WO2014048071A1 - 抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的药物组合和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及关于PRCP的拮抗剂、PREP的拮抗剂、或者PRCP以及PREP的双重拮抗剂的药物组合物。本发明也涉及关于联合使用PRCP的拮抗剂和mTOR的拮抗剂、联合使用PREP的拮抗剂和mTOR的拮抗剂、或者联合使用PRCP以及PREP的双重拮抗剂和mTOR的拮抗剂的药物组合物。此外，本发明还涉及利用上述药物组合物治疗或预防癌症等与胰岛素受体底物蛋白相关的以及与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的疾病的方法。

Description

抑制 PI3K/AKT/mTOR信号通路的药物组合和方法 本申请要求 2012 年 12 月 29 日提交的中国专利申请 （申请号
201210379418.9 ) 的优先权。 技术领域
本发明涉及 PI3K (磷脂酰肌醇激酶 （Phosphoinositide 3-kinase ) /AKT (蛋白激酶 B ( Protein Kinase B ) I mTOR (雷帕霉素靶蛋白
( mammalian target of rapamycin ) )信号通路相关的疾病的治疗或预防。 更 具 体地说 ， 本发 明 涉及包含 PRCP ( 脯氨酰羧肽酶 ( prolylcarboxypeptidase ) ) 拮抗剂 （也即抗 PRCP的拮抗剂） 、 或者 是 PREP (脯肽酰内肽酶（prolyl endopeptidase ) )拮抗剂（也即抗 PREP 的拮抗剂） 、 或者是 PRCP以及 PREP双重拮抗剂的药物组合物， 或者 是包含 PRCP拮抗剂和 mTOR拮抗剂的药物组合物，或者是包含 PREP 拮抗剂和 mTOR拮抗剂的药物组合物， 或者是包含 PRCP和 PREP双 重拮抗剂和 mTOR拮抗剂的药物组合物。 本发明还涉及使用上述药物 组合物来治疗或预防 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关的疾病的方法。 此外， 本发明还涉及胰岛素受体蛋白稳定性和降解的分子机制， 以及 利用 PRCP拮抗剂、 PREP拮抗剂、 以及 PRCP以及 PREP双重拮抗剂 降解胰岛素受体底物蛋白从而进行治疗的方法。 背景技术
PRCP禾卩 PREP同属于脯氨酰肽酶 （prolyl peptidase ) 家族。 系统 进化分析显示 PRCP和 PREP含有高度相似的氨基酸序列，并且拥有相 似的酶功能。 它们都能裂解已知 PRCP 底物神经肽血管紧缩素 ΙΙ/ΙΠ ( Angll/III ) 和 α-黑素细胞刺激素 （α-MSH ) 。 PREP还额外与神经加 压素 ( neurotensin ) 和促胃液素释放激素 ( gastrin-releasing hormone ) 等神经肽相互作用。 这些神经肽能够激活 G蛋白偶联受体（GPCR )并 通过 G 蛋白偶联受体来调节受体酪氨酸激酶信号通路的功能 ( Garcia-Horsman et al., (2007) Neutopeptides 41 : 1 -24; Rosenblum JS et al" (2003) Current Opinion in Chemical Biology, 7:496-504; Skidgel et al, ( 1998) Immunological Reviews, 161 : 129-41. Rozengurt E et al, Clin Cancer Res 2010; 16:2505-1 1 ) 。 目前的研究表明， PRCP与肥胖症有关 系 （ Shariat-Madar B et al, (2010) Diabetes Metab Syndr Obes., 3: 67-78 ) 。 我们之前的研究发现 PRCP调节细胞增殖、 自噬和对三苯氧 胺药物的抗性 ( Duan L et al, (201 1) JBC, 286:2864-2876 ) 。 而 PREP与 健忘症、 抑郁症和早老性痴呆病有关系 （Rosenblum JS et al, (2003) Current Opinion in Chemical Biology7 :496-504 ) 。 目前， PRCP禾卩 PREP 的其他作用机理尚不清楚。 细胞增长和增殖受若干不同的因素调控。 这些因素包括营养的可 获性、 生长因子 （例如胰岛素和胰岛素样生长因子等） 的可获性以及 细胞的能量状态等。 PI3K/AKT/mTOR信号通路整合这三个因素的输 入来控制细胞的增长和增殖 （Manning et al, (2007) Cell 129: 1261-1274； Engelman et al, (2006) Nat Rev Genet 7:606-619 ) 。
PBK/AKT/mTOR 信号通路可以认为是癌症中最常见的被异常激 活的信号通路 （Engelman, JA. (2009) Nature Reviews/Cancer 9:551 ) 。
PBK/AKT/mTOR 信号通路被 RTK (受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase ) ) 激活。 受体酪氨酸激酶包括胰岛素受体 （IR) ， 胰岛素样生 长因子受体 （IGF-1R) ， 血小板衍生生长因子受体 （PDGFR) 以及表 皮生长因子受体 （EGFR) 。 受体酪氨酸激酶可以直接地调节 PI3K p85 亚基或者间接通过胰岛素受体底物 （IRS ) 调节与其相互作用的 ΡΙ3Κ ρ85亚基来激活 PBK C Markman et al, (2009) Ann Oncol. 21(4):683-91 )。
P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶。 PI3K有三类。 I类 PI3K大部 分位于胞浆， 是由一个起催化作用的蛋白亚基和一个起调节作用的蛋 白亚基组成的异源二聚体。 I类 PI3K进一步分成两类： IA类 PI3K由 一个起催化作用的 pH O亚基和一个包含 SH2结构的起调节作用的 p85 亚基组成二聚体， 被受体酪氨酸激酶激活； IB类 PI3K由一个起催化作 用的 ρΐ ΐθγ亚基和一个起调节作用的 plOl亚基组成二聚体， 被 G蛋白 偶联受体激活 ( Katso et al, (2001 ) Annu. Rev. Cell Dev. Biol.17:615 ) 。 II类 PI3K由三个亚基组成。 III类 PI3K只调节磷脂酰环己六醇的磷酸 化， 在蛋白质向溶酶体转运中起必要作用 （Volinia et al, (1995) EMBO J. 14:3339 ) 。 其中， IA类 PI3K的激活与受体酪氨酸激酶密切相关。 受体酪氨酸 激酶介导的 PI3K的激活对受体酪氨酸激酶的致癌性起重要的作用。 在 受体酪氨酸激酶依赖的癌症中， PI3K的活性完全地被受体酪氨酸激酶 控制。 静止状态的 IA类 PI3K位于细胞浆中。 它的活性被与其组成二聚 体的 p85亚基所抑制。 PI3K的 p85亚基对受体酪氨酸激酶介导的 PI3K的 激活起至关重要的作用。 p85亚基的 SH2结构结合到受体上磷酸化的酪 氨酸， 并且导致释放 p85亚基对 PI3K的抑制， 从而激活 PI3K。 胰岛素受体以及胰岛素样生长因子受体属于受体酪氨酸激酶， 并 且对 ΡΙ3Κ的激活起至关重要的作用。 胰岛素受体以及胰岛素样生长因 子受体的信号引起胰岛素受体底物 （IRS ) 磷酸化， 磷酸化后的胰岛素 受体底物转而与 ρ85亚基的 SH2结构相互作用，导致招募 ΡΙ3Κ到细胞膜， 并且释放 ρ85亚基对 ΡΙ3Κ抑制， 从而激活 ΡΙ3Κ。 胰岛素受体底物 (包括 IRS- 1 ,IRS- 1 ,IRS-3,IRS-4) 是胰岛素受体 (IR) 和胰岛素样生长因子受体 (IGF-1R) 的接头蛋白。 胰岛素受体以及胰岛 素样生长因子受体通过调节胰岛素受体底物酪氨酸磷酸化和与胰岛素 受体底物交互作用的 PI3K p85亚基磷酸化来激活 PI3K。 胰岛素受体底 物对激活细胞中的 ΡΙ3Κ/ΑΚΤ起关键性的作用。 许多癌组织过量表达胰 岛素受体底物 IRS- 1 , 并且转基因表达 IRS-1或 IRS-2于老鼠乳腺中导致 乳腺癌发生和癌转移（Metz， et al., Clin Cancer Res 17: 206-21 1 ; Bergmann et al., (1996) Biochem Biophys Res Commun 220: 886-890; Dearth et al., (2006) Mol Cell Biol 26: 9302-9314)。 除受胰岛素受体以及胰岛素样生长因子受体调节酪氨酸磷酸化之 夕卜， 胰岛素受体底物还受一些苏氨酸激酶（比如说 mTOR, S6K和 ERK)调 节的苏氨酸磷酸化。 胰岛素受体底物的苏氨酸磷酸化可导致胰岛素受 体底物蛋白降解和功能抑制， 而治疗性的降解胰岛素受体底物导致癌 细胞死亡 (Sun et al" (2009) Vitam Horm 80: 351-387; Reuveni et al" Cancer Res 73: 4383-4394)。 被激活的 PI3K催化磷脂酰肌醇第三羟基的磷酸化， 产生酰磷酯酰 肌醇 -3-磷酸 （PI3P ) 。 PI3P作为细胞生长信号通路的第二信使， 影响 细胞增长、 增殖、 生存、 迁徙、 恶性转化、 组织血管新生和蛋白质转 运等细胞活动 ( Mark隱 et al, (2009) Ann Oncol. 21(4):683-91 ) 。 AKT是一种丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶。 PI3K产生的 PI3P可以和
AKTN端的 PH结构域结合， 使 AKT从细胞质转移到细胞膜上， 并在 3- 磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1 ( PDKI )的辅助下， 通过磷酸化 AKT蛋白上 的苏氨酸磷酸化位点 （Thr308 ) 和丝氨酸磷酸化位点 （Ser473 ) ， 从而 激活 AKT。 AKT通过激活下游的靶分子来控制细胞增殖、 生存及组织 血管新生 （Cantley et al, (1999) PNAS 96:4240) 。
AKT下游的一个重要的靶分子是 mTOR。 mTOR是一个重要的丝氨 酸 /苏氨酸激酶。 它最初在酵母菌中被发现命名为 TOR, 并随后经筛选 识别为免疫拮抗剂雷帕霉素的靶点（Kunz et al, (1993 ) Cell (73): 585 , 或 U.S. Pat. No. 3,929,992 ) 。 根据它的催化区同源性， mTOR被归类于
PI3K蛋白激酶家族。 mTOR的活性受氨基酸、 葡萄糖和生长因子调节。 除了作为营养状况的检验点， mTOR还是 PI3K/AKT信号通路下游的一 个重要中转站 （Grunwald et al，（2002) Cancer Res. 62: 6141 ; Stolovich et al, (2002) Mol Cell Biol. 22: 8101 ) 。 AKT调节 TSC 1/TSC2的磷酸化， 并抑制它们对小 G蛋白 Rheb的 GTP酶活化， 从而激活 Rheb。 Rheb直接与 mTOR结合， 这个过程受氨基酸调节。 mTOR信号传导通过需要氨基酸 和激活 Rhed来送到 S6K1。 mTOR下游的效应分子包括核醣体蛋白 p70 S6激酶 （S6K 1 ) 和真 核启动因子抑制性结合蛋白 （4E-BP1 ) 。 激活后的 mTOR催化 S6K1的 磷酸化并激活它。 同时， mTOR催化 4E-BP1的磷酸化并使其失活。 该 结果导致蛋白翻译的起始和细胞周期的前进 （Kozma et al, (2002) Bioessays 24: 65 ) 。 更重要的是， mTOR通过抑制胰岛素受体底物的磷 酸化和稳定性来负反馈调节 PI3K/AKT的活性。 抑制 PI3K/AKT/mTOR信号通路被认为是一种有前途的抗癌疗法 ( Engelman, JA, (2009) Nature Reviews: Cancer 9:551 ) 。 mTOR的拮抗 剂雷帕霉素 （rapamycin) 是最先使用的抗 PI3K/AKT/mTOR信号通路 的抗癌药 （Courtney et al, (2010) J Clin Oncol 28: 1075-1083; Vivanco et al, (2002) Nat Rev Cancer 2:489-501 ) 。 遗憾的是， 雷帕霉素在解除了 mTOR信号通路对胰岛素受体底物的负反馈性抑制的同时， 反而导致 PI3K和 AKT的激活。受雷帕霉素治疗的病人肿瘤中的 AKT磷酸化增强， 导致雷帕霉素对肿瘤的治疗失败 （Easton et al, (2006) Cancer Cell. 9(3):153-5 ) 因此， 需要寻找对于 PBK/AKT/mTOR信号通路相关疾病的更有效 的治疗方法， 特别是需要寻找阻止胰岛素受体底物反馈性激活的药物。 发明内容
本发明涉及 mTOR拮抗剂（如雷帕霉素）反馈性激活 PI3K和 AKT 的机制， 并且发明可阻止这一反馈性激活的药剂， 从而促进对 PI3K/AKT/mTOR相关的疾病的治疗或预防。这种药剂和 mTOR拮抗剂 的联合使用将会改善 PI3K/AKT/mTOR 相关的疾病的症状， 治疗或预 防 PI3K/AKT/mTOR 相关的疾病的发生， 从而有效地防治 PI3K/AKT/mTOR相关的疾病。 相应地， 本发明还涉及如何使用上述药 剂和药物组合物治疗和预防相关疾病的方法。 一方面， 本发明使用有效剂量的 PRCP拮抗剂、 有效剂量的 PREP 拮抗剂、 或者是使用有效剂量的 PRCP 以及 PREP双重拮抗剂来抑制 P K/AKT/mTOR 信 号 通 路 ， 从 而 治 疗 或 预 防 癌 症 等 与
PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活相关的疾病。拮抗剂的范围包括但 不限于使用化学抑制剂或者抑制性核苷酸。 另一方面， 本发明还用 PRCP拮抗剂、 PREP拮抗剂、 或者 PRCP 以及 PREP双重拮抗剂来阻止 mTOR拮抗剂导致的反馈性激活 PI3K和
A To 通过联合使用有效剂量的 PRCP拮抗剂和 mTOR拮抗剂、 或者 联合使用有效剂量的 PREP拮抗剂和 mTOR拮抗剂、 或者联合使用有 效剂量的 PRCP 以及 PREP 双重拮抗剂和 mTOR 拮抗剂来抑制 PI3K/AKT/mTOR信号通路， 从而治疗或预防与 PI3K/AKT/mTOR信号 通路异常激活相关的疾病。 拮抗剂的范围包括但不限于使用化学抑制 剂或者抑制性核苷酸。 此外，本发明还涉及利用 PRCP拮抗剂、 PREP拮抗剂、或者 PRCP 以及 PREP双重拮抗剂来降解胰岛素受体底物蛋白。通过使用有效剂量 的前述拮抗剂来降解胰岛素受体底物蛋白， 从而治疗或预防与胰岛素 受体底物蛋白密切相关的疾病， 包括由 PI3K/AKT/mTOR 信号通路异 常激活所导致的相关疾病， 特别是癌症。 前述发明中， PRCP拮抗剂、 PREP拮抗剂、或者 PRCP以及 PREP 双重拮抗剂可以是任何拮抗剂。 例如， 它们可以是抑制性核苷酸。 优 选地， PRCP拮抗剂和 PREP拮抗剂是小分子化合物及其衍生物； 更优 选地， 前述小分子化合物为叔丁基 (2S)-2-U(2S)-2-甲酰基吡咯垸 -1-基] 羰 基 ） 吡 咯 垸 -1- 羧 酸 酯 (tert-butyl(2S)-2-{[(2S)-2-formylpyrrolidin-l-yl]carbonyl}pyrrolidine-l-ca rboxylate)(Z-Pro-Prolinal或者 ZPP)及其衍生物和小分子化合物 [2-[8- (二 甲 基氨基）辛硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基 噻吩 -2-基 甲 酮 ([2-[8-(dimethylamino)octylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen- 2-ylmethanone) (Y29794)及其衍生物。 另外， 优选的 mTOR拮抗剂是小 分子化合物雷帕霉素 （rapamycin) 及其衍生物。 其中， 优选与 PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活相关的疾病是 癌症、 神经变性疾病、 新陈代谢性疾病、 错构瘤综合征和遗传性肌病。 附图说明
图 1.应用 MTT比色法和菌落形成实验 （clonogenesis assay ) 检测
ZPP引起癌细胞毒性。
图 2. 应用 MTT比色法检测 Y29794引起癌细胞毒性。
图 3. 应用免疫印迹法检测 PRCP或者 PREP蛋白在通过 Lenti 病 毒介导的 shRNA沉默方法获得的 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默、 或者 PRCP和 PREP基因双重沉默的 Panc-1胰腺癌细胞中的蛋白表达 水平，应用细胞 DNA染色细胞增殖实验检测抑制 Panc-1胰腺癌细胞增 殖。
图 4. 应用实时定量 PCR检测在 PRCP或者 PREP基因在通过 Lenti 病毒介导的 shRNA沉默方法获得的 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默、 或者 PRCP和 PREP基因双重沉默的 PK-9胰腺癌细胞中的基因表达水 平，应用细胞 DNA染色细胞增殖实验检测抑制 PK-9胰腺癌细胞增殖。
图 5. 应用实时定量 PCR检测在 PRCP或者 PREP基因在通过 Lenti 病毒介导的 shRNA沉默方法获得的 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默、 或者 PRCP和 PREP基因双重沉默的 Capan-1胰腺癌细胞中的基因表达 水平， 应用细胞 DNA染色细胞增殖实验检测抑制 Capan-1胰腺癌细胞 增殖。
图 6. 应用免疫印迹法检测 PRCP或者 PREP蛋白在通过 Lenti 病 毒介导的 shRNA沉默方法获得的 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默、 或者 PRCP和 PREP基因双重沉默的 MCF7乳腺癌癌细胞中的蛋白表达 水平，应用细胞 DNA染色细胞增殖实验检测抑制 MCF7乳腺癌癌细胞 增殖。
图 7. 应用免疫印迹法检测在 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默、 或者 PRCP和 PREP基因双重沉默抑制癌细胞 Panc-1、 PK-9、 Capan-1 和 MCF7中 AKT磷酸化。
图 8. 应用免疫印迹法检测 ZPP 和 Y29794降低癌细胞 Panc-1、
PK-9和 MCF7中 AKT磷酸化。
图 9. 应用免疫印迹法检测 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默、 或 者 PRCP 和 PREP 基因双重沉默阻止雷帕霉素所诱导的反馈性升高 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化。
图 10. 应用免疫印迹法检测 ZPP在 Panc-1和 MCF细胞中抑制雷 帕霉素所诱导的反馈性升高 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化。
图 11. 应用免疫印迹法检测 Y29794在 Panc-1和 MCF细胞中抑制 雷帕霉素所诱导的反馈性升高 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化。
图 12. 应用 PI3K 激酶活性分析实验和免疫印迹法检测 ZPP 和 Y29794抑制细胞中的 PI3K激酶活性激酶活性， 并且阻止雷帕霉素所 诱导的反馈性激活 PI3K。
图 Π. 应用 ΡΙ3Κ 激酶活性分析实验和免疫印迹法检测 ΖΡΡ 和 Υ29794抑制细胞中的 IRS-1磷酸化及其与 ρ85亚基的相互作用， 并且 抑制 IRS-1关联的 ΡΙ3Κ激酶活性。
图 14. 应用 ΡΙ3Κ激酶活性分析实验和免疫印迹法检测 PRCP和
PREP基因双重沉默降低 PI3K激酶活性， 并且阻止雷帕霉素所诱导的 反馈性激活 PI3K。
图 15. 应用 ΜΤΤ比色法和菌落形成实验检测 ΖΡΡ和雷帕霉素联 合使用协同增加药物的细胞毒作用。
图 16. 应用 ΜΤΤ比色法和菌落形成实验检测 Υ29794和雷帕霉素 联合使用协同增加药物的细胞毒作用。
图 17. 应用裸鼠种植肿瘤治疗实验 Υ29794和雷帕霉素联合使用 协同抑制肿瘤生长。
图 18. 应用免疫印迹法检测 PRCP和 PREP基因双重沉默引起胰 岛素受体底物的苏氨酸磷酸化和蛋白降解。 图 19. 利用药物抑制 PRCP和 PREP酶功能引起胰岛素受体底物 的苏氨酸磷酸化和蛋白降解。 具体实施方式
本发明中， PRCP (基因文库指定号码 （ accession number )
NP— 005031， 其中同工型 （isoform ) 1 为 NP— 005031 .1 ; 同工型 2 为 NP— 955450.2 ) 是指一个属于脯氨酰肽酶 （ prolyl peptidase ) 家族和羧 肽酶家族 （carboxypeptidase) 的丝氨酸肽酶。 人类的 PRCP 的氨基酸 序列如 SEQ ID No. l所示。 PRCP裂解肽段 C -末端的脯氨酸肽键。 本 发明中， PREP (基因文库指定号码 NP— 002717 )属于脯氨酰肽酶家族。 人类的 PREP的氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示。 系统进化分析显示 PRCP和 PREP含有高度相似的氨基酸序列， 并且拥有相似的酶功能。 它们都能裂解已知 PRCP底物神经肽血管紧缩素 Π/ΙΙΙ ( Angll/III )和 α- 黑素细胞刺激素 （α-MSH ) 。 PREP还额外与神经加压素 （neurotensin) 和促胃液素释放激素 （gastrin-releasing hormone ) 等神经肽相互作用。 这些神经肽激活 G蛋白偶联受体 （GPCR) 并通过 G蛋白偶联受体来 调节受体酪氨酸激酶信号通路的功能 （Garcia-Horsman et al. (2007) Neutopeptides 41 : 1-24; Rosenblum JS et al, (2003) Current Opinion in Chemical Biology, 7:496-504; Skidgel et al, ( 1998) Immunological Reviews, 161 : 129-41 ) 。 脯氨酰肽酶家族还包括 acylaminoacyl peptidase ( AAP ) ， 二肽基 肤醇 ( DPP4 , DPP7， DPP8, DPP9禾卩 fibroblast activation protein alpha ( FAP ) ) ( Rosenblum JS et al, (2003) Current Opinion in Chemical Biology, 7:496-504 ) 。 脯氨酰肽酶家族蛋白质己知的生物功能有相似 之处。 PRCP与肥胖症有关系 （ Shariat-Madar B et al, (2010) Diabetes Metab Syndr Obes., 3: 67-78 ) 。 PRCP基因敲除的老鼠体重比野生型老 鼠低。抑制 PRCP酶功能亦能降低老鼠体重。我们自己的研究发现 PRCP 调节细胞增殖、 自噬和对抗癌药物的抗性 （Duan L et al, (201 1 ) JBC, 286:2864-2876 ) 。 DPP4与肥胖症和糖尿病有关系。 DPP4基因敲除的 老鼠在进食高脂肪食物以后比野生型老鼠难增加体重而且对胰岛素更 敏感 ( Richter B et al, (2008) Cochrane Database Syst Rev., 16;(2):CD006739 ) 。 DPP4抑制剂被用于治疗糖尿病。 DPP7调节静态 淋巴细胞的生存。 PREP禾 B FAP 超量表达增加细胞增殖。 PREP与健忘 症， 抑郁症和早老性痴呆病有关系 （Rosenblum JS et al, (2003) Current
Opinion in Chemical Biology7:496-504 ) 。 拮抗剂指的是在体外和体内试验中能减少、 阻止或预防 PRCP、 PREP或 mTOR功能的分子。 PRCP拮抗剂和 PRCP的拮抗剂包括但不 限于对羧肽酶家族和脯氨酰肽酶家族的其他具有相似功能的蛋白质的 拮抗剂。 mTOR的拮抗剂包括但不限于对参与激活 mTOR信号通路的 其他蛋白质的拮抗剂。 这里使用的抑制性核苷酸这个术语指的是能够抑制特定基因表达 的核苷酸化合物。 典型的抑制性核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸
( antisense oligonucleotides)、三链螺旋 DNA ( triple helix DNA )、 RNA 适配体（aptamers )、核酶（ribozymes )、短抑制核糖核苷酸（siRNA ) 、 短发夹 RNA ( shRNA)和 microRNA。例如， 由于己经知道 PRCP和 PREP 的序列， 能够根据 PRCP和 PREP的序列设计 siRNA , microRNA或者反 义寡核苷酸， 从而抑制 PRCP和 PREP的表达。 相似地， 能够合成核酶去 特异识别基因的核苷酸序列并对其进行剪切。 应该意识到， 本领域技 术人员完全能够通过现有技术设计这类的抑制性核苷酸， 而不需要付 出创造性的劳动。 这里使用的小分子化合物这个术语指的是一种分子量小于 3千道 尔顿的有机化合物。 有机化合物可以是天然物或者是化合物。 有效剂量是指足够影响靶分子或信号通路的生物功能， 因而能起 到预防或改善临床症状或状态的剂量。 有效剂量是基于预期目标来确 定的。 本发明中， 有效剂量也是指能够减少靶分子或者信号通路的活 性、 功能、 或者宿主反应至少 10%的剂量， 优选的是能够减少其 30%的 剂量，更优选的是能够减少其 50-90%的剂量。
P13K/AKT/mTORff号通路相关的疾病、 P13K/AKT/mTOR信号通 路异常导致的疾病、 PI3K/AKT/mTOR信号异常导致的疾病、
PI3K/AKT/mTOR信号相关的疾病和 PI3K/AKT/mTOR信号引起的疾病 属于同一术语。这些疾病包括但不限于癌症、器官移植相关的失调（比 方说降低排斥率、 移植物抗宿主病等） 、 肌肉硬化症、 关节炎、 过敏 性脑脊髓炎、 免疫抑制相关的失调、 代谢失调 （比方说肥胖症、 糖尿 病等） 、 减少血管损伤后的内膜增厚、 蛋白质错误折叠疾病 （比方说 早老性痴呆病、 高雪氏病、 帕金森氏病、 亨廷顿舞蹈症、 囊肿性纤维 化、 黄斑变性、 色 素性视网膜炎、 糖尿病视网膜病变、 感染性蛋白质 病等） 。 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的疾病还包括错构瘤综合征， 比如 结节性硬化症和多发性错构瘤综合征等。 错构瘤是一种类似于肿瘤的 畸形， 临床表现为受影响部位的成熟细胞和组织的生长过度。
PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的疾病还包括遗传性的肌病， 比如 肌管性肌病等。 肌管性肌病的特点是磷酸酶肌微管素 （myotubularin ) 的活性降低。肌微管素的功能是脱去 PI3P的磷酸，在肌细胞分化方面起 必不可少的作用。 这里使用的癌症这个术语包括哺乳动物的固态肿瘤和血液恶性肿 瘤。 固态肿瘤包含有头颈癌、 肺癌、 胸膜间皮瘤、 食道癌、 胃癌、 胰 腺癌、 肝胆系统癌、 小肠癌、 结肠癌、 结直肠癌、 直肠癌、 肛门癌、 肾癌、 尿道癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 阴茎癌、 睾丸癌、 妇产科癌、 卵 巢癌、 乳腺癌、 内分泌系统癌、 皮肤癌、 中枢神经系统癌、 软组织肉 瘤、 骨肉瘤和黑色素瘤等。 血液恶性肿瘤包含有淋巴瘤、 何杰金氏病、 白血病、 浆细胞肿瘤和艾滋病相关的癌等。 另外， 所有期别的癌症包 括原发癌， 转移性癌和复发癌等都在范畴内。 本发明中优选的治疗或预防癌症等与 PI3K/AKT/mTOR信号通路 异常激活相关的疾病是癌症、 神经变性疾病、 新陈代谢性疾病、 错构 瘤综合征和遗传性肌病。 本发明中优选的治疗或预防癌症等与 PI3K/AKT/mTOR信号通路 异常激活相关的癌症是乳腺癌、 胰腺癌或肺癌。 本项发明提供治疗或预防 PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活相 关的疾病的药物组合物， 其中包括给予病人有效剂量的 ZPP及其衍生 物。使用有效剂量的 Y29794及其衍生物； 联合使用有效剂量的 ZPP及其 衍生物以及雷帕霉素及其衍生物； 联合使用有效剂量的 Y29794及其衍 生物以及雷帕霉素及其衍生物。 其中， 衍生物是指一种或多种化学反 应对母体有机化合物进行修饰所产生的化合物。 衍生物与母体有机化 合物具有相似的结构， 在功能上具有相似的效果。 本项发明还提供治疗或预防 PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活 相关的疾病的方法， 其中包括给予病人有效剂量的 PRCP的拮抗剂、 或 者有效剂量的 PREP的拮抗剂、 使用有效剂量的 PRCP和 PREP的双重拮 抗剂、 联合使用有效剂量的 PRCP的拮抗剂以及 mTOR的拮抗剂、 联合 使用有效剂量的 PREP的拮抗剂以及 mTOR的拮抗剂、 联合使用有效剂 量的 PRCP和 PREP的双重拮抗剂以及 mTOR的拮抗剂。 mTOR的拮抗剂 包括对 mTOR的直接拮抗剂以及对 mTOR的上游和下游信号转导的相 关分子的拮抗剂。
PRCP 以及 PREP的化学拮抗剂包括叔丁基 (2S)-2-{[(2S)-2-甲酰基 吡 咯 垸 -1- 基 〗 羰 基 } 吡 咯 烷 -1- 羧 酸 酯 (tert-butyl(2S)-2-{ [(2S)-2-formylpyrrolidin- 1 -yljcarbonyl }pyrrolidine- 1 -ca rboxylate)(Z-Pro-Prolinal或者 ZPP)以及衍生物。 在具体实施例中， ZPP 抑制癌细胞中的胰岛素受体底物磷酸化、 P13K激酶活性和 AKT磷酸化， ZPP还抑制雷帕霉素反馈性激活 IRS- 1、 PI3K和 AKT。 叔丁基 (2S)-2-{[(2S)-2-甲酰基吡咯烷 - 1 -基]羰基 }吡咯垸 -1 -羧酸酯 (tert-butyl(2S)-2-{ [(2S)-2-formylpyrrolidin-l -yl]carbonyl}pyrrolidine-
1 -carboxylate)(Z-Pro-Prolinal或者 ZPP)是一种以吡咯垸基羰基为基本结 构的小分子化合物。 目前 ZPP及其衍生物作为抑制剂的制备方法已经公 开， 例如可参考美国专利第 5,41 1 ,976号。 ZPP的衍生物包括但不限于苯 甲 基（2S)-2-[(2S)-2- 甲 酰吡 咯烷 -1 -羰基 ]吡 咯垸 -1 -羧酸酯 (benzyl(2S)-2-[(2S)-2-formylpyrrolidine- 1 -carbonyljpyrrolidine- 1 -carboxy late)(Z-Pro-Pro-二甲基乙缩醛 (Z-Pro-Pro-dimethyl acetal aldehyde)); 对 苯 二 甲 酸 双 （L-脯 氨 酰 - 吡 咯 烷 ） 酰 胺 （terephthalic acid bis(L-prolyl-pyrrolidine) amide);叔丁酯 (2S)-2- (吡咯烷 - 1 -基羰基)吡咯烷 -1 - 羧 酸 乙 酉旨 (tert-butyl(2S)-2-(pyrrolidin-l-ylcarbonyl)pyrrolidine- 1 -carboxy late); UAMC-00021 ; 4-苯基 -l-[(2S)-2- (吡咯垸 -1-羰基）吡咯垸
-1-基 ]丁 -1-酮 (4-phenyl- 1 -[(2S)-2-(pyrrolidine- 1 -carbonyl)pyrrolidin- l-yl]butan-l-one) (SUAM 1221); (S)-2- [[(S)- 2- (羟基乙酰基 )-1 -吡咯烷基] 羰基 ]-N- 苯基甲基） - 1-吡咯垸甲酰胺（(S)-2-[[(S)-2-(hydroxyacetyl)- 1 -pyrrolidinyl]carbonyl]-N-phenylmethyl)- 1 -pyrrolidinecarboxamid )(JTP- 4819)。
PRCP 以及 PREP的化学拮抗剂包括 [2-[8- (二甲基氨基)辛硫基 ]-6- 丙 -2-基吡啶 -3-基]-噻吩- 2-基甲酮 （[2-[8-(dimethylamino)octylsulfanyl]- 6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)(Y29794)以及其衍生 物。 在本发明一具体实施例中， Y29794抑制癌细胞中的胰岛素受体底 物磷酸化、 PI3K激酶活性和 AKT磷酸化， Y29794还抑制雷帕霉素反 馈性激活 IRS- 1、 PI3 和 AKT。
Y29794([2-[8- (二甲基氨基）辛硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2- 基 甲酮 ([2-[8-(dimethylamino)octylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]- thiophen-2-ylmethanone) )是一种以吡啶为基本结构的小分子化合物。 Y29794及其衍生物作为拮抗剂的制备方法已经公幵， 例如可参考美国 专利第 5，001，137号。 Y29794的衍生物包括 （但不限于） [2-[6- (二丙 基氨 基 ） 已硫基 ]-6-丙 -2-基 吡 啶 -3-基 ]-噻 吩 -2-基 甲 酮 ([2-[6-(dipropylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen -2-ylmethanone); [2-[6- (二丙基氨基）己硫基 ]-6-(2-甲基丙基)吡啶 -3-基] - 噻 吩 -2- 基 甲 酮 （[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-(2- methylpropyl)pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6- (二甲基氨基) 己 硫 基 ]-6-(3- 甲 基 丁 基 ） 吡 啶 -3- 基 ] - 噻 吩 -2- 基 甲 酮 ( [2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-(3-methylbutyl)pyridin-3-yl]-thi ophen-2-ylmethanone ) ； [2- [6- (二甲基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3- 基 ]-(5-甲基噻吩 -2-基）甲酮 （ [2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]- 6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-(5-methylthiophen-2-yl)methanone )； [2-[6- (二 乙基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基 噻吩 -2-基 甲 酮 ( [2-[6-(diethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen
-2-ylmethanone ) ； [2-[6- (二甲基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻 吩 -2- 基 甲 酮 （ [2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2- ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6- (二甲基氨基)己硫基 ]-6- 丙基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 （[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6- propylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) [2-[6-[2- (二甲基氨基)乙基
-甲基氨基 ]己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基 ]-噻吩 -2-基 甲酮 ([2-[6-[2-(dimethylamino)ethyl-methylamino]hexylsulfanyl]-6-propan-2-yl pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6-[苄基（甲基）氨基]己硫 基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 （ [2-[6- [benzyl(methyl)amino] hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone ) ； [6- 叔 -丁基 -2-[6-(二甲基氨基）己硫基]吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 ( [6-tert-butyl-2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen- 2-ylmethanone ) ； [2-[6- (二甲基氨基）己硫基 ]-6-甲基吡啶 -3-基] -噻吩 -2- 基 甲 酮 ([2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-methylpyridin-3- yl]-thiophen-2-ylmethanone ) ； [2-[6- (二甲基氨基）己硫基 ]-4,6-二甲基吡 啶 -3_基 ]_噻吩 -2-基 甲 酮（[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-4，6- dimethylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6-(丁基氨基)己硫 基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基 ]-噻吩 -2-基 甲 酮（[2-[6-(butylamino) hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) ； [2-[6-(4-苄基哌啶 -1-基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮
([2-[6-(4-benzylpiperidin-l-yl)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-t hiophen-2-ylmethanone)； [2-[8-(甲基氨基）辛基硫基]- 6-丙 -2-基吡啶 -3- 基 ]-噻 吩 -2-基 甲 酮 ([2-[8-(methylamino)octylsulfanyl]-6-propan-2- ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone); [2-[6- (甲基氨基）己石 基] -6-丙 -2-基吡啶 -3-基 ]-噻吩 -2-基甲酮（[2-[6-(methylamino)hexylsulfanyl]-6- propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6-(叔 -丁基氨基) 己硫基] -6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮（[2-[6-(tert-butylamino) hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [6- 丙 -2-基 -2-[6-(丙 -2-基氨基）己硫基]吡啶 -3-基 ]-噻吩 -2-基甲酮 ([6-propan-2-yl-2-[6-(propan-2-ylamino)hexylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiop hen-2-ylmethanone); [2-[6- (乙基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2- 基 甲 酮 ([2-[6-(ethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2- ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) ； (E)- 丁 -2- 稀 二 酸 ((E)-but-2-enedioic acid); [2-[6- (二甲基氨基）己硫基 ]-6-(3-甲基丁基)吡 啶 -3-基 ] -噻吩 -2-基甲酮（[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-(3- methylbutyl)pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6-(节基氨基)己 硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮（[2-[6-(benzylamino) hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) ； [2-[6-(2-苯基乙基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 ([2-[6-(2-phenylethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thio phen-2-ylmethanone)； [2-[8-(二甲基氨基）辛基硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3- 基 ] -噻吩 -2-基 甲酮乙二酸 ([2-[8-(dimethylamino)octylsulfanyl]-6- propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone; oxalic acid); [2-[6- (二 甲基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮乙二酸 ([2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen -2-ylmethanone; oxalic acid); [2-[6- (二乙基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮乙二酸（ [2-[6-(diethylamino)hexylsulfanyl]-6- propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone; oxalic acid); [2-[6- (二 甲基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基 ]-(5-甲基噻吩 -2-基）甲酮乙二酸 ([2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-(5-meth ylthiophen-2-yl)methanone; oxalic acid); [2-[6- (二甲基氨基)己硫基 ]-6- 丙 -2-基吡啶 -3-基〗 -苯基甲酮（[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6- propan-2-ylpyridin-3-yl]-phenylmethanone)； [2-[6-(二甲基氛基)己硫 基 ]-6-丙基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮乙二酸（[2-[6-(dimethylamino) hexylsulfanyl]-6-propylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone; oxalic acid)； Ν,Ν-二 乙基 -2- 甲 基 -6-噻吩 -3-基吡啶 e-3- 甲 酰胺 (N,N-diethyl-2-methyl-6-thiophen-3-ylpyridine-3-carboxamide) ; N- (环丙 基 甲 基 ）-N,2- 二 甲 基 -6- 噻 吩 -3- 基 吡 啶 -3- 甲 酰 胺 (N-(cyclopropylmethyl)-N,2-dimethyl-6-thiophen-3-ylpyridine-3-carboxa mide); [6-丙 -2-基 -2-[6-[4-[3- (三氟甲基)苯基]哌嗪 -1-基]己硫基]吡啶 -3- 基 ] - 噻 吩 -2- 基 甲 酮 ([6-propan-2-yl-2-[6-[4-[3-(trifluoromethyl) phenyl]piperazin-l -yl]hexylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone )； [2-[6- (二甲基氨基）己硫基]吡啶 -3-基] -(5-乙基噻吩 -2-基）甲酮 ([2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]pyridin-3-yl]-(5-ethylthiophen-2-yl) methanone); [2-[6-[4- [双 (4-氟苯基）甲基]哌啶 - 1 -基]己硫基 ]-6-丙 -2-基吡 啶 -3- 基 ] - 噻 吩 -2- 基 甲 酮 （[2-[6-[4-[bis(4-fluorophenyl) methyl]piperidin- l -yl]hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen- 2-ylmethanone); [2-[6- [苄基（甲基）氨基]己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] - 噻吩 -2-基甲酮乙二酸（[2-[6-[benzyl(methyl)amino]hexylsulfanyl]-6- propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone; oxalic acid); [6-叔-丁 基 -2-[6- (二甲基氨基）己硫基] P比啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮乙二酸 ([6-tert-butyl-2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2 -ylmethanone; oxalic acid); [2-[6- (二甲基氨基）己硫基 ]-6-甲基吡啶 -3- 基] -苯基甲酮 ([2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-6-methylpyridin-3- yl]-phenylmethanone) ; [2-[8- (二甲基氨基)辛基硫基] -6-丙 -2-基吡啶 -3- 基 噻吩 -2-基 甲酮（[2-[8-(dimethylamino)octylsulfanyl]-6-propan-2- ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) ； 4- 甲 基 苯 石黄 酸 (4-methylbenzenesulfonic acid); [4- [(二甲基氨基）甲基]哌啶 - 1 -基] -(2-甲 基 -6-噻吩 -3-基吡啶 -3-基）甲酮 ([4-[(dimethylamino)methyl]piperidin- 1 -yl]-(2-methyl-6-thiophen-3-ylpyridin-3-yl)methanone)； (2-甲基 -6-噻盼
-3-基吡啶 -3-基） -哌啶 -1 -基甲酮 ((2-methyl-6-thiophen-3-ylpyridin- 3 -yl)-piperidin- 1 -ylmethanone)； N-(2-氰丙基 )- N-乙基 -2-甲基 -6-噻吩 -3- 基吡啶 -3-甲酰胺 (N-(2-cyanopropyl)-N-ethyl-2-methyl-6-thiophen-3- ylpyridine-3-carboxamide)； N，N，2-三甲基 -6-噻吩 -3-基吡啶 -3-甲酰胺 (N,N,2-trimethyl-6-thiophen-3-ylpyridine-3-carboxamide); (2-甲基 -6-噻盼
-3-基吡啶 -3-基）-硫代吗啉 -4-基 甲 酮（(2-methyl-6-thiophen-3- ylpyridin-3-yl)-thiomorpholin-4-ylmethanone)； N,N，6-三甲基 -2-[ 1 - (噻盼 -3-基甲基）哌啶 -4-基] P比啶 -3-甲酰胺 (N,N,6-trimethyl-2-[l -(thiophen- 3-ylmethyl)piperidin-4-yl]pyridine-3-carboxamide); [2-[1 -[2- [双 (4-氟苯基) 甲基]哌啶 -1-基]己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮
([2-[ 1 -[2-[bis(4-fluorophenyl)methyl]piperidin- 1 -yl]hexylsulfanyl]-6-prop an-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone); [2-[5- (二甲基氨基)戊基硫 基]吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮（[2-[5-(dimethylamino)pentylsulfanyl] pyridin-3-yl]-thiophen-2 -ylmethanone); [2-[6- (丁基氨基)己硫基 ]-6-丙 -2- 基 卩比 啶 -3- 基 ] - 噻 吩 -2- 基 甲 酮 乙 二 酸
([2-[6-(butylamino)hexylsulfanyl]-6- propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone; oxalic acid); [2-[6- (乙 基氨基）己硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基卜噻吩 -2-基甲酮乙二酸 ([2-[6-(ethylamino)hexylsulfanyl]-6-propan-2-ylpyridin-3-yl]-thiophen-2-y Imethanone; oxalic acid); [2-[6- (二丙基氨基）己硫基]卩比啶 -3-基] -噻吩 -2- 基 甲 酮 ([2-[6-(dipropylamino)hexylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen- 2-ylmethanone); [2-[1 -[6- (二甲基氨基）己硫基 ]-2-甲基丙 - 2-基]硫基吡啶 -3-基 ] - 噻 吩 -2-基 甲 酮 ([2-[ 1 -[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]-2- methylpropan-2-yl]sulfanylpyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) ； [2-[8-(二甲基氨基）辛 -2-基硫基]吡啶 -3-基 ]-噻吩 -2-基甲酮 ([2-[8-(dimethylamino)octan-2-ylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmeth anone) ; [2-[7- (二甲基氨基）庚 -2-基硫基]吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 ([2-[7-(dimethylamino)heptan-2-ylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmet hanone)； [2-[6-(二甲基氨基）己 -2-基硫基] P比啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 ([2-[6-(dimethylamino)hexan-2-ylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmet hanone)； [2-[7-(二甲基氨基）庚基硫基]吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮 ([2-[7-(dimethylamino)heptylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethano ne); [2-[2-[3- (二甲基氨基)丙基硫基]乙基硫基]吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲 酮 ([2-[2-[3-(dimethylamino)propylsulfanyl]ethylsulfanyl]pyridin-3-yl]- thiophen-2-ylmethanone)； [2-[1-[3- (二甲基氨基）丙基硫基〗丙 -2-基硫基] 吡 啶 -3- 基 ]- 噻 吩 - 2- 基 甲 酮 （[2-[l-[3-(dimethylamino) propylsulfanyl]propan-2-ylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone) ； [2-[2-[6- (二甲基氨基）己硫基]乙基硫基] B比啶 -3-基] -噻吩 - 2-基甲酮 ([2-[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]ethylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thioph en-2-ylmethanone); [2-[1-[6- (二甲基氨基）己硫基]丙 -2-基硫基]吡啶 -3- 基 ] -噻吩 -2-基 甲 酮 ([2-[ 1 -[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl]propan- 2-ylsulfanyl]pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)； [2-[6- (二甲基氨基) 己硫基]吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮（[2-[6-(dimethylamino)hexylsulfanyl] pyridin-3-yl]-thiophen-2-ylmethanone)。 mTOR的化学拮抗剂包括雷帕霉素以及雷帕霉素衍生物。雷帕霉素 (又名西罗莫司（sirolimus))是已知的大环内脂， 其化学名是 (35,6R，7E,9R, 10R,12R,14S,15E,17E,19E,21 S,23S,26R,27R,34aS)-9, 10,12, 1 3, 14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a- 十 六 氢 -9,27- 二 羟 基 -3-[( lR)-2-[( l S,3R,4R)-4-羟基- 3-甲氧基环己基 ]- 1-甲基乙基] -10，21 -二 甲氧基 -6，8，12,14,20,26-六甲基 -23,27-环氧-吡啶并 [2, l-c][ l ,4]氧杂氮杂 三 ^— i^¾- l ,5,l l,28,29(4H,6H, 31 H)-戊酮。 mTOR拮抗剂也包括雷帕 霉素衍生物。 雷帕霉素及其衍生物作为 mTOR的化学拮抗剂已经公开， 例如可参考美国专利 3,993,749号、 美国专利 6,277,983号、 美国专利 7,384,953号、 中国专利第 200980154352.X号。 许多雷帕霉素衍生物在 所属领域中是已知的。 雷帕霉素衍生物的非限制性实例包括但不限于 依维莫司、 他克莫司、 CCI-779 , ABT-578、 AP-23675 , AP-23573 AP-2384 7-表 -雷帕霉素、 7-硫甲基 -雷帕霉素、 7-表 -三甲氧基苯基- 雷帕霉素、 7-表-硫甲基 -雷帕霉素、 7-去甲氧基 -雷帕霉素、 32-去甲氧 基 -雷帕霉素、 2-去甲基 -雷帕霉素、 前雷帕霉素 (prerapamycin)、 西罗莫 司脂化物 (temsirolimus)和 42-0-(2-羟基）乙基 -雷帕霉素。 雷帕霉素的其 它衍生物包括： 雷帕霉素肟 (美国专利笫 5， 446, 048号)、 雷帕霉素氨基 酯 (美国专利第 5, 130, 307号)、雷帕霉素二醛 (美国专利第 6,680, 330号)、 雷帕霉素 29-烯醇 (美国专利第 6, 677, 357号)、 0-垸基化雷帕霉素衍生物 (美国专利第 6， 440,990号）、 水溶性雷帕霉素酯 (美国专利第 5,955,457 号)、 垸基化雷帕霉素衍生物 (美国专利第 5,922,730号)、 雷帕霉素脒基 氨基甲酸酯 (美国专利第 5,637,590号)、 雷帕霉素生物素酯 (美国专利第 5,504, 091号)、 雷帕霉素氨基甲酸酯 (美国专利第 5，567，709号)、 雷帕霉 素羟基酯 (美国专利第 5, 362, 718号)、 雷帕霉素 42-磺酸酯和 42- (N-垸氧 璣基)氨基磺酸酯 (美国专利笫 5， 346， 893号)、 雷帕霉素环氧己烷异构体
(美国专利第 5， 344,833号)、咪唑烷基雷帕霉素衍生物 (美国专利第 5, 310, 903号)、 雷帕霉素烷氧酯 (美国专利第 5, 233， 036号)、 雷帕霉素吡唑 (美 国专利第 5, 164, 399号）、 雷帕霉素酰基衍生物 (美国专利第 4,316,885 号)、 雷帕霉素的还原产物 (美国专利第 5， 102,876号和第 5， 138, 051号）、 雷帕霉素酰胺酯 (美国专利第 5，1 18，667号)、 雷帕霉素氟化酯 (美国专利 第 5,100,883号)、 雷帕霉素縮醛 (美国专利第 5， 151,413号)、 氧杂雷帕霉 素 (美国专利第 6,399,625号)和雷帕霉素硅醚 (美国专利第 5, 120,842号）。 本发明中的一种药物组合物包含雷帕霉素及其衍生物和 ZPP及其 衍生物。 本发明中的另一种药物组合物包含雷帕霉素及其衍生物和 Y29794及其衍生物。 实施例
下面结合具体实施例， 对本发明作进一步的阐述。 以下实施例用 于说明本发明的优选实施方案。 所述领域技术人员应了解， 以下实施 例中所公开的技术代表发明人所发现的在本发明实施中表现良好的技 术， 且因此可被视为构成其优选实施模式。 但是， 应理解， 这些实施 例仅用于说明本发明， 而不在于限制本发明的范围。 根据本说明书， 所属领域技术人员应了解， 在不超出本发明精神的范围内， 对公开的 具体实施方案中可以做许多修改和变化， 并且仍可获得相同或类似的 结果。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为本领域技术人员 了解的常规方法； 所用的材料， 如无特殊说明， 均为常规生化试剂公 司购买得到的。 在一具体实施例中， PRCP和 PREP对激活 PI3K/AKT/mTOR信号 通路和癌细胞的增殖和生存起着必要的作用。 通过对癌细胞包括乳腺 癌细胞系 MCF7 和 TD47， 胰腺癌细胞系 Panc-1、 PK-9、 Capan-1 和 AsPC-1 , 以及肺癌细胞系 H1703和 A549进行测试， 抑制 PRCP基因 沉默 或者 PREP基因表达减少癌细胞的增殖，双重抑制 PRCP 和 PREP 基因表达使癌细胞的增殖停滞。 本发明明确了抑制 PRCP 基因表达、 抑制 PREP基因表达和双重抑制 PRCP和 PREP基因表达降低 IRS-1、 PI3K和 AKT的活性， 双重抑制 PRCP 和 PREP基因表达更进一步阻 止了使用雷帕霉素所诱导的反馈性地激活 IRS-1、 PI3K和 AKT。 并且， 双重抑制 PRCP 和 PREP基因表达与雷帕霉素一起联合使用起到了协 同抑制癌细胞增殖和生存的作用。 在另一个具体实施例中，对 ZPP和 Y29794抑制 PI3K/AKT/mTOR 信号通路和癌细胞的增殖和生存的作用进行试验， 结果显示 ZPP或者 Y29794使癌细胞的增殖停滞。 ZPP或者 Y29794降低胰岛素受体底物 ( IRS-1 )磷酸化， 因而抑制 PI3K和 AKT的活性。 ZPP 或者 Y29794 阻止了使用雷帕霉素所诱导的反馈性胰岛素受体底物（IRS-1 )磷酸化， 因而抑制 PI3K和 AKT的活性。 并且， ZPP或者 Y29794与雷帕霉素一 起联合使用起到了协同抑制癌细胞增殖和生存的作用。 通过裸鼠异体 移植实验， Y29794与雷帕霉素一起联合使用起到了协同抑制裸鼠异体 移植胰腺癌增殖的作用。 实施例 1 : ZPP或 Y29794对癌细胞引起毒性
1.1 用 MTT细胞活性分析实验检测 ZPP或 Y29794对癌细胞引起毒 性 第一天， 一式八份的实验所用细胞被置入 96孔板中 （3X103细胞 / 孔） 毫米培养皿中。 第二天开始使用不同剂量的化学拮抗剂 ZPP持续 处 理 4 天 。 细 胞 随 后 被 培 养 在 包 含 1.2 mM MTT ( 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-vn-2,5-diphenvltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) 的无酚红 （phenol red ) 的培养基中 4小时。 随后用 10% SDS/0.01M HC1溶解细胞。 MTT透射率 （ 570nm 光谱） 由酶标仪 测量， 相对的 MTT透射率用来表示细胞活性。 ZPP购于 Biomol有限 责任公司 ( Plymouth Meeting, PA, USA ) 。 MTT购于 Sigma-Aldrich有 限责任公司（81丄01^，1^0，118八）。 Panc-1 与 Capan-1 胰脏癌细胞系、 MCF7与 T47D乳腺癌细胞系、 A549与 H I 703肺癌细胞系购于 American Type Culture Collection ( ATCC, USA ) 。 PK-9胰脏癌细胞系的制备方 法已公开， 例如 Tohoku J. et al, (1986) exp. Med.150:231-248; Etoh T. et al, (2003) Clin Cancer Res 9;1218； Arafat H. et al, ( 201 1 ) Surgery. 150(2): 306-315。 所有的细胞都供养于包含 10% 胎牛血清的 Dulbecco's Modified Eagle's ( DMEM ) 培养基 ( Invitrogen, Carlsbad, CA) 中。 Hyclone胎牛血清（FBS )购于 Thermoscientific有限责任公司（USA)。 结果表明在胰腺癌细胞系 Panc-1、 PK-9, Capan-1和 AsPC-1 (图 1A) ， 肺癌细胞系 H1703和 A549 (图 1B ) 以及乳腺癌细胞系 MCF7 和 TD47 (图 1 C ) 中， MTT 比色法显示细胞的活性随 ZPP浓度上升而 降低， 表明 ZPP对细胞呈现剂量毒性效应。 第一天， 一式八份的细胞被置入 96孔板中 （3X103细胞 /?L ) 毫米 培养皿中。 第二天开始使用不同剂量的化学拈抗剂 Y29794持续治疗 4 天。细胞随后被培养在包含 1.2 mM MTT的无酚红的培养基中 4小时。 随后用 10% SDS/0.01M HC1溶解细胞。 MTT透射率（ 570nm 光谱） 由 酶标仪测量，相对的 MTT透射率被用来表示细胞活性。 Y29794 oxalate 贝勾于 Tocris Biosciences公司 （Bristol, UK ) 。 结果表明在胰腺癌细胞系 Panc-1、 PK-9、 Capan-1和 AsPC-1 (图
2A ) ， 肺癌细胞系 H1703和 A549 (图 2B ) 以及乳腺癌细胞系 MCF7、 TD47 和 MDAMB231 (图 2C ) 中， MTT 比色法显示细胞的活性随 Y29794浓度上升而降低， 表明 Y29794对细胞呈现剂量毒性效应。 1.2 用菌落形成试验 （clonogenesis assay ) 检测 ZPP对癌细胞引起 毒性 第一天一式三份的 103 实验细胞 Panc-1被置入 100毫米培养皿中 用 10毫升含 10% 胎牛血清的 DMEM来培养。第二天开始用 ZPP持续 治疗 7天。停药以后继续培养细胞 3周。细胞经 PBS漂洗 3次，用 100% 乙醇固定 15min， PBS漂洗 3次， 用 2%晶紫乙醇溶液着色后对菌落计 数。 所有的试验数据都用单因子变量 （自变量） 生成对定量因变量的 单因素方差分析 （one way ANOVA) 和两个尾学 T-测试 （two tailed t-test ) 来进行统计学分析。 如无特别说明， 之后的统计数据均采用此 种统计学分析方法。 结果显示在胰腺癌细胞系 Panc-1 (图 ID) 中， ZPP对细胞呈现剂 量毒性效应 （菌落数量 ZPP浓度上升而降低） （P<0.01 ) ， 表明 ZPP 抑制上述实验中的细胞生存。 实施例 2: PRCP或者 PREP在癌细胞中的基因沉默 (gene silencing) 2.1 Lenti 病毒介导的 shRNA沉默癌细胞的 PRCP与 PREP基因
Lenti病毒载体 ( pLKO. l ) 携带的 PREP shRNA ( PREP shRNA# l 的克隆识别号码为 TRCN0000050198； PREP shRNA#2的克隆识别号码 为 TRC0000050199 ) 和 PRCP shRNA ( PRCP shRNA#l的克隆识别号 码为 TRCN0000050808； PRCP shRNA#2 的克隆识别号码为 TRC0000050809)购于 OpenBiosystems(USA)。 pLKO. l携带和 shRNA 质粒以及 Lenti 病毒包装载体 psPAX2和 pMD2G (购于 Addgene) 质 粒被用于沉默癌细胞的 PRCP与 PREP基因。 293T病毒包装细胞购于
Invitrogen公司 ( Carlsbad, CA, USA) 。 具体方法： （ 1 ) 产生 PRCP shRNA和 PREP shRNA的病毒上清 液： 第一天， 5X105的 293T病毒包装细胞被置于 100毫米培养皿中用 10 毫升含 10% 胎牛血清的 DMEM 来培养。 第二天， 6 微克的杂乱 shRNA质粒或者是 PRCP shRNA (或者 PREP shRNA ) 质粒以及 3微 克的 psPAX2质粒和 6微克的 pMD2.G质粒被并入 55微升培养液中， 并与 45微升 Fugene转染试剂 （购于 Promega公司， USA ) 混合 15分 钟。 此混合液然后被加入到 293T病毒包装细胞培养液中去转染细胞。 第三天， 收集包含病毒的细胞上清液并用 0.45微米的针筒滤器过滤；
( 2 )病毒感染实验细胞： 5X105的实验细胞（如胰腺癌细胞系 Panc-1、 PK-9、Capan-l 以及乳腺癌细胞系 MCF7等）被置于 100毫米培养皿中。 5毫升病毒上清液与 5毫升含 10% 胎牛血清的培养液混合后， 加入到 培养皿中去感染实验细胞。 24小时后， 置换培养液并加入嘌呤霉素 （1 微克 /毫升）对细胞进行筛选。一星期后产生的 PRCP (或者 PREP)shRNA 稳定表达的细胞系以及杂乱 shRNA (对照 shRNA) 稳定表达的细胞 系被进一歩用于实验分析。
2.2 用蛋白质免疫印迹法检测 PRCP 或者 PREP 在癌细胞中的 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默 鼠抗 PRCP抗体购于 Abeam公司 （Cambridge, MA， USA) 。 山羊 抗 PREP抗体购于 R&D Systems公司 （Minneapolis, MN， USA) 。 鼠 抗 β-actin antibody抗体 !fl勾 3 Santa Cruz Biotechnology公司 ( Santa Cruz, CA, USA) 。 胰腺癌细胞 Panc-1和乳腺癌癌细胞 MCF7细胞培养至 80%左右密 度时，细胞经预冷的 PBS漂洗 3次，加入 500μ1裂解液（ 150 mmol/L Nacl, 1% Triton-x-100, 50mmol/lTrispH8.0,l mmol/L PMSF, lug/L aprotinin, lug/L leupeptin, lug/L peptain) 。 细胞刮刀收集， 用移液器转移至离心 管中， 反复吹打。 以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理， 超声时为 5秒， 间歇时间为 10秒， 功率为 100-120W, 超声至溶液清 澈无粘稠为止， 处理过程在水浴中进行， 之后 4°C25000g离心 1 小时 取上清。 蛋白质用 Bradford定量。 免疫沉淀反应： 取 250-500ug蛋白质加入加入 2-5 ug特异性抗体， 4 °C摇晃 2-4小时后加入 20ul Protein G珠 （Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) ， 4 °C摇晃 1小时。 在含有 0.5 % Triton-x-100的 20vol裂 解溶液中洗珠子 5次后得到免疫沉淀物。 取 25-50ug裂解蛋白质或者免疫沉淀物加入 2XLaemmli 样品缓冲 液（50 mmoL/L Tris-HCL(pH8.0),100 mmoL/L DTT, 2% SDS, 0.1% 溴酚 蓝， 10% 甘油）， 强力混匀。样品置 100°C水浴箱里水浴加热 3-5分钟。 蛋白质样品经常规的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE) 电泳分 离后转移到 Amersham Hybond-P PVDF膜 （GE 公司， USA) 上。 膜用
2%的 BSA封闭 1小时后先加入未标记特异性抗体（Abl)室温（22-25 )摇动孵育 2小时后再加入酶结合物标记的（HRP-conjugated)抗抗 体 （Ab2) 进行 0.5 小时杂交。 印迹膜经 TBS-T 液 （Tris 1.21g+ NaC15.84g+800ml H2O用 HC1调节 pH到 8.0)洗膜 3次每次 lOmin后， 加上混合好的 ECM显色剂 （GE 公司， USA) 1-5分钟。 将印迹膜在暗 室中使胶片暴光 1-5分钟， 用 X-OMAT Developer ( KODAK, USA ) 自 动冲洗胶片显示印迹。 结果显示， 在 PREP基因沉默 （PREP KD ) 的 Panc-1细胞中， 蛋 白质免疫印迹显示与对照细胞（control )相比 PREP表达降低（图 3B )。 在 PRCP基因沉默（PRCP KD)的 Panc-1细胞中，与对照细胞（control ) 相比， PRCP表达降低 （图 3C ) 。 在 PREP基因沉默的 MCF7细胞中， 与对照细胞 （control ) 相比， PREP 表达降低； 在 PRCP 基因沉默的 MCF7细胞中 PRCP表达降低；在 PRCP和 PREP基因双重沉默（DKD ) 的 MCF7细胞中， PRCP和 PREP表达均降低 （图 6B&C ) 。 因此， 在 Panc-1 和 MCF7细胞中， PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者在 PRCP和 PREP基因双重沉默都有很好的效果。
2.3 用实时定量 PCR分析检测 PRCP 或者 PREP 在癌细胞中的 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默
Trizol, Superscript III first-strand synthesis supermix, Turbo DN A- free ( Ambion ) 禾口 sybrgreen qPCR supermix购于 Invitrogen 公 司 （ Carlsbad, CA, USA ) 。 PRCP 弓 | 物 （ 正 向 ： TCTACACTGGTAATGAAGGGGAC (如 SEQ ID No.3所示） ， 反向：
TCCTTGAATGAGTTGTCACCAAA (如 SEQ ID No.4所示 ） ） 禾口 PREP 引物（正向： GAGACCGCCGTACAGGATTAT (如 SEQ ID No.5所示）， 反向： TGAAGTGGCAACTATACTTGGGA (如 SEQ ID No.6所示） 合 成于 Integrated DN A Technologies公司 （ Coralville, USA) 。 具体方法： （1 )总 RNA提取： 胰腺癌细胞 PK-9和 Capan-1培养至 80%左右密度时，细胞经预冷的 PBS漂洗 3次，加入 1 ml Trizol裂解细胞， 在 RT上孵育 5 min。 加入 0.2 ml氯仿， 混匀 15 s后在 RT上孵育 2到 3 min。 4°C， 12000g离心 15 min。 取上清（约 0.6ml )到一新管中。加入 0.6 ml氯 仿于上清中。用力混匀， RT上孵育 2 min,然后 4。C， 12000g离心 15 min。 取上清 （二次氯仿提取） 。 加入异丙醇到上清液中用于沉淀 RNA， 并 混匀。 RT上孵育 10min， 4°C下 12000g离心 15 min。 去上清， 加入 1 ml 75%的 DEPC-ETOH洗 RNA。 混匀， 4。C下 7500g离心 5 min。 去上清， 干燥 RNA沉淀 （不超过 lOmin) 。 加入无 RNA酶的水溶解 RNA。 RT上 孵 育 5-10 min 。 使 用 Nanodrop 测 定 RNA 的 含 量 。 通 过
A26o/A28Q和 A26Q/A23() (高纯度的 RNA两个值都接近 2 ) 来检测 RNA的纯 度。 （2) 除去基因组 DNA (TURBO除 DNA试剂盒） ： 建立反应体系 (50ul) 。 准备 RNA (lOug) ， 5ul 10X buffer, lul Turbo DNA酶， 无 RNase水补齐到 50ul， 轻轻混匀， 37。C孵育 20-30 min。 力口 5ul DNA酶 灭活剂并混匀。 RT (>22°C) 孵育 5 minutes, 立即混匀。 10000g离心
1.5 min , 取上清到 新 的 管子 中 。 （ 3 ) 第 一条链合成 ( superscript III supermix)： 2XRT反应 mix 10 ul, RT酶 mix 2 ul, RNA (lug)， 无核酸水， 补齐到 20ul。轻轻的混匀， 25°C孵育 10min， 50°C 孵育 30min， 85° 孵育 51^11终止反应， 然后放置冰上。 加入 lul (2U) 的 E.coliRNaseH, 37。C孵育 20min。 （4) qPCR反应（ sybrgreen qPCR supermix universal )：在 PCR管中混合 Sybrgreen supermix universal 2X10 ul, 正向引物 （4 uM) 1 ul, 反向引物 （4 uM) 1 ul， cDNA (来自 lug 总 RNA) 1 ul, 无核酸水补齐到 20 ulo 在预热的实时 PCR仪上反应， 50°C 2 min, 95°C lOmin, 40循环: 95°C 15 s, 60°C 60 s。 参考仪器说 明分析溶解曲线结果。 实时定量 PCR分析显示与对照细胞 （control) 相比， 在 PRCP基因 沉默、 PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默的 PK-9细胞 （图 4B)中， PREP或者 /和 PRCP基因在对应的基因沉默中表达降低（图 4B)。 在 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默的
Capan-1细胞 （图 5B) 中， 实时定量 PCR分析显示与对照细胞 （control) 相比， 在对应的基因沉默中， PRCP或者 /和 PREP基因的表达降低.
2.4 细胞 DNA染色细胞增殖实验检测 PRCP基因沉默、 PREP基因沉 默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默对癌细胞增殖的影响. 一式八份的细胞被置入 96孔板中 （3X103细胞 /?L ) 毫米培养皿中。 所有的细胞都供养于包含 10% 胎牛血清的 DMEM培养基中。 每二天更 新培养基一次。 细胞在生长一天， 四天以及七天后被去除培养基， 经 PBS漂洗 3次后置入 100 ul的 TE(pH8) 缓冲液， 反复在干冰上冷冻随着 在 37GC水浴箱里解冻三次使细胞溶解。 随后用 Picogreen (Invitrogen, USA) 于 1 :200稀释于 TE缓冲液中对细胞的 DNA进行染色 30min， 随后 用微孔板检测仪 (荧光激发-发射矩阵光谱分别为 480 nm-520 nm) 对 Picogreen的荧光强度进行检测。 相对的 Picogreen的荧光强度平均值 (一 式八份） 的增加被用来表示细胞的增殖。 与对照细胞（control )相比， 胰腺癌细胞系 Panc-1 (图 3A ) 、 PK-9 (图 4A) 、 Capan-1 (图 5A) 以及乳腺癌细胞系 MCF7 (图 6A)在 PRCP 基因沉默 （PRCP KD1和 PRCP KD2 ) 、 PREP基因沉默 （PREP KD1和 PREP KD2 ) 以后降低增殖 （图 3A) 。 实施例 3: PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP 基因双重沉默细胞中或者经过加入 ZPP或者 Y29794处理后降低 IRS-1、 PI3K和 AKT的活性并阻止了使用雷帕霉素所诱导的反馈性的 IRS-1、 PI3K和 AKT的激活
3.1 用蛋白质免疫印迹检测 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默细胞中或者加入 ZPP 或者 Y29794处理后 的癌细胞中， AKT磷酸化的降低 采用实施例 2.2所述的蛋白免疫印迹法，检测在 PRCP和 PREP基 因沉默抑制癌细胞中或者 ZPP 和 Y29794降低癌细胞中 AKT磷酸化。 兔抗 phospho-AKT ( S437 ) 、 兔抗 AKT 抗体购于 Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology公司 ( Danvers, MA, USA) 。
PK-9 (图 7A) 、 Capan-1 (图 7B ) 和 Panc-1 (图 7C ) 细胞裂解 物蛋白质免疫印迹显示与对照细胞（control)相比， 在 PRCP基因沉默 (PRCPKD1) 或者 PREP基因沉默 （PREPKD1) 的细胞中 AKT磷酸 化 （p-AKT) 明显降低， 在 PRCP和 PREP基因双重沉默 （DKD) 的细 胞中 AKT磷酸化更显著降低。 MCF7细胞裂解物蛋白质免疫印迹 （图 7D)显示与对照细胞 （control)相比， 在 PRCP和 PREP基因双重沉默
(DKD) 的细胞中 AKT磷酸化显著降低。
PK-9 (图 8A) 、 Capan-1 (图 8B)和 Panc-1 (图 8C)被 ZPP (200 μΜ) 治疗四天后， 细胞裂解物蛋白质免疫印迹显示细胞裂解物免疫印 迹显示与对照（DMSO)治疗相比， 在 ΖΡΡ 治疗过的细胞中 ΑΚΤ磷酸 化显著降低。 Panc-1 (图 8D)、 MCF7 (图 8E)和 P 9 (图 F)被 Y29794 (0.5 μΜ) 治疗四天后， 细胞裂解物蛋白质免疫印迹显示与对照 (ethanol)治疗相比， Y29794 治疗过的细胞中 AKT磷酸化显著降低。 3.2用蛋白质免疫印迹检测 PRCP基因沉默、 PREP基因沉默或者
PRCP和 PREP基因双重沉默细胞中以及加入 ZPP或者 Y29794处理后 的癌细胞中雷帕霉素所诱导的反馈性升高 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化 被抑制 采用实施例 2.2所述的蛋白免疫印迹法， 检测 PRCP基因沉默、
PREP基因沉默或者 PRCP和 PREP基因双重沉默细胞中或者加入 ZPP 或者 Y29794处理后雷帕霉素所诱导的反馈性的 IRS-1 蛋白质和 AKT 磷酸化的升高被抑制。 兔抗 IRS-1抗体购于 Santa Cruz Biotechnology 公司 （Santa Cruz， CA， USA) 。
Panc-1 细胞裂解物蛋白质免疫印迹显示雷帕霉素治疗过的对照细 胞 （control) 中 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化显著升高。 在 PRCP基因 沉默 （PRCPKD1 (图 9A) 或者 PRCPKD2 (图 9B) ) 的细胞中、 或 者 PREP基因沉默 （PREP KD1 (图 9A) 或者 PREP KD2 (图 9B) 的 细胞中， 雷帕霉素治疗诱导的 IRS-1蛋白质升高和 AKT磷酸化比对照 细胞明显降低。 在 PRCP和 PREP基因双重沉默 （DKD1 (图 9A ) 和 DKD2 (图 9B ) )的细胞中雷帕霉素未能显著升高 IRS-1蛋白质和 AKT 磷酸化。 细胞裂解物蛋白质免疫印迹显示 Panc-1 (图 10A) 和 MCF7 (图
10B )细胞中的 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化被雷帕霉素升高。但在 ZPP ( 200 μΜ ) 治疗过的细胞中雷帕霉素未能显著升高 IRS-1 蛋白质和 ΑΚΤ磷酸化。 细胞裂解物蛋白质免疫印迹显示 Panc-1 (图 11A) 和 MCF7 (图
1 1B )细胞中的 IRS-1蛋白质和 AKT磷酸化被雷帕霉素升高。在 Y29794 ( 0.5 μΜ)治疗过的细胞中雷帕霉素未能显著升高 IRS-1蛋白质和 AKT 磷酸化。 3.3 用 ΡΙ3Κ激酶活性分析试验检测 ΖΡΡ和 Υ29794抑制细胞中和
PRCP和 PREP基因沉默细胞中的 PI3K激酶活性以及雷帕霉素所诱导 的反馈性激活 PI3K
PI3K激酶活性分析试剂盒（Calbiochem, USA)被用于测量细胞中 IRS-1和 p85关联的 PI3K激酶活性。 细胞培养至 80%左右密度时， 细 胞经预冷的 PBS漂洗 3次， 加入 500μ1裂解液 （ 150 mmol/L Nacl, 1% Triton-x-100, 50mmol/lTris ( pH8.0, 1 mmol/L PMSF, lug/L aprotinin, lug/Lleupeptin, lug/L peptain)。一式三份的 500 μg 细胞裂解物被用于 抗 IRS-1抗体和抗 p85 PI3K抗体蛋白质免疫沉淀。 免疫沉淀物悬浮于 200 ul 缓 冲 液 中 ， 与 荧 光 标 记 的 PI3K 底 物
BODIPY-TMR-phosphatidylinositoK 100 uM )和 ATP反应 1小时（370C )。 反应物用荧光光度计进行荧光强度测量 （激发波长 540nM， 散发波长 570nM) 。 对照（裂解液）免疫沉淀物的反应物和细胞裂解物免疫沉淀 物的反应物之间的荧光强度差值用来表示 PI3K 激酶活性。 兔抗 IR-1 抗体与兔抗 PI3K p85抗体购于 Millipore公司 （Billerica, MA， USA) 。 Panc-1 细胞裂解物蛋白质经抗 p85 PI3K 抗体免疫沉淀后进行 PI3K激酶活性 （图 12上） 及蛋白质免疫印迹 （图 12下） 分析。 雷帕 霉素升高对照细胞中的 PI3K激酶活性 （PO.01) 。 ZPP (200 μΜ) 治 疗过的细胞中 ΡΙ3Κ激酶活性显著降低 （Ρ<0.01) ， 而且抑制雷帕霉素 诱导的 ΡΙ3Κ激酶活性升高 (Ρ<0.01 ) ； 在 PREP的化学拮抗剂 Y29794 (200 nM) 治疗过的细胞中 PI3K激酶活性显著降低 （P<0.01) ， 而且 抑制雷帕霉素诱导的 PI3K激酶活性升高 （P<0.01) 。 Panc-1细胞裂解物经抗 IRS-1抗体 （图 14A) 和抗 p85 PI3K抗 体 （图 14B) 免疫沉淀后进行 PI3K激酶活性 （图 14上） 及蛋白质免 疫印迹 （图 14 下） 分析。 雷帕霉素治疗过的对照细胞 （control) 的 IRS-1抗体（图 14A)和抗 p85 PI3K抗体（图 14B)免疫沉淀物中 PI3K 激酶活性显著升高 （P<0.01) 。 PRCP和 PREP基因双重沉默 （DKD1) 的细胞的 IRS-1抗体 （图 14A) 和抗 p85 PI3K抗体 （图 14B) 免疫沉 淀物中的 PI3K激酶活性显著降低 （P<0.01) 。 雷帕霉素未能显著升高 PRCP 和 PREP 基因双重沉默细胞中的 PI3K 激酶活性 （图 14B) (P>0.5) 。 3.4 ZPP或者 Y29794抑制细胞中的 IRS-1磷酸化及其与 PI3K激酶的 p85亚基的相互作用并且抑制 IRS-1关联的 PI3K激酶活性 采用 2.2中所述蛋白质免疫印迹以及免疫共沉淀法检测 Panc-1细胞 裂解物经抗 IRS-1抗体免疫沉淀后， 进行 PI3K激酶活性 （图 13上） 及蛋 白质免疫印迹 （图 13下） 分析。 ZPP或者 Y29794降低 IRS-1磷酸化及与 其相互作用的 p85亚基。 ZPP或者 Y29794显著降低 IRS-1关联的 PI3K激酶 活性 （P<0.01) 。 实例 4: ZPP或者 Y29794和雷帕霉素联合使用协同增加药物的 细胞毒作用 4.1 用 MTT细胞活性分析实验和菌落形成实验检测 ZPP和雷帕霉 素联合使用协同增加药物的细胞毒作用 用实例 1.1 中的 MTT细胞活性分析实验和实例 1.2中菌落形成实 验所述方法检测 ZPP 和雷帕霉素联合使用协同增加药物的细胞毒作 用。 Panc-1细胞用不同剂量的 ZPP及不同剂量的 ZPP加上雷帕霉素（0.5 ng/ml ) 治疗 （图 15A) ， 或者不同剂量的雷帕霉素及不同剂量的雷帕 霉素加上 ZPP ( 25 μΜ/ml ) 治疗 （图 15B ) 四天后进行细胞活性分析。 MTT 比色法显示雷帕霉素显著增加 （P<0.01 ) ZPP对细胞的毒性 （图 15A) ， ZPP反过来亦显著增加 （PO.01 ) 雷帕霉素对细胞的毒性 （图
15B ) 。 菌落形成试验 （图 15C ) 显示雷帕霉素 （1 ng/ml 和 10 ng/ml ) 单独使用不影响细胞生存。雷帕霉素和 ZPP联合使用显著抑制（P<0.01 ) 细胞生存。 4.2 用 MTT细胞活性分析实验和菌落形成实验检测 Y29794和雷 帕霉素联合使用协同增加药物的细胞毒作用 用实例 1.1 中的 MTT细胞活性分析实验和实例 1.2中的菌落形成 实验所述方法检测 Y29794 和雷帕霉素联合使用协同增加药物的细胞 毒作用。 Panc-1细胞用不同剂量的 Y29794及不同剂量的 Y29794加上 雷帕霉素 （0.5 ng/ml ) 治疗 （图 16A) ， 或者不同剂量的雷帕霉素及不 同剂量的雷帕霉素加上 Y29794 ( 25 nM/ml ) 治疗 （图 16B ) 四天后， 进行细胞活性分析。 MTT 比色法显示雷帕霉素显著增加 （P<0.01 ) Y29794对细胞的毒性（图 16A)， Y29794反过来亦显著增加（P<0.01 ) 雷帕霉素对细胞的毒性 （图 16B) 。 菌落形成试验 （图 16C ) 显示雷帕 霉素 （1 ng/ml 和 10 ng/ml ) 单独使用不影响细胞生存。 雷帕霉素和 Y29794联合使用显著抑制 （P<0.01 ) 细胞生存。 实例 5: Y29794和雷帕霉素联合使用协同抑制肿瘤生长
5.1采用裸鼠移植肿瘤治疗试验检测 Y29794和雷帕霉素联合使用 协同抑制肿瘤生长
4-6周雄性裸鼠（BALB/C )购于 Charles River laboratories ( USA ) 。 Pane- 1细胞培养至 80%左右密度时， 用含 0.25%胰酶和 0.02%EDTA的细 胞消化液消化 5min。悬浮后的细胞用 10%FBS中和胰酶后离心沉淀。 106 细胞密度的 Panc-1癌细胞被再悬浮于 100 ul 含 10% Matrigel的 PBS缓冲 液中， 用 1-cc注射器与 27-30标准尺寸的针头注射于消毒裸鼠胁腹皮下。 4周后明显形成肿瘤 （平均体积 50-60 mm3 ) 的裸鼠被随机分为 4组 （每 个组 6只裸鼠） ： 对照组、 雷帕霉素治疗组、 Y29794治疗组或者雷帕霉 素和 Y29794联合治疗组。 每组裸鼠给予相应的药物治疗。 雷帕霉素和
Y29794均溶于 Cremophor配方 （20% Cremophor EL, 30% propylene glycol, 50% ethanol ) 中。 雷帕霉素 （2mg/公斤体重） 经腹膜腔注射每 周 1次。 Y29794 ( 20mg/公斤体重）经灌胃强饲每周 5次。 每周测量肿瘤 尺寸 （长度、 宽度和深度） 3次并计算肿瘤体积 （1/2最大直径 X最小直 径） ， 直到对照组肿瘤达到 1000立方毫米后结束试验。 结果显示， 移植 Panc-1肿瘤的裸鼠用雷帕霉素、 Y29794或者联合 使用雷帕霉素和 Y29794治疗 25天。 肿瘤生长曲线分析 （图 17 ) 显示 Y29794单独使用显著抑制肿瘤生长 （P<0.01 ) 。 联合使用雷帕霉素和 Y29794比单独使用雷帕霉素或者 Y29794显著抑制肿瘤生长（P<0.01 ) 。 数据表明 Y29794和雷帕霉素联合使用协同抑制肿瘤生长。 实例 6: PRCP和 PREP基因沉默或者利用 Y29794抑制 PECP和 PREP酶功能导致胰岛素受体底物 IRS-1的苏氨酸磷酸化和蛋白降解 采用实施例 2.2所述的蛋白免疫印迹法，检测 PRCP和 PREP基因 双重沉默细胞中或者加入 Y29794处理后 IRS-1的苏氨酸磷酸化和蛋白 降解，以及是否这种变化可以被雷帕霉素所阻断。所用的抗体（抗 IRS-1, 抗 p-IRS (S307), 抗 p-IRS-l(S636/639)， 抗 p-S6K (T389), 抗 S6K, 抗胰 岛素受体 （IR), 抗胰岛素样生长因子 -1 受体， 抗 p-mTOR (S2448), 抗 mTOR抗体购自 Cell Signaling公司 （Denver, MA, USA) 。 所用的 蛋白合成抑制剂 Cycloheximide购自 Sigma Aldrich。 如图 18所示，细胞裂解物免疫印迹显示，与对照细胞 (control)相比， PRCP和 PREP基因双重沉默（DKD )的 PK-9, Capan-1和 Panc-1细胞中的 胰岛素受体底物 （IRS-1 ) 蛋白质明显降低， 而胰岛素样生长因子受体 (IGF-1R) 蛋白质无变化（见图 18A ) ， 表明 PRCP和 PREP专门地调节胰 岛素受体底物。 同时， 与对照细胞相比， PRCP和 PREP基因双重沉默的 细胞中 IRS-1苏氨酸 (S307和 S636/639)磷酸化增加， 而 IRS-1酪氨酸磷酸 化减少（见图 18B ) 。 利用 Cycloheximide蛋白合成抑制剂处理后的细胞 裂解物免疫印迹显示， 与对照细胞相比， PRCP和 PREP基因双重沉默的 细胞中 IRS-1半衰期缩短， 说明 PRCP和 PREP其实调节胰岛素受体底物 蛋白的稳定性 （见图 18C ) 。 使用雷帕霉素处理细胞， 虽然在对照细胞 中雷帕霉素可诱导升高 IRS-1蛋白质， 但在 PRCP和 PREP双重基因沉默 的细胞中， 雷帕霉素不能升高 IRS-1蛋白质； 此外， 在 PRCP和 PREP基 因双重沉默的细胞中， IRS-1苏氨酸 (307和 636/639)磷酸化增加， 使用雷 帕霉素处理虽然可抑制 PRCP和 PREP基因双重沉默的细胞中 IRS-1苏氨 酸 307磷酸化， 但不能抑制苏氨酸 636/639磷酸化， 尽管雷帕霉素还同样 有效地抑制了 S6K的磷酸化 (T389) (见图 18D)，因此说明雷帕霉素并不能 完全克服 PRCP和 PREP基因双重沉默对 IRS-1蛋白的影响。 利用药物抑制 PRCP 和 PREP酶功能同样引起胰岛素受体底物的 苏氨酸磷酸化和蛋白降解（见图 19)。 Panc-1细胞裂解物免疫印迹显示， 与对照细胞相比， 在 Y29794治疗后的细胞中 IRS-1蛋白质明显降低 （见 图 19A) 。 Panc-1细胞裂解物免疫印迹显示， 与对照细胞相比， Y29794 治疗后的细胞中 IRS-1苏氨酸 (307和 636/639)磷酸化增加 （见图 19B ) 。 利用 Cycloheximi de蛋白合成抑制剂处理来固化不同细胞周期， 细胞裂 解物免疫印迹显示， 与对照相比， 在 Y29794治疗后的细胞中 IRS-1半衰 期缩短 （见图 19C ) 。 同时， 雷帕霉素尽管在对照细胞中可以诱导升高 IRS-1蛋白质， 但在 Y29794处理后的细胞中不能升高 IRS-1蛋白质； 与 之相对照， 无论细胞经不经过 Y29794处理， 雷帕霉素均能有效地抑制 mTOR的苏氨酸 (2448)磷酸化。 本文所提及的任何出版物、 参考文献、 专利和专利申请均应视作 以全文引用的方式并入本申请， 并应视为是以明确的和独立的方式全 文引用每一个独立的出版物、 参考文献、 专利或专利申请。 本文提供 的任何以及所有实施例， 或示范性语言 （例如、 诸如等） 仅意欲更好 地阐述本发明， 并不形成对本发明范围的限制， 除非另外要求。 本发 明描述了优选实施方案， 包括本发明人已知实施本发明的最佳模式。 本发明包含这些优选实施方案可能的变化， 本发明人意欲以这些与本 文具体描述不同的方式实施本发明， 同样， 本领域普通技术人员也清 楚了解这些变化， 并预期能熟练地利用所述变化。 在法律所能允许的 范围， 本发明包括了在所附权利要求中引用的主题的所有修改和等价 物， 除非本文另外指明， 或明显与上下文相抵触。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种用于治疗或者预防 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的疾病 的方法， 所述方法包括给有需要的患者施用有效剂量的 PRCP拮抗剂、 有效剂量的 PREP拮抗剂、或者是有效剂量的 PRCP以及 PREP双重拮 抗剂。
2. 一种用于治疗或者预防 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的疾病 的方法， 所述方法包括给有需要的患者施用有效剂量的以下拮抗剂组 合中的至少一种： （l ) mTOR拮抗剂与 PRCP 拮抗剂组合， （2 ) mTOR 拮抗剂与 PREP拮抗剂的组合，或（3 )mTOR拮抗剂与 PRCP以及 PREP 双重拮抗剂的组合。
3. 一种治疗性的降解胰岛素受体底物蛋白的方法， 所述方法包括 给有需要的患者施用有效剂量的 PRCP拮抗剂、 PREP拮抗剂、 或者是
PRCP 以及 PREP双重拮抗剂。
4. 权利要求 3 所述的方法， 所述方法应用于治疗或者预防 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的疾病。
5. 权利要求 1至 4中任一项所述的方法， 其中所述 PRCP拮抗剂 和所述 PREP拮抗剂为抑制性核苷酸。
6. 权利要求 1至 4中任一项所述的方法， 其中所述 PRCP拮抗剂 和所述 PREP拮抗剂为小分子化合物叔丁基 (2S)-2-{[(2S)-2-甲酰基吡咯 垸 -1-基]羰基 }吡咯烷 -1-羧酸酯及其衍生物。
7. 权利要求 1至 4中任一项所述的方法， 其中所述 PRCP拮抗剂 和所述 PREP 拮抗剂为小分子化合物 [2-[8- (二甲基氨基） 辛硫基 ]-6-丙 -2-基吡啶 -3-基] -噻吩 -2-基甲酮及其衍生物。
8. 权利要求 2所述的方法，其中所述的 mTOR拮抗剂是抑制性核 苷酸。
9. 权利要求 2所述的方法，其中所述 mTOR拮抗剂是小分子化合 物雷帕霉素及其衍生物。
10. 权利要求 1、2、或 4所述的方法，其中所述的 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关的疾病是癌症。
1 1. 权利要求 1、2、或 4所述的方法，其中所述的 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关的疾病是神经变性疾病。
12. 权利要求 1、2、或 4所述的方法，其中所述的 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关的疾病是新陈代谢性疾病。
13. 权利要求 1、2、或 4所述的方法，其中所述的 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关的疾病是错构瘤综合征。
14. 权利要求〗、 2、 或 4所述的方法， 其中所述 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关的疾病是遗传性肌病。
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