WO2014076202A2 - Single-stage method for the purification of (blood) plasma proteins such as albumin from mixtures - Google Patents
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Abstract
The invention relates to a single-stage method for the purification of a (blood) plasma protein from a mixture containing said (blood) plasma protein, comprising the steps of applying the (blood) plasma protein to a sorbent, which comprises a solid carrier material the surface of which is functionalized with pyridino-4-carboxamide groups and 3-carboxamidopropionic acid groups, and eluting the (blood) plasma protein from the sorbent. The present invention provides a simple and inexpensive method for the purification of such (blood) plasma proteins, the method being characterized by the additional advantage of a substantially complete removal of factor XI and factor XIa from the (blood) plasma protein.
Description
Einstufiges Verfahren zur Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen wie Albumin aus One-step process for the purification of (blood) plasma proteins such as albumin
Gemischen mixtures
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, unter Verwendung eines Sorbenz, dessen Oberfläche mit zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist, wobei das Sorbenz im Wesentlichen die im Blutplasmaprotein enthaltenen Verunreinigungen absorbiert und nicht das (Blut)Plasmaprotein selbst. Mit diesem Verfahren ist es möglich, Verunreinigungen, wie insbesondere IgA, IgM und Faktor XIa sowie Faktor XI aus entsprechenden (Blut)Plasma- proteinmischungen abzutrennen. The present invention relates to a one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein using a sorbent whose surface is functionalized with two receptor molecules, the sorbent substantially absorbing the impurities contained in the blood plasma protein and not the (blood) plasma protein itself. With this method it is possible to separate impurities, in particular IgA, IgM and factor XIa as well as factor XI from corresponding (blood) plasma protein mixtures.
Hintergrund der Erfindung Background of the invention
Der Faktor XI (auch als Rosentalfaktor oder Plasma Thromboplasmin Antecedent bezeichnet) ist ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym in Form einer Factor XI (also referred to as rosemary factor or plasma thromboplasmin antecedent) is an enzyme involved in blood coagulation in the form of a
Serinproteinase. Dieses Enzym wird von der Leber produziert und liegt im Serine proteinase. This enzyme is produced by the liver and is located in the
Blutplasma in seiner inaktiven Form als Homodimer vor, in dem zwei Einheiten über eine Disulphitbrücke miteinander verbunden sind. Das Monomer besitzt eine Molekülmasse von 800 kDa. Der Faktor XI wird durch den aktivierten Hageman- Faktor (Faktor Xlla) oder durch Thrombin aktiviert und dann als Faktor XIa bezeichnet. Es gehört zum intrinsischen Pfad der Blutgerinnung, die in Aktion tritt, wenn der Hageman-Faktor und andere Bestandteile auf negativ geladenes Collagen unter dem Endothel der Gefäßwand trifft. Der Faktor XIa aktiviert in der Gerinnungskaskade den Christmas-Faktor (Faktor IX) zu Faktor IXa.
Ein erhöhtes Faktor XI-Niveau im Blut wird heute mit der Verursachung von Thrombosen in Verbindung gebracht. In der jüngeren Vergangenheit wurde daher bei Blutplasmaproteinpräparaten starker Wert darauf gelegt, dass die enthaltenen Präparate möglichst frei von Faktor XI oder Faktor XIa sind, damit sich bei Gabe entsprechender Blutpräparate an Patienten bei diesen das Thromboserisiko nicht erhöht. Blood plasma in its inactive form as a homodimer, in which two units are connected by a disulphite bridge. The monomer has a molecular weight of 800 kDa. Factor XI is activated by the activated Hagemane factor (Factor XIIa) or by thrombin and then designated Factor XIa. It is part of the intrinsic pathway of blood clotting that occurs when the Hageman factor and other components strike negatively charged collagen under the endothelium of the vessel wall. The factor XIa activates the Christmas factor (factor IX) to factor IXa in the coagulation cascade. An elevated blood XI level in the blood today is associated with the cause of thrombosis. In the recent past, therefore, in blood plasma protein preparations, great importance has been attached to the fact that the preparations contained are as free as possible from factor XI or factor XIa, so that the risk of thrombosis does not increase with the administration of appropriate blood preparations to patients.
Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Faktor XI oder XIa wurde beispielsweise bereits in der US 5,252,217 beschrieben, wobei der Faktor säulenchromato- graphisch mit Hilfe von "Sulphat-Sepharose-Gelen" isoliert wurde. Problematisch an diesem Verfahren ist allerdings, dass diese Gele nur mit einer relativ geringen Beladung (d.h., einem geringen Verhältnis von zu reinigender Substanz zu The separation or purification of factor XI or XIa has already been described, for example, in US Pat. No. 5,252,217, the factor being isolated by column chromatography with the aid of "sulphate-Sepharose gels". However, the problem with this method is that these gels can be charged only with a relatively low loading (i.e., a low ratio of substance to be purified)
Chromatographie Material) betrieben werden können. Damit sind diese Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI und/oder XIa aus großen Mengen an Chromatography material) can be operated. Thus, these methods for the separation of factor XI and / or XIa from large amounts of
(Blut)plasmaproteinen relativ zeitaufwändig und kostspielig. (Blood) plasma proteins are relatively time-consuming and costly.
In der WO 2005/049070 sind Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI In WO 2005/049070 are methods for the separation of factor XI
beschrieben, die auf Affinitätschromatographie beruhen. Dabei werden mit Faktor XI-Antikörpern modifizierte Säulenmaterialien oder mit Heparin, L-Arginin oder Benzamidin-modifizierte Materialien vorgeschlagen. Weitere Verfahren zur described based on affinity chromatography. Here, columnar materials modified with factor XI antibodies or with heparin, L-arginine or benzamidine-modified materials are proposed. Further procedures for
Abtrennung von Faktor IX basieren auf Ionenaustauschchromatographie, Separation of factor IX based on ion exchange chromatography,
Größenausschlusschromatographie, elektrophoretischen Verfahren oder Size exclusion chromatography, electrophoretic methods or
unterschiedlicher Löslichkeit der Faktoren in den Präparaten. Die WO different solubility of the factors in the preparations. The WO
2005/0949070 beschreibt zudem ein sequentielles Chromatographieverfahren, umfassend eine Kationaustauschchromatographie, eine hydrophobe Further, 2005/0949070 describes a sequential chromatographic method comprising a cation exchange chromatography, a hydrophobic
Wechselwirkungschromatographie und eine abschließenden Behandlung mit Hydroxylapatit, wobei sehr reiner Faktor XI erhalten werden soll. Interaction chromatography and a final treatment with hydroxyapatite to obtain very pure factor XI.
In der EP 2 102 335 A2 ist schließlich für die Aufreinigung von Faktor XI ein hydrophobes Ladungsinduktionschromatographiematerial beschrieben, das u.a. einen Pyridinring aufweist. Dabei wird Faktor IX zunächst bei neutralem pH (wobei der Pyridinring ungeladen vorliegt) an das Chromatographiematerial gebunden. Nach Erhöhung des pHs auf etwa 4, was zur Protonierung des Finally, EP 2 102 335 A2 describes a hydrophobic charge-induction chromatography material for the purification of factor XI, which i.a. having a pyridine ring. Factor IX is first bound to the chromatography material at neutral pH (with the pyridine ring being uncharged). After increasing the pH to about 4, resulting in the protonation of the
Pyridinrings führt, wird der Antikörper anschließend wieder freigesetzt.
Die beschriebenen Verfahren zielen jedoch allesamt auf die Reinigung von Faktor XI ab, und beschäftigen sich nicht mit der Abtrennung des Faktors aus Pyridine ring leads, the antibody is then released again. However, all of the methods described are directed to the purification of factor XI and do not deal with the separation of the factor
(Blut)plasmaproteingemischen, bei denen eine möglichst reine (Blood) plasma protein mixtures, where as pure as possible
(Blut)plasmaproteinfraktion erhalten werden soll. Demzufolge ist unklar ob diese Verfahren mit Ausgangsprodukten durchgeführt werden können, bei denen der Faktor XI nur in gegenüber den übrigen Proteinen geringen Anteilen vorhanden ist. (Blood) plasma protein fraction is to be obtained. Consequently, it is unclear whether these processes can be carried out with starting products in which the factor XI is present only in small proportions compared with the other proteins.
Ein weiteres in (Blut)Plasmaproteinpräparaten unerwünschtes Nebenprodukt ist das Immunoglobulin A, welches Allergien in Patienten verursachen kann. Another by-product undesirable in (blood) plasma protein preparations is immunoglobulin A, which can cause allergies in patients.
Es besteht daher ein Bedarf an einem möglichst einfachen und kostengünstigen Reinigungsverfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, (Blut)Plasmaproteine von Verunreinigungen, wie insbesondere Immunoglobulin A und M, sowie Faktor XI und Faktor XIa zu reinigen. Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme. There is therefore a need for a purification process which is as simple and inexpensive as possible, with the aid of which it is possible to purify (blood) plasma proteins of impurities, in particular immunoglobulin A and M, as well as factor XI and factor XIa. The present invention solves these problems.
Beschreibung der Erfindung Description of the invention
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Pyridin-4-carboxamido-Resten und 3-Carboxamidopropionsäure-Resten funktionalisiert ist, und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz. The present invention relates to a one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein to a sorbent comprising a solid support material having a pyridine-4 surface area. carboxamido residues and 3-carboxamidopropionic acid residues, and eluting the (blood) plasma protein from the sorbent.
Wenn im Vorstehenden von einem einstufigen Verfahren die Rede ist, bezieht sich die Bezeichnung "einstufig" nur auf die Schritte zur Behandlung des (Blut)Plasma- proteins an sich, d.h., das Verfahren kann dennoch weitere Schritte oder Stufen umfassen, die sich mit der Vor- oder Nachbehandlung des Sorbenzes befassen. Das einstufige Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst jedoch nicht mehr als einen Behandlungsschritt für das (Blut)Plasmaprotein. If the above is a one-step process, the term "one-step" refers only to the steps to treat the (blood) plasma protein per se, ie the process may still involve further steps or steps that interfere with the Pre- or post-treatment of the sorbent deal. However, the one-step method according to the present invention does not involve more than one treatment step for the (blood) plasma protein.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise vorteilhaft ausgestaltet, indem das Sorbenz das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen nicht bindet oder absorbiert. Das heißt, dass sich nach dem Auftragen oder Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf das Sorbens das zu reinigende Blutplasmaprotein im
Wesentlichen mit der Fließmittelfront durch das Sorbenz bewegt, und mit dieser von der Säule zurückgewonnen werden kann . Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es demzufolge bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein nach Zugabe der fünffachen Menge, vorzugsweise der dreifachen Menge, und besonders bevorzugt der zweifachen Menge an Fließmittel, bezogen auf das Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz im Wesentlichen vollständig, d.h., zu The method according to the invention is preferably configured advantageously in that the sorbent substantially does not bind or absorb the (blood) plasma protein to be purified. That is, after the application or application of the (blood) plasma protein to the sorbent, the blood plasma protein to be purified in the Essentially moved with the solvent front through the sorbent, and can be recovered with this from the column. In the context of the present invention, it is accordingly preferred if the (blood) plasma protein after addition of the five-fold amount, preferably three times, and particularly preferably twice the amount of superplasticizer, based on the sorbent volume, essentially completely, ie to
mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 % und besonders bevorzugt mindestens 93 % von dem Sorbenz zurückgewonnen werden kann. Für das Verfahren ist es zweckmäßig, wenn das (Blut)Plasmaprotein für das Aufbringen auf das Sorbenz in einem Puffer gelöst wird. Der Puffer sollte vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 6,5 aufweisen, wobei als Puffer sämtliche Puffer mit einem pKa-Wert in diesem Bereich in Frage kommen. Als Puffer kann vorzugsweise ein Kohlensäure-Silikat-Puffer, Essigsäurepuffer, Citratpuffer, Phosphatpuffer und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulphonsäure (MES)- Puffer ausgewählt werden. Ein im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugter Puffer ist ein Citratpuffer. at least 80%, preferably at least 90% and most preferably at least 93% of the sorbent can be recovered. For the method, it is expedient if the (blood) plasma protein for application to the sorbent is dissolved in a buffer. The buffer should preferably have a pH in the range of 4 to 6.5, all buffers with a pKa value in this range being suitable as buffer. As the buffer, it is preferable to select a carbonic acid silicate buffer, acetic acid buffer, citrate buffer, phosphate buffer and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer. A particularly preferred buffer in the context of the invention is a citrate buffer.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin bevorzugt, wenn das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült wird, bis das zu reinigende In the context of the present invention, it is further preferred if the sorbent is rinsed with the buffer until the to be cleaned
(Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen vollständig (d.h ., vorzugsweise zu (Blood) plasma protein substantially complete (i.e., preferably too
mindestens 80%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, noch mehr bevorzugt zu mindestens 93%, und am meisten bevorzugt zu mindestens 95%) vom at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 93%, and most preferably at least 95%) of
Sorbenz eluiert ist. Sorbenz is eluted.
Hinsichtlich des Verhältnisses des aufzureinigenden (Blut)Plasmaproteins in der Mischung zum Volumen des Sorbenz ergeben sich keine besonderen With regard to the ratio of the purified (blood) plasma protein in the mixture to the volume of the sorbent, there are no particular
Beschränkungen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass entsprechende Restrictions. However, it has been shown that appropriate
Blutplasmaproteine auch bei hohen Verhältnissen von Blutplasmaprotein zu Sorbensvolumen eine ausgezeichnete Reinigungsleistung aufweisen. So ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das Blutplasmaprotein in einer Menge von > 25 mg/ml Sorbenzvolumen, bevorzugt > 50 mg/ml Blood plasma proteins have excellent cleaning performance even at high blood plasma protein to sorbent volume ratios. Thus, it is preferred in the context of the present invention if the blood plasma protein in an amount of> 25 mg / ml Sorbenzvolumen, preferably> 50 mg / ml
Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. Besonders bevorzugt ist es, wenn das (Blut)Plasmaprotein in einer Menge im Bereich von 120 bis 250 mg/ml Sorbensvolumen aufgetragen wird. Bei diesen Verhältnissen ergibt sich eine sehr gute Reinigungs- und Trennleistung des Materials bei gleichzeitig sehr hoher
Auftragsmenge des zu reinigenden Produkts, wodurch sich der Durchsatz und damit die Kosten des Verfahrens signifikant reduzieren lassen. Sorbensvolumen is applied to the sorbent. It is particularly preferred if the (blood) plasma protein is applied in an amount in the range of 120 to 250 mg / ml sorbent volume. At these conditions results in a very good cleaning and separation performance of the material at the same time very high Order quantity of the product to be cleaned, which can significantly reduce the throughput and thus the cost of the process.
Bei dem zu reinigenden (Blut)Plasmaprotein handelt es sich zweckmäßig um ein (Blut)Plasmaprotein, das durch das Sorbenz im Wesentlichen nicht absorbiert wird. Bevorzugt handelt es sich bei dem (Blut)Plasmaprotein um Albumin, vorzugsweise menschliches Albumin. Bei Albumin konnte zudem beobachtet werden, dass sich im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Ionentauschern, Immunoglobulin X Verunreinigungen (d.h. insbesondere IgG, IgA, IgE und IgM) und Faktoren (XI und XIa) in einem chromatographischen Schritt von Albumin im Wesentlichen vollständig (d.h. zu mehr als 98 Gew.-%) abtrennen lassen. The (blood) plasma protein to be purified is expediently a (blood) plasma protein which is essentially not absorbed by the sorbent. Preferably, the (blood) plasma protein is albumin, preferably human albumin. In albumin, it has also been observed that in contrast to commercially available ion exchangers, immunoglobulin X contaminants (ie, particularly IgG, IgA, IgE and IgM) and factors (XI and XIa) in a chromatographic step of albumin are substantially complete (ie more as 98% by weight).
Vorzugsweise sollte das aufzureinigende Albumin kein Transferrin oder nur geringe Mengen davon, d.h. weniger als 10 Gew.-% bezogen auf das Preferably, the albumin to be purified should not contain transferrin or only small amounts thereof, i. less than 10 wt .-% based on the
Gesamtgewicht des Gemischs, enthalten. Total weight of the mixture.
Als (Blut)Plasmaproteinmischung können ebenfalls vorgereinigte As (blood) plasma protein mixture can also pre-purified
(Blut)Plasmaproteinmischungen, besonders bevorzugt vorgereinigten (Blood) plasma protein mixtures, more preferably pre-purified
Albuminmischungen, eingesetzt werden, in denen das Albumin vorzugsweise mindestens 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 85 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, und am meisten bevorzugt 92 bis 98 Gew.-% des (Blut)Plasmaproteingemisches, jeweils bezogen auf das Trockengewicht des Gemischs, ausmacht. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte (Blut)Plasmaproteinmischung ist eine vorgereinigte Albuminlösung mit einem Albumingehalt (bezogen auf das Trockengewicht der Albuminmischung) von 92 bis 98 Gew.-%. Albumin mixtures, in which the albumin is preferably at least 80% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 90% by weight, and most preferably 92 to 98% by weight of (blood ) Plasma protein mixture, each based on the dry weight of the mixture. A (blood) plasma protein mixture which is particularly preferred in the context of the present invention is a prepurified albumin solution with an albumin content (based on the dry weight of the albumin mixture) of 92 to 98% by weight.
Bei dem im vorstehend beschriebenen Verfahren verwendeten Sorbenz handelt es sich um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt besteht das The sorbent used in the process described above is a solid support material whose surface is functionalized with at least two receptor molecules. This is especially preferred
Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyaminverbindung zunächst mit dieser Aminverbidung in mindestens einer Lage überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten Rezeptormolekülen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. Bei dem
porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol. Als Polyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyvinylamin als besonders zweckmäßig erwiesen. Das Trägermaterial wird durch die Zugabe eines Support material of a porous base material, which is initially coated for incorporation and crosslinking of a polyamine compound with this Aminverbidung in at least one layer and then functionalized with the attachment of functionalized receptor molecules to form covalent bonds between the receptor molecules and the polyamine. In which porous base material is suitably a porous polystyrene. As a polyamine compound, the use of polyvinylamine has been found to be particularly useful. The carrier material is made by adding a
Vernetzungsmittels, beispielsweise einem Diepoxid, vernetzt. Die Herstellung des Trägermaterials kann durch Beschichtung des porösen Grundmaterials mit einer Schicht einer Polyaminverbindung erfolgen, es ist jedoch auch möglich, das Grundmaterial mit zwei oder mehreren Schichten zu überziehen. Vor dem Crosslinking agent, such as a diepoxide crosslinked. The preparation of the support material can be done by coating the porous base material with a layer of a polyamine compound, but it is also possible to coat the base material with two or more layers. Before the
Aufbringen der jeweils weiteren Schicht erfolgt zweckmäßig eine Vernetzung der aufgebrachten Polyaminverbindung, beispielsweise mit einem Vernetzungsmittel, wie vorstehend beschrieben. Application of the respective further layer is expediently carried out a crosslinking of the applied polyamine compound, for example with a crosslinking agent, as described above.
Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in EP 1 141 038 und EP 1 232 018 beschrieben worden. The preparation of support materials which are coated with polyvinylamine has already been described in the prior art, for example in EP 1 141 038 and EP 1 232 018.
Anschließend wird das so erhaltene mit Polyamin beschichtete Sorbenz mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen. Subsequently, the polyamine-coated sorbent thus obtained is functionalized with two organic radicals. In particular, the use of acid-functionalized receptor molecules or derivatives thereof in which amide linkages are formed after reaction with the polyvinylamine has proven to be particularly useful.
Es ist möglich, die im Sorbenz vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 15 bis 98 % der freien Amingruppen des Polyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden. It is possible to completely functionalize the amine groups present in the sorbent with organic radicals. However, in the practice of the present invention, it is desirable that only about 15 to 98% of the free amine groups of the polyamine be reacted with receptor molecules.
Für das Sorbenz hat es sich gezeigt, dass zum einen Rezeptormoleküle mit einem Pyridinring (-CSH4N) deren Wasserstoffatome substituiert sein können und For the Sorbenz it has been shown that, for a receptor molecules with a pyridine ring (-C S H 4 N) whose hydrogen atoms can be substituted, and
Carboxylgruppen (-COOH) zu besonders selektiven Sorbenzien führen. Dabei können sowohl der Pyridinring als auch die Carboxylgruppe über einen kovalent gebundenen Linker mit dem Polyaminmaterial verbunden sein. Falls ein Linker vorhanden ist, ist dieser vorzugsweise konformationell flexibel, damit sich das
Rezeptormolekül in die für die Bindung des Peptids oder Proteins günstigste Position drehen kann. Carboxylic groups (-COOH) lead to particularly selective sorbents. Both the pyridine ring and the carboxyl group can be connected via a covalently bound linker with the polyamine material. If a linker is present, it is preferably conformationally flexible to allow the Receptor molecule in the most favorable position for the binding of the peptide or protein position can rotate.
Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidbindungen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Zur Bildung solcher For the linkage of the receptor molecules with the solid support material, all known methods for linking amines with other functional groups are suitable, in particular processes for forming amide bonds, sulfonamide bonds or the reaction of the amines with aldehydes under reductive conditions. If an acid functionality is used for linking with the amine radicals of the support material, an amide functionality is generally obtained after the reaction with which the receptor molecule is bound to the support material. To form such
Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen Amide linkages are all described in the prior art
Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind. Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in Types of reactions which are familiar to the person skilled in the art. The binding of receptor molecules to support materials as described above has also been described in the prior art, in particular in US Pat
WO 2004/085046, beschrieben. WO 2004/085046.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es zweckmäßig sein, das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf das Sorbenz mit einer weiteren Flüssigkeit zu equilibrieren. Dazu wird vorzugsweise eine Flüssigkeit verwendet, die eine Lösung mit dem pH-Bereich von 4 bis 6,5, vorzugsweise ein Puffer mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5 ist. Für das Equilibrieren hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn der Puffer eine Konzentration im Bereich von 2 bis 350 mM und vorzugsweise 5 bis 15 mM aufweist. Weiterhin ist es In the context of the present invention, it may be expedient to equilibrate the sorbent with another liquid before applying the (blood) plasma protein to the sorbent. For this, it is preferable to use a liquid which is a solution having the pH range of 4 to 6.5, preferably a buffer having a pH in the range of 4 to 6.5. For equilibration, it has been found to be useful if the buffer has a concentration in the range of 2 to 350 mM and preferably 5 to 15 mM. It continues
zweckmäßig, einen Puffer auf demselben Säure/Salzsystem zu wählen, wie er für das anschließende Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf das Sorbenz verwendet wird. Nach dem Equilibrieren ist es möglich, das Sorbenz vor dem Aufbringen der Mischung des (Biut)Plasmaproteins noch mit derselben Flüssigkeit zu spülen. it is expedient to choose a buffer on the same acid / salt system as used for the subsequent application of the (blood) plasma protein to the sorbent. After equilibration it is possible to rinse the sorbent with the same liquid before applying the mixture of the (Biut) plasma protein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, wenn nach dem Isolieren des zu reinigenden (Blut)Plasmaproteins das Sorbenz nachgeschalteten Waschschritten unterzogen wird. Schließlich ist es möglich, das Sorbenz nach
Abschluss des Waschens mit einer stark basischen Lösung zu regenerieren und von den auf dem Sorbenz verbleibenden (Blut)Plasmaproteinresten zu reinigen. Dabei beträgt der pH-Wert der stark basischen Lösung vorteilhaft mindestens 10, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von etwa 14 verwendet. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid zu verwenden . Vor der Regenerierung kann das Sorbenz weiterhin noch mit einer Säurelösung gespült werden, wobei diese insbesondere eine Konzentration im Bereich von 250 bis 1500 mM aufweisen kann. In the context of the present invention, it is furthermore possible if, after isolation of the (blood) plasma protein to be purified, the sorbent is subjected to subsequent washing steps. Finally, it is possible to after the sorbent To complete the wash with a strongly basic solution to regenerate and to cleanse of remaining on the sorbent (blood) plasma protein residues. The pH of the strongly basic solution is advantageously at least 10, more preferably a pH of about 14 is used. Any commercially available base can be used as the base, but for reasons of cost it is advisable to use sodium hydroxide or potassium hydroxide. Before regeneration, the sorbent can still be rinsed with an acid solution, which in particular may have a concentration in the range of 250 to 1500 mM.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines wie vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa, von einem Another aspect of the present invention relates to the use of a method as described above for separating one or more selected from IgA, IgM, Factor XI and Factor XIa from one
(Blut)Plasmaprotein . Bei diesem Plasmaprotein handelt es sich vorzugsweise ebenfalls um Albumin, insbesondere um menschliches Albumin. (Blood) plasma protein. This plasma protein is preferably also albumin, especially human albumin.
Schließlich betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Finally, another aspect of the present invention relates to
Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Pyridin-4-carboxamidoresten und 3-Carboxamidopropionsäure- resten funktionalisiert ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus Albumin und besonders bevorzugt aus menschlichem Albumin . Bezüglich von bevorzugten Ausführungsformen sind die vorstehenden Ausführungen zum Use of a sorbent comprising a solid support surface functionalized with pyridine-4-carboxamido radicals and 3-carboxamidopropionic acid residues to separate one or more selected from IgA, IgM, Factor XI and Factor XIa from (blood) plasma proteins , preferably of albumin, and more preferably of human albumin. With regard to preferred embodiments, the above statements are for
Verfahren entsprechend auf die Verwendung übertragbar. Procedure applicable to the use transferable.
Wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Albumin, das Verunreinigungen aus Immunoglobulin G und Immunoglobulin M enthält, gereinigt, so ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls möglich, diese Nebenbestandteile in hoher Reinheit von dem verwendeten Sorbenz zu isolieren. Nach der Abtrennung des Albumins kann beispielsweise das Immunoglobulin G zweckmäßig mit einem Puffer eines pH-Werts im Bereich von 6 bis 8, vorzugsweise 7 bis 7,8 isoliert werden. Die Konzentration des Puffers sollte in diesem Fall vorzugsweise im Bereich von 50 bis 250 mM, besonders bevorzugt im Bereich von 80 bis 150 mM liegen. Ein besonders bevorzugter Puffer für die Isolierung von Immunoglobulin G ist ein Phosphatpuffer. Nach Isolation von Immunoglobulin G oder falls dieses in der Mischung nicht enthalten ist, kann in der Mischung enthaltenes
Immunoglobulin M zweckmäßig durch Elution mit einem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 5, vorzugsweise etwa 4 vom Sorbenz isoliert werden. Dieser Puffer weist vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 50 bis 1000 mM und besonders bevorzugt im Bereich von 80 bis 150 mM auf. Ein für die Elution von Immunoglobulin M besonders geeigneter Puffer ist ein Acetatpuffer. If albumin containing immunoglobulin G and immunoglobulin M impurities is purified in the context of the present invention, it is likewise possible within the scope of the present invention to isolate these secondary constituents in high purity from the sorbent used. For example, after separation of the albumin, the immunoglobulin G can be conveniently isolated with a buffer of pH in the range of 6 to 8, preferably 7 to 7.8. The concentration of the buffer in this case should preferably be in the range of 50 to 250 mM, more preferably in the range of 80 to 150 mM. A particularly preferred buffer for the isolation of immunoglobulin G is a phosphate buffer. After isolation of immunoglobulin G or if this is not included in the mixture, may be included in the mixture Immunoglobulin M is conveniently isolated from the sorbent by elution with a buffer having a pH in the range of 3 to 5, preferably about 4. This buffer preferably has a concentration in the range of 50 to 1000 mM and more preferably in the range of 80 to 150 mM. A particularly suitable buffer for the elution of immunoglobulin M is an acetate buffer.
Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren lassen sich (Blut)Plasmaproteine, insbesondere Albumin, in einem einzigen Schritt schnell und kostengünstig reinigen. Darüber hinaus ist es mit dem beschriebenen Verfahren möglich, unerwünschte Nebenbestandteile, wie IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinmischungen zu entfernen. With the method described above, (blood) plasma proteins, in particular albumin, can be purified rapidly and inexpensively in a single step. In addition, with the described method it is possible to remove unwanted minor components, such as IgA, IgM, Factor XI and Factor XIa, from (blood) plasma protein mixtures.
Das folgende Beispiel dient der Illustration der beschriebenen Erfindung und soll deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken. The following example is illustrative of the invention described and is not intended to limit its scope in any way.
Beispiel 1 example 1
Ein mit Pyridin-4-carboxamidoresten und 3-Carboxamidopropionsäureresten funktionalisiertes Sorbenz wird mit 10 mM-Citratpuffer (pH 5) equilibriert. A sorbent functionalized with pyridine-4-carboxamido radicals and 3-carboxamidopropionic acid residues is equilibrated with 10 mM citrate buffer (pH 5).
Anschließend wird eine Mischung aus 40 g/l Albumin mit 1 g/l IgG, 1,4 g/l IgA und 0,4 g/l IgM gelöst in 10 mM Citratpuffer bei pH 5 auf das Sorbenz Subsequently, a mixture of 40 g / l albumin with 1 g / l IgG, 1.4 g / l IgA and 0.4 g / l IgM dissolved in 10 mM citrate buffer at pH 5 on the sorbent
aufgebracht. Die Beladung des Sorbenzes betrug etwa 50 mg/ml. Das Albumin wurde in einer Ausbeute von > 93% isoliert, wobei die Verunreinigung an IgA in diesem Produkt < 25 mg/l, die von IgM < 5 mg/l und die von IgG < 1 mg/l betrugen. Die anschließende Elution von Immunoglobulin G vom Sorbenz mit einem 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) lieferte Immunoglobulin G in einer Ausbeute > 95%, wobei die Menge an Verunreinigung von Albumin < 1 mg/l betrugen. applied. The loading of the sorbent was about 50 mg / ml. Albumin was isolated in> 93% yield with IgA contamination in this product <25 mg / L, IgM <5 mg / L and IgG <1 mg / L. Subsequent elution of immunoglobulin G from the sorbent with a 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) provided immunoglobulin G in> 95% yield, with the amount of contamination of albumin <1 mg / L.
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Claims
Ansprüche Expectations
1, Einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Pyridin-4-carboxamido-Resten und 3- Carboxamidopropionsäure-Resten funktionalisiert ist und das Eluieren des 1, One-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein to a sorbent comprising a solid support material, the surface of which has pyridine-4-carboxamido residues and 3-carboxamidopropionic acid residues and the elution of the
(Blut)plasmaprotein von dem Sorbenz, (blood) plasma protein from the sorbent,
2, Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen nicht absorbiert, 2, method according to claim 1, characterized in that the sorbent essentially does not absorb the (blood) plasma protein to be purified,
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein für das Aufbringen auf das Sorbenz in einem Puffer, vorzugsweise mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5, und besonders bevorzugt in Citratpuffer, gelöst wird. 3. Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the (blood) plasma protein for application to the sorbent is dissolved in a buffer, preferably with a pH in the range from 4 to 6.5, and particularly preferably in citrate buffer becomes.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült wird, bis das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen vollständig von Sorbenz eluiert ist. 4. The method according to claim 3, characterized in that the sorbent is rinsed with the buffer until the (blood) plasma protein to be purified is essentially completely eluted from sorbent.
5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein in einer Menge von > 50 mg/ml Sorbenzvolumen, vorzugsweise in einer Menge im Bereich von 120 bis 250 mg/ml Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen wird, 5. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein is applied to the sorbent in an amount of > 50 mg/ml sorbent volume, preferably in an amount in the range of 120 to 250 mg/ml sorbent volume,
6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das es sich bei dem (Blut)plasmaprotein um Albumin, vorzugsweise um menschliches Albumin, handelt. 6. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein is albumin, preferably human albumin.
7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf das Sorbenz mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird.
7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the sorbent is equilibrated with a further liquid before the (blood) plasma protein is applied to the sorbent.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zum 8. The method according to claim 7, characterized in that the to
Equilibrieren verwendete Flüssigkeit eine Lösung mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5, vorzugsweise ein Puffer, ist, The liquid used for equilibration is a solution with a pH in the range of 4 to 6.5, preferably a buffer,
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Citrat-Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 2 bis 20 mM, vorzugsweise 5 bis 15 mM ist, 9. The method according to claim 8, characterized in that the solution is a citrate buffer with a concentration in the range from 2 to 20 mM, preferably 5 to 15 mM,
10. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch 10. Method according to one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass das Sorbenz durch Spülen mit einer Lösung, die einen pH von mindestens 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 14, aufweist, regeneriert wird. characterized in that the sorbent is regenerated by rinsing with a solution having a pH of at least 10, preferably in the range of about 14.
11. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch 11. Method according to one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass als festes Trägermaterial ein Material verwendet wird, das auf einem porösen Grundmaterial, vorzugsweise aus Polystyrol, beruht, welches mit einem Polymer, vorzugsweise einem Polyaminpolymer, in mindestens einer Lage überzogen, vernetzt und anschließend funktionalisiert wurde. characterized in that the solid carrier material used is a material which is based on a porous base material, preferably made of polystyrene, which has been coated with a polymer, preferably a polyamine polymer, in at least one layer, crosslinked and then functionalized.
12. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa, von einem (Blut)plasmaprotein. 12. Use of a method according to one of claims 1 to 11 for separating one or more, selected from IgA, IgM, factor XI and factor XIa, from a (blood) plasma protein.
13. Verwendung eines Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Pyridin-4-carboxamido-Resten und 3-Carboxamidopropionsäure-13. Use of a sorbent comprising a solid carrier material, the surface of which has pyridine-4-carboxamido residues and 3-carboxamidopropionic acid
Resten funktionalisiert ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)plasmaproteinen, bevorzugt aus Albumin. Residues are functionalized for the separation of one or more selected from IgA, IgM, factor XI and factor XIa, from (blood) plasma proteins, preferably from albumin.
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