, una de ellas se congeló en nitrógeno liquido a -80°C y la otra se fijo en un búfer de formaldehido y se embebió en parafina para los análisis inmunohistoquimicos y histológicos. Las muestras pre y posttratamiento se congelaron 30 min después de la cirugía o la biopsia (Figura 1A). Para el análisis global de expresión génica, las pacientes con cáncer de mama fueron distribuidas en grupos experimentales, de acuerdo con la respuesta patológica al tratamiento con quimioterapia basada en antraciclinas y taxanos que presentaron, y según el sistema de gradación de Miller y Payne (Ogston et al., Breast 2003 Oct; 12(5):320-7), lo que resultó en un grupo de buena respuesta -GR (Miller & Payne grados 4 y 5)-, un grupo de respuesta media -MR-(Miller & Payne grado 3)- y un grupo de mala respuesta -BR (Miller & Payne grados 1 and 2)-. El ensayo de validación se realizó en un set de 170 muestras pareadas (pre y posttratamiento) que corresponden con 85 casos de cáncer de mama. Las parejas de muestras pre y post tratamiento fueron examinadas por un patólogo que clasificó la respuesta a la quimoteramia según la clasificación de Miller y Payne. Los especímenes se clasificaron en 4 grupos según su respuesta patológica a la quimioterapia y su expresión del receptor Her2. Las muestras que no expresaron Her2 se distribuyeron en BR ("Bad responder" - mal respondedor), MR ("Mild responder" - respondedor medio) y GR ("Good Responder" - buen respondedor). El grupo MR se subdividió en 2 grupos mas según el porcentaje de eliminación de células tumorales después del tratamiento y se llamaron MRH ("Mild responder High" - respondedor medio alto y MRL ("Mild responder low" - respondedor medio bajo). Se añadió un grupo adicional que expresó Her2.
Este estudio fue aprobado por el comité Ético de Investigación Clínica del Complejo Hospitalario de Jaén, y con un formulario de consentimiento por escrito de todos los pacientes y siguiendo las Buenas Prácticas Clínicas según la Declaración de Helsinki.
Aislamiento de ARN y análisis por microarrays El procesado de muestras, hibridación de microarrays y análisis de expresión génica se llevo a cabo con el sistema Affymetrix Genechip System (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Brevemente, el ARN total se extrajo y se purificó para el análisis de microarrays mediante las columnas QIAshredder y el RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) según las instrucciones del fabricante. A partir de ^g de ARN total, se sintetizó el DNA complementario (cDNA) mediante el One-Cycle cDNA Synthesis kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). El RNA complementario biotinilado se sintetizó mediante YVT labeling kit (Affymetrix) y se purificó con el GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix). A continuación, el cRNA biotinilado se fragmentó e híbrido al Genechip Human Genome U133 Plus 2.0 microarray (Affymetrix). Tras la hibridación, se realizaron lavados y el protocolo de tinción según el GeneChip Scanner 2000 (Affymetrix). La señal fluorescente que corresponde con la intensidad de la hibridación de cada tránscrito se cuantificó y normalizó mediante el Gene Chip Operating Software (GCOS 1.4, Affymetrix). Finalmente, un conjunto de medidas se genero a partir de los archivos imágenes cuantificado sAffymetrix mediant el Robust Multichip Average method (RMA) del paquete Affy Bioconductor (http:/ www.bioconductor.org).
Se empleó el test de Bonferroni para corregir ensayos múltiples, considerándose significativo cuando P≤ 0.05 y calculando los valores FC (Fold-change"- cambio de orden de magnitud) para todas las comparaciones. Los genes diferencialmente expresados entre las distintas condiciones analizadas se identificaron mediante un modelo de regresión lineal que incluyó como variables la respuesta patológica a la quimioterapia, si la muestra se obtenía antes o después del tratamiento sistémico y el emparejado de muestras pre y postratamiento derivaban del mismo paciente. El análisis supervisado PCA y el agrupamiento se realizaron con datos procesados. Se utilizó el software Partek Genomics Suite v7.3.1 (Partek, St. Louise, MO, USA) para el análisis estadístico. El análisis de enriquecimiento funcional se llevo a cabo mediante los programas "Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships" (PANTHER) (http://www.pantherdb.org), Datábase for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) http://david.abcc.ncifcrf.gov/ e Ingenuity Pathways Analysis (IPA), (http://www.ingenuitv.com/).
Análisis de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR)
Basándonos en los resultados del microarray, los niveles de expresión de 90 genes se evaluaron mediante qRT-PCR análisis. Para ello, se procesaron 5 secciones de 10 μηι de cada muestra de cáncer de mama fijada en formaldehido y embebida en parafina para aislar 10 ng de RNA total mediante el RNesay FFPE Kit (Qiagen). Los cDNAs se retrotranscribieron a partir de muestras de RNA total mediante el High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante. Reacciones PCR TaqMan se realizaron en muestras de cDNA utilizando el Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), 7,900 microfluidic cards a medida (Applied Biosystems) y ABI PRISM 7,900 HT Sequence Detection Systems, también según las instrucciones del fabricante.
El set de genes, que contienen los genes control, GADPH, HPRT1 , MRPL19, RPLP0, TBP y TFRC, fueron seleccionados según la bibliografía (Drury et al. Diagn Mol Pathol. 2009 Jun; 18(2): 103-7). Los seis genes se consideraron para la normalización. Valores de ciclo umbral (Ct valúes) se determinaron mediante el software SDS 2.2.2 software (Applied Biosystems) . Los valores DCt se utilizaron como variables independientes en el análisis estadístico. Un modelo de regresión lineal (LIMMA) se empleó para detectar los cambios entre grupos diferencialmente expresados y el método de Benjamini y Hochberg's se utilizó para controlar la tasa de falsos descubrimientos.
RESULTADOS
Se obtuvieron pares de muestras de tejido pre-quimioterpaia y post-quimioterapia de cada paciente y llevamos a cabo un análisis de expresión génica del genoma completo usando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos. Después de comparar las muestras previas y posteriores a la quimioterapia, se identificaron 47 genes sobrexpresados después de la quimioterapia, considerando todos los grupos experimentales (Figura 1 B). Un análisis funcional empleando bases de datos ontológicas reveló que las proteínas codificadas por estos genes están involucradas en el metabolismo de la matriz extracelular, la proliferación y adhesión celular, la respuesta al estrés oxidativo, la angiogénesis y los procesos involucrados en el desarrollo. Todos estos son clave para el desarrollo de quimioresistencia y para la progresión de la enfermedad, dado que juegan un papel central durante la invasión celular y su conexión con la de-diferenciación celular (Figura 1 C). Subsiguientes análisis de las rutas de señalización molecular en las cuales estas proteínas participan permitió la selección de otros 49 genes de interés, funcionalmente relacionados con los anteriores, que fueron analizados en el ensayo de validación. Este análisis confirmó las observaciones previas y añadió nueva información en lo referente a la expresión de estos genes en cada uno de los grupos experimental y a lo largo del tratamiento.
En las Tablas 2-7 incluidas al final del presente documento se pueden observar los diferentes genes diferencialmente expresados dentro de cada grupo experimental pre-quimioterapia y post-quimioterapia, según se detalla en los resultados que se presentan a continuación.
De forma notable, las diferencias intra-grupo revelaron que el número de genes significativamente sobrexpresadas después de la quimioterapia aumentaba conforme el grado de respuesta patológica al tratamiento mejoraba (Figura 2). La comparación Post-quimioterapia vs Pre-quimioterapia identificó 53 genes diferencialmente expresados en el grupo GR, mientras que la misma comparación en el grupo BR no identificó ningún gen diferencialmente expresado después de la quimioterapia. Curiosamente, todos estos genes fueron sobrexpresados después de la quimioterapia a excepción de dos de ellos, que fueron identificados como adaptor- related protein complex 1 , mu 2 subunit (AP1 M2) and topoisomerase (DNA) II alpha (TOP2A).
Las comparaciones entre grupos antes y después de la quimioterapia dieron lugar a resultados interesantes. Antes de la quimioterapia, los grupos GR y BR difirieron significativamente en la expresión de 52 genes, todos los cuales resultaron estar reprimidos en el grupo GR con respecto al grupo BR (Figura 3A). Sorprendentemente, observamos que 33 de los genes que compusieron la lista de genes fruto de la comparación intragrupo de GR también estaban presentes en la comparación GR vs BR antes de la quimioterapia, pero con el signo del factor de cambio de orden de magnitud invertido, excepto para el gen AP1 M2 (Figura 3B, 3C). Esto significa que identificamos 33 genes diferencialmente expresados en ambas comparaciones pero significativamente reprimidos en el grupo GR con respecto al grupo BR antes de la quimioterapia y significativamente sobrexpresados después de la quimioterapia en el grupo GR. En otras palabras, se observó que 33 genes, cuya expresión caracteriza a los tumores quimioresistentes y estaban reprimidos en tumores quimiosensitivos, fueron selectivamente sobrexpresados por las células tumorales residuales tras la quimioterapia en carcinomas quimiosensitivos. Las comparaciones entre los grupos GR y BR después de la quimioterapia no mostraron diferencia alguna en cuanto a la expresión de los genes analizados. Estos datos sustentan la idea de que aquellas células procedentes de tumores quimiosensitivos capaces de sobrevivir al estímulo citotóxico derivado de la quimioterapia, modulan positivamente aquellas rutas moleculares que están constitutivamente activadas en los tumores quimioresistentes. La Figura 4 esquematiza el diseño experimental de ambos ensayos y resume los principales resultados derivados de los mismos.
Tabla 2. Genes de interés seleccionados de ensayos de validación. Los genes fueron seleccionados de acuerdo con el resultado del ensayo de descubrimiento y de los criterios bibliográficos enfocados en las relaciones funcionales entre los genes significativamente sobreexpresados tras la quimioterapia.
Símbolo del
Nombre del gen
gen
Genes seleccionados en base a los resultados del ensayo de
descubrimiento.
CDC42 binding protein kinase alpha (DMPK-like) CDC42BPA coiled-coil domain containing 80 CCDC80 collagen. type I. alpha 1 COL1A1 collagen. type XIV. alpha 1 (undulin) COL14A1
Contactin 1 CNTN1 cysteine-rich. angiogenic inducer. 61 CYR61 dual specificity phosphatase 1 DUSP1
Early growth response 1 EGR1
echinoderm microtubule associated protein like 1 EML1
elastin (supravalvular aortic stenosis. Williams-Beuren
ELN
syndrome)
fibronectin leucine rich transmembrane protein 2 FLRT2
fibulin 1 FBLN1
growth arrest-specific 1 GAS1
growth arrest-specific 6 GAS6
GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle GEM
hemicentin 1 HMCN1
Nedd4 family interacting protein 1 NDFIP1 nephroblastoma overexpressed gene NOV
nucleosome assembly protein 1 -like 3 NAP1 L3 osteoglycin OGN
platelet derived growth factor D PDGFD platelet-derived growth factor receptor-like PDGFRL podocan PODN
PR domain containing 6 PRDM6 protein kinase D1 PRKD1 protein kinase. cGMP-dependent. type I PRKG1 Genes seleccionados en base a los resultados del ensayo de descubrimiento.
protocadherin 7 PCDH7 purine-rich element binding protein A PURA
RAB11 family interacting protein 2 (class I) RAB11 FIP2
Ras protein-specific guanine nucleotide-releasing factor 2 RASGRF2 secreted frizzled-related protein 4 SFRP4 secreted protein. acidic. cysteine-rich (osteonectin) SPARC six transmembrane epithelial antigen of the prostate 2 STEAP2
SMAD family member 9 SMAD9
SPARC related modular calcium binding 2 SMOC2 spondin 1. extracellular matrix protein SPON1 suppressor of cytokine signaling 5 SOCS5
Transcribed locus SSPN UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-
GALNTL2 acetylgalactosaminyltransferase
v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog FOS zinc finger homeobox 4 ZFHX4
Genes seleccionados seguiendo criterios funcionales y bibliométricos adaptor-related protein complex 1. mu 2 subunit AP1 M2
ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP). member 1 ABCB1
ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE). member 2 ABCG2 catenin (cadherin-associated protein). beta 1. 88kDa CTNNB1
CDP-diacylglycerol synthase (phosphatidate CDS1 cytidylyltransferase) 1
cell división cycle 42 (GTP binding protein. 25kDa) cdc42 chemokine (C-X-C motif) ligand 12 CXCL12 chemokine (C-X-C motif) receptor 4 CXCR4 endoplasmic reticulum metallopeptidase 1 ERMP1 epithelial cell transforming sequence 2 oncogene ECT2 family with sequence similarity 107. member A FAM107A focal adhesión kinase 1 FAK1 Genes seleccionados seguiendo criterios funcionales y bibliométricos four and a half LIM domains 1 FHL1
GLI family zinc finger 1 GLI1 hypoxia inducible factor 1. alpha subunit HIF1A integrin. beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide. antigen
ITGB1
CD29 includes MDF2. MSK12)
integrin. beta 3 (platelet glycoprotein Illa, antigen CD61) ITGB3 integrin. beta 4 ITGB4
JUN N-terminal kinase JNK
LIM and senescent cell antigen-like domains 2 LIMS2 lipase. hormone-sensitive LIPE mal. T-cell differentiation protein 2 MAL2 mast/stem cell growth factor receptor SCFR matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B. 92kDa gelatinase.
MMP9
92kDa type IV collagenase)
mitogen-activated protein kinase 1 ERK2 neuropilin 1 NRP1
NOTCH1 Notchl nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-
NF-KB1 cells 1
nucleolar and spindle associated protein 1 NUSAP1 p38 mitogen activated protein kinase p38
period homolog 1 (Drosophila) PER1 ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family. small
Rac1
GTP binding protein Rac1)
serine peptidase inhibitor. Kunitz type. 2 SPINT2 signal transducer and activator of transcription 3 STAT3 sonic hedgehog SHH spectrin. beta, non-erythrocytic 1 SPTBN1 sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK ZAK
Survivin Survivin tenascin XB TNXB topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa TOP2A Genes seleccionados seguiendo criterios funcionales y bibliométricos ubiquitin-like. containing PHD and RING finger domains. 1 UHRF1
v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 AKT1
vascular endothelial growth factor A VEGF-A165 vascular endothelial growth factor C VEGF-C
Continuación Tabla 2 vascular endothelial growth factor receptor 1 VEGFR1 vascular endothelial growth factor receptor 2 VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor 3 VEGFR3 v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (avian) REL A
ZW10 interactor ZWINT
Tabla 3. Genes diferencialmente sobreexpresados tras la quimioterapia dentro de cada grupo experimental. RQ describe la magnitud de cambio de cada gen diana tras la qumioterapia con respecto a su expresión antes de la quimioterapia. BR, (bad response group) grupo de mala respuesta ; GR, (good response group) grupo de buena respuesta; Her2G, (Her2-positive group) grupo Her2-positivo; MRH, (mid- response high group) grupo de respuesta medio alta; MRL, (mid-response low group) grupo de respuesta medio baja ; Post-QT, (after chemotherapy) tras quimioterapia; Pre-QT, (before chemotherapy) antes de quimioterapia; RQ, (relative quantity) cantidad relativa.
RQ
RQ RQ RQ RQ RQ
BR (Post-
Gen Post-QT vs Pre- GR (Post-QT vs Pre- Her2G (Post-QT vs MRH (Post-QT vs MRL (Post-QT vs
QT vs Pre- QT QT) Pre-QT) Pre-QT) Pre-QT)
QT)
ABCB1 5.22051399 18.7863593
AP1 M2 0.27364557 0.18527341
CCDC80 8.30583516 24.9035562 3.90303671 6.43526756
CDC42 3.26993026
CNTN1 4.20108014 9.21 143666 7.45427943 6.14923525
COL14A1 23.2869531 152.96929 18.8156475 14.9904183
COL1A1 2.45216252 9.42556898
CTNNB1 3.16379687
CXCL12 4.9681 1391 17.7098848 6.17022871 RQ
RQ RQ RQ RQ RQ
BR (Post-
Gen Post-QT vs Pre- GR (Post-QT vs Pre- Her2G (Post-QT vs MRH (Post-QT vs MRL (Post-QT vs
QT vs Pre- QT QT) Pre-QT) Pre-QT) Pre-QT)
QT)
CXCR4 4.02204436 4.1557321 1 - - - -
CYR61 6.93700362 15.9942326 - 8.86887349 - -
DUSP1 39.4831454 1 18.634773 32.7759926 20.8912387 - -
EGR1 26.4279316 91 .8892096 21 .8833712 27.3501581 - -
ELN 7.1609181 1 32.8078197 - 9.76823923 - -
EML1 2.03056068 - - - - -
FAM107A - 43.7354836 - - - -
FBLN1 5.82187972 21 .7898132 5.43612978 - - -
FHL1 1 1 .3890393 27.5995193 17.1902104 - - -
FLRT2 7.30486874 8.25765462 15.8634541 - - -
FLT1 2.93547717 3.66768961 4.1 1518979 4.40447562 - -
FOS 87.349656 301 .374689 41 .0432755 82.0529634 314.027697 -
GALNTL2 4.2099271 1 8.90195973 - - - -
GAS1 2.9599777 5.72289519 6.16970781 3.1 1734076 - -
GAS6 3.60424669 9.25756696 - 3.77475864 - -
GEM 6.4379977 20.1878305 3.54158778 9.43439628 - -
GLI1 7.30224584 12.6628601 22.4772188 8.2736397 - -
HIF1A - 3.23169083 - - - -
HMCN1 4.16308517 17.8855569 - 5.19892785 - -
ITGB4 2.36588586 - - - - -
KDR 1 .91 1501 1 1 - - 3.48954532 - -
KIT 4.38576218 7.21497578 5.79625781 4.37288902 - -
MAPK1 2.12582604 3.32065324 - - - -
MAPK8 1 .78421539 - - 3.432882 - -
NAP1 L3 3.79074397 5.25859157 - - - -
NDFIP1 - 5.03897534 - - - -
NOTCH1 1 .84473298 - - - - -
NOV 10.715444 14.7979853 7.16140454 6.91463005 - -
NRP1 3.27542538 4.94143776 3.3987206 - - -
OGN 17.1234556 74.4143783 24.3667438 - - -
PDGFD 5.8770087 35.7791 181 15.531 1265 - - -
PDGFRL 4.4314074 24.5159965 - - - -
PER1 4.6960959 18.8005316 7.19757026 3.04392075 - -
PODN 8.72658555 26.4201888 1 1 .9921999 10.2345441 - -
PRDM6 3.55948157 4.65997786 RQ
RQ RQ RQ RQ RQ
BR (Post-
Gen Post-QT vs Pre- GR (Post-QT s Pre- Her2G (Post-QT vs MRH (Post-QT vs MRL (Post-QT vs
QT vs Pre-
QT QT) Pre-QT) Pre-QT) Pre-QT)
QT)
PRKD1 3.17434281 7.18643302 - - - -
PRKG1 1 .86172577 6.87755998 - - - -
RAB1 1 FIP
1 .98973665 - - - - - 2
RAC1 - 2.45128546 - - - -
RASGRF2 2.92452339 5.19824073 - - - -
SFRP4 4.82783392 16.3994467 12.3260271 2.83353941 - -
SMAD9 - 9.43966808 - - - -
SOCS5 4.50483753 3.95622867 1 1 .4290092 - - -
SPARC 3.50674038 12.0367405 - - - -
SPINT2 - - 0.18345832 - - -
SPON1 3.55313965 1 1 .6892213 - - - -
SPTBN1 2.07215736 4.76568851 - - - -
SSPN 4.55422422 1 1 .4258243 7.73733586 - - -
STEAP2 3.6660691 7.49707654 5.772502 - - -
TNXB 24.1926332 158.167929 19.9286356 10.0195522 - -
TOP2A 0.1 1268083 0.04972546 0.0602591 - - -
UHRF1 0.43312899 - - - - -
VEGFA 0.45549202 - - - - -
VEGFC 2.46132279 5.31736888 - - - -
ZAK 1 .83785984 3.30297386 - - - -
ZFHX4 4.81722371 1 1 .9025459 7.96945002 - - -
Total 57 genes 55 genes 30 genes 22 genes 1 gen 0 genes
Tabla 4. Genes diferencialmente sobre expresados tras la quimioterapia dentro del grupo de comparación GR (Post-QT vs Pre-QT).
Gen RQ GR (Post-QT vs Pre-QT)
ABCB1 18.7863593
AP1 M2 0.18527341
CCDC80 24.9035562
CDC42 3.26993026
CNTN1 9.21 143666
COL14A1 152.96929
COL1A1 9.42556898
CTNNB1 3.16379687
CXCL12 17.7098848
CXCR4 4.15573211
CYR61 15.9942326
DUSP1 1 18.634773
EGR1 91.8892096
ELN 32.8078197
FAM107A 43.7354836
FBLN1 21.7898132
FHL1 27.5995193
FLRT2 8.25765462
FLT1 3.66768961
FOS 301.374689
GALNTL2 8.90195973
GAS1 5.72289519
GAS6 9.25756696
GEM 20.1878305
GLI1 12.6628601
HIF1A 3.23169083
HMCN1 17.8855569
KIT 7.21497578
MAPK1 3.32065324
NAP1 L3 5.25859157
NDFIP1 5.03897534
NOV 14.7979853 Gen RQ GR (Post-QT vs Pre-QT)
NRP1 4.94143776
OGN 74.4143783
PDGFD 35.7791181
PDGFRL 24.5159965
PER1 18.8005316
PODN 26.4201888
PRKD1 7.18643302
PRKG1 6.87755998
RAC1 2.45128546
RASGRF2 5.19824073
SFRP4 16.3994467
SMAD9 9.43966808
SOCS5 3.95622867
SPARC 12.0367405
SPON1 1 1.6892213
SPTBN1 4.76568851
SSPN 1 1.4258243
STEAP2 7.49707654
TNXB 158.167929
TOP2A 0.04972546
VEGFC 5.31736888
ZAK 3.30297386
ZFHX4 1 1.9025459
La cantidad relative -relative quantity - (RQ) describe la magnitud de cambio de cada gen diana tras la quimioterapia con respecto a su expresión tras la quimioterapia. GR, (good response group) grupo de buena respuesta Post-QT, (after chemotherapy) tras quimioterapia; Pre-QT, (before chemotherapy) antes de la quimioterapia; RQ, (relative quantity) cantidad relativa. Tabla 5. Comparación de los genes diferencialmente sobre expresados quimioterapia entre los grupos GR y BR -Pre-QT (GR vs BR) comparison-.
Gen RQ Pre-QT (GR vs BR)
AP1 M2 0.255125214
BIRC5 0.110677577
CCDC80 0.220793548
CDC42 0.206385939
CDS1 0.082805419
COL1A1 0.125509807
CTNNB1 0.192678056
CXCL12 0.187189206
ELN 0.050310318
ERMP1 0.20689296
FBLN1 0.120018468
FLRT2 0.081622721
FLT1 0.2211 15432
GAS6 0.18383045
HIF1A 0.196784302
HMCN1 0.17215669
ITGB1 0.21352813
ITGB4 0.167066634
KIT 0.187318823
MAL2 0.282348031
MAPK1 0.21790637
MAPK14 0.249461483
MAPK8 0.226563528
NAP1 L3 0.115303297
NDFIP1 0.118071989
NFKB1 0.243706413
NOTCH1 0.215517053
OGN 0.076928492
PDGFD 0.048857703
PER1 0.104646914
PRKG1 0.100946291
PTK2 0.139123609 Gen RQ Pre-QT (GR vs BR)
PURA 0.171486164
RASGRF2 0.172151561
REL 0.261837755
SFRP4 0.166182257
SMAD9 0.063640678
SOCS5 0.212031403
SPARC 0.099342014
SPINT2 0.254468059
SPON1 0.075141 141
SSPN 0.104315474
STAT3 0.151972732
VEGFA 0.213175336
ZAK 0.233274662
ZFHX4 0.09150727
La RQ, (relative quantity) cantidad relativa describe la magnitud de cambio de cada gen dianaantes de la quimioterapia en el grupo GR con respecto al grupo BR (bad response group) grupo de mala respuesta; GR, (good response group) grupo de buena respuesta; Pre-QT, (before chemotherapy) antes de quimioterapia; RQ, (relative quantity) cantidad relativa.
Tabla 6. Genes diferencialmente sobre expresados antes de la quimioterapia. RQ describe la magnitud de cambio de cada uno de los genes Diana con respecto a su expresión en el grupo experimental que se corresponde al segundo término de comparación. BR, (bad response group) grupo de mala respuesta; GR, (good response group) grupo de buena respuesta; Her2G, (Her2-positive group) grupo Her2-positivo; MRH, (mid-response high group) grupo de respuesta medio alta; MRL, (mid-response low group) grupo de respuesta medio baja; Post-QT, (after chemotherapy) tras quimioterapia; Pre-QT, (before chemotherapy) antes de quimioterapia; RQ, (relative quantity) cantidad relativa. RQGR RQGR RQH RQH RQH RQH RQMRH RQIV RQIV
Gen RQG
vs MRH MRL GR vs MRH G vs MRL BR vs BR vs MRL vs BR
ABCG2 0.045590 0.255125
AP1 M2 0.201 184 0.1 10677
BIRC5 0.071 153 0.220793
CCDC80 0.179527 0.206385
CDC42 0.264425
CDC42BPA 0.291359 0.082805
CDS1
CNTN1 0.173990 0.125509
COL1A1 0.091596 0.192678
CTNNB1 0.248095 0.187189
CXCL12 0.233231 0.050310
ELN 0.109152
EML1 0.236671 0.206892
ERMP1 0.174301 0.120018
0.102108
FBLN1
019
FHL1 0.100892 0.081622
0.0484942
FLRT2 0.103333 0.221 1 15
9
FLT1 0.172172 0.18383
GALNT2
GAS6 0.182202
GLI1 0.130749 0.196784
HIF1A 0.170323 0.172156
HMCN1 0.133705 0.213528
ITGB1 0.185414 0.167066
ITGB4
KDR 0.21 1097 0.187318
KIT 0.282348
MAL2 0.217906
MAPK1 0.244283 0.249461
MAPK14 0.186427 0.226563
MAPK8 0.21 1924
MMP9 0.140669 0.1 15303
NAP1 L3 0.153685 0.1 18071
NDFIP1 0.126531 0.243706
NFKB1 0.215517 RQ RQ RQHer2Gvs RQHer2G RQHer2 RQHer2G vs RQ RQ RQ
Gen RQ
vs vs vs vs vs vs
NOTCH1 - - - - - - - - - -
NRP1 - 0.250803 0.076928 - - - - -
OGN - - 0.048857 - - - - -
PDGFD - 0.114661 - 0.05495
PDGFRL - 0.171356 0.104646 - - - - -
PODN - 0.082401 - - - - - - - -
PRDM6 - 0.186491 - - - - - - - -
PRKD1 - 0.093087 0.100946 - - - - -
PRKG1 - - 0.139123 - - - - -
PTK2 - - 0.171486 - - - - -
PURA - 0.122997 - - - - - - - -
RAB11FIP2 - 0.218605 0.172151 - - - - -
RASGRF2 - 0.118278 0.261837 - - - - -
REL - 0.188733 0.166182 - - - - -
SFRP4 - 0.113632 0.063640 - - - - -
SMAD9 - - 0.212031 - - - - -
SOCS5 - 0.202196 0.099342 - - - - -
SPARC - 0.103744 0.254468 - - - - -
SPINT2 - - 0.075141 - - - - -
SPON1 - 0.084121 0.104315 - - - - -
SSPN - 0.144382 0.151972 - - - - -
STAT3 - - - - - - - - - -
STEAP2 - 0.148295 0.213175 - - - - -
VEGFA - 0.199504 - - - - - - - -
VEGFC - 0.125948 0.233274 - - - - -
ZAK - 0.266141 0.091507 - - - - -
ZFHX4 - 0.087975 0.255125 - - - - -
0 0 0 0 0
Total 49 genes 46 genes 4 genes 0 genes 2 genes
genes genes genes genes genes Tabla 7. Genes diferencialmente sobre expresados entre el grupo experimental tras la quimioterapia. RQG RQG VS RQG RQlHei RQ|Hei RQM RQM
^βΠ vs vs vs
vs vs vs vs vs vs
A 2P1M . 0.04616 - - - - - - - .
BIRC5 - °-°!°3 0.0721
CCDC
0.0914
80
COL1
0.1299
A1
CTNN
0.1502
B1
FBLN
1 0.0517
FLRT 0.0605
0.0575
2 3
ITGB1 - - - - - - - 0.0937
MAPK
0.1149
1
MMP9 - - - - - - - 0.0751
PRDM 0.0550
6 . 5 - - - - - - .
PURA - - - - - - - 0.0956
SOCS 0.1097
0.0914
0.1047
0.0351
0.0547
5
0.0871
0.1200
0.0619
8
0.1428
° 7 ° 0 0 0 0 16 0
Total gene gene 1 gen gene gene
a genes a genes genes a a a genes genes Genes diferencialmente sobre expresados antes de la quimioterapia. RQ describe la magnitud de cambio de cada uno de los genes diana con respecto a su expresión en el grupo experimental que se corresponde al segundo término de comparación. BR, (bad response group) grupo de mala respuesta; GR, (good response group) grupo de buena respuesta; Her2G, (Her2-positive group) grupo Her2-positivo; MRH, (mid-response high group) grupo de respuesta medio alta; MRL, (mid-response low group) grupo de respuesta medio baja; Post-QT, (after chemotherapy) tras quimioterapia; Pre-QT, (before chemotherapy) antes de quimioterapia; RQ, (relative quantity) cantidad relativa.

Claims

REIVINDICACIONES
El uso de al menos un gen que se selecciona de la lista que consiste en AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 o cualquiera de sus combinaciones, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama.
El uso de los genes de la lista que comprende: AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y ZFHX4 para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama.
3. Un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quimioterapia en individuos diagnosticados de cáncer de mama, que comprende:
a. Obtener una muestra biológica aislada que comprende células de un individuo diagnosticado de cáncer de mama, y
b. Detectar la cantidad de producto de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2,
FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 en la muestra aislada de (a). 4. El método según la reivindicación 3, que además comprende:
c. Comparar los niveles de expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 en la muestra obtenida en (a), en relación a la cantidad de expresión detectada para dichos genes en una muestra referencia de respuesta patológica conocida.
Un método para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con quim ioterapia en i ndividuos diagnosticados de cáncer de mama que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, y además comprende incluir al individuo en el grupo de mala respuesta o respuesta negativa (BR-bad responder) cuando la expresión de los genes AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A 1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4 está sobreexpresada en comparación con una muestra de referencia (muestra procedente de un paciente que registró una buena respuesta a la quimioterapia, GR-good responder).
El método según la reivindicación anterior, donde la sobreexpresión se define como un nivel de expresión mayor o igual a 3,16 veces la puntuación máxima alcanzada por cada uno de los genes en biopsias de mama tumorales de pacientes respondedores al tratamiento (muestra de referencia) antes de la quimioterapia.
El método según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, donde la detección de la cantidad de producto de expresión se realiza mediante:
a. Un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o b. Un procedimiento de microarrays que comprende el aislamiento de ARN y/o
c. Un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real, y/o
d. Transferencia Northern, y/o
e. Un procedimiento histoquímico, y/o
f. Un procedimiento de secuenciación génica masiva ó "Next Generation Sequencing" (NGS).
El método según la reivindicación 7, donde la detección de la cantidad de producto de expresión se realiza mediante PCR cuantitativa a tiempo real.
9. El método según la reivindicación 7, donde la detección de la cantidad de producto de expresión se realiza mediante microarrays.
10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 5-9, que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde el método se lleva a cabo in vitro usando una muestra originaria del sujeto humano, y en el que la muestra del paso (a) se toma después del tratamiento con quimioterapia y la muestra de referencia se toma antes del tratamiento con quimioterapia.
1 1. Un método para el seguimiento de la evolución del cáncer de mama en un individuo, que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (b) según cualquiera de las reivindicaciones 3-4 o 5-10, en muestras biológicas procedentes de un mismo individuo, y aisladas en momentos diferentes.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende la administración de antraciclinas y taxanos. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-12, donde la muestra biológica se obtiene de tejido de mama.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-13, en el que la muestra biológica es un tejido reciente, tejido embebido en parafina o ARN extraído de un tejido de un individuo diagnosticado con cáncer de mama.
15. Un método para asignar un individuo que padece cáncer de mama a uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende individuos que desarrollan resistencia a la quimioterapia identificables por el método según cualquiera de las reivindicaciones 3-14, caracterizados por presentar una cantidad de producto de expresión superior a la cantidad de referencia; y en el que el grupo 2 representa el resto de los sujetos.
16. Una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre AP1M2, CCDC80,
CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN1, KIT, MAPK1, NAP1L3, NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y/o ZFHX4, para tratar un individuo del grupo 1 que desarrolle resistencia a la quimioterapia según se define en la reivindicación 15, identificable por el método según cualquiera de las reivindicaciones 3-14.
17. Un anticuerpo para tratar un individuo del grupo 1 que desarrolle resistencia a la quimioterapia según se define en la reivindicación 15, identificable por el método según cualquiera de las reivindicaciones 3-14, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-AP1 M2, anti-CCDC80, anti-CDC42, anti-COL1A1 , anti-CTNNB1 , anti-CXCL12, anti-ELN, anti-FBLN1 , anti-FLRT2, anti-FLT1 , anti-GAS6, anti-HIF1A, anti-HMCN1 , anti-KIT, anti-MAPK1 , anti-NAP1 L3, anti- NDFIP1 , anti-OGN, anti-PDGFD, anti-PER1 , anti-PRKG1 , anti-RASGRF2, anti-SFRP4, anti-SMAD9, anti-SOCS5, anti-SPARC, anti-SPON1 , anti-SSPN, anti-ZAK y/o anti-ZFHX4.
18. Un kit o dispositivo que comprende las herramientas moleculares para detectar el producto de expresión de al menos uno genes de la lista que comprende AP1M2, CCDC80, CDC42, COL1A1, CTNNB1, CXCL12, ELN, FBLN 1, FLRT2, FLT1, GAS6, HIF1A, HMCN 1, KIT, MAPK1, NAP1L3,
NDFIP1, OGN, PDGFD, PER1, PRKG1, RASGRF2, SFRP4, SMAD9, SOCS5, SPARC, SPON1, SSPN, ZAK y 7o ZFHX4.
19. El kit según la reivindicación 18, que además comprende una muestra de referencia.
20. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 18-19, en el que la muestra de referencia es una muestra de mama humana de un paciente respondedor al tratamiento que fue tomada antes del tratamiento.
21. El uso del kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 18-20 para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento de quimioterapia en individuos diagnosticados con cáncer de mama.
PCT/ES2013/070808 2012-11-23 2013-11-22 Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer Ceased WO2014080060A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP201231820 2012-11-23
ES201231820 2012-11-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014080060A1 true WO2014080060A1 (es) 2014-05-30

Family

ID=50775583

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2013/070808 Ceased WO2014080060A1 (es) 2012-11-23 2013-11-22 Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2014080060A1 (es)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676183A (zh) * 2017-02-09 2017-05-17 复旦大学 Zfhx4作为食管癌预后诊断的生物标志物
CN107179685A (zh) * 2016-03-09 2017-09-19 中国科学院沈阳自动化研究所 一种适用于多变量模型预测控制的分程控制实现方法
CN109097462A (zh) * 2018-09-10 2018-12-28 青岛市海慈医疗集团 Ap1m2基因作为诊断青光眼的分子标志物的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006052862A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-18 Genomic Health, Inc. Predicting response to chemotherapy using gene expression markers
WO2007107254A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh Prediction of breast cancer response to chemotherapy
WO2010003773A1 (en) * 2008-06-16 2010-01-14 Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh Algorithms for outcome prediction in patients with node-positive chemotherapy-treated breast cancer
WO2011080373A1 (es) * 2009-12-31 2011-07-07 Centro De Investigaciones Energéticas, Medioambientales Y Tecnológicas (Ciemat) Huella genómica como predictor de respuesta a tratamiento

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006052862A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-18 Genomic Health, Inc. Predicting response to chemotherapy using gene expression markers
WO2007107254A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh Prediction of breast cancer response to chemotherapy
WO2010003773A1 (en) * 2008-06-16 2010-01-14 Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh Algorithms for outcome prediction in patients with node-positive chemotherapy-treated breast cancer
WO2011080373A1 (es) * 2009-12-31 2011-07-07 Centro De Investigaciones Energéticas, Medioambientales Y Tecnológicas (Ciemat) Huella genómica como predictor de respuesta a tratamiento

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107179685A (zh) * 2016-03-09 2017-09-19 中国科学院沈阳自动化研究所 一种适用于多变量模型预测控制的分程控制实现方法
CN107179685B (zh) * 2016-03-09 2019-12-10 中国科学院沈阳自动化研究所 一种适用于多变量模型预测控制的分程控制实现方法
CN106676183A (zh) * 2017-02-09 2017-05-17 复旦大学 Zfhx4作为食管癌预后诊断的生物标志物
CN109097462A (zh) * 2018-09-10 2018-12-28 青岛市海慈医疗集团 Ap1m2基因作为诊断青光眼的分子标志物的应用
CN109097462B (zh) * 2018-09-10 2022-01-11 青岛市海慈医疗集团 Ap1m2基因作为诊断青光眼的分子标志物的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2537403T3 (es) Método para usar la expresión génica para determinar el pronóstico de cáncer de próstata
US8202968B2 (en) Predicting lung cancer survival using gene expression
WO2005054508A2 (en) Gene expression profiling of colon cancer by dna microarrays and correlation with survival and histoclinical parameters
WO2013052480A1 (en) Marker-based prognostic risk score in colon cancer
WO2010000907A1 (es) Huella genómica de cáncer de mama
JP2016514966A (ja) 前立腺ガンの予後の検知及び判定のための組成物及び該検知及び判定方法
TWI622892B (zh) 基因表現圖譜以及將其應用於乳癌醫療之方法與套組與微陣列晶片
Dong et al. Elevated CD44 expression predicts poor prognosis in patients with low-grade glioma
GB2616359A (en) Methods and genomic classifiers for identifying homologous recombination deficiency prostate cancer
US20210010090A1 (en) Method and system for predicting recurrence and non-recurrence of melanoma using sentinel lymph node biomarkers
TWI682034B (zh) 用於評估子宮內膜癌的發展風險或診斷子宮內膜癌的方法
CA2504403A1 (en) Prognostic for hematological malignancy
US20110183859A1 (en) Inflammatory genes and microrna-21 as biomarkers for colon cancer prognosis
WO2014080060A1 (es) Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer
CA2962551C (en) Method for evaluating efficacy of chemoradiotherapy against squamous cell carcinoma
CN116121390A (zh) 癌症预后和免疫治疗适用性的标志物及其应用
Tao et al. Identification of distinct gene expression profiles between esophageal squamous cell carcinoma and adjacent normal epithelial tissues
WO2015044495A1 (es) Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes de cáncer colorrectal
US20090297506A1 (en) Classification of cancer
CN111315897B (zh) 用于黑素瘤检测的方法
ES2544882T3 (es) Determinación del riesgo de metástasis distante en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio I-IIIA, tratados quirúrgicamente
KR20100045703A (ko) 침윤성 또는 비침윤성 방광암의 예후 예측용 진단 키트, 방광암의 예후 측정방법 및 방광암 치료제의 스크리닝 방법
ES2403781B1 (es) Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas, y para evaluar la respuesta al tratamiento.
ES2856232B2 (es) Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, metodos y usos basados en los mismos
CN103060348A (zh) 用于检测原发性肝癌的复发潜力的基因标志物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13856146

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13856146

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1