WO2014065410A1 - Ｈｌａ遺伝子のｄｎａタイピング方法及びキット - Google Patents

Ｈｌａ遺伝子のｄｎａタイピング方法及びキット Download PDF

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一善 細道
滋樹 光永
猪子　英俊
逸朗 井ノ上
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ジェノダイブファーマ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for DNA typing of HLA genes using a massively parallel sequencer.
  • HLA Human leukocyte antigen
  • MHC histocompatibility complex
  • HLA class I antigen consists of ⁇ -chain showing high polymorphism and ⁇ 2-microglobulin with little polymorphism
  • HLA class II antigen is ⁇ -chain with high polymorphism and ⁇ with little polymorphism. Consists of chains. ⁇ chain of class I molecule is encoded by HLA-A, HLA-B and HLA-C genes
  • ⁇ chain of class II antigen is HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1
  • ⁇ chain is HLA-DRA1 , HLA-DQA1, and HLA-DPA1 gene.
  • exon 2 and exon 3 of the gene encoding the ⁇ chain show high polymorphism in the HLA class I antigen, and exon 2 of the gene encoding the ⁇ chain in the HLA class II antigen is advanced. Show polymorphism.
  • the gene region encoding HLA is located in human chromosome 6 short arm 6p21.3, class I region (HLA-A, HLA-C, HLA-B, etc.) from the telomere side toward the centromere side, Class III region, class II region (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) are arranged in this order, and many genes are encoded at very high density. The relationship between blood transfusion and transplantation and various diseases has been reported. There is no HLA gene in the class III region, and genes such as complement components and tumor necrosis factor (TNF) are present.
  • TNF tumor necrosis factor
  • HLA-DRB gene region encoding the ⁇ chain of the HLA-DR antigen.
  • pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1.
  • HLA-DRB5 (DR51) gene and pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1.
  • DR3 DR52
  • HLA-DRB2 HLA-DRB9
  • DR4 DR7 and DR9 types
  • pseudogenes such as HLA-DRB4 (DR53) gene
  • HLA-DRB7, HLA-DRB8 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome.
  • DR8 type no HLA-DRB gene other than HLA-DRB1 is located on the same chromosome.
  • Each allele exon has a plurality of polymorphic regions, and the base sequence (amino acid sequence) of a polymorphic region is often common to a plurality of alleles. That is, each HLA allele is defined by a combination of multiple polymorphic regions. In the HLA class I antigen, exon 2 or exon 3 having the same base sequence as well as the polymorphic region in the exon may be common to a plurality of alleles.
  • HLA is known to have an extremely large number of alleles due to the presence of advanced polymorphisms, and their notation is also determined. That is, the first zone for discriminating serological HLA type (2 digit level), the second zone for discriminating alleles with amino acid substitution within the same serological HLA type (4 digit level), and no amino acid mutation The third zone (6 digit level) that discriminates alleles in which base substitution is recognized, and the fourth zone (8 digit level) that discriminates alleles with base substitution outside the gene region encoding the HLA molecule (intron). .
  • the conventional method is a DNA typing method using PCR centering on the exon region of each gene, it misses base substitution in the intron region and the promoter region, and as a result, the gene structure has other expression HLA. It was possible to miss the detection of a null allele that is not different from the gene but whose expression is suppressed.
  • An object of the present invention is to provide a highly accurate DNA typing method and kit that eliminates ambiguity derived from phase ambiguity.
  • the present invention provides an HLA DNA typing method including the following steps.
  • Primer sets sequences that specifically anneal to the upstream region and downstream region of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 in the human genome sequence
  • Preparing a pair of oligonucleotides comprising a base sequence shown in any of Nos. 1 to 12 Preparing a pair of oligonucleotides comprising a base sequence shown in any of Nos. 1 to 12;
  • PCR-amplifying a test sample (DNA) using the primer set (3) determining the base sequence of the PCR amplified product; and (4) performing a homology search with the database.
  • the method of the present invention provides the entire base sequence necessary for DNA typing of the 6-locus of the HLA gene from one molecule, so that the ultimate DNA typing in which phase ambiguity with unknown cis-trans positional relationship is eliminated Is the law. As a result, high-accuracy HLA matching between the transplant candidate and the donor candidate at the time of transplantation is realized. Since the entire nucleotide sequence of the gene including peripheral regions such as the promoter region, exon region, and intron region of the HLA gene is determined, it is possible to detect null alleles or novel alleles that are not expressed at all or whose expression is suppressed.
  • (A) It is a figure which shows the relationship between HLA class I gene structure and molecular structure.
  • (B) It is a figure which shows the structure of the promoter area
  • (A) It is a figure which shows the relationship between HLA class II gene structure and molecular structure.
  • (B) It is a figure which shows the structure of the promoter area
  • Primer set preparation step In the DNA typing method of the present invention, first, upstream of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 in the human genome sequence.
  • a primer set (a pair of oligonucleotides comprising a base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 12) that specifically anneals to each of the region and the downstream region is prepared.
  • the genomic base sequence of human chromosome 6 (6p21.3) including the region where the HLA gene is present has already been elucidated, and the relationship between the gene structure and the structure of the expression product (HLA molecule) is also known (Fig. 1 and FIG. 2).
  • HLA-A, HLA-B and HLA-C which are called classical HLA class I molecules, contain 7 or 8 exons (FIG. 1 (a)).
  • HLA-A, HLA-B and HLA-C which are called classical HLA class I molecules, contain 7 or 8 exons (FIG. 1 (a)).
  • enhancers and promoter regions There are two types of enhancers and promoter regions, and expression is regulated (FIG. 1 (b)).
  • the conventional DNA typing method particularly performs PCR using primers prepared based on exons 2 and 3. As a result, the phase ambiguity problem has arisen as described above.
  • HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP which are said to be classical HLA class II molecules, are composed of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and each gene contains 5 or 6 exons (FIG. 2).
  • A) the promoter region is located outside exon 1, and expression is regulated (FIG. 2 (b)).
  • PCR using a primer prepared based on exon 2 is performed, and accordingly As mentioned above, there was a phase ambiguity problem.
  • the classical class I molecules HLA-A, HLA-B, HLA-C
  • all of the classical class II molecules HLA-DRB1, HLA-DPB1 and HLA-DQB1 gene regions (not only exons) Intron, 5 'and 3' untranslated regions, including a promoter region)
  • a primer set capable of PCR amplification is prepared, and PCR amplified PCR products are used for next-generation sequencing described below.
  • Uncertainties such as phase ambiguity can be eliminated, and the presence or absence of null allyl can be accurately detected.
  • PCR primer sets listed in Table 1 below are prepared.
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-A gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-A gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 1 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 29,910,189th position to the 29,910,212th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
  • SEQ ID NO: 2 is a reverse primer having a base sequence complementary to a base corresponding to the 29th, 913, 562th to 29th, 913, 586th from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is about 3,398 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 3 and 4 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-B gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-B gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 3 is a forward primer having a base sequence corresponding to the 31,321,366th position to the 31,321,392rd position from the telomere side in the HLA region of the human genome base sequence.
  • SEQ ID NO: 4 is a reverse primer having a base sequence complementary to the bases corresponding to the 31st, 325th, 632rd to 31st, 325th, 661th positions from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 4,296 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-C gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-C gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 5 is a forward primer having a base sequence corresponding to the 31st, 235, 959th to the 31st, 235, 982th from the telomere side in the HLA region of the human genome base sequence.
  • SEQ ID NO: 6 is a reverse primer having a base sequence complementary to the bases corresponding to the 31st, 240th, 373rd to 31st, 240th, 398th from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is about 4,440 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 7 and 8 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DRB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 7 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,220th position to the 32,546,247th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
  • SEQ ID NO: 8 is a reverse primer having a base sequence complementary to the bases corresponding to the 32,558,090th position to the 32,558,118th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 11,899 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 9 and 10 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DPB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 9 is a forward primer having a base sequence corresponding to the 33,042,795th to 33,042,823th from the telomere side in the HLA region of the human genome base sequence.
  • SEQ ID NO: 10 is a reverse primer having a base sequence complementary to the base corresponding to the 33,056,373rd position to the 33,056,399th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 13,605 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 11 and 12 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 11 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 32,627,718th position to the 32,627,743th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
  • SEQ ID NO: 12 is a reverse primer having a base sequence complementary to the base corresponding to the 32,634,812th position to the 32,634,835th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,118 bases (bp).
  • primers can be prepared by a technique usually used in this field.
  • the primer set shown in Table 1 shows the most preferable example.
  • forward In the method of the present invention, forward (Forward) in which the entire region of each gene of HLA can be annealed at a position between the upstream side and the downstream side.
  • a set of a primer and a reverse primer those having 1 to several base substitutions, insertions or deletions in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 can be similarly used.
  • the test sample (DNA) is PCR amplified using the primer set prepared in step (1).
  • the PCR amplification reaction is performed according to a normal protocol. Specifically, it is as follows. 1. DNA is extracted from the sample according to the form of the test sample. 2. The extracted DNA is quantified, and a primer solution is appropriately set to prepare a reaction solution. 3. Set the reaction conditions and perform the PCR reaction. Example: Thermal denaturation step (usually 92-97 ° C) Annealing step (usually 55-72 ° C) Elongation step (usually 65-80 ° C) 4). The obtained PCR product is purified and subjected to the next nucleotide sequencing step.
  • step (3) A base sequence determination step. Next, the base sequence of the PCR product (amplified DNA) generated in step (2) is determined. This step is preferably performed by using a so-called next-generation sequence (or ultra-high speed sequence). For the next-generation sequence, see, for example, “Experimental Medicine” Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodosha).
  • a DNA library is prepared using a Nextera TM DNA sample preparation kit manufactured by Illumina and sequenced using a genome sequencer MiSeq system (Illumina).
  • the library can be prepared in a short time of about 90 minutes or less. Paired end analysis is preferably used for sequencing the resulting sample.
  • step (3) by comparing the base sequence obtained in step (3) with the data of the base sequence database of known HLA alleles, the allele type of the DNA contained in the test sample (Up to 8 digits) is determined.
  • the primer set described in Table 1 is used as a representative example. It is characterized in that primers are set at positions sandwiching the entire HLA class I and HLA class II gene regions, and the amplified DNA is sequenced over almost the entire region of each gene. Guity (uncertainty) can be eliminated and information on null allyl can be obtained. That is, the present invention also provides a kit for HLA genotyping comprising a primer comprising an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1-12.
  • PCR reaction was performed using each HLA gene-specific primer set (see Table 1) using the already extracted genomic DNA as a template.
  • the specific procedure is as follows.
  • (1) PCR amplification was performed using Prime STAR GXL polymerase (TaKaRa) with the following composition.
  • Genomic DNA solution (10 ng) 0.5 ⁇ L 5x PrimeSTAR GXL buffer 2 ⁇ L dNTP solution 0.8 ⁇ L Forward primer (5 pmol) 0.4 ⁇ L Reverse primer (5 pmol) 0.4 ⁇ L PrimeSTAR GXL polymerase 0.4 ⁇ L Sterile water 5.5 ⁇ L Total 10 ⁇ L
  • the base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows. A DNA library was prepared from the resulting PCR amplification product using the Nextera TM DNA sample preparation kit (Illumina) and sequenced at 150 bp paired end using the MiSeq system (Illumina). Nextera TM DNA sample preparation kit can prepare DNA library in 90 minutes including reaction time by simultaneously performing DNA cleavage called tagmentation and insertion of tag sequence via Nextera transposome. It has the feature of becoming. Further, by using two types of indexes, a maximum of 96 types (Index 1: 8 types + Index 2: 12 types) of samples can be analyzed simultaneously. Another feature is that, unlike other next-generation sequencer DNA library preparations, the starting DNA requirement is only 50 ng.
  • the insert size of the prepared DNA library is as wide as 200 bp to 1 kb or more, which is a feature and merit of this method.
  • HLA typing is performed by data analysis. This data analysis is the most original point of this method.
  • the sequence reads obtained were mapped by BWA (Burrows-Wheeler Aligner) and SAMTools (Sequence Alignment / Map tool) against the reference sequence of each PCR amplification region to obtain analysis results as diplotypes, and Picard and Genome A base different from the reference sequence is detected by Analysis Toolkit (GATK).
  • BWA Brownrows-Wheeler Aligner
  • SAMTools Sequence Alignment / Map tool
  • the phases are classified based on the SNV only based on the pair information shown in the sequence read, and this phase is divided into 2 based on the SNV of the haplotype that is divided.
  • Two HLA gene sequences are generated.
  • one paired-end sequence lead needs to contain two or more SNVs.
  • the distance between two or more SNVs varies, but the HLA gene is very diverse and the insert size of the DNA library prepared with the Nextera TM DNA sample preparation kit is 200 bp to 1 kb or more.
  • the wide feature makes it possible to specify a phase containing two or more SNVs.
  • the confirmation of the SNV divided into phases and the phase of Indel are determined.
  • Indel detected in the first mapping result includes false positives, but in the second mapping, it is mapped to a base sequence having no SNV, so that Indel can be determined with certainty.
  • the two consensus sequences obtained in the second mapping are the sequences of the two HLA genes, and searching this in the IMGT / HLA database reveals whether the HLA allele is new or known. If the HLA allyl is known, the HLA allyl number can be obtained.
  • PCR primers that specifically amplify each of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 were designed, and PCR was performed under the conditions described above.
  • PCR amplification product was electrophoresed by agarose gel electrophoresis, a single amplification product was obtained at the position of the target molecular weight for each HLA gene (FIG. 4).
  • Table 2 shows the HLA allyl type determined using the method of the present invention and the HLA allyl type determined using the conventional SSO method for some of the samples employed. While the SSO method could only specify up to the 4-digit level, the method (Example) of the present invention could determine the allyl type in detail up to the 6-digit or 8-digit level.
  • the method of the present invention enables 8-digit level HLA typing without phase ambiguity, and efficiently detects base substitutions, insertions and deletions in promoters and introns that cause null alleles. It is considered an excellent tool.

Abstract

【課題】　フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供する。 【解決手段】　（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット（配列番号１～１２）を準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。

Description

ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法及びキット
　本発明は、大量並列シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法及びキットに関する。
　ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっている。ヒト白血球抗原の主なものとして、ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ）の６種類の抗原が知られている。
　ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２－ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型性が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスＩ分子のα鎖はＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ－ＤＲＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
　ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
　ＨＬＡ－ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１以外のＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子は位置しない。
　各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が、複数のアリルに共通であることもある。
　ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である。
　骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのＨＬＡタイプが４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のＧＶＨＤ頻度が低下すると言われている。逆に、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＨＬＡタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
　ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）－Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
　これら従来のＤＮＡタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ　ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＨＬＡタイピングが難しい場合があった。
　また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするＰＣＲを用いたＤＮＡタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出を見逃す可能性があった。
特開平１１－２１６０００号公報
Ｌｉｎｄ　Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３－１０４２頁（２０１０年）
　本発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、クラスＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＣならびにクラスＩＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の６座について、それらのＨＬＡ遺伝子を特異的に増幅しうるＰＣＲプライマーを新たに設計し、好適なＰＣＲ条件を設定して、大量並列シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち本発明は、以下のステップを含むＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット（配列番号１～１２のいずれかに示す塩基配列を含んでなる一対のオリゴヌクレオチド）を準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
　本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子の６座位のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のＤＮＡタイピング法である。これにより、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なＨＬＡの一致が実現される。
　ＨＬＡ遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているヌルアリルや新規アリルの検出が可能となる。
（ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。 （ａ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁～第４７頁から引用した。 ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。 実施例で増幅したＰＣＲ産物の増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
　以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
　本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット（配列番号１～１２のいずれかに示す塩基配列を含んでなる一対のオリゴヌクレオチド）を準備する。
　ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＨＬＡ分子）の構造との関連も知られている（図１と図２参照）。
　即ち、古典的ＨＬＡクラスＩ分子と言われるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの遺伝子は７個又は８個のエクソンを含んでおり（図１（ａ））、エクソン１の外側には２種類のエンハンサーやプロモーター領域があって発現が調節されている（図１（ｂ））。
　さらに、エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２及び３に基づいて作製されたプライマーを用いたＰＣＲが行われ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
　また、古典的ＨＬＡクラスＩＩ分子と言われるＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含んでおり（図２（ａ））、エクソン１の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている（図２（ｂ））。
　さらに、エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２に基づいて作製されたプライマーを用いたＰＣＲが行われ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
　本発明では、古典的クラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ）ならびに古典的クラスＩＩ分子のＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１の遺伝子領域の全て（エクソンのみならず、イントロン、５’側と３’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む）をＰＣＲ増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を後述する次世代シークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ヌルアリルの有無も正確に検知することができる。
　具体的には、下記表１に掲げるＰＣＲプライマーセットを調製する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１における配列番号１及び２は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第２９，９１０，１８９番目から第２９，９１０，２１２番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
　配列番号２は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第２９，９１３，５６２番目から第２９，９１３，５８６番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約３，３９８塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号３及び４は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から３１，３２１，３６６　番目から第３１，３２１，３９２番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
　配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３１，３２５，６３２番目から第３１，３２５，６６１番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，２９６塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号５及び６は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３１，２３５，９５９番目から第３１，２３５，９８２番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
　配列番号６は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３１，２４０，３７３番目から第３１，２４０，３９８番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，４４０塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号７及び８は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号７は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３２，５４６，２２０番目から第３２，５４６，２４７番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
　配列番号８は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３２，５５８，０９０番目から第３２，５５８，１１８番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１１，８９９塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号９と１０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号９は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３３，０４２，７９５番目から第３３，０４２，８２３番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
　配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３３，０５６，３７３番目から第３３，０５６，３９９番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１３，６０５塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号１１と１２は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３２，６２７，７１８番目から第３２，６２７，７４３番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
　配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第３２，６３４，８１２番目から第３２，６３４，８３５番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，１１８塩基（ｂｐ）である。
　これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニール可能なフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとのセットであれば、配列番号１～１２に示した塩基配列に、１から数個の塩基の置換、挿入又は欠損を有するものを同様に使用することができる。
（２）ＰＣＲ増幅ステップ
　本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅する。
　ＰＣＲ増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
３．反応条件を設定してＰＣＲ反応を実施する。
　例：熱変性ステップ（通常は９２～９７℃）
　　　アニーリングステップ（通常は５５～７２℃）
　　　伸長ステップ（通常は６５～８０℃）
４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
（３）塩基配列決定ステップ。
　次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス（あるいは超高速シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。
　例えば、イルミナ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）社のＮｅｘｔｅｒａＴＭＤＮＡサンプル調製キットを用いてＤＮＡライブラリーを作製し、ゲノムシークエンサーＭｉＳｅｑシステム（イルミナ社）を用いて配列決定する方法などが挙げられる。
　この方法では、トランスポソームを介するＤＮＡの断片化とアダプター結合が同時に行われるので、ライブラリーの調製が約９０分以内という短時間で実施できる。得られたサンプルの配列決定には、好ましくはペアエンド解析が用いられる。
（４）ＤＮＡタイピングステップ
　次いで、前記ステップ（３）で得られた塩基配列を、既知のＨＬＡ対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡのアリル型（８桁まで）が決定される。
　本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、各遺伝子のほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってフェーズ・アンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ヌルアリルに関する情報を得ることもできる。
　すなわち本発明は、配列番号１～１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むＨＬＡ遺伝子タイピング用キットも提供する。
　以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
［実験方法］
１．既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、各ＨＬＡ遺伝子特異的プライマーセット（表１参照）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲ増幅はＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用い、以下の組成で実施した。
　ゲノムＤＮＡ溶液（１０ｎｇ）　　　　　　０．５μＬ
　５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ緩衝液　　　　２μＬ
　ｄＮＴＰ溶液　　　　　　　　　　　　　　０．８μＬ
　フォワード・プライマー（５ｐｍｏｌ）　　０．４μＬ
　リバース・プライマー（５ｐｍｏｌ）　　　０．４μＬ
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼ　０．４μＬ
　滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　５．５μＬ
　合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μＬ
（２）上記ＰＣＲ増幅反応液を９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で１０分間の２ステップを１工程として、この工程を３０回繰り返してＰＣＲ増幅を行った。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図４に示した。
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
　得られたＰＣＲ増幅産物からＮｅｘｔｅｒａＴＭＤＮＡサンプル調製キット（イルミナ社）を用いてＤＮＡライブラリーを調製し、ＭｉＳｅｑシステム（イルミナ社）を用いて１５０ｂｐペアエンドで配列決定した。ＮｅｘｔｅｒａＴＭＤＮＡサンプル調製キットは、Ｎｅｘｔｅｒａトランスポソームを介するタグメンテーションと呼ばれるＤＮＡ切断化とタグ配列の挿入を同時に行うことにより反応時間を含めて９０分という短時間でのＤＮＡライブラリーの調製が可能となるという特徴を有する。また、２種類のＩｎｄｅｘを用いることで最大９６種類（Ｉｎｄｅｘ１：８種類＋Ｉｎｄｅｘ２：１２種類）のサンプルを同時に解析することもできる。また、他の次世代シーケンサーのＤＮＡライブラリー調製と異なり、開始ＤＮＡ必要量がわずか５０ｎｇというのも特徴の一つである。さらに、調製したＤＮＡライブラリーのインサートサイズが２００ｂｐ～１ｋｂ以上と非常に幅が広いことも、本手法での特徴とメリットとなっている。単一なＰＣＲに由来する良質なシークエンス情報を得た後、データ解析によりＨＬＡタイピングを行うが、このデータ解析が本法の最も独創的な点である。まず得られたシークエンスリードを各ＰＣＲ増幅領域のリファレンス配列に照らしてＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ　Ａｌｉｇｎｅｒ）およびＳＡＭＴｏｏｌｓ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐツール）によりマッピングし、ディプロタイプとしての解析結果を得て、ＰｉｃａｒｄおよびＧｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ）によりリファレンス配列と異なる塩基を検出する。検出された一塩基置換（ＳＮＶ）および挿入欠失（Ｉｎｄｅｌ）のうち、シークエンスリードに示されるペア情報を元にＳＮＶのみを相を分類し、この相を分けられたハプロタイプのＳＮＶを元に２つのＨＬＡ遺伝子配列を作成する。相を特定するためには１つのペアエンドのシークエンスリードが２つ以上のＳＮＶを含むことが必要となる。２つ以上のＳＮＶ間の距離は様々であるが、ＨＬＡ遺伝子が非常に多様性に富んでいるという特徴とＮｅｘｔｅｒａＴＭＤＮＡサンプル調製キットにより調製したＤＮＡライブラリーのインサートサイズは２００ｂｐ～１ｋｂ以上と非常に幅が広いという特徴により、２つ以上のＳＮＶを含む相の特定が可能となっている。次いでこの２つのハプロタイプのＨＬＡ遺伝子配列にシークエンスリードを再度マッピングすることで相に分けられたＳＮＶの確認とＩｎｄｅｌの相を決定する。１度目のマッピング結果で検出されるＩｎｄｅｌは偽陽性を含んでいるが、２度目のマッピングではＳＮＶのない塩基配列にマッピングされるため確実にＩｎｄｅｌを決定することが可能である。２度目のマッピングで得られた２つのコンセンサス配列が２つのＨＬＡ遺伝子のシークエンスであり、これをＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースで検索することによってＨＬＡアリルが新規のものか既知のものかが明らかとなる。ＨＬＡアリルが既知のものであればＨＬＡアリル番号を得ることができる。
［結果］
　ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及びＨＬＡ-ＤＱＢ１について、それぞれ特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計し、前記の条件下でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動法により泳動したところ、各ＨＬＡ遺伝子について目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図４）。
　表２に、採用した幾つかのサンプルについて、本願発明の方法で決定したＨＬＡアリル型（実施例）及び従来のＳＳＯ法を用いて決定したＨＬＡアリル型を示す。
　ＳＳＯ法では４桁レベルまでしか特定されなかったのに対し、本発明の方法（実施例）では６桁又は８桁レベルまで詳細にアリル型を決定することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　よって本発明の方法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ヌルアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールであると考えられる。

Claims (13)

  1. （１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールする、配列番号１～１２に示す塩基配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む一対のプライマーセットを準備するステップ；
    （２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
    （３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
    （４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
  2. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ａ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ｂ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ｃ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  8. 配列番号：１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ－Ａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  9. 配列番号：３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  10. 配列番号：５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  11. 配列番号：７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  12. 配列番号：９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  13. 配列番号：１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
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