WO2014049182A1 - Utilización de una composición con peróxido de hidrógeno para detectar biofilms - Google Patents

Utilización de una composición con peróxido de hidrógeno para detectar biofilms Download PDF

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WO2014049182A1
WO2014049182A1 PCT/ES2013/070401 ES2013070401W WO2014049182A1 WO 2014049182 A1 WO2014049182 A1 WO 2014049182A1 ES 2013070401 W ES2013070401 W ES 2013070401W WO 2014049182 A1 WO2014049182 A1 WO 2014049182A1
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hydrogen peroxide
surfactant
gum
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PCT/ES2013/070401
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Dora Isela SALAS VÁZQUEZ
Juan José RODRÍGUEZ JEREZ
Miguel OSSET HERNÁNDEZ
Vanessa MONTAÑEZ IZQUIERDO
Minerva FERNÁNDEZ BLANCO
Isabel FORNS AGUDO
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Itram Higiene, S. L.
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    • C12Q1/30—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving catalase

Definitions

  • the present invention is framed in the field of surface hygiene and refers to a method for the detection of biofilms by using a composition comprising hydrogen peroxide.
  • a biofilm is an aggregate of microorganisms constituted by a population of cells growing attached to each other, anchored to a surface, and embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (or EPS) from the English extracellular polymeric substances produced by the biofilm itself.
  • the EPS may contain polysaccharides, proteins, phospholipids, teicoic and nucleic acids, and other polymeric substances hydrated with up to 97% water.
  • the biofilm may consist of monocultures of microorganisms, or of various species, as well as a mixture of phenotypes of a given species.
  • the formation of biofilms is not restricted to a specific group of microorganisms and today it is considered that under the appropriate environmental conditions, all microorganisms are capable of forming biofilms on any type of surface.
  • biofilm for the life of microorganisms are numerous, mainly the availability of more stable environmental conditions, a reserve of nutrients, an anchor point, and greater resistance to desiccation. Likewise, biofilm also confers greater resistance to microorganisms against the action of disinfectants.
  • a biofilm represents a barrier between microorganisms and disinfectants, antibiotics or biocides, as described in the article Bredholt et al., Microbial methods for assessment of cleaning and disinfection of food-processing surfaces cleaned in a low-pressure system, Eur. Food Res. Technol., 1999, 209 (2), 145-152.
  • biofilms Although most bacterial species have the ability to form biofilms, some genera form it easier and faster than others, such as Pseudomonas, Lister ⁇ a, Enterobacter, Flavobacter ⁇ um, Alcaligenes, Staphylococcus and Bacillus.
  • Pseudomonas Lister ⁇ a, Enterobacter, Flavobacter ⁇ um, Alcaligenes, Staphylococcus and Bacillus.
  • yeasts can also form them, such as, for example, Saccharomyces cerevisiae, present in the wine industry
  • biofilms are especially undesirable in those areas in which hygiene is a fundamental aspect, such as in the processes of manufacturing food and beverages, or in the pharmaceutical and hospital field.
  • the presence of biofilms has been determined in areas as diverse as, for example, at the medical level, involved in the pathogenesis of various infectious diseases and in the formation of dental plaque; in hospitals, as contaminants on various surfaces, particularly in medical instruments, as well as in catheters, implants or prostheses; in the food industry, the proliferation of biofilms on surfaces, pipes and equipment, on any type of material, poses a risk of contamination of the finished product, and may represent a significant public health problem; in various aquatic systems, such as industrial refrigeration systems and drinking water pipes; in the domestic sphere, mainly in bathrooms and kitchens; among other possible examples.
  • Food contact surfaces are one of the most frequent food contamination pathways, both in the food industry, as in collective catering, or in the home.
  • Food contact surfaces include both those that have direct contact with them, and those from which there is a spill on the food or on surfaces that contact the food, usually during the course of operations. Utensils and equipment surfaces are also included.
  • HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point
  • TCP tissue culture plate method
  • JP-A- 2005210997 refers to a method to detect biofilm on surfaces, preferably in the field of the food industry, in order to improve the cleaning and disinfection thereof, and which consists of staining the biofilm with a composition containing the Red dye Monascus
  • Some commercial products are also available on the market, based on the use of selective dyes of the biofilm polymer matrix, such as the "Biofilm detector kit” marketed by Realeo and the “Biofilms TBF 300 Detection Test "marketed by the company Betelgeux.
  • the object of the present invention is the use of a composition with hydrogen peroxide to detect biofilms.
  • Also part of the object of the present invention is a method for detecting biofilms in which said composition is used.
  • Figure 1 shows a photograph of the result of the application of the method according to the present invention, for the detection of biofilm of Pseudomonas aeruginosa on a stainless steel surface arranged in a horizontal position.
  • Figure 2 shows a photograph of the result of the application of the method according to the present invention, for the detection of biofilm of Pseudomonas aeruginosa on a stainless steel surface arranged in an upright position.
  • Figure 3 shows a photograph of the result of the application of the method according to the present invention (left image), or after the application of an aqueous solution of hydrogen peroxide (right image), for the detection of biofilm of Pseudomonas aeruginosa on surfaces coated with epoxy paint, arranged in a horizontal position, after 30 seconds of reaction (3A).
  • Figure 3B shows a photograph with the same surfaces after 5 minutes of reaction.
  • Figure 3C shows a photograph with the same surfaces after 15 minutes of reaction.
  • Figure 4 shows a photograph of a surface coated with epoxy paint with a biofilm of Pseudomona aeruginosa, arranged in an upright position, where an aqueous solution of hydrogen peroxide was applied by spraying, after a time of 30 seconds (left image) and 5 minutes (right image).
  • Figure 5 shows a photograph of the result of the application of the method according to the present invention (left image), or after the application of a simple aqueous solution of hydrogen peroxide (right image), for the detection of biofilm of Pseudomonas aeruginosa on surfaces coated with epoxy paint, arranged in an upright position, after 5 minutes of reaction.
  • Figure 6 shows a photograph of the result of the application of the method according to the present invention, using a composition without dye (left image), or with dye (central image), or after the application of a simple aqueous solution of peroxide of hydrogen (right image), for the detection of biofilm of Pseudomonas aeruginosa on stainless steel surfaces arranged in an upright position, after 5 minutes of reaction.
  • the object of the present invention is the use of an aqueous composition comprising hydrogen peroxide and a thickening agent to detect biofilms.
  • the authors of the present invention have developed a composition based on the combination of hydrogen peroxide and a thickening agent that, surprisingly, is highly effective for the detection of biofilm on any type of surface.
  • the biofilm detective action of said composition is mainly based on the reaction of biofilms with hydrogen peroxide, through the enzyme catalase.
  • Catalase are antioxidant enzymes that are present in most aerobic microorganisms, facultative anaerobes and as notable exceptions in some anaerobes, as is the case of the genus Bacteroides.
  • Other enzymes that also react with hydrogen peroxide are peroxidases and hydroxyperoxidases.
  • This decomposition causes effervescence due to the release of oxygen gas, which serves as an indicator of the presence of microorganisms.
  • ROS reactive oxygen species
  • composition a viscous consistency that allows prolonging the contact time of the product with the biofilm, favoring the enzymatic reaction of the catalase, while increasing the retention power of the oxygen generated at the time if enzymatic decomposition is carried out. All this allows detecting the presence of biofilms on surfaces in a highly effective way, with a simple visual inspection.
  • said composition also contains a surfactant base, which is preferably foaming.
  • the surfactant base is formed by one or more surfactants and exerts several functions. On the one hand it has a moisturizing function on the extracellular matrix of the biofilm, which facilitates the action of catalase on hydrogen peroxide.
  • the foaming effect allows a better visualization of the effervescence, since the foam formed contributes to the retention of the bubbles produced by the oxygen released during the reaction.
  • the composition further comprises a dye that facilitates the visualization of the foam formed by the enzymatic reaction.
  • a dye that facilitates the visualization of the foam formed by the enzymatic reaction.
  • surfactant also includes two or more surfactants. Hydrogen peroxide
  • Hydrogen peroxide is present in the composition of the invention, and the content thereof is preferably between 0.5% and 50%, more preferably, between 4% and 15%, even more preferably between 4.5% and 7%, and even more preferably it is about 5%, where all the percentages are expressed by weight over the total weight of the composition.
  • the inventors have shown that the composition for biofilm detection can include a broad hydrogen peroxide content, preferably between 0.5% and 50%, although the hydrogen peroxide content may be even superior.
  • composition for the detection of biofilm according to the use of the present invention contains a thickening agent.
  • thickener products suitable for incorporation into the compositions according to the use of the present invention are, for example, thickeners of natural origin, such as guar gum, xanthan gum, gellan gum, garrotine gum, tragacanth gum, welan gum, pectin , carboxymethyl cellulose, alginates, starch, dextrins, carrageenans, bentonite, Konjac gum, among others; as well as homopolymers or copolymers, optionally crosslinked, of carboxylic acids or olefinically saturated anhydrides, such as acrylic acid, methacrylic acid or maleic anhydride, among others, or their esters, with free or salt-shaped carboxyl groups; hydrophobically modified polymer polyols, or urethane polyols; or mixtures of the above.
  • thickeners of natural origin such as guar gum, xanthan gum, gellan gum, garrotine gum, tragacanth gum, welan gum, pectin
  • Such polymers and copolymers are commercially available, for example under the trade names Carbopol ® , Ultrez ® , Acusol ® , Acrysol ® , Polygel ® , Synthalen ® and Stabylen ® .
  • the mentioned polymers can also be used in association with silicates modified with inorganic polyphosphate peptizers, such as products marketed under the name Laponite ® .
  • the thickening agent is selected from the group consisting of xanthan gum, guar gum, gellan gum, garrotine gum, tragacanth gum, carrageenans, Konjac gum, homopolymers or copolymers of carboxylic acids or anhydrides olefinically unsaturated, and cross-linked homopolymers or copolymers of carboxylic acids or olefinically unsaturated anhydrides; more preferably, the thickening agent is chosen from xanthan gum, gellan gum, Konjac gum and cross-linked homopolymers or copolymers of carboxylic acids or olefinically unsaturated anhydrides.
  • a particularly preferred thickening agent is xanthan gum.
  • This product is commercially available through various suppliers, such as xanthan gum marketed by CP Kelco, under the trade name Keltrol ® .
  • Another particularly preferred thickening agent is crosslinked acrylic acid polymers, for example, those marketed by Lubrizol under the trade name Carbopol ® .
  • Another particularly preferred thickening agent is gellan gum, which is commercially available through various suppliers, such as, for example, by the company Kelco, under the trade name Kelcogel ® .
  • Another particularly preferred thickening agent is carrageenans, which are commercially available from various suppliers, such as, for example, by the company Kelco, under the trade name Kelcogel ® BF.
  • Konjac gum Another particularly preferred thickening agent is Konjac gum. This product is also commercially available, for example through the company FMC Corp., under the name Nutricol ® .
  • the incorporation of a thickening agent makes it possible to have a composition with a relatively high viscosity.
  • the composition of the invention has a viscosity between 100 and 1000 mPa.s, preferably between 300 and 600 mPa.s, and more preferably about 500 mPa.s.
  • the content of the thickening agent is preferably between 0.05% and 5%, and more preferably between 0.1% and 2%, where the percentage is expressed by weight over the total weight of the composition.
  • the composition for biofilm detection further comprises a surfactant.
  • the surfactant exerts, on the one hand, a wetting function on the extracellular matrix of the biofilm, which favors the action of the catalase on hydrogen peroxide.
  • the foaming effect of the surfactant facilitates the visualization of the effervescence, due to the retention of the bubbles produced by the oxygen released during the reaction between the hydrogen peroxide and the catalase present in the microorganisms that form the biofilm.
  • Surfactants are amphiphilic substances that possess a hydrophobic part and a hydrophilic part. This particular chemical structure of the surfactants is responsible for their properties, for example, for their action as humectants, by reducing the surface tension of the liquid, which favors surface wetting. Surfactants also have, in general, foaming properties, favoring foaming, unless they have been designed as low foaming surfactants for applications where foaming is undesirable.
  • surfactant products can be obtained commercially from various suppliers, such as, for example, the Kao Corportation, BASF, Croda, Huntsman, Clariant or Evonik companies, among others.
  • the surfactants suitable for use according to the present invention are preferably foaming agents, and are preferably selected from the group consisting of anionic surfactants, amphoteric surfactants, non-ionic surfactants, and mixtures thereof.
  • the composition according to the use of the present invention comprises a mixture of anionic and non-ionic surfactants.
  • anionic surfactants suitable for use in the context of the present invention are, for example, soaps, alkylbenzenesulfonic acids and their salts, sulfonated ⁇ -olefins, sulfonated paraffins, alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, ether sulfates of glycerin, alkyl sulfosuccinates, acid ethers carboxylic acids and their salts, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkylphenol sulfates, alkylphenol ether sulfates, isethionates, sarcosinates, taurates, and N-acylamino acid salts.
  • alkyl ether sulfates is sodium lauryl ether sulfate, such as that supplied by the Kao Corporation under the trade name Emal ® or the Texapon ® product range of the Cognis company ( currently BASF); alkyl sulfates are marketed under the name Sulfopon ® of the company Cognis (currently BASF); among the ethers of carboxylic acids are those supplied by the company Kao Corporation under the trade name Akypo ® ; or among the alkylbenzenesulfonic acids, for example, linear alkylbenzene sulfonic acids (LAS), especially n-dodecylbenzenesulfonic acid and its salts, such as that supplied by the Cognis company (currently BASF) under the trade name Maranil ® : and among the a-olefin sulfates, such as those supplied by the Clariant company under the name of Hostapur
  • the anionic surfactant is an alkyl ether sulfate.
  • nonionic surfactants suitable for use in the context of the present invention are, for example, ethoxylated fatty alcohols, ethoxylated fatty acids, ethoxylated alkylphenols, fatty acid alkanolamides, ethoxylated fatty acid alkanolamides, ethoxylated fatty amines, oxides of fatty amine, fatty amidoamine oxides, glycerin esters and fatty acids, sorbitan esters, ethoxylated sorbitan esters, sucrose esters, alkyl polyglycosides, ethylene / propylene oxide copolymers, among others.
  • ethoxylated fatty alcohols those supplied by Cognis (currently BASF) under the trade name Dehydol ® can be mentioned.
  • esters of ethoxylated sorbitan those supplied by the company Kao Corporation under the trade name Rheodol ® may be mentioned.
  • ethoxylated alkylphenols products marketed under the name Dehydrophen ® by Cognis (currently BASF) can be mentioned.
  • the nonionic surfactant is selected from the group consisting of ethoxylated fatty alcohol, ethoxylated sorbitan ester and alkyl polyglycoside; more preferably, the nonionic surfactant is an ethoxylated fatty alcohol.
  • the content of surfactant in the composition of the invention is preferably between 3% and 25%, more preferably between 5% and 15%, wherein the percentage is expressed by weight over the total weight of the composition.
  • the composition comprises a mixture of anionic and non-ionic surfactants, wherein the content of non-ionic surfactant is preferably between 1% and 15%, more preferably between 3% and 10%, and still more preferably between 5% and 8%; and the content of anionic surfactant is preferably between 0.5% and 10% of anionic surfactants, more preferably between 1% and 8%, and even more preferably between 2% and 5%, wherein the percentage is expressed by weight over the total weight of the composition
  • composition according to the present invention also contains a colorant.
  • the presence of a dye in the formulation facilitates the visualization of foaming due to the enzymatic reaction between catalase and hydrogen peroxide.
  • the dye used can be any dye commonly used in food or cleaning products, as are known to those skilled in the art, and which is stable in the composition of the invention.
  • the dye used is very soluble in water, which avoids the coloration of the surfaces evaluated and reduces the difficulty for their removal, as is currently the case with some of the products available in the market. Additionally, the dye is able to color the formed foam, to facilitate the visualization of the enzymatic reaction.
  • Coloring materials suitable for use in the present invention are, for example, anthraquinone dyes, azo dyes, or triarylmethane dyes.
  • colorants suitable for incorporation into the composition according to the invention are, for example, Ponceau 4R (also called Acid Red 18, E124, or cochineal red, Cl 16255, commercially available, for example, under the designation Sanolin ® Ponceau 4RC 82), Reagent Red 180 (Cl 181055C.I., Commercially available, for example, under the designation Duasyn ® Brilliant Red F3B-SF), Acid Blue 9 (CI42090, commercially available, for example, under the designation Sanolin ® Blue AE 90), Acid Yellow 23 (also called tartrazine, or E102, C.1.19140, commercially available, for example, under the name Sanolin ® Tartrazine X90), among others.
  • Ponceau 4R also called Acid Red 18, E124, or cochineal red, Cl 16255
  • Reagent Red 180 Cl 181055C.I.
  • Duasyn ® Brilliant Red F3B-SF Commercially available, for example, under the designation Duasyn ® Brilliant Red
  • the dye content is preferably between 0.0001% and 1.0%, more preferably between 0.001% and 0.5%, and even more preferably between 0.005% and 0.2%, expressed by weight over the total weight of the composition.
  • composition for detecting biofilms may contain other components, such as sequestrants, antioxidants, or pH modifying substances, among others.
  • the composition further comprises a sequestering agent.
  • sequestering agents also called chelators
  • chelators are substances capable of forming soluble complexes with metal ions.
  • its presence allows to improve the action of the surfactants, by eliminating the metal ions of the medium, mainly calcium and magnesium, reducing the hardness of the water and reducing the formation of insoluble salts.
  • sequestering agents have the function of complexing heavy metal ions that can eventually catalyze the decomposition of hydrogen peroxide in the composition.
  • Suitable sequestering agents for use in the context of the present invention are, for example, polyphosphates, especially tripolyphosphates and alkaline pyrophosphates; phosphonates, such as HEDP (1-hydroxyethane 1, 1-diphosphonic acid), DTPMP (diethylenetriamine pentamethylene phosphonic acid), EDTMP (ethylenediamine tetramethylene phosphonic acid), ATMP (amino trimethylethylene phosphonic acid), or HDTMP (hexamethylenediaphosphonic acid) alkaline salts; hydroxypolycarboxylates, such as citric, tartaric or gluconic acid; aminopolycarboxylates, such as EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid), NTA (triacetic nitrile acid), or GLDA (glutamic acid, ⁇ , ⁇ -diacetic acid) or its sodium salts; or their mixtures
  • the sequestering agent is selected from the group consisting of HEDP, DTPMP, EDTMP, ATMP, HDTMP phosphonates, or their sodium salts, or mixtures thereof.
  • the content thereof is between 0.001% and 5%, more preferably between 0.01% and 1.0%, and even more preferably between 0.05% and 0.5%, wherein the percentage is expressed by weight over the total weight of the composition.
  • composition of the invention may also additionally contain stabilizing substances.
  • stabilizers suitable for use in the scope of the present invention are, for example, 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene (BHT), ferf-butyl hydroxyanisole (BHA), trimethoxybenzoic acid (TMBA), a-tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ethoxyquin, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, ascorbic acid, sorbic acid and its salts, dihydroxypumaric acid and its salts, lignosulfonic acid and its salts, gallic acid and its alkyl esters, p-anisic acid and its salts, benzoic acid and its salts, 4-hydroxy-TEMPO, p-toluenesulfonic acid and its salts, hydroquinones and their derivatives (such as 2,5-di -ferf-butyl hydroquinone or DTBHQ, toluhydrou
  • BHT is used as a stabilizer.
  • the amount of stabilizer is preferably between 0.001% and 1%, more preferably between 0.01% and 0.5%, and even more preferably between 0.05% and 0.3%, where The percentage is expressed by weight over the total weight of the composition.
  • the biofilm detection composition may contain pH regulating agents, for example, acidic, such as mineral acids, or carboxylic acids.
  • acidic such as mineral acids, or carboxylic acids.
  • compositions according to the use of the present invention may contain other additional components, such as foam stabilizers or preservatives, for example.
  • the biofilm detection composition comprises:
  • a thickener preferably between 0.1% and 2%;
  • - between 0.001% and 1% stabilizer, preferably between 0.01% and 0.5%, and more preferably between 0.05% and 0.3%.
  • the biofilm detection composition comprises:
  • a thickener preferably between 0.1% and 2%;
  • non-ionic surfactant preferably between 3% and 10%
  • anionic surfactant preferably between 1% and 8%
  • stabilizer between 0.001% and 1% of stabilizer, preferably between 0.01% and 0.5%, and more preferably between 0.05% and 0.3%.
  • composition is completed with a sufficient amount of water until 100% is obtained.
  • weight percentages refer to the weight in active matter of each component.
  • the thickener is selected from the group consisting of xanthan gum, gellan gum, Konjac gum and crosslinked acrylic acid polymers; the anionic surfactant is an alkyl ether sulfate; and the nonionic surfactant is an ethoxylated fatty alcohol.
  • the preparation of the composition according to the use of the present invention is carried out according to procedures that are well known in the field of detergent and cleaning products technology. For example, it can be prepared by dissolving the different components in water, with stirring until a homogeneous solution is achieved.
  • Also part of the object of the present invention is a method for detecting biofilms on a surface, comprising the following steps:
  • step (iii) visually inspect the appearance of bubbling.
  • the spray action required in step (i) refers to the action of applying a thin layer of the composition on the surface, scattered in small drops, for which any standard spray device can be used, for example, in the form of a gun manual for spraying, or by using a booster pump.
  • composition applied according to step (i) preferably has all the same characteristics already described above.
  • the appearance of bubbling is indicative of the enzymatic reaction of the catalases present in the biofilm and, therefore, allows the detection of its presence on the surface by simple visual inspection.
  • This method allows the detection of biofilms, both monospecies and multispecies, which are catalase-positive.
  • microorganisms that possess some type of catalase are, for example, within the bacterial genus, Salmonella, Listeria, Escher ⁇ chia, Staphylococcus, Micrococcus, Helicobacter, Enterococcus, Proteus, Pseudomonas, among others; and within the fungal genus, Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Fusar ⁇ um, Botritys, Cladospor ⁇ um, among others, as described in the article Beltrán-Garc ⁇ a et al., Phytopathogenic fungal catalase: Virulence and fungicide resistance factors? , Rev. Mex. Fitopatol., 2006, 24 (1), 50-58.
  • this method is suitable for the detection of almost all biofilms usually present in the industrial and domestic environment, since they usually always include a bacterium that is catalase-positive. Since most biofilms in the environment are multispecies, it is sufficient that the biofilm includes at least one catalase-positive species to be sensitive to the detection method.
  • the surface virtually any type of surface is capable of being applied the biofilm detection method of the present invention, both metallic, such as aluminum, chrome, steel, or stainless steel; as glass, ceramic or porcelain surfaces; as well as any of any kind of plastics, such as thermoplastic or thermosetting polymers, for example epoxy resins; among other possible materials.
  • the surface to be analyzed can be in any arrangement, both horizontally, vertically and on ceilings.
  • Figure 1 shows a photograph of a stainless steel surface, arranged in a horizontal position, on which the method of the invention for the detection of a biofilm of Pseudomonas aeruginosa was applied.
  • FIG 2 a photograph of the application of the method of the invention for the detection of the same type of biofilm is also shown on a stainless steel surface, but this time arranged in an upright position.
  • the presence of biofilm causes the appearance of a bubbling, which is easily observable by simple visual inspection.
  • the period of time required in step (ii) of the method, during which the composition must be allowed to act ranges from 30 seconds to 20 minutes, and will be dependent on the enzymatic production of the catalase and, consequently, on the density of the surface biofilm.
  • the actuation time is between 30 seconds and 5 minutes, since a longer time is not necessary for an effective detection of the biofilm, although it may optionally be allowed to act for a longer period, of up to approximately 20 minutes, without impairment of efficiency
  • the method developed in the present invention has the advantage that is valid for the detection of biofilms on any surface and in any field. It can be especially useful in those areas where hygiene requirements are particularly strict, such as the food industry or in the healthcare framework.
  • the present method for the detection of biofilm can be particularly advantageous as an aid for the establishment of Critical Control Points (CCP) on the surfaces of the agri-food industry.
  • CCP Critical Control Points
  • Example 1 Compositions for biofilm detection 7 formulations (A to G) of compositions for biofilm detection were prepared, according to the use of the present invention, using the proportions detailed in the following table:
  • compositions of the invention were determined against biofilms that were prepared following procedures well known to those skilled in the art such as those described in, for example, articles Fuster et al., Effect of different environmental conditions on the bacteria survival on stainless steel surfaces, Food Control, 2008, 19 (3), 308-314 and Monta ⁇ ez-lzquierdo et al., Use of epifluorescence microscopy to assess the effectiveness of phage P100 in controlling Lister ⁇ a monocytogenes biofilms on stainless steel surfaces, Food Control , 2012, 23 (2), 470-477. To do this, tests were carried out with different conditions of humidity, temperature and time, selecting those that allowed optimal adherence of the microorganism to the different test surfaces, and also allowed to reproduce the biofilms with a homogeneous and repetitive formation.
  • Biofilms were designed with microorganisms of general problems in the food and hospital sector, such as: Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli, Cronobacter sakazakii, Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus, and Candida albicans. In addition, as a witness of negative catalase Lactobacillus spp.
  • compositions A to G were tested, all of them within the scope of the present invention.
  • the compositions were sprayed on the biofilms on the mentioned surfaces, both horizontally and vertically. After spraying, a visual inspection was carried out at different times, observing the production of an easily visible effervescence, indicative of the presence of biofilms.
  • the dye formulas (B to G) were more effective in facilitating the visualization of the effervescence generated.
  • Figures 1 and 2 show two photographs with the result of the test carried out with formulation B, on the horizontally and vertically arranged surface, respectively. Effervescence, indicative of the presence of biofilm, can be observed with the naked eye.
  • Figure 3 shows two surfaces coated with epoxy paint on whose surface two biofilms of Pseudomona aeruginosa have been developed.
  • the surfaces are arranged in a horizontal position, and in Figure 3A they are shown after 30 seconds of spraying the composition according to the present invention (left image) and a simple solution composed of water and hydrogen peroxide of the same concentration (image right).
  • Figure 3B shows a photograph with the same surfaces as Figure 3, but after 5 minutes of reaction.
  • Figure 3C shows a photograph with the same surfaces as Figure 3, but after 15 minutes of reaction.
  • the bubbling generated with the composition according to the present invention becomes more visible, since it is stronger, agglutinated and remains over time with respect to that of the simple solution where it is observed weak, dispersed and disappears over time.
  • Figure 4 shows a photograph of a surface coated with epoxy paint with a biofilm of Pseudomona aeruginosa, arranged in an upright position, where the simple solution composed of water and hydrogen peroxide used in the test of Figure 3 was applied by spraying
  • the reaction times are 30 seconds and 5 minutes for the left and right image, respectively.
  • Figure 5 shows a photograph of two surfaces coated with epoxy paint with biofilms of Pseudomona aeruginosa, arranged in an upright position, after 5 minutes of reaction when spraying the composition according to the present invention (left image) and a simple solution composed of water and hydrogen peroxide of the same concentration (right image).
  • left image a photograph of two surfaces coated with epoxy paint with biofilms of Pseudomona aeruginosa, arranged in an upright position, after 5 minutes of reaction when spraying the composition according to the present invention
  • a simple solution composed of water and hydrogen peroxide of the same concentration right image
  • Figure 6 shows a photograph of three stainless steel surfaces with biofilms of Pseudomona aeruginosa, arranged in an upright position, after 5 minutes of reaction when spraying the simple solution composed of water and hydrogen peroxide (right surface), a composition according to the present invention (center surface) and a composition according to the present invention without dye (left surface).
  • the biofilm of the center is better visualized by the production of bubbling and color, even when the coloration is not intense, it helps in its easy detection with respect to the biofilm right where it takes thickener, but not coloring.

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Abstract

La presente invención se refiere a la utilización de una composición con peróxido de hidrógeno para detectar biofilms. Dicha composición comprende además un agente espesante y resulta especialmente adecuada para la detección rápida y eficaz de biofilm in situ, sobre superficies expuestas a contaminación microbiana, por ejemplo en el ámbito de la industria agroalimentaria y en el ámbito farmacéutico y hospitalario. También se refiere a un método para detectar biofilms en el que se emplea dicha composición.

Description

UTILIZACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN CON PERÓXIDO DE HIDRÓGENO PARA
DETECTAR BIOFILMS
DESCRIPCIÓN
Campo de la técnica
La presente invención se enmarca en el campo de la higiene de superficies y se refiere a un método para la detección de biofilms mediante el empleo de una composición que comprende peróxido de hidrógeno.
Estado de la técnica anterior
Un biofilm es un agregado de microorganismos constituido por una población de células creciendo adheridas entre ellas, ancladas a una superficie, e incrustadas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (o EPS, del inglés extracellular polymeríc substances) producidas por el propio biofilm. Las EPS pueden contener polisacáridos, proteínas, fosfolípidos, ácidos teicoicos y nucleicos, y otras sustancias poliméricas hidratadas hasta con un 97% de agua.
El biofilm puede estar constituido de monocultivos de microorganismos, o de diversas especies, así como de una mezcla de fenotipos de una especie dada. La formación de biofilms no está restringida a un grupo específico de microorganismos y hoy en día se considera que en las condiciones ambientales adecuadas, todos los microorganismos son capaces de formar biofilms sobre cualquier tipo de superficie.
Las ventajas que aporta un biofilm para la vida de los microorganismos son numerosas, principalmente el disponer de unas condiciones ambientales más estables, una reserva de nutrientes, un punto de anclaje, y mayor resistencia a la desecación. Así mismo, el biofilm también confiere una mayor resistencia a los microorganismos frente a la acción de desinfectantes.
Por lo tanto, en la práctica, un biofilm representa una barrera entre los microorganismos y los desinfectantes, antibióticos o biocidas, tal como se describe en el artículo Bredholt et al., Microbial methods for assessment of cleaning and disinfection of food-processing surfaces cleaned in a low-pressure system, Eur. Food Res. Technol., 1999, 209 (2), 145- 152.
A pesar de que la mayoría de las especies bacterianas tienen la capacidad de formar biofilms, algunos géneros lo forman más fácil y rápidamente que otros, como es el caso de Pseudomonas, Listería, Enterobacter, Flavobacteríum, Alcaligenes, Staphylococcus y Bacillus. La formación de biofilms no es exclusiva de bacterias, sino que las levaduras también pueden formarlos, como, por ejemplo, el Saccharomyces cerevisiae, presente en la industria vinícola
La presencia de biofilms es especialmente indeseable en aquellos ámbitos en los que la higiene constituye un aspecto fundamental, como por ejemplo, en los procesos de fabricación de alimentos y bebidas, o en el ámbito farmacéutico y hospitalario. Sin embargo, se ha determinado la presencia de biofilms en ámbitos tan diversos como, por ejemplo, a nivel médico, implicados en la patogenia de diversas enfermedades infecciosas y en la formación de placa dental; en hospitales, como contaminantes sobre diversas superficies, particularmente en instrumentos médicos, así como en catéteres, implantes o prótesis; en la industria alimentaria la proliferación de biofilms en las superficies, conducciones y equipos, sobre cualquier tipo de material, supone un riesgo de contaminación del producto acabado, y puede llegar representar un importante problema de salud pública; en diversos sistemas acuáticos, como por ejemplo, en sistemas de refrigeración industrial y conducciones de agua potable; en el ámbito doméstico, principalmente en baños y cocinas; entre otros posibles ejemplos.
En los biofilms presentes en el ambiente hospitalario, suelen predominar las bacterias Gram-positivas, notablemente del género estafilococos, aunque las infecciones debidas a bacterias Gram-negativas y fúngicas suelen ser más serias. Las infecciones fúngicas más comunes suelen ser causadas por especies patogénicas de Candida, particularmente C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis y C. parapsilosis, como se describe en los artículos Hawser et al., Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro, Infection Immunity, 1994, 62 (3), 915-921 , y Jabra-Rizk et al., Fungal biofilms and drug resistance, Emerging Infect. Dis., 2004, 10 (1 ), 14-19. Las especies más relevantes involucradas en la formación de biofilm en el marco de la producción de alimentos y que comprometen particularmente la seguridad alimentaria son Listería monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli, Cronobacter spp., Pseudomonas spp., Campylobacter jejuni y Bacillus spp, principalmente, tal como se describe en los artículos Mattila-Sandholm et al., Biofilm in the industry: A review, Food Rev. Int., 1992, 8 (4), 573-603, Lee Wong et al., Biofilm in Food Processing Environments, J. Dairy Sci., 1998, 81 (10), 2765-2770, y Jo et al., Maturation and survival of Cronobacter biofilms on silicone, polycarbonate, and stainless steel after UV light and ethanol immersion treatments, J. Food Protection, 2010, 73 (5), 952-956.
Las superficies son una de las vías de contaminación de alimentos más frecuentes, tanto en la industria alimentaria, como en la restauración colectiva, o en el hogar. Las superficies de contacto con alimentos incluyen tanto las que tienen un contacto directo con los mismos, como aquellas desde las cuales existe un vertido sobre el alimento o sobre superficies que contactan el alimento, normalmente durante el curso de las operaciones. También se incluyen utensilios y superficies de los equipos.
Así pues, la industria alimentaria requiere adherirse estrictamente a las normas de higiene establecidas, así como la aplicación rigurosa del sistema de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (APPCC) a lo largo de la cadena alimentaria, tal como se describe en el artículo Panisello et al., Application of foodborne disease outbreak data in the development and maintenance of HACCP systems, Int. J. Food Microbiol., 2000, 59 (3), 221 -234.
En este marco, es imprescindible efectuar un control eficaz de la formación de biofilms sobre las superficies de contacto con el alimento, puesto que al desprenderse fragmentos de un biofilm con células viables, éstas pueden dispersarse y actuar como matriz para la fijación de nuevas células que darán lugar a un nuevo biofilm, con la consiguiente recontaminación de las superficies.
Uno de los factores esenciales en la implementación de dichos sistemas de higiene es disponer de un método rápido y efectivo para controlar su efectividad. Es imprescindible, pues, disponer de métodos que tengan una capacidad detectora de biofilms, que actúen como auxiliares para el establecimiento de Puntos Críticos de Control (PCC) en las superficies de la industria agroalimentaria. En el estado de la técnica son conocidos un buen número de métodos para el estudio y la monitorización de biofilms procedentes de diversos ámbitos, que se basan, por ejemplo, en técnicas como la microscopía de fluorescencia, microscopía de barrido electrónica (SEM, scanning electrón microscopy), microscopía óptica diferencial de contraste de interferencia (DIC, differential interference contrast microscopy), microscopía electrónica de transmisión (TEM, transmission electrón microscopy) o, últimamente, la microscopía de barrido confocal láser (CLSM) en conjunto con el análisis de imagen han contribuido a un mejor entendimiento visual de la arquitectura del biofilm, tanto estática como dinámica, tal como se describe en el artículo Schlapp et al., Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture, J. Microbiol. Methods, 201 1 , 87, 234-240. No obstante, uno de los métodos más utilizados en el estudio y detección de biofilm es el método del cultivo tisular en placas (TCP, tissue culture píate method), que se basa realización de cultivos en placas y posterior análisis del biofilm formado por técnicas como ELISA, previa fijación y tinción del biofilm, tal como se describe en el artículo Christensen et al., Adherence of coagulase-negative staphylococci to plástic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices., J. Clin. Microbiol., 1985, 22 (6), 996-1006.
Actualmente, los métodos disponibles para la determinación de biofilm en superficies, por ejemplo, en la industria alimentaria, son los métodos tradicionales y rápidos de control microbiológico. Los métodos tradicionales son el cultivo en placa o métodos de aplicación-impronta (Rodac, slides y Petrifilm) que, aunque fiables y eficientes, requieren al menos de varios días a una semana antes de que los resultados sean obtenidos, por lo que son inapropiados como herramienta de vigilancia rápida para el APPCC. Los métodos rápidos se agrupan en tres categorías: métodos cualitativos, cuantitativos y de identificación. Aunque los tres dan un resultado "rápido", únicamente el análisis cualitativo permite dar un resultado in situ y al momento. Este resultado rápido en la detección del biofilm es una de las premisas más valoradas a nivel industrial, pues permite identificar, contener y recuperarse rápidamente de un episodio de contaminación localizada. Algunos ejemplos de métodos rápidos son: ELISA (inmunológica), Detección de ATP por bioluminiscencia (enzimática), Microscopía de Epifluorescencia Directa (DEM) y PCR en Tiempo Real (biología molecular).
Así mismo, también se han descrito otras metodologías con dicha finalidad, como la utilización de ciertas sustancias que son capaces de teñir selectivamente la matriz polimérica extracelular del biofilm. Así por ejemplo, la solicitud de patente japonesa JP-A- 2005210997 se refiere a un método para detectar biofilm en superficies, preferiblemente en el ámbito de la industria alimentaria, con la finalidad de mejorar la limpieza y desinfección de las mismas, y que consiste en la tinción del biofilm con una composición que contiene el colorante Rojo Monascus.
En el mercado se encuentran disponibles algunos productos comerciales basados también en la utilización de tintes selectivos de la matriz polimérica del biofilm, como, por ejemplo, el "Biofilm detector kit" comercializado por la empresa Realeo y el "Test de detección de Biofilms TBF 300" comercializado por la empresa Betelgeux.
Sin embargo, la mayoría los métodos descritos en el estado de la técnica no resultan adecuados o totalmente satisfactorios para la detección inmediata de biofilms en superficies relativamente grandes, particularmente en la industria agroalimentaria o en el ámbito farmacéutico y hospitalario, y especialmente durante las tareas rutinarias de limpieza y desinfección bien sea por su falta de eficacia en la detección, porque no permiten disponer de resultados de forma rápida, o debido a su coste elevado.
Así pues, es manifiesto que subsiste la necesidad de poder disponer de un método para la detección de biofilm en superficies de todo tipo, especialmente en el ámbito de la industria agroalimentaria o en el ámbito farmacéutico y hospitalario, que sea efectivo en la detección de biofilm de forma rápida y precisa, que sea fácil de utilizar y no requiera de un tipo de instrumentación complejo, que sea aplicable a grandes extensiones de superficies y que resulte económico para favorecer su aplicación generalizada, y permitir así un mejor control de la presencia de biofilm y por lo tanto una mejor vigilancia de la eficacia de los sistemas de higienización, que a su vez permitan aplicar medidas correctoras oportunas en el mismo momento que se efectúan las determinaciones.
Objeto de la invención El objeto de la presente invención es la utilización de una composición con peróxido de hidrógeno para detectar biofilms.
También forma parte del objeto de la presente invención un método para detectar biofilms en el que se emplea dicha composición.
Descripción de las figuras Figura 1 :
En la figura 1 se muestra una fotografía del resultado de la aplicación del método según la presente invención, para la detección de biofilm de Pseudomonas aeruginosa sobre una superficie de acero inoxidable dispuesta en posición horizontal.
Figura 2:
En la figura 2 se muestra una fotografía del resultado de la aplicación del método según la presente invención, para la detección de biofilm de Pseudomonas aeruginosa sobre una superficie de acero inoxidable dispuesta en posición vertical.
Figura 3:
En la figura 3 se muestra una fotografía del resultado de la aplicación del método según la presente invención (imagen izquierda), o tras la aplicación de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno (imagen derecha), para la detección de biofilm de Pseudomonas aeruginosa sobre superficies recubiertas con pintura epoxi, dispuestas en posición horizontal, después de 30 segundos de reacción (3A).
En la figura 3B se muestra una fotografía con las mismas superficies después de 5 minutos de reacción.
En la figura 3C se muestra una fotografía con las mismas superficies después de 15 minutos de reacción.
Figura 4:
En la figura 4 se muestra una fotografía de una superficie recubierta con pintura epoxi con un biofilm de Pseudomona aeruginosa, dispuesta en posición vertical, donde se aplicó mediante pulverización una solución acuosa de peróxido de hidrógeno, tras un tiempo de 30 segundos (imagen izquierda) y 5 minutos (imagen derecha).
Figura 5:
En la figura 5 se muestra una fotografía del resultado de la aplicación del método según la presente invención (imagen izquierda), o tras la aplicación de una solución acuosa simple de peróxido de hidrógeno (imagen derecha), para la detección de biofilm de Pseudomonas aeruginosa sobre superficies recubiertas con pintura epoxi, dispuestas en posición vertical, después de 5 minutos de reacción.
Figura 6: En la figura 6 se muestra una fotografía del resultado de la aplicación del método según la presente invención, utilizando una composición sin colorante (imagen izquierda), o con colorante (imagen central), o tras la aplicación de una solución acuosa simple de peróxido de hidrógeno (imagen derecha), para la detección de biofilm de Pseudomonas aeruginosa sobre superficies de acero inoxidable dispuestas en posición vertical, después de 5 minutos de reacción.
Descripción detallada de la invención El objeto de la presente invención es la utilización de una composición acuosa que comprende peróxido de hidrógeno y un agente espesante para detectar biofilms.
Los autores de la presente invención han desarrollado una composición basada en la combinación de peróxido de hidrógeno y un agente espesante que, sorprendentemente, es altamente efectiva para la detección de biofilm en cualquier tipo de superficies.
La acción detectora del biofilm de dicha composición se basa principalmente en la reacción de los biofilms con el peróxido de hidrógeno, a través de la enzima catalasa. Las catalasas son enzimas antioxidantes que están presentes en la mayoría de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos y como notables excepciones en algunos anaerobios, como es el caso del género Bacteroides. Otras enzimas que también reaccionan con el peróxido de hidrógeno son las peroxidasas y las hidroxiperoxidasas.
Dichas enzimas catalizan la degradación del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, según la siguiente reacción:
2 H202 ► 2 H20 + 02
Esta descomposición provoca una efervescencia debido a la liberación de oxígeno gas, que sirve de indicador de la presencia de microorganismos.
La mayoría de los microorganismos producen una o más catalasas que usualmente responden al estrés oxidativo, al peróxido de hidrógeno o a la presencia de otras especies reactivas de oxígeno, también denominadas ROS (del inglés reactive oxygen species), tal como se describe en el artículo Chelikani et al., Diversity of structures and properties among catatases, CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 2004, 61 , 192-208. Generalmente, la mayoría de los biofilms en el medio ambiente son multiespecies, es decir, están formados por varias especies. Entre ellas es habitual que se encuentren bacterias aerobias, cuya catalasa sirve de indicador en la utilización de la invención. La presencia de una sustancia espesante confiere a la composición una consistencia viscosa que permite prolongar el tiempo de contacto del producto con el biofilm, favoreciéndose la reacción enzimática de las catalasas, a la vez que se aumenta el poder de retención del oxígeno generado en el momento de efectuarse la descomposición enzimática. Todo ello permite detectar la presencia de los biofilms en las superficies de forma altamente efectiva, con una simple inspección visual.
Ventajosamente, dicha composición contiene además una base tensioactiva, que preferiblemente es espumante. La base tensioactiva está formada por uno o varios tensioactivos y ejerce varias funciones. Por un lado tiene una función humectante sobre la matriz extracelular del biofilm, que facilita la acción de las catalasas sobre el peróxido de hidrógeno. Por otro lado, el efecto espumante permite una mejor visualización de la efervescencia, ya que la espuma formada contribuye a la retención de las burbujas producidas por el oxígeno liberado durante la reacción.
Así mismo, en una realización preferida, la composición comprende además un colorante que facilita la visualización de la espuma formada mediante la reacción enzimática. En la presente descripción así como en las reivindicaciones, las formas singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así por ejemplo, la referencia a "tensioactivo" incluye además dos o más tensioactivos. Peróxido de hidrógeno
El peróxido de hidrógeno se halla presente en la composición de la invención, y el contenido del mismo preferiblemente está comprendido entre el 0,5% y el 50%, más preferiblemente, entre el 4% y el 15%, aún más preferiblemente entre el 4,5% y el 7%, y aún más preferiblemente es aproximadamente el 5%, en donde todos los porcentajes están expresados en peso sobre el peso total de la composición. Los autores de la invención han puesto de manifiesto que la composición para la detección de biofilm puede incluir un contenido de peróxido de hidrógeno amplio, preferiblemente comprendido entre el 0,5% y el 50%, si bien el contenido de peróxido de hidrógeno puede ser incluso superior.
No obstante, se ha observando que con concentraciones relativamente bajas de peróxido de hidrógeno, preferiblemente comprendidas entre el 4% y el 15%, más preferiblemente entre el 4,5% y el 7%, y aún más preferiblemente con una concentración de aproximadamente el 5%, las composiciones son altamente efectivas para detectar el biofilm, sin necesidad de emplear un contenido más elevado de peróxido de hidrógeno, lo cual redunda en una mayor seguridad y menor coste.
Agente espesante
La composición para la detección de biofilm según la utilización de la presente invención contiene un agente espesante.
Entre los productos espesantes aptos para ser incorporados en las composiciones según la utilización de la presente invención están, por ejemplo, los espesantes de origen natural, como la goma guar, goma xantana, goma gellan, goma garrotín, goma tragacanto, goma welan, pectina, carboximetilcelulosa, alginatos, almidón, dextrinas, carragenanos, bentonita, goma de Konjac, entre otros; así como homopolímeros o copolímeros, eventualmente reticulados, de ácidos carboxílicos o anhídridos olefínicamente saturados, tales como el ácido acrílico, ácido metacrílico o anhídrido maleico, entre otros, o sus ásteres, con grupos carboxilo libres o en forma de sal; polioles poliméricos hidrofóbicamente modificados, o polioles de uretano; o mezclas de los anteriores. Dichos polímeros y copolímeros están disponibles en el mercado, por ejemplo bajo las denominaciones comerciales Carbopol®, Ultrez®, Acusol®, Acrysol®, Polygel®, Synthalen® y Stabylen®. Los polímeros mencionados también se pueden emplear en asociación con silicatos modificados con peptizadores de polifosfatos inorgánicos, tales como los productos comercializados bajo la denominación Laponite®.
En una realización preferida, el agente espesante se elige de entre el grupo formado por goma xantana, goma guar, goma gellan, goma garrotín, goma tragacanto, carragenanos, goma de Konjac, homopolímeros o copolímeros de ácidos carboxílicos o anhídridos olefínicamente insaturados, y homopolímeros o copolímeros reticulados de ácidos carboxílicos o anhídridos olefínicamente insaturados; más preferiblemente, el agente espesante se elige entre goma xantana, goma gellan, goma Konjac y homopolímeros o copolímeros reticulados de ácidos carboxílicos o anhídridos olefínicamente insaturados.
Un agente espesante particularmente preferido es la goma xantana. Este producto se encuentra disponible en forma comercial a través de diversos suministradores, como, por ejemplo la goma xantana comercializada por la compañía CP Kelco, bajo la denominación comercial Keltrol®.
Otro agente espesante particularmente preferido son los polímeros reticulados del ácido acrílico, por ejemplo, los comercializados por la empresa Lubrizol bajo la denominación comercial Carbopol®. Otro agente espesante particularmente preferido es la goma gellan, que está disponible comercialmente a través de diversos suministradores, como, por ejemplo por la empresa CP Kelco, bajo la denominación comercial Kelcogel®.
Otro agente espesante particularmente preferido son los carragenanos, que están disponibles comercialmente a través de diversos suministradores, como, por ejemplo por la empresa CP Kelco, bajo la denominación comercial Kelcogel® BF.
Otro agente espesante particularmente preferido es la goma Konjac. Este producto también se encuentra disponible comercialmente, por ejemplo a través de la compañía FMC Corp., bajo la denominación Nutricol®.
La incorporación de un agente espesante permite disponer de una composición con una viscosidad relativamente elevada. Así pues, preferiblemente, la composición de la invención tiene una viscosidad comprendida entre 100 y 1000 mPa.s, preferiblemente entre 300 y 600 mPa.s, y más preferiblemente aproximadamente 500 mPa.s.
El contenido del agente espesante está preferiblemente comprendido entre el 0,05% y el 5%, y más preferiblemente comprendido entre el 0,1 % y el 2%, donde el porcentaje está expresado en peso sobre el peso total de la composición.
Tensioactivo Preferiblemente, la composición para la detección de biofilm comprende adicionalmente un tensioactivo. En dicha composición, el tensioactivo ejerce, por un lado, una función humectante sobre la matriz extracelular del biofilm, lo que favorece la acción de las catalasas sobre el peróxido de hidrógeno. Por otro lado, el efecto espumante del tensioactivo facilita la visualización de la efervescencia, debido a la retención de las burbujas producidas por el oxígeno liberado durante la reacción entre el peróxido de hidrógeno y la catalasa presente en los microorganismos que forman el biofilm.
Los tensioactivos, como es bien conocido por el experto en la materia, son sustancias anfifílicas que poseen una parte hidrofobica y una parte hidrofílica. Esta estructura química particular de los tensioactivos es responsable de sus propiedades, por ejemplo, de su acción como humectantes, al reducir la tensión superficial del líquido con lo que se favorece el mojado de las superficies. Los tensioactivos también tienen, en general, propiedades espumantes, favoreciendo la formación de espuma, a no ser que hayan sido diseñados como tensioactivos de baja espuma para aplicaciones en las que la formación de espuma no es deseable.
Una gran variedad de productos tensioactivos puede obtenerse de forma comercial a partir de diversos suministradores, tales como, por ejemplo, las compañías Kao Corportation, BASF, Croda, Huntsman, Clariant o Evonik, entre otras. Los tensioactivos apropiados para la utilización según la presente invención son preferiblemente espumantes, y se seleccionan preferiblemente de entre el grupo formado por tensioactivos aniónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos no iónicos, y mezclas de los mismos. En una realización particularmente preferida, la composición según la utilización de la presente invención comprende una mezcla de tensioactivos aniónicos y no iónicos.
Entre los tensioactivos aniónicos apropiados para ser usados en el marco de la presente invención se encuentran, por ejemplo, jabones, ácidos alquilbencenosulfónicos y sus sales, α-olefinas sulfonadas, parafinas sulfonadas, sulfatos de alquilo, sulfatos de éteres de alquilo, sulfatos de éteres de glicerina, sulfosuccinatos de alquilo, éteres de ácidos carboxilicos y sus sales, fosfatos de alquilo, fosfatos de éteres de alquilo, sulfatos de alquilfenoles, sulfatos de éteres de alquilfenoles, isetionatos, sarcosinatos, tauratos, y sales de N-acilaminoácidos. Por sólo citar algunos ejemplos de este grupo, entre los sulfatos de éteres de alquilo se encuentra el lauril éter sulfato sódico, como el suministrado por la compañía Kao Corporation bajo la denominación comercial Emal® o la gama de productos Texapon® de la compañía Cognis (actualmente BASF); los sulfatos de alquilo se encuentran comercializados bajo la denominación Sulfopon® de la compañía Cognis (actualmente BASF); entre los éteres de ácidos carboxilicos se encuentran los suministrados por la compañía Kao Corporation bajo la denominación comercial Akypo®; o entre los ácidos alquilbencenosulfónicos cabe citar, por ejemplo, los ácidos alquilbenceno sulfónicos lineales (LAS) especialmente el ácido n- dodecilbencenosulfónico y sus sales, como por ejemplo el suministrado por la compañía Cognis (actualmente BASF) bajo la denominación comercial Maranil®: y entre las a-olefin sulfatos, como por ejemplo los suministrados por la compañía Clariant bajo la denominación de Hostapur®.
Preferiblemente, el tensioactivo aniónico es un sulfato de éter de alquilo.
Entre los tensioactivos no iónicos apropiados para ser usados en el marco de la presente invención se encuentran, por ejemplo, alcoholes grasos etoxilados, ácidos grasos etoxilados, alquilfenoles etoxilados, alcanolamidas de ácidos grasos, alcanolamidas etoxiladas de ácidos grasos, aminas grasas etoxiladas, óxidos de amina grasos, óxidos de amidoaminas grasas, esteres de glicerina y ácidos grasos, esteres de sorbitán, esteres de sorbitán etoxilado, esteres de sacarosa, alquilpoliglicósidos, copolímeros de óxido de etileno/propileno, entre otros. Así, por ejemplo, entre los alcoholes grasos etoxilados pueden citarse los suministrados por la compañía Cognis (actualmente BASF) bajo la denominación comercial Dehydol®. Entre los esteres de sorbitán etoxilado pueden mencionarse los suministrados por la compañía Kao Corporation bajo la denominación comercial Rheodol®. Entre los alquilfenoles etoxilados se pueden mencionar los productos comercializados bajo la denominación Dehydrophen® por la compañía Cognis (actualmente BASF).
Preferiblemente, el tensioactivo no iónico se selecciona de entre el grupo formado por alcohol graso etoxilado, éster de sorbitán etoxilado y alquilpoliglicósido; más preferiblemente, el tensioactivo no iónico es un alcohol graso etoxilado. En el libro M. Asch y I. Asch, Handbook of Industrial Surfactants, cuarta edición, Synapse Information Resources, 2005, puede encontrarse una extensa relación de los tensioactivos disponibles comercialmente. El contenido de tensioactivo en la composición de la invención está preferiblemente comprendido entre el 3% y el 25%, más preferiblemente entre el 5% y el 15%, en donde el porcentaje está expresado en peso sobre el peso total de la composición.
En una realización preferida, la composición comprende una mezcla de tensioactivos aniónicos y no iónicos, en donde el contenido de tensioactivo no iónico está preferiblemente comprendido entre el 1 % y el 15%, más preferiblemente entre el 3% y el 10%, y aún más preferiblemente entre el 5% y el 8%; y el contenido de tensioactivo aniónico está preferiblemente comprendido entre el 0,5% y el 10% de tensioactivos aniónicos, más preferiblemente entre el 1 % y el 8%, y aún más preferiblemente entre el 2% y el 5%, en donde el porcentaje está expresado en peso sobre el peso total de la composición
Colorante Así mismo, en una realización preferida la composición según la presente invención contiene además un colorante.
La presencia de un colorante en la formulación facilita la visualizacion de la formación de espuma debida a la reacción enzimática entre la catalasa y el peróxido de hidrógeno.
El colorante usado puede ser cualquier colorante de los habitualmente utilizados en los productos de alimentación o limpieza, según son conocidos por el experto en la materia, y que sea estable en la composición de la invención. Preferiblemente el colorante utilizado es muy soluble en agua, lo que evita la coloración de las superficies evaluadas y reduce la dificultad para su eliminación, como sucede actualmente con algunos de los productos disponibles en el mercado. Adicionalmente, el colorante es capaz de colorear la espuma formada, para facilitar la visualizacion de la reacción enzimática. Materiales colorantes adecuados para uso en la presente invención son, por ejemplo, colorantes de antraquinona, colorantes azoicos, o colorantes de triarilmetano.
Algunos de los colorantes apropiados para ser incorporados en la composición según la invención son, por ejemplo, Ponceau 4R (también denominado Rojo Ácido 18, E124, o rojo cochinilla, C.l. 16255, disponible comercialmente, por ejemplo, bajo la denominación Sanolin® Ponceau 4RC 82), Rojo Reactivo 180 (C.l. 181055C.I., disponible comercialmente, por ejemplo, bajo la denominación Duasyn® Brilliant Red F3B-SF), Azul Ácido 9 (C.I.42090, disponible comercialmente, por ejemplo, bajo la denominación Sanolin® Blue AE 90), Amarillo Ácido 23 (también denominado tartrazina, o E102, C.1.19140, disponible comercialmente, por ejemplo, bajo la denominación Sanolin® Tartrazine X90), entre otros.
Cuando está presente en la composición, el contenido de colorante está preferiblemente comprendido entre el 0,0001 % y el 1 ,0%, más preferiblemente entre el 0,001 % y el 0,5%, y aún más preferiblemente entre el 0,005% y el 0,2%, expresado en peso sobre el peso total de la composición.
Otros componentes
Adicionalmente, la composición para detectar biofilms según la utilización de la presente invención puede contener otros componentes, como por ejemplo, secuestrantes, antioxidantes, o sustancias modificadoras del pH, entre otras. En una realización preferida, la composición comprende además un agente secuestrante.
Como es bien conocido por el experto en la materia, los agentes secuestrantes, también denominados quelantes, son sustancias capaces de formar complejos solubles con iones metálicos. En concreto, en el marco de la detergencia, su presencia permite mejorar la acción de los tensioactivos, al eliminar los iones metálicos del medio, principalmente calcio y magnesio, disminuyendo la dureza del agua y reduciendo la formación de sales insolubles. Además, en el campo de las composiciones que comprenden peróxido de hidrógeno, los agentes secuestrantes tienen la función de complejar iones de metales pesados que eventualmente pueden catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno en la composición. Algunos de los agentes secuestrantes adecuados para ser utilizados en el marco de la presente invención son, por ejemplo, polifosfatos, especialmente tripolifosfatos y pirofosfatos alcalinos; fosfonatos, como por ejemplo, HEDP (ácido 1 -hidroxietano 1 ,1 - difosfónico), DTPMP (ácido dietilentriamino pentametilenfosfónico), EDTMP (ácido etilendiamino tetrametilenfosfónico), ATMP (ácido amino trimetilenfosfónico), o HDTMP (ácido hexametilendiamino tetrametilenfosfónico), o sus sales alcalinas; hidroxipolicarboxilatos, como ácido cítrico, tartárico o glucónico; aminopolicarboxilatos, como EDTA (ácido etilendiamino tetraacético), DTPA (ácido dietilentriamino pentaacético), NTA (ácido nitrilo triacético), o GLDA (ácido glutámico, Ν,Ν-diacético) o sus sales sódicas; o sus mezclas.
Preferiblemente, el agente secuestrante se elige de entre el grupo formado por los fosfonatos HEDP, DTPMP, EDTMP, ATMP, HDTMP, o sus sales sódicas, o sus mezclas. Cuando el agente secuestrante se encuentra en la composición según la utilización de la presente invención, el contenido del mismo está comprendido entre el 0,001 % y el 5%, más preferiblemente entre el 0,01 % y el 1 ,0%, y aún más preferiblemente entre el 0,05% y el 0,5%, en donde el porcentaje está expresado en peso sobre el peso total de la composición.
La composición de la invención puede también contener adicionalmente sustancias estabilizantes.
Entre los estabilizantes apropiados para ser utilizados en el ámbito de la presente invención están, por ejemplo, 3,5-di-tert-butil-4-hidroxitolueno (BHT), ferf-butil hidroxianisol (BHA), ácido trimetoxibenzoico (TMBA), a-tocoferol, γ-tocoferol, δ-tocoferol, etoxiquina, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico, ácido ascórbico, ácido sórbico y sus sales, ácido dihidroxifumárico y sus sales, ácido lignosulfónico y sus sales, ácido gálico y sus ásteres alquílicos, ácido p-anísico y sus sales, acido benzoico y sus sales, 4-hidroxi-TEMPO, ácido p-toluensulfónico y sus sales, hidroquinonas y sus derivados (como 2,5-di-ferf-butil hidroquinona o DTBHQ, toluhidrouinona o THQ, o mono- ferf-butil hidroquinona o MTBHQ) entre otros, y sus mezclas.
Preferiblemente se emplea BHT como estabilizante. La cantidad de estabilizante está preferiblemente comprendida entre el 0,001 % y 1 %, más preferiblemente comprendida entre el 0,01 % y el 0,5%, y aún más preferiblemente entre el 0,05% y el 0,3%, en donde el porcentaje está expresado en peso sobre el peso total de la composición.
Opcionalmente, la composición para la detección de biofilm puede contener agentes reguladores del pH, por ejemplo, de carácter ácido, tales como ácidos minerales, o carboxílicos. Adicionalmente, las composiciones según la utilización de la presente invención pueden contener otros componentes adicionales, como estabilizadores de espuma o conservantes, por ejemplo.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, la composición para la detección de biofilms comprende:
- entre el 4% y el 15% de peróxido de hidrógeno, preferiblemente entre el 4,5% y el 7%, y más preferiblemente aproximadamente el 5%;
- entre el 0,05% y el 5% de un espesante, preferiblemente entre el 0,1 % y el 2%;
- entre el 3% y el 25% de tensioactivo, preferiblemente entre el 5% y el 15%;
- entre el 0,0001 % y el 1 % de colorante, preferiblemente entre el 0,001 % y el 0,5%;
- entre el 0,001 % y el 5% de un agente secuestrante, preferiblemente entre el 0,01 % y el 1 ,0%; y
- entre el 0,001 % y 1 % de estabilizante, preferiblemente entre el 0,01 % y el 0,5%, y más preferiblemente entre el 0,05% y el 0,3%.
Estos porcentajes están expresados en peso con respecto al peso total de la composición. La composición se completa con la cantidad suficiente de agua hasta obtener el 100%. En una realización más preferida de la presente invención, la composición para la detección de biofilm comprende:
- entre el 4% y el 15% de peróxido de hidrógeno, preferiblemente entre el 4,5% y el 10%, más preferiblemente aproximadamente el 5%;
- entre el 0,05% y el 5% de un espesante, preferiblemente entre 0,1 % y 2%;
- entre el 1 % y el 15% de tensioactivo no iónico, preferiblemente entre el 3% y el 10%; - entre el 0,5% y el 10% de tensioactivo aniónico, preferiblemente entre el 1 % y el 8%;
- entre el 0,0001 % y el 1 % de colorante, preferiblemente entre el 0,001 % y el 0,5%;
- entre el 0,001 % y el 5% de un agente secuestrante, preferiblemente entre el 0,01 % y el 1 ,0%; y
- entre el 0,001 % y el 1 % de estabilizante, preferiblemente entre el 0,01 % y el 0,5%, y más preferiblemente entre el 0,05% y el 0,3%.
Estos porcentajes están expresados en peso con respecto al peso total de la composición La composición se completa con la cantidad suficiente de agua hasta obtener el 100%.
En el contexto de la descripción, los porcentajes en peso se refieren al peso en materia activa de cada componente. En una realización particularmente preferida el espesante se selecciona de entre el grupo formado por goma xantana, goma gellan, goma Konjac y polímeros reticulados del ácido acrílico; el tensioactivo aniónico es un sulfato de éter de alquilo; y el tensioactivo no iónico es un alcohol graso etoxilado. La preparación de la composición según la utilización de la presente invención se realiza según procedimientos que son bien conocidos en el campo de la tecnología de los detergentes y productos de limpieza. Por ejemplo, se puede preparar por disolución de los diferentes componentes en agua, bajo agitación hasta conseguir una disolución homogénea.
Método para la detección de biofilm
También forma parte del objeto de la presente invención un método para detectar biofilms en una superficie, que comprende las siguientes etapas:
(i) pulverizar sobre dicha superficie una composición que comprende peróxido de hidrógeno y un agente espesante;
(ii) dejar actuar la composición durante un período comprendido entre 30 segundos y 20 minutos; e
(iii) inspeccionar visualmente la aparición de burbujeo. La acción de pulverizar requerida en la etapa (i) se refiere la acción de aplicar una fina capa de la composición sobre la superficie, esparcida en pequeñas gotas, para lo cual puede utilizarse cualquier dispositivo para pulverización estándar, por ejemplo, en forma de pistola manual para pulverización, o mediante el empleo de una bomba impulsora.
La composición aplicada según la etapa (i) tiene preferiblemente todas las mismas características ya descritas anteriormente.
La aparición de burbujeo es indicativa de la reacción enzimática de las catalasas presentes en el biofilm y, por lo tanto, permite la detección de la presencia del mismo en la superficie por simple inspección visual.
La simplicidad de este método tiene la ventaja de permitir su aplicación para la detección de biofilm in situ en cualquier superficie, tanto a nivel de instalaciones industriales, como a nivel doméstico, y permite la detección rápida y eficaz de biofilms.
Este método permite la detección de biofilms, tanto monoespecie como multiespecie, que son catalasa-positivos. Ejemplos de microorganismos que poseen algún tipo de catalasa son, por ejemplo, dentro del género bacteriano, Salmonella, Listeria, Escheríchia, Staphylococcus, Micrococcus, Helicobacter, Enterococcus, Proteus, Pseudomonas, entre otros; y dentro del género fúngico, Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Fusaríum, Botritys, Cladosporíum, entre otros, tal como se describe en el artículo Beltrán-García et al., Catalasas de hongos fitopatógenos: ¿Factores de virulencia y resistencia a los fungicidas?, Rev. Méx. Fitopatol., 2006, 24 (1 ), 50-58.
En la práctica, este método resulta adecuado para la detección de la práctica totalidad de biofilms habitualmente presentes en el ámbito industrial y doméstico, ya que por lo general siempre incluyen una bacteria que sea catalasa-positiva. Dado que la mayoría de los biofilms en el medio ambiente son de tipo multiespecie, es suficiente con que el biofilm incluya al menos una especia catalasa-positiva para ser sensible al método de detección.
En cuanto a la superficie, prácticamente cualquier tipo de superficie es susceptible de serle aplicado el método de detección de biofilm de la presente invención, tanto metálicas, como por ejemplo de aluminio, cromo, acero, o acero inoxidable; como superficies de vidrio, cerámica o porcelana; así como cualquier de cualquier tipo de plástico, tales como polímeros termoplásticos o termoestables, por ejemplo resinas epoxi; entre otros posibles materiales.
La superficie a analizar puede estar en cualquier disposición, tanto en posición horizontal, vertical y en techos.
En la figura 1 se muestra una fotografía de una superficie de acero inoxidable, dispuesta en posición horizontal, sobre la que se aplicó el método de la invención para la detección de un biofilm de Pseudomonas aeruginosa.
Análogamente, en la figura 2 se muestra una fotografía de la aplicación del método de la invención para la detección del mismo tipo de biofilm también sobre una superficie de acero inoxidable, pero esta vez dispuesta en posición vertical. Según puede apreciarse en dichas fotografías, tras la pulverización del producto de la invención sobre la superficie, la presencia de biofilm provoca la aparición de un burbujeo, que es fácilmente observable por simple inspección visual.
El período de tiempo requerido en la etapa (ii) del método, durante el cual debe dejarse actuar la composición, oscila entre 30 segundos y 20 minutos, y será dependiente de la producción enzimática de la catalasa y, por consiguiente, de la densidad del biofilm en la superficie. Preferiblemente, el tiempo de actuación es de entre 30 segundos y 5 minutos, ya que no es necesario un tiempo superior para una detección eficaz del biofilm, si bien puede opcionalmente dejarse actuar durante un período superior, de hasta 20 minutos aproximadamente, sin menoscabo de la eficacia.
El método desarrollado en la presente invención presenta la ventaja que es válido para la detección de biofilms en cualquier superficie y en cualquier ámbito. Puede resultar especialmente útil en aquellos ámbitos en los que los requisitos de higiene son particularmente estrictos, como la industria alimentaria o en el marco sanitario.
En particular, el presente método para la detección de biofilm puede ser particularmente ventajoso como auxiliar para el establecimiento de Puntos Críticos de Control (PCC) en las superficies de la industria agroalimentaria.
Ejemplo 1 : Composiciones para la detección de biofilm Se prepararon 7 formulaciones (A a G) de composiciones para la detección de biofilm, según la utilización de la presente invención, utilizando las proporciones detalladas en la siguiente tabla:
Figure imgf000021_0001
Todas las composiciones obtenidas presentaban una viscosidad comprendida entre 300 y 600 mPa.s. Ejemplo 2: Ensayos de eficacia en la detección de biofilms
La eficacia de las composiciones de la invención se determinó frente a biofilms que se prepararon siguiendo procedimientos bien conocidos por el experto en la materia tal como los descritos en, por ejemplo, los artículos Fuster et al., Effect of different environmental conditions on the bacteria survival on stainless steel surfaces, Food Control, 2008, 19 (3), 308-314 y Montañez-lzquierdo et al., Use of epifluorescence microscopy to assess the effectiveness of phage P100 in controlling Listería monocytogenes biofilms on stainless steel surfaces, Food Control, 2012, 23 (2), 470-477. Para ello, se realizaron ensayos con diferentes condiciones de humedad, temperatura y tiempo, seleccionándose aquellas que permitían una óptima adherencia del microorganismo a las distintas superficies de prueba, y que además permitían reproducir los biofilms con una formación homogénea y repetitiva.
Se diseñaron biofilms con microorganismos de problemática general en el sector alimentario y hospitalario, como: Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli, Cronobacter sakazakii, Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus, y Candida albicans. Además, como testigo de catalasa negativa Lactobacillus spp.
A continuación, se ensayaron las 7 composiciones preparadas en el ejemplo 1 (composiciones de A a G), todas ellas dentro del marco de la presente invención. Para ello, las composiciones fueron pulverizadas sobre los biofilms en las superficies mencionadas, tanto en disposición horizontal como vertical. Después de pulverizar, se realizó una inspección visual a diferentes tiempos, observándose la producción de una efervescencia fácilmente visible, indicativa de la presencia de biofilms.
Las fórmulas con colorante (B a G) resultaron más eficaces en cuanto a facilitar la visualización de la efervescencia generada.
Las figuras 1 y 2 muestran dos fotografías con el resultado del ensayo realizado con la formulación B, sobre la superficie dispuesta horizontalmente y verticalmente, respectivamente. Puede observarse a simple vista la efervescencia, indicadora de la presencia de biofilm.
Ejemplo 3: Ensayos comparativos de eficacia
Se utilizaron superficies recubiertas con pintura epoxi para el desarrollo de biofilms de Pseudomona aeruginosa.
En la figura 3 se muestran dos superficies recubiertas con pintura epoxi en cuya superficie se han desarrollado sendos biofilms de Pseudomona aeruginosa. Las superficies se encuentran dispuestas en posición horizontal, y en la figura 3A se muestran después de 30 segundos de haber pulverizado la composición según la presente invención (imagen izquierda) y una solución simple compuesta de agua y peróxido de hidrógeno de la misma concentración (imagen derecha).
En la figura 3B se muestra una fotografía con las mismas superficies de la figura 3, pero después de 5 minutos de reacción. En la figura 3C se muestra una fotografía con las mismas superficies de la figura 3, pero después de 15 minutos de reacción.
El burbujeo generado con la composición según la presente invención se hace más visible, ya que es más fuerte, aglutinado y permanece a lo largo del tiempo con respecto al de la solución simple donde se observa débil, disperso y desaparece a lo largo del tiempo.
En la figura 4 se muestra una fotografía de una superficie recubierta con pintura epoxi con un biofilm de Pseudomona aeruginosa, dispuesta en posición vertical, donde se aplicó mediante pulverización la solución simple compuesta de agua y peróxido de hidrógeno usada en el ensayo de la figura 3. Los tiempos de reacción son de 30 segundos y 5 minutos para la imagen izquierda y derecha, respectivamente. Se aprecia un burbujeo inicial escaso a los 30 segundos (señalado por el óvalo en imagen izquierda) que difícilmente permanece visible a medida que avanza el tiempo (señalado por el óvalo en imagen derecha).
En la figura 5 se muestra una fotografía de dos superficies recubiertas con pintura epoxi con biofilms de Pseudomona aeruginosa, dispuestas en posición vertical, después de 5 minutos de reacción al pulverizar la composición según la presente invención (imagen izquierda) y una solución simple compuesta de agua y peróxido de hidrógeno de la misma concentración (imagen derecha). En la superficie recubierta con pintura epoxi dispuesta en posición vertical, se aprecia una gran diferencia en la producción del burbujeo y su permanencia a lo largo del tiempo con la composición según la presente invención con respecto a la solución simple, donde la producción del burbujeo se percibe débil, ya que se desliza y rápidamente desaparece. En la figura 6 se muestra una fotografía de tres superficies de acero inoxidable con biofilms de Pseudomona aeruginosa, dispuestas en posición vertical, después de 5 minutos de reacción al pulverizar la solución simple compuesta de agua y peróxido de hidrógeno (superficie derecha), una composición según la presente invención (superficie centro) y una composición según la presente invención sin colorante (superficie izquierda). Aquí se puede apreciar, como a una distancia razonable, menor de un metro, se visualiza mejor el biofilm del centro por la producción de burbujeo y el color, aun cuando la coloración no es intensa, ésta ayuda a su fácil detección con respecto al biofilm derecho donde lleva espesante, pero no colorante.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Utilización de una composición acuosa que comprende peróxido de hidrógeno y un agente espesante para detectar biofilms.
2. - Utilización según la reivindicación 1 , caracterizado porque el contenido de peróxido de hidrógeno está comprendido entre el 0,5% y el 50%, expresado en peso sobre el peso total de la composición.
3.- Utilización según la reivindicación 2, caracterizado porque el contenido de peróxido de hidrógeno está comprendido entre el 4,5% y el 7%, expresado en peso sobre el peso total de la composición.
4. - Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el agente espesante se elige de entre el grupo formado por goma xantana, goma guar, goma gellan, goma garrotín, goma tragacanto, carragenanos, goma de Konjac, homopolímeros o copolímeros de ácidos carboxílicos, o anhídridos olefínicamente insaturados, y homopolímeros o copolímeros reticulados de ácidos carboxílicos o anhídridos olefínicamente insaturados.
5. - Utilización según la reivindicación 4, caracterizado porque el agente espesante se elige entre goma xantana, goma gellan, goma Konjac y homopolímeros o copolímeros reticulados de ácidos carboxílicos o anhídridos olefínicamente insaturados.
6.- Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el contenido de agente espesante está comprendido entre el 0,05% y el 5%, expresado en peso sobre el peso total de la composición.
7.- Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la composición contiene adicionalmente un tensioactivo.
8- Utilización según la reivindicación 7, caracterizado porque el tensioactivo se selecciona de entre el grupo formado por tensioactivos aniónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos no iónicos, y mezclas de los mismos.
9.- Utilización según la reivindicación 8, caracterizado porque la composición comprende una mezcla de tensioactivos aniónicos y no iónicos.
10. - Utilización según la reivindicación 9, caracterizado porque el tensioactivo aniónico es un sulfato de éter de alquilo y el tensioactivo no iónico se selecciona de entre el grupo formado por alcohol graso etoxilado, éster de sorbitan etoxilado y alquilpoliglicósido.
1 1 . - Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque el contenido de tensioactivo está comprendido entre el 3% y el 25%, expresado en peso sobre el peso total de la composición.
12. - Utilización según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el contenido de tensioactivo no iónico está comprendido entre el 1 % y el 15%, y el contenido de tensioactivo aniónico está comprendido entre el 0,5% y el 10%, expresado en peso sobre el peso total de la composición.
13. - Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la composición contiene además un colorante.
14.- Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 caracterizado porque la composición contiene además un agente secuestrante.
15. - Utilización según la reivindicación 1 , caracterizado porque la composición comprende:
- entre el 4% y el 15% de peróxido de hidrógeno;
- entre el 0,05% y el 5% de un espesante;
- entre el 3% y el 25% de tensioactivo;
- entre el 0,0001 % y el 1 % de colorante;
- entre el 0,001 % y el 5% de un agente secuestrante; y
- entre el 0,001 % y 1 % de estabilizante,
en donde los porcentajes están expresados en peso con respecto al peso total de la composición.
16. - Utilización según la reivindicación 1 , caracterizado porque la composición comprende:
- entre el 4% y el 15% de peróxido de hidrógeno; - entre el 0,05% y 5% de un espesante;
- entre el 1 % y el 15% de tensioactivo no iónico;
- entre el 0,5% y el 10% de tensioactivo aniónico;
- entre el 0,0001 % y el 1 % de colorante;
- entre el 0,001 % y el 5% de un agente secuestrante; y
- entre el 0,001 % y el 1 % de estabilizante,
en donde los porcentajes están expresados en peso con respecto al peso total de la composición
17.- Método para detección de biofilm en una superficie, que comprende las siguientes etapas:
(i) pulverizar sobre dicha superficie una composición acuosa que comprende peróxido de hidrógeno y un agente espesante;
(ii) dejar actuar la composición durante un período comprendido entre 30 segundos y 20 minutos; e
(iii) inspeccionar visualmente la aparición de burbujeo.
18.- Método según la reivindicación 17, caracterizado porque la composición pulverizada en la etapa (i) es según se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200115733A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-16 Sterilex, Llc Compositions, devices and methods for detecting biofilms

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3214180B1 (en) 2016-03-01 2021-11-17 Sani-Marc Inc. Methods, compositions and kits for determining cleanness of a surface
US10920263B2 (en) 2016-03-01 2021-02-16 Sani-Marc Inc. Methods, compositions and kits for determining cleanness of a surface

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0105747A1 (en) * 1982-10-06 1984-04-18 Venturecare Limited Hygiene-testing
JPS61162199A (ja) * 1985-01-11 1986-07-22 Karupisu Shokuhin Kogyo Kk 微生物汚染度簡易検出剤
FR2611744A1 (fr) * 1987-02-23 1988-09-09 Biomerieux Sa Reactif de detection de la catalase par degagement d'oxygene
JP2005210997A (ja) 2004-01-30 2005-08-11 Nichirei Corp バイオフィルム染色剤
US20090208996A1 (en) * 2008-02-20 2009-08-20 Jagath Kadurugamuwa Method and Kit for Detecting Microorganisms On A Household Surface

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0105747A1 (en) * 1982-10-06 1984-04-18 Venturecare Limited Hygiene-testing
JPS61162199A (ja) * 1985-01-11 1986-07-22 Karupisu Shokuhin Kogyo Kk 微生物汚染度簡易検出剤
FR2611744A1 (fr) * 1987-02-23 1988-09-09 Biomerieux Sa Reactif de detection de la catalase par degagement d'oxygene
JP2005210997A (ja) 2004-01-30 2005-08-11 Nichirei Corp バイオフィルム染色剤
US20090208996A1 (en) * 2008-02-20 2009-08-20 Jagath Kadurugamuwa Method and Kit for Detecting Microorganisms On A Household Surface

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELTRÁN-GARCÍA ET AL.: "Catalasas de hongos fitoiDat6 enos: Factores de virulencia y resistencia a los fungicidas?", REV. MEX. FITOPATOL., vol. 24, no. 1, 2006, pages 50 - 58
BREDHOLT ET AL.: "Microbial methods for assessment of cleaning and disinfection of food-processing surfaces cleaned in a low-pressure system", EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 209, no. 2, 1999, pages 145 - 152
CHELIKANI ET AL.: "Diversity of structures and properties among catalases", CMLS, CELL. MOL. LIFE SCI., vol. 61, 2004, pages 192 - 208
CHRISTENSEN ET AL.: "Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 22, no. 6, 1985, pages 996 - 1006
FUSTER ET AL.: "Effect of different environmental conditions on the bacteria survival on stainless steel surfaces", FOOD CONTROL, vol. 19, no. 3, 2008, pages 308 - 314
HAWSER ET AL.: "Biofilm formation by Candida species on the surface catheter of materials in vitro", INFECTION IMMUNITY, vol. 62, no. 3, 1994, pages 915 - 921
JABRA-RIZK ET AL.: "Fungal biofilms and drug resistance", EMERGING INFECT. DIS., vol. 10, no. 1, 2004, pages 14 - 19
JO ET AL.: "Maturation and survival of Cronobacter biofilms on silicone, polycarbonate, stainless steel and UV light and ethanol after immersion treatments", J. FOOD PROTECTION, vol. 73, no. 5, 2010, pages 952 - 956
LEE WONG ET AL.: "Biofilm in Food Processing Environments", J. DAIRY SCI., vol. 81, no. 10, 1998, pages 2765 - 2770
M. ASCH; ASCH: "Handbook of Industrial Surfactants", 2005, article "Synapse Information Resources"
MATTILA-SANDHOLM ET AL.: "Biofilm in the industry: A review", FOOD REV. INT., vol. 8, no. 4, 1992, pages 573 - 603
MONTANEZ-IZQUIERDO ET AL.: "Use of epifluorescence microscopy to assess the effectiveness of phage P 100 in controlling Listeria monocytogenes biofilms on stainless steel surfaces", FOOD CONTROL, vol. 23, no. 2, 2012, pages 470 - 477
PANISELLO ET AL.: "Application of foodborne disease outbreak data in the development and maintenance of HACCP systems", INT. J. FOOD MICROBIOL., vol. 59, no. 3, 2000, pages 221 - 234
SCHLAPP ET AL.: "Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture", J. MICROBIOL. METHODS, vol. 87, 2011, pages 234 - 240
See also references of EP2902497A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200115733A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-16 Sterilex, Llc Compositions, devices and methods for detecting biofilms
US10927397B2 (en) * 2018-10-16 2021-02-23 Sterilex, Llc Compositions, devices and methods for detecting biofilms

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