WO2014033346A1 - Sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas que comprende una nanopartícula, un péptido y una molécula biológicamente activa - Google Patents

Sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas que comprende una nanopartícula, un péptido y una molécula biológicamente activa Download PDF

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WO2014033346A1
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transporting
chitosan
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José Antonio GARCÍA SALCEDO
Juan Diego UNCITI BROCETA
José MACEIRA PENA
Teresa DEL CASTILLO SANTAELLA
José HERNÁNDEZ QUERO
Miguel SORIANO RODRÍGUEZ
José Luis ARIAS MEDIANO
María Adolfina RUIZ MARTÍNEZ
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Fundación Pública Andaluza Para La Investigación Biosanitaria De Andalucía Oriental Alejandro Otero (Fibao)
Servicio Andaluz De Salud
Universidad De Almería
Universidad De Granada
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    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Definitions

  • System for the transport of biologically active molecules comprising a nanoparticle, a peptide and a biologically active molecule.
  • the present invention is within the field of medicine, chemistry, biochemistry and immunology, and refers to a system for the transport of biologically active molecules capable of targeting receptors or targets selectively, and in particular the functionalization of chitosan nanoparticles with polyethylene glycol and Nanobody that carry a drug.
  • the present invention also relates to the compositions, the preparation process and the uses of the system for the transport of biologically active molecules.
  • nanoparticles are of special relevance in the transport of biologically active molecules due to their advantages, such as: - the protection of the encapsulated drug against enzymatic degradation and the ability to control release until reaching its site of action;
  • biodegradable polymers for its preparation, which allows the controlled release of the drug for days, weeks or months.
  • polymeric nanoparticles In the case of polymeric nanoparticles, important properties are added such as biocompatibility and biodegradability that allow their use in a wide variety of applications in the medical field.
  • polymeric drug transporters are used that allow the transport of the drug selectively minimizing its biodistribution, biological metabolization and the elimination of the drug it carries, allowing a greater therapeutic effect with low toxicity.
  • Nanoparticulate systems based on hydrophilic polymers have been developed for application as drug delivery systems. This is demonstrated by the abundant literature in this field. Numerous works have been published that describe various methods of making hydrophilic nanoparticles based on macromolecules of natural origin such as albumin nanoparticles (W. Lin et al., Pharm. Res., 1 1, 1994) and gelatin (HJ. Watzke et al., Adv. Colloid Interface ScL, 50, 1-14, 1994) and based on polysaccharides such as alginate (M. Rajaonarivonvy et ai, J. Pharm. Sc, 82, 912-7, 1993). However, most of these methods require the use of organic solvents, oils and high temperatures, aspects that greatly limit the exploitation of these systems.
  • chitosan is widely used. These nanoparticles have the disadvantage of their limited stability under certain conditions of pH and ionic strength.
  • WO-A-99/47130 refers to nanoparticles that have a biocompatible and biodegradable polyelectrolyte complex, from at least one polycation (which can be chitosan) and at least one polyanion, as well as an active ingredient, being the nanoparticles obtainable by further treating the polyelectrolyte complex during or after their formation with at least one crosslinking agent (glyoxal, TSTU or EDAP).
  • Chitosan nanoparticles are also known in combination with polyoxyethylene (ES 2098188 and ES 21 14502), in addition to the active ingredient that can be a therapeutic or antigenic macromolecule. The formation of these nanoparticles takes place due to a joint precipitation process of the chitosan and the active macromolecule in the form of polymeric nanoaggregates, caused by the addition of a basic agent such as tripolyphosphate.
  • chitosan can be modified by covalent bonding with polyethylene glycol through the amino function, which is known as the pegylation process.
  • EP patents 1304346 and US 6,730,735 describe a composition for the administration of drugs by mucosal routes comprising a conjugate of chitosan and PEG, both being covalently linked through the amino group of chitosan.
  • Application US2004 / 0156904 describes a pharmaceutical agent release system, in which the active agent is incorporated into a matrix prepared from a composition that includes chitosan-PEG and a water insoluble polymer such as polylactic-co-glycolic acid. (PLGA)
  • Application WO01 / 32751 describes the obtaining of chitosan nanoparticles that precipitate in the presence of a surfactant, including polyethylene glycol, by increasing the pH of the solution where they are found. PEG does not covalently bind to chitosan.
  • the inventors have developed a system for the transport of biologically active molecules based on nanoparticles functionalized with a polypeptide or protein on their surface, which are stable, non-toxic, water soluble, and compatible with biological systems, as well as a procedure to obtain it. These nanoparticles are useful for vehiculizing active ingredients and / or pharmaceutical or cosmetic compositions.
  • a first aspect of the invention relates to a system for the transport of biologically active molecules, hereinafter system for the transport of biologically active molecules of the invention, comprising:
  • biologically active molecule has a broad meaning and comprises molecules such as high, or more preferably, low molecular weight drugs, polysaccharides, proteins, peptides, lipids, oligonucleotides and nucleic acids, as well as combinations thereof.
  • the biologically active molecule has the function of preventing, alleviating, curing or diagnosing diseases.
  • the biologically active molecule has a cosmetic function.
  • biologically active molecule also includes the terms "active ingredient”, “active substance”, “pharmaceutically active substance”, “active ingredient”, “therapeutic agent”, “drug” or “pharmaceutically active ingredient”, that is, it means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect in the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals. It also includes “cosmetics”.
  • the transport of biologically active molecules of the invention is significantly less in the absence of the polypeptide or protein than when the polypeptide or protein is present in the system.
  • the biologically active molecule and the Nanobody bind to the transport system preferably, but not limited to, independently.
  • This union may be either covalently or non-covalently.
  • Preferably it will be a non-covalent bond, which generally occurs through electrostatic interactions, surface adsorption or encapsulation, or intercalated inside it.
  • the nanoparticles can be of any known nanomaterial, such as, but not limited to, carbon-based nanoparticles, silica, metals (gold, iron or iron oxides), liposomes, niosomes, dedimers, or composites of the aforementioned.
  • the system for transporting biologically active molecules of the invention is preferably based on chitosan nanoparticles, poly (é-caprolactone), PLGA, poly (alkylcyanocycrylate). or a derivative thereof.
  • the system for transporting biologically active molecules of the invention is preferably based on chitosan nanoparticles or a derivative thereof, and more preferably, functionalized with a polymer.
  • the starting material of this invention is a polyamine called chitosan, which is a derivative of chitin that is obtained by N-deacetylation, being one of the main components of fungal cell walls and exoskeleton. of arthropods.
  • chitin is the second most abundant natural biopolymer on earth.
  • Chitosan is a copolymer of N-acetylglucosamine and glucosamine, a linear polyamine biocompatible with tissues since it does not cause allergic reactions or rejection, and it is also biodegradable, since it is degraded in non-toxic amino acids by fermentation.
  • Chitosan is a cationic polymer under neutral pH conditions that contains free amino groups that can be protonated by solubilizing it in water. Free amino groups facilitate its functionalization with other molecules such as proteins or peptides. In comparison with other polymers, chitosan has a positive charge and is mucoadhesive (Berscht et al. Biomaterials 15, 593-600).
  • the chitosan comprises the repetition of units according to formula (I), where n is an integer and represents the degree of polymerization, that is, the number of monomer units in the chitosan chain
  • chitosan includes both chitosan, its salts (eg nitrate, phosphate, sulfate, hydrochloride, glutamate, lactate or acetate), and those derived from chitosan (including esters, ethers, derivatives by group bonding acyl, alkyl, hydroxyl, etc).
  • salts eg nitrate, phosphate, sulfate, hydrochloride, glutamate, lactate or acetate
  • derived from chitosan including esters, ethers, derivatives by group bonding acyl, alkyl, hydroxyl, etc.
  • derivatives are 0- (Ci-Ci 2 ) alkyl ethers of chitosan, 0- (Ci-C 6 ) acyl esters of chitosan.
  • the chitosan or chitosan derivative or its salt preferably has a molecular weight between 7 to 1200 KDa (Kilo Dalton), more preferably in the range of 45 and 900 KDa (Kilo Dalton). Even more preferably, the chitosan has a molecular weight between 50 and 190 KDa. Chitosans of different molecular weights can be used in accordance with the present invention.
  • acylation refers to both the N-acylation of the chitosan amino group, and the O-acylation of the chitosan hydroxyl group, with monocarboxylic acids or their halide derivatives of acid, anhydrides, amides, esters, lactones and lactams, which contain at least one aromatic ring in their structure.
  • the solubility, viscosity and film-forming nature of chitosan can be increased and / or regulated due to supramolecular interactions between the aromatic rings of acyl groups that modify said chitosan.
  • degrees of substitution DS degrees of acylation in this case
  • new materials are obtained whose solubility, viscosity and film-forming character can be modulated according to the medium in which it is intended to be used, which generate films on surfaces or can be used as a means of dosing additives. Modulation of the degree of acylation will influence the physical properties of chitosan, solubility and viscosity, but also its biochemical behavior.
  • the degree of acylation of the chitosan is preferably between 3% and 99% of the hydroxyl groups and / or between 1% and 60% of the chitosan amino groups. More preferably, the chitosan has a degree of acylation between 70 and 90% of the hydroxyl groups and / or 3% and 15% of the amino groups. In another preferred embodiment, the chitosan has a degree of deacetylation of between 75 and 85%.
  • the average size of these systems can be measured by standard procedures known to the person skilled in the art, and which are described, for example, in the experimental part below.
  • the nanoparticles of the system are characterized by having an average particle size of less than 1 ⁇ , preferably having an average size between 1 and 999 nm, preferably between 50 and 800 nm, and even more preferably between 50 nm and 500 nm. In an even more preferred embodiment, it has an average particle size between 70 and 130 nm.
  • Medium diameter means the average diameter of the nanoparticle population dispersed in an aqueous medium.
  • the average diameter of these systems can be measured by standard procedures known to those skilled in the art and described, for example, in the examples below.
  • the average particle size is mainly influenced by the proportion of chitosan with respect to PEG, by the degree of deacetylation of chitosan and also by the conditions of particle formation (chitosan-PEG concentration, crosslinking agent concentration and ratio from both).
  • the presence of PEG reduces the average particle size with respect to systems formed by non-pegylated chitosan.
  • the polymer confers solubility to the nanoparticle and will preferably be a biodegradable polymer.
  • polymers would be polyethyleneimine (PEI), poly (L-lysine) (PLL), poly (2-dimethyl-amino) ethylmethacrylate (pDMAEMA), histidine-derived polypeptides, poly (D, L-lactide) (PLA) , poly (glycolide) (PGA), PLGA, poly (é-caprolactone), PEG, poly (N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide) (PHPMA), or any combination thereof.
  • PEI polyethyleneimine
  • PLA poly (L-lysine)
  • pDMAEMA poly (2-dimethyl-amino) ethylmethacrylate
  • histidine-derived polypeptides poly (D, L-lactide) (PLA) , poly (glycolide) (PGA), PLGA, poly (é-caprolactone), PEG, poly (N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide) (PHPMA), or any combination thereof.
  • any other polymer could be used in the present invention as long as it is sufficient to prepare a nanoparticle.
  • chitosan superficially functionalized with the polymer by any method described in the state of the art.
  • the system for transporting biologically active molecules of the invention comprises a chitosan nanoparticle functionalized with a polymer that is selected from the list consisting of PEI, PLL, pDMAEMA, histidine derived polypeptides, PLA, PGA , PLGA, poly (ecaprolactone), PEG, PHPMA, or any combination thereof.
  • this polymer is polyethylene glycol or PEG, this being a polymer of general formula (Formula II):
  • n is an integer that represents the degree of polymerization of the PEG and gives rise to different molecular weights of the polymer.
  • the molecular weight of the PEG is in the range between 150 and 7000 Kda, more preferably between 180 and 6000 KDa, even more preferably between 200 and 5500 KDa, and even more preferably it has a molecular weight of between 400 and 5000 Kda.
  • a PEG is preferably used where the two terminal hydroxyl groups are modified or protected by a protecting group of general formula
  • X1 is a protective group that blocks the OH function for subsequent reactions.
  • Hydroxyl protecting groups are well known in the art, as described for example Protective Groups in Organic Synthesis of Greene and Wuts, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.
  • protecting groups including oxygen to be protected
  • silyl ethers such as trimethylsilyl ether, triethylsilyl ether, tert-butyldimethylsilyl ether, tert-butyldiphenylsilyl ether, tri-isopropylsilyl ether, diethylisopropylsilyl ether, texyldimethylsilyl ether, triphenylsilyl ether, di-tert-butylmethylsilyl ether; alkyl ethers such as methyl ether, tert-butyl ether, benzyl ether, p-methoxybenzyl ether, 3,4-dimethoxybenzyl ether, trityl ether; allyl ether; alkoxymethyl ether such as methoxymethyl ether, 2- methoxyethoxymethyl ether, benzyloxymethyl ether, p-methoxybenzyl
  • hydroxyl protecting groups can be found in reference books such as Protective Groups in Organic Synthesis of Greene and Wuts, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.
  • the protecting group X1 is an alkyl group , and more preferably a methyl.
  • X2 can be a hydrogen or a bridge group that allows anchoring to the chitosan amino groups.
  • the preferred, but not exclusive, form is succinimide group or a derivative thereof.
  • the group X2 is a carboxyl group.
  • the system for transporting biologically active molecules comprises 3 chitosan parts per 4, 3, 2 or 1 part of PEG; preferably 2 chitosan parts for every 4, 3, 2 or 1 part of PEG; and more preferably 1 chitosan part for every 4, 3, 2 or 1 part of PEG.
  • n represents the degree of polymerization of PEG
  • the number of chitosan amino groups that react with PEG, functionalization or PEGylation is between 60 and 100%.
  • the nanoparticles comprise a conjugate comprising a) at least 70% by weight of chitosan or a derivative thereof and b) less than 30% by weight of polyethylene glycol (PEG) or a derivative thereof.
  • PEG polyethylene glycol
  • the resulting chitosan-PEG conjugate has a molecular weight between 5 and 3000 kDa, preferably between 10 and 500 kDa.
  • Bioly active molecule can include from low molecular weight drugs to polysaccharide-type molecules, proteins, peptides, lipids, oligonucleotides and nucleic acids and combinations thereof.
  • the system for transporting biologically active molecules of the invention may comprise more than one distinct biologically active molecule.
  • the biologically active molecule is of low molecular weight.
  • this molecule is hydrophilic.
  • this molecule is hydrophobic, and more preferably, this molecule is pentamidine.
  • Chitosan-PEG nanoparticles are systems that have a great ability to associate bioactive molecules. This association capacity depends on the type of molecule incorporated as well as the indicated formulation parameters.
  • the biologically active molecule can be incorporated into the transport system in a non-covalent manner, generally by electrostatic interactions, surface adsorption or encapsulation or intercalated within it.
  • the encapsulation occurs inside the nanoparticle.
  • the drug transport system comprising a chitosan-polymer nanoparticle and a biologically active molecule also comprises one or more additives and / or pharmacologically acceptable agents.
  • polypeptide or protein (referred to herein as the polypeptide or protein of the invention) has an amino acid sequence comprising:
  • the Nanobody, domain antibodies or single domain antibodies or dAb is directed against an epitope, antigen, target, protein or polypeptide.
  • the polypeptide or protein of the invention consists of a Nanobody (called the Nanobody of the invention).
  • the Nanobody, domain antibodies or single domain antibodies or dAb derives from a VH or VHH domain.
  • Single domain antibodies are antibodies whose complementarity determining regions are part of a single domain polypeptide.
  • a single domain antibody as used herein, is a naturally occurring single domain antibody known as a heavy chain antibody devoid of light chains.
  • Such single domain antibodies are described for example in WO 94/04678.
  • this variable domain derived from a light chain naturally heavy chain antibody is known herein as a VHH or nanobody, to differentiate it from conventional VH from four-chain immunoglobulins.
  • Said VHH molecule can be derived from antibodies generated in Camelidae species, for example, in camel, dromedary, llama, vicu ⁇ a, alpaca and guanaco. Other species apart from Camelidae can produce heavy chain antibodies naturally devoid of light chain; said VHH are included in the scope of the invention.
  • nanobody also called “nanoantibody” or “nanobody” to a type of antibodies smaller than usual, being relatively simple proteins with an approximate size of one tenth of the size of the corresponding in humans and just a few nanometers of length.
  • the characteristics and properties of said nanobodies, nanoantibodies or nanobodies are known to those skilled in the art, and are described, for example, but not limited to, in Hamers-Casterman et al., 1993. Nature Jun 3; 363 (6428): 446-8; Muyldermans S, Baral TN, Retamozzo VC et al., 2009. Vet Immunol Immunopathol, 128 (1-3), 178-183 (2009). Vincke, C and Muyldermans, S. Introduction to heavy chain antibodies and derived nanobodies. 91 1, 15-26, 2012.
  • the nanobody or nanoantibody is a formatted nanobody or nanoantibody.
  • Nanobodies (Nbs) or formatted nanoantibodies are entities obtained by binding nanoantibodies to different molecules. This concept encompasses the union between several Nbs, which can be: multivalent (two or more linked Nbs), multispecific (united Nbs that recognize different antigens) and multiparatopic (united Nbs that recognize different epitopes within the same antigen).
  • the polypeptide or protein of the invention may alternatively include a fragment of an antibody, which can be any part of the antibody that maintains the function of the entire antibody.
  • antibody fragments are Fv, Fab (antigen binding fragments), Fab2 (fragments with two antigen binding sites), all well known to one skilled in the art.
  • the single-chain variable fragments (scFv) comprise the VH (heavy chain variable domain) and VL (light chain variable domain) domains of the antibody, these domains being in a single polypeptide chain.
  • minibodies which comprise a scFv and a constant region of type CH3, or so-called scFv-Fc, which comprise a scFv and the constant regions CH2 and CH3 .
  • minibodies which comprise a scFv and a constant region of type CH3, or so-called scFv-Fc, which comprise a scFv and the constant regions CH2 and CH3 .
  • scFv-Fc which comprise a scFv and the constant regions CH2 and CH3 .
  • the polypeptide or protein of the invention generally comprises an amino acid sequence that can be considered to comprise the complementary determining region. Also, within the scope of the invention, the use of parts, fragments, analogs, mutants, variants, alleles and / or derivatives thereof are included. Nanobodies, polypeptides or proteins of the invention and / or the use of polypeptides or proteins that comprise or consist essentially of the same, provided that they can be used for the uses described herein.
  • the amino acid sequence of the Nanobody, polypeptide or protein of the invention is derived from a VH or VHH domain and can be "humanized”"camelized” respectively or modified as described later in the examples (Vincke et al., 2009. J Biol Chem 284: 3273-3284.Davies & Riechmann L. 1994. FEBS Lett 339: 285-890).
  • the Nanobody, domain antibodies or single domain antibodies or dAb is directed against a blood protein. More preferably, the system comprising a single Nanobody, domain antibodies or single domain antibodies or dAb that allows the resulting transport system to target its specific target by penetrating and / or crossing the mucosal membrane and / or the blood brain barrier or by binding to a protein in blood
  • said Nanobody specifically recognizes the surface of Trypanosoma brucei.
  • said polypeptide comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and in another even more preferred embodiment, it comprises the N33body An33.
  • Nanobodies of the invention is carried out following the protocols described Stijlemans et al., 2004. J Biol Chem 279: 1256-1261). A detailed description of the preparation of Nanobodies, polypeptides and proteins of the invention can also be found, for example but not limited, in WO 06/040153, WO 06/122825, WO 06/122786, WO 07/042289, WO 07/104529 and PCT / EP2007 / 058587
  • composition composition, pharmaceutical composition and cosmetic composition
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art.
  • compositions include, without limitation, any liquid composition (suspension of the system including nanoparticles in water or in water with additives such as viscosizers, pH buffers, etc.) or solid (the system including lyophilized or atomized nanoparticles forming a powder that can be used to make granules, tablets or capsules) for administration either orally, orally or sublingually, topically, or in liquid or semi-solid form for administration transdermally, ocularly, nasally, vaginally or parenterally .
  • the contact of the nanoparticles with the skin or mucous membranes can be improved by giving the particles a significant positive charge, which will favor their interaction with the aforementioned negatively charged surfaces.
  • these systems offer the possibility of modulating the in vivo distribution of associated drugs or molecules. They may also be suspensions in biological fluids, such as serum. Aqueous suspensions may be buffered or unbuffered and have additional active or inactive components. Additional components include salts to modulate ionic strength, preservatives, including, but not limited to, microbial agents, antioxidants, chelators, and the like, and nutrients including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • compositions may be combined with various inert vehicles or excipients, including but not limited to; binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients such as starch or lactose; dispersing agents such as alginic acid or corn starch, etc.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch, etc.
  • compositions and / or their formulations may be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intracecal, intraventricular, oral. , enteral, parenteral, intranasal or dermal.
  • the administration will be parenteral.
  • the administration will be topical.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises another active ingredient. Said additional active principle or principles may be included in the system for the transport of biologically active molecules of the invention or be part of the pharmaceutical composition of the invention without being part of the transport system.
  • This invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of at least one disease that can be prevented with the administration of a therapeutic agent to a patient suffering from said disease.
  • this method comprises the administration to an individual of the therapeutically effective amount of the composition.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a system for the transport of biologically active molecules of the invention, or of a pharmaceutical composition of the invention, in the preparation of a medicament, or alternatively, to the system for the transport of biologically molecules. of the invention, or the pharmaceutical composition of the invention for use in the manufacture of a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a system for the transport of biologically active molecules of the invention, or of a pharmaceutical composition of the invention, in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of trypanosomiasis, or alternatively , to the system for the transport of biologically active molecules of the invention, or the pharmaceutical composition of the invention for the prevention or treatment of trypanosomiasis.
  • Trypanosomiasis is a parasitic disease caused by protozoa of the Trypanosoma genus.
  • the genus Trypanosoma belongs to the superukine Eukaryota, order Kinetoplastida, family Trypanosomatidae.
  • the Trypanosoma is T. brucei.
  • T. brucei belongs to the Eukaryota super-kingdom, order Kinetoplastida, family Trypanosomatidae, genus Trypanosoma and subgenus Trypanozoon. African trypanosomiasis, also called sleeping sickness when it affects humans, and Nagana on ' wins when it affects animals, it is a disease caused by parasites of the species Trypanosoma brucei.
  • T. b. gambiense which causes chronic slow-onset African trypanosomiasis.
  • T. b. Rhodesian which causes acute, rapid onset African trypanosomiasis.
  • T. b. brucei which causes African animal trypanosomiasis (or nagana), like other trypanosome species.
  • trypanosomiasis is caused by a Trypanosoma that is selected from the list consisting of: T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, T. brucei brucei, T. congo tense, T. vivax, T evansi and Trypanosoma equiperdum. More preferably said trypanosome is T brucei.
  • nanosystems such as the system for transporting biologically active molecules of the invention, allow the development of novel, promising and intriguing possibilities of nanotechnology in medical diagnosis and treatment.
  • the nanodevices used as contrast agents in medical imaging have clear advantages over traditional agents in terms of better optical dispersion, increased biocompatibility, decreased probability of denaturation and, especially , their ability to bind ligands, which makes them devices with multiple functions that bind to white cells, allow imaging for diagnosis and carry medications, allowing specific treatment and efficient possibilities of nanotechnology in diagnosis.
  • composition of the invention may additionally comprise a detectable label.
  • detectable label refers to any label that can be used to locate the composition in vivo or in vitro. Examples of markers, but not limited to these, would be fluorophors, chemical or protein markers that allow visualization of a polypeptide. Visualization can be done with the naked eye or by an apparatus (such as, but not limited to a microscope) and may involve a source of energy or light.
  • another aspect of the invention relates to a diagnostic kit or device, comprising a system for transporting biologically active molecules of the invention, or a pharmaceutical composition of the invention.
  • biologically active molecule drug or therapeutic agent, or detectable label
  • They refer to any substance that provides pharmacological activity and is used in the treatment, cure, prevention or diagnosis of a disease or that is used in the diagnosis, cure, mitigation, treatment or prevention of a disease, or that affects the structure or body function of man or other animals.
  • biologically active molecules can include from low molecular weight drugs to molecules of the polysaccharide type, proteins, peptides, lipids, oligonucleotides and nucleic acids and combinations thereof.
  • these molecules are well known to the person skilled in the art and include the meaning of a compound that has the characteristics that make it acceptable for use in medicine, for example and without being limited to the active principle in a medicine. Therefore, for example and without being limited to, these molecules can be synthesized by different organic chemistry techniques, or molecular biology and bio chemistry techniques.
  • the terms used herein are understood as any compound that is administered to a patient for the treatment of a condition and that can pass through the cell membrane more efficiently when attached to the nanoparticle of the invention than when administered without the nanoparticle of the invention.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • the therapeutic agent includes but is not limited to hydrophilic and hydrophobic compounds. Accordingly, the therapeutic agents contemplated in this invention include but are not limited to drug-like molecules, proteins, peptides, antibodies, antibody fragments, aptamers and small molecules.
  • a therapeutic therapeutic agent includes but is not limited to peptides, enzymes, structural proteins, receptors, and other circulating or cellular proteins as well as fragments and derivatives thereof whose aberrant expression give rise to one or more medical conditions.
  • a therapeutic agent also includes chemotherapeutic compounds and radioactive materials,
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as age, but, sex, tolerance, ... of the mammal.
  • the "therapeutically effective amount” refers to the amount of active ingredient, or its salts, pro-drugs, derivatives or analogs or their combinations, that produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said pro-drugs, derivatives or analogs and the therapeutic effect to be achieved.
  • the "adjuvants” and “pharmaceutically acceptable carriers” that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • excipient refers to a substance that aids the absorption or distribution or action of any of the active ingredients of the present invention, stabilizes said active substance or aids in the preparation of the medicament in the sense of giving it consistency or providing flavors. Make it more enjoyable.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • the excipient must be pharmaceutically suitable, that is, a file that allows the activity of the active substance or active ingredients, that is, that is compatible with the active ingredient, in this case, the active ingredient is any of the compounds of the present invention.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the vehicle like the excipient, is a substance that is used in the medicament to dilute any of the compounds of the present invention to a certain volume or weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to the active ingredients of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow greater dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent
  • small molecule refers to a chemical compound, for example a peptidomimetic that can be derivatized or any other organic compound of low molecular weight, natural or synthetic. Said small molecules can be therapeutically transported substances or can be derivatized to facilitate transport.
  • Low molecular weight is understood as compounds whose molecular weight is less than 1000 Daltons, usually between 300 and 700 daltons.
  • Another aspect of the invention relates to a process for obtaining a system for the transport of biologically active molecules of the invention, hereafter referred to as the method of the invention, comprising: a) the preparation of a copolymer in an aqueous solution of the chitosan-polymer conjugate;
  • incorporation of the biologically active molecule and / or the polypeptide or protein by mechanical agitation can be done by first incorporating the biologically active molecule by mechanical agitation, and then the polypeptide or protein is incorporated by mechanical agitation.
  • the biologically active molecule is first incorporated by mechanical agitation in the process of the invention, and then the polypeptide or protein is incorporated by mechanical agitation.
  • the polypeptide or protein is first incorporated by mechanical agitation, and then the biologically active molecule is incorporated by mechanical agitation.
  • the first step in the preparation of the nanoparticles is the synthesis of the chitosan-polymer copolymer. Preferably, this is done by cross-coupling using techniques known to the person skilled in the art as described in example 1.
  • the biologically active molecule and the Nanobody bind to the transport system directly and independently, this union can be indistinctly covalent or non-covalent. So the polypeptide is covalently bound to the nanoparticle.
  • a reactive group is first introduced into the PEG (N-hydroxysuccinimide (NHS). This reactive group reacts with the primary amines present in the protein and covalently binds to them. The end result is the binding of the noparticle and the protein.
  • PEG N-hydroxysuccinimide
  • prevention and / or treatment not only includes preventing and / or treating the disease, but generally also it includes preventing the onset of the disease, showing or reversing its progression, preventing or showing the onset of one more symptoms associated with the disease, reducing and / or alleviating said symptoms, reducing the severity and / or duration of the disease and / or the symptoms associated with it and preventing a future increase in the severity of the disease and / or the symptoms associated with it, preventing, reducing or reversing the physiological damage caused by the disease, and generally any pharmacological action that is beneficial for the patient.
  • polypeptide polypeptide
  • peptide or “protein” are used interchangeably herein.
  • FIG. 1 Characterization of chitosan nanoparticles superficially functionalized with PEG and "Nanobody”, and loaded with pentamidine by HRTEM (a) and FeSEM (b). Bar length: 50 nm.
  • FIG. 2 Zeta potential (£ mV) of nanoparticles loaded with ( ⁇ ), or without pentamidine (or), as a function of pH (a) and as a function of the concentration of KN0 3 (b).
  • FIG. 4. Parasitemia. The number of parasites per milliliter of blood versus days after infection. The count was done in Neubauer's chamber.
  • FIG. 5 Survival study. Survival percentage compared to post-infection days.
  • FIG. 6. Scanning electron microscopy image of PLGA nanoparticles.
  • X axis survival percentage;
  • Y axis post-infection days.
  • Nanobody An33 has been used, which specifically recognizes the T. brucei parasite, which is the cause of the disease and the drug pentamidine, which is used in the treatment of the disease.
  • EXAMPLE 1 Preparation of nanoparticles functionalized with PEG and Nanobody An33 and encapsulated with pentadimine.
  • the synthesis of the chitosan-polyethylene glycol copolymer is carried out by dissolving under stirring chitosan hydrochloride in double distilled water, and methoxypolyethylene glycol (MeO-PEG-CH 2 C0 2 ll) and A / -hydroxysuccinimide (NHS). Finally, and with stirring, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) is added slowly, maintaining the stirring for 22 hours at room temperature. Finally, the solution is subjected to a process of ultrafiltration and subsequent lyophilization.
  • the nanoparticles were then synthesized by a coacervation method that does not require organic solvents.
  • sodium sulfate is added to a chitosan-polyethylene glycol copolymer solution in acetic acid.
  • acetic acid As a consequence of the reduction of the water solubility of the polymer, rapid precipitation of the copolymer in the form of nanoparticles occurs.
  • a sufficient amount of chitosan-polyethylene glycol was dissolved in double distilled water at a final concentration of 1% (m / V).
  • a suitable amount of poloxamer (for example, pluronic ® F-68) and pentamidine was also dissolved at a final concentration of 1% (m / V) and 0.01 M, respectively.
  • a 20% aqueous solution of sodium sulfate (m / V) was added slowly (speed: 0.5 mL / minute) and under mechanical stirring (2000 rpm) to the copolymer and drug solution. This mechanical agitation was maintained for another hour to ensure the formation of chitosan nanoparticles with polyethylene glycol (PEG) chains at the surface level, and loaded with pentamidine.
  • PEG polyethylene glycol
  • the physicochemical characterization of the nanoparticles was studied using various techniques, including high resolution transmission electron microscopy (HRTEM) and photon correlation spectroscopy (PCS) for the determination of the geometry and size of the nanoparticles, as shown in figure 1, obtaining average diameter values around 130 nm, which will facilitate proper parenteral biodistribution (Decuzzi et al., 2009. Pharmaceutical Research, 26 (1), 235-243).
  • HRTEM transmission electron microscopy
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • the quantification of the amount of pentamidine incorporated into the nanoparticles was performed by ultraviolet-visible spectrophotometry.
  • the amount of drug incorporated was expressed in terms of entrapment efficiency ⁇ entrapment efficiency, EE) (%) [(vehicularized pentamidine (mg) / total amount of pentamidine used (mg)) x 100] and drug loading (drug loading , DL) (%) [(vehicularized pentamidine (mg) / total mass of nanoparticles (mg)) x 100]).
  • EE entrapment efficiency
  • diaphragm bags of pore size of 2000 Da (Spectrum ® Spectra / Por ® 6) were used, which retains the nanoparticles and allows the pentamidine to pass to the release medium.
  • the quantification of the released pentamidine was also performed by ultraviolet-visible spectrophotometry as shown in Fig. 3.
  • EXAMPLE 2 Specificity and effectiveness of chitosan nanoparticles functionalized with PEG and Nanobody An33 in the specific recognition of the Trypanosoma brucei parasite.
  • IC50 defined as the concentration of drug necessary to decrease fluorescence production by 50%
  • Table 2 shows the results obtained that revealed that the PEG and Nanobody functionalized nanoparticles loaded with pentamidine significantly reduce the IC 50 compared to the drug alone.
  • EXAMPLE 3 Effectiveness of the Nanobody-NP (chitosan) -pentamidine transporter in the treatment of African trypanosomiasis.
  • mice of the C57BL / 6J strain of 8 weeks of age were infected, intraperitoneally (i.p.), with 10,000 parasites of the monomorphic strain AnTat1 .1 of T. brucei.
  • the infection was checked visually by detecting parasites in blood extracted by venous puncture of the tail.
  • the mice were randomly separated, in independent cages, into groups of 5 individuals and treatment was started. The treatment consisted of 4 doses on 4 consecutive days by intraperitoneal injection. 7 groups were established:
  • Control group saline administration.
  • Control group administration of Nb-NP (chitosan) - empty.
  • Pentamidine group 2.5 mg / Kg. 4 doses i.p.
  • Pentamidine group 0.25 mg / Kg. 4 doses i.p.
  • Pentamidine group 0.025 mg / Kg. 4 doses i.p.
  • Nb-NP (Chitosan) -pentamidine group 0.25 mg / Kg. 4 doses i.p.
  • Nb-NP (Chitosan) -pentamidine group 0.025 mg / kg 4 doses i.p.
  • the variables studied in the procedure were parasitemia (millions of parasites / milliliter of blood) and survival.
  • Fig. 4 shows the results of this experiment. Briefly, the parasitemia of the "saline serum" control group and of the "Nb-NP (chitosan)-empty” control group resulted in the death of all animals at day 6 post-infection.
  • Poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) is a versatile polymer widely used in biomedical applications, including the encapsulation of drugs through nanoparticle formulation.
  • PLGA has attractive properties for use in biomedicine. It is biodegradable and biocompatible, degrading in the liver to lactic acid.
  • PLGA polymer is approved by the FDA and the European Medicines Agency for parenteral administration. The formulations and methods of synthesis of PLGA nanoparticles are well standardized and the nanoparticles are adaptable to different types of drugs and routes of administration. Synthesis and characterization of nanoparticles
  • the synthesis of the PLGA nanoparticles loaded with pentamidine was carried out in a medium consisting of organic phase / aqueous phase / organic phase (w / o / w), by a method of double emulsion and solvent evaporation (DE / SEV).
  • Pentamidine was incorporated together with PLGA in the organic phase (ethyl acetate).
  • the emulsion was obtained by adding pluronic acid F-68 as a surfactant under strong mechanical agitation (20,000 rpm). This emulsion was poured into an aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA) under strong stirring (20,000 rpm) to finally obtain an emulsion w / o / w.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Agitation is a critical parameter in the preparation of PLGA nanoparticles by this DE / SEV methodology since it determines the final particle size.
  • a very high stirring speed (20,000 rpm) with a bar stirrer generates the optimum particle size (100-200 nm).
  • the organic solvent was evaporated overnight at 25 ° C under gentle stirring (1000 rpm). Then, the resulting colloidal suspension was washed several times by centrifugation (1,1000 rpm) and re-dispersed in water until low conductivity was detected in supernatant.
  • the carboxyl groups on the surface of the PLGA nanoparticles were functionalized with an isotonic buffer of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) in saline solution (pH 5.5). Then activated PEG polyethylene glycol was added as HCI ⁇ NH2-PEG-COOH (Mw: 3,400 Da) and allowed to react at room temperature in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.5). Unbound PEG was removed by washing with PBS (pH 7.5). Finally, the nano-antibodies were conjugated to the PLGA-b-PEG nanoparticles at room temperature in PBS (pH 7.5) under gentle agitation (200 rpm).
  • MES N-morpholino) ethanesulfonic acid
  • nanoparticles were washed with PBS (pH 7.5) to remove unbound nanobodies.
  • the average size of the nanoparticles obtained was: 145 ⁇ 35 nm ( Figure 1) and at a maximum concentration of loaded pentamidine, expressed as encapsulation efficiency and drug loading capacity, was 72% (SD ⁇ 6).
  • Nanobody-NP chitosan
  • Fig. 7 shows the results of this experiment.
  • the parasitemia of the "saline serum" control group and the "Nb-NP (PLGA)-empty” control group resulted in the death of all animals at day 5 post-infection.
  • the survival study that was carried out for 50 days post-infection.
  • pentamidine-treated groups individuals treated with 0.025 mg / kg (100 times lower than the curative dose of pentamidine) died between 15-19 days post-infection.
  • Individuals treated with 0.25 mg / kg pentamidine died between 24-27 days post-infection. 100% of individuals treated with pentamidine at the curative dose 2.5 mg / kg survived.
  • the groups treated with Nb-NP (PLGA) - pentamidine all individuals treated with a dose 10 times lower and 60% of those treated with a dose 100 times lower than the curative dose of pentamidine survived.

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Abstract

Sistemas para el transporte de moléculas biológicamente activas capaces de dirigirse hacia receptores o dianas de forma selectiva, que comprende una nanopartícula, un polipéptido y una molécula biológicamente activa. La presente invención se refiere también a las composiciones, al procedimiento de preparación y a los usos de dichos sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas.

Description

Sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas que comprende una nanopartícula, un péptido y una molécula biológicamente activa.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, de la química, la bioquímica y la inmunología, y se refiere un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas capaz de dirigirse hacia receptores o dianas de forma selectiva, y en particular a la funcionalización de nanopartículas de quitosano con polietilenglicol y Nanobody que transportan un fármaco. La presente invención se refiere también a las composiciones, al procedimiento de preparación y a los usos del sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Es conocido en el estado de la técnica que la administración de algunosingredientes activos al cuerpo humano y animal por diferentes vías de administración presenta, muchas veces, serias dificultades. Algunos fármacos, entre los que se encuentran péptidos, proteínas y polisacáridos no se absorben de manera efectiva a través de superficies mucosas dada la limitada permeabilidad de las barreras epiteliales. Esto hace que sea necesario el desarrollo de sistemas de administración que permitan una mejor administración de estos principios activos.
De entre las posibilidades propuestas recientemente para superar las dificultades de la administración de fármacos, destaca la incorporación de los ingredientes activos en partículas de pequeño tamaño. La interacción de dichas partículas con las mucosas se ve afectada entre otros factores por el tamaño de estas partículas, aumentando dicha interacción con la disminución del tamaño de las partículas. En función de su tamaño los podemos clasificar en micro- y nanosistemas.
Entre los diferentes tipos de nanosistemas, las nanopartículas son de especial relevancia en el transporte de moléculas biológicamente activas debido a sus ventajas, como son: - la protección del fármaco encapsulado frente a la degradación enzimática y la capacidad para controlar la liberación hasta alcanzar su sitio de acción;
- la gran capacidad de penetración en microcapilares o en compartimentos intracelulares o para atravesar la barrera hematoencefálica debido a su tamaño nanométrico;
- el uso de polímeros biodegradables para su preparación, que permite la liberación controlada del fármaco durante días, semanas o meses.
En el caso de las nanopartículas poliméricas, se suman propiedades importantes como la biocompatibilidad y biodegradabilidad que permiten su uso en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la medicina. Así pues, en el tratamiento del cáncer por ejemplo, se emplean transportadores de fármacos poliméricos que permiten el transporte del fármaco selectivamente minimizando su biodistribución, metabolización biológica y la eliminación del medicamento que transporta, permitiendo un mayor efecto terapéutico con una baja toxicidad.
Se han desarrollado sistemas nanoparticulados a base de polímeros hidrofílicos para su aplicación como sistemas de liberación de fármacos. Así lo demuestra la abundante literatura existente en este campo. Se han publicado numerosos trabajos que describen diversos métodos de elaboración de nanopartículas hidrofílicas a base de macromoléculas de origen natural como son las nanopartículas de albúmina (W. Lin et al., Pharm. Res., 1 1 , 1994) y gelatina (HJ. Watzke et al., Adv. Colloid Interface ScL, 50, 1 -14, 1994) y a base de polisacáridos como el alginato (M. Rajaonarivonvy et ai, J. Pharm. Sc , 82, 912-7, 1993). Sin embargo la mayoría de estos métodos requieren el uso de disolventes orgánicos, aceites y elevadas temperaturas, aspectos que limitan enormemente la explotación de estos sistemas.
Dentro de los diferentes polímeros biodegradables y biocompatibles que se emplean como transportadores, el quitosano es ampliamente utilizado. Estas nanopartículas tienen el inconveniente de su limitada estabilidad en determinadas condiciones de pH y fuerza iónica.
Existen numerosos documentos que describen la elaboración de quitosanos o derivados de quitosano en forma de nanopartículas, como por ejemplo el documento WO-A-01/32751 , donde se descrinbe la disolución del quitosano o derivados en un medio acuoso y la elevación posterior del pH en presencia de un agente modificador de superficie, hasta la precipitación del quitosano. El documento WO-A-99/47130 se refiere a nanopartículas que presentan un complejo de polielectrolito biocompatible y biodegradable, a partir de al menos un policatión (que puede ser el quitosano) y al menos un polianión, así como un ingrediente activo, siendo las nanopartículas obtenibles tratando adicionalmente el complejo de polielectrolito durante o después de su formación con al menos un agente reticulante (glioxal, TSTU o EDAP). También se conocen nanopartículas de quitosano en combinación con polioxietileno (ES 2098188 y ES 21 14502), además del ingrediente activo que puede ser una macromolécula terapéutica o antigénica. La formación de estas nanopartículas tiene lugar debido a un proceso de precipitación conjunta del quitosano y de la macromolécula activa en forma de nanoagregados poliméricos, causado por la adición de un agente de carácter básico como es el tripolifosfato.
Por otra parte, el quitosano puede ser modificado por la unión covalente con polietilenglicol a través de la función amino, lo que se conoce como proceso de pegilación. Las patentes EP 1304346 y US 6,730,735 describen una composición para la administración de fármacos por vías mucosas que comprende un conjugado de quitosano y PEG, estando ambos unidos covalentemente a través del grupo amino del quitosano.
La solicitud US2004/0156904 describe un sistema de liberación de agentes farmacéuticos, en el cual el agente activo se incorpora a una matriz preparada a partir de una composición que incluye quitosano-PEG y un polímero insoluble en agua como el ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA).
La solicitud WO01/32751 describe la obtención de nanopartículas de quitosano que precipitan en presencia de un tensioactivo, entre ellos el polietilenglicol, al aumentar el pH de la disolución donde se encuentran. El PEG no se une covalentemente al quitosano.
A pesar de las numerosas publicaciones dirigidas al desarrollo de sistemas para la liberación de fármacos, existe aún una necesidad de proporcionar un tipo de sistema nanoparticulado que presente estabilidad y una gran capacidad de asociación con una molécula biológicamente activa y que permita su liberación a una velocidad controlada, permitiendo simultáneamente dirigirlo hacia una diana determinada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la invención han desarrollado un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas basado en nanopartículas funcionalizadas con un polipéptido o proteína en su superficie, que son estables, no tóxicos, solubles en agua, y compatibles con los sistemas biológicos, así como un procedimiento para su obtención. Estas nanopartículas son útiles para vehiculizar principios activos y/o composiciones farmacéuticas o cosméticas.
SISTEMA PARA EL TRANSPORTE DE MOLÉULAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS. COMPOSICIONES Y USOS
Un primer aspecto de la invención se refiere a un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas, de ahora en adelante sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, que comprende:
a) una nanopartícula;
b) un polipéptido o proteína que comprende:
i) , un Nanobody,
ii) . un anticuerpo de dominio, o
iii) . un anticuerpo de dominio simple o "dAb"; y
c) una molécula biológicamente activa, agente terapéutico o fármaco.
La expresión "molécula biológicamente activa" tiene un sentido amplio y comprende moléculas tales como fármacos de alto, o más preferentemente, de bajo peso molecular, polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos, así como combinaciones de las mismas. En una variante de la invención la molécula biológicamente activa tiene como función prevenir, paliar, curar o diagnosticar enfermedades. En otra variante de la invención la molécula biológicamente activa tiene una función cosmética. En esta memoria el término "molécula biológicamente activa" incluye también los términos "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo", "agente terapéutico", "fármaco" ó "ingrediente farmacéuticamente activo", es decir, significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. Incluye también a los "cosméticos".
Preferiblemente, el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención es significativamente menor en ausencia del polipéptido o proteína que cuando el polipéptido o proteína está presente en el sistema.
La molécula biológicamente activa y el Nanobody se unen al sistema transportador preferiblemente, pero sin limitarse, de forma independiente. Esta unión podrá ser indistintamente de forma covalente o no covalente. Preferentemente será una unión no covalente, que de manera general sucede mediante interacciones electrostáticas, adsorción superficial o encapsulación, o intercalado en el interior de la misma.
Nanopartícula
Las nanopartículas pueden ser de cualquier nanomaterial conocido, como por ejemplo, pero sin limitarse, nanopartículas a base de carbón, sílice, metales (oro, hierro u óxidos de hierro), liposomas, niosomas, dedrímeros, o materiales compuestos de los anteriormente citados. En otra realización preferida, el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención está preferiblemente basado en nanopartículas de quitosano, poli(é--caprolactona), PLGA, poli(alquilcianocrilato). o un derivado de los mismos. En otra realización preferida, el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención está preferiblemente basado en nanopartículas de quitosano o un derivado del mismo, y más preferentemente, funcionalizadas con un polímero.
Así pues, en una realización preferida, el material de partida de esta invención es una poliamina llamada quitosano, que es un derivado de la quitina que se obtiene por N- deacetilación, siendo uno de los componentes principales de paredes celulares de hongos y del exoesqueleto de artrópodos. Después de la celulosa, la quitina es el segundo biopolímero natural más abundante en la tierra. El quitosano es un copolímero de N-acetilglucosamina y glucosamina, una poliamina linear biocompatible con tejidos ya que no causa reacciones alérgicas ni rechazo, y además es biodegradable, ya que se degrada en aminoazucares no tóxicos por fermentación. Estas cualidades convierten al quitosano en un buen candidato para aplicaciones farmacéuticas y como trasportador de fármacos, haciendo que se utilice en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la medicina, los medicamentos y la tecnología de los alimentos. El quitosano es un polímero catiónico en condiciones de pH neutras que contiene grupos amino libres que pueden protonarse solubilizándolo en agua. Los grupos amino libres facilitan su funcionalización con otras moléculas como proteínas o péptidos. En comparación con otros polímeros el quitosano tiene carga positiva y es mucoadhesivo (Berscht et al. Biomaterials 15, 593-600). Por ello se ha utilizado en diversas aplicaciones como en el transporte de moléculas biológicamente activas al colon, el transporte a través de la mucosa, la terapia contra el cáncer, terapia génica, y transporte por vía óptica y ocular (Ritger, et al. J. Controlled Reléase 5, 37-42; Artursson, Pharm. Res. 1 1, 1358-1361 ; Tokumitsu et al. Pharm. Res. 16, 1830-1835, Cui et al. J. Controlled Reléase 75, 409-419; ContiSTP Pharma. Sci. 10, 101 -104; De Campos, Int. J. Pharm. 224, 159-168.
El quitosano comprende la repetición de unidades según la fórmula (I), donde n es un número entero y representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades monoméricas en la cadena de quitosano
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Fórmula (I)
En el ámbito de la presente invención, el término quitosano incluye tanto quitosano, sus sales (p.e. nitrato, fosfato, sulfato, clorhidrato, glutamato, lactato o acetato), como los derivados de quitosano (incluyendo esteres, éteres, derivados por unión de grupos acilo, alquilo, hidroxilo, etc). Ejemplos de derivados son 0-(Ci-Ci2)alquil éteres de quitosano, 0-(Ci-C6) acil esteres de quitosano. El quitosano o derivado de quitosano o su sal tiene preferiblemente un peso molecular de entre 7 a 1200 KDa (Kilo Dalton), más preferiblemente en el rango de 45 y 900 KDa (Kilo Dalton). Aún más preferiblemente, el quitosano tiene un peso molecular de entre 50 y 190 KDa. Quitosanos de diferentes pesos moleculares pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención.
El término "acilación" se refiere a tanto a la N-acilación del grupo amino del quitosano, como a la O-acilación del grupo hidroxilo del quitosano, con ácidos monocarboxílicos o sus derivados haluros de ácido, anhídridos, amidas, esteres, lactonas y lactamas, que contienen al menos un anillo aromático en su estructura.
De acuerdo con la presente invención, la solubilidad, la viscosidad y el carácter filmógeno del quitosano puede ser aumentado y/o regulado debido a las interacciones supramoleculares entre los anillos aromáticos de los grupos acilo que vienen a modificar dicho quitosano. De forma que dosificando los grados de sustitución DS (grados de acilación en este caso) se consiguen nuevos materiales cuya solubilidad, viscosidad y carácter filmógeno puede ser modulada en función del medio en que se pretenda utilizar, los cuales generan películas sobre superficies o pueden ser utilizados como medio de dosificación de aditivos. La modulación del grado de acilación influirá sobre las propiedades físicas del quitosano, solubilidad y viscosidad, pero también sobre su comportamiento bioquímico. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el grado de acilación del quitosano está preferentemente comprendido entre el 3% y el 99% de los grupos hidroxilo y/o entre el 1 % y el 60% de los grupos amino del quitosano. De manera más preferida, el quitosano presenta un grado de acilación comprendido entre 70 y el 90% de los grupos hidroxilo y/o un 3% y 15% de los grupos amino. En otra realización preferida, el quitosano tiene un grado de desacetilación de entre el 75 y el 85 %.
El tamaño medio de estos sistemas se puede medir mediante procedimientos estándar conocidos por el experto en la materia, y que se describen, por ejemplo, en la parte experimental más abajo. Las nanopartículas del sistema se caracterizan por presentar un tamaño medio de partículas inferior a 1 μηι, preferentemente tienen un tamaño medio comprendido entre 1 y 999 nm, preferentemente entre 50 y 800 nm, y aún más preferentemente entre 50 nm y 500 nm. En una realización aún más preferida, presenta un tamaño medio de partículas de entre 70 y 130 nm.
Por "diámetro medio" se entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas dispersa en un medio acuoso. El diámetro medio de estos sistemas se puede medir por procedimientos estándar conocidos del experto en la materia y que se describen, por ejemplo, en los ejemplos más abajo.
El tamaño medio de las partículas se ve influenciado principalmente por la proporción de quitosano con respecto al PEG, por el grado de desacetilacion del quitosano y también por las condiciones de formación de las partículas (concentración de quitosano-PEG, concentración de agente reticulante y relación de ambos). La presencia del PEG reduce el tamaño medio de las partículas respecto a sistemas formados por quitosano sin pegilar.
La síntesis de la nanopartícula se describe más extensamente en el ejemplo 1 de la invención.
Polímero
El polímero confiere solubilidad a la nanopartícula y preferiblemente será un polímero biodegradable. Por polímero biodegradable se entiende un polímero que se puede degradar en un periodo de tiempo aceptable en condiciones fisiológicas pH=6-8, preferiblemente en los fluidos corporales o microorganismos en un cuerpo humano. Ejemplos representativos de polímeros serian polietilenimina (PEI), poli(L-lisina) (PLL), poli(2-dimetil-amino)etilmetacrilato (pDMAEMA), polipéptidos derivados de la histidina, poli(D,L-lactida) (PLA), poli(glicolida) (PGA), PLGA, poli(é--caprolactona), PEG, poli (N- (2-hidroxipropil)metacrilamida) (PHPMA), o cualquiera de sus combinaciones.
Además de los polímeros aquí mencionados, cualquier otro polímero podría ser usado en la presente invención siempre que sea suficiente para preparar una nanopartícula de quitosano funcionalizada superficialmente con el polímero mediante cualquier método descrito en el estado del arte.
En una realización preferida, el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención comprende una nanopartícula de quitosano funcionalizada con un polímero que se selecciona de la lista que consiste en PEI, PLL, pDMAEMA, polipéptidos derivados de la histidina, PLA, PGA, PLGA, poli(e- caprolactona), PEG, PHPMA, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente este polímero es polietilenglicol o PEG, siendo este un polímero de formula general (Fórmula II):
H-(0-CH2-CH2)n-0-H
Fórmula II
Donde n es un número entero que representa el grado de polimerización del PEG y da lugar a distintos pesos moleculares del polímero. En la presente invención el peso molecular del PEG se encuentra en el rango comprendido entre 150 y 7000 Kda, más preferiblemente entre 180 y 6000 KDa, aún más preferiblemente entre 200 y 5500 KDa, y aún mucho más preferiblemente tiene un peso molecular de entre 400 y 5000 Kda.
Para la síntesis del copolímero quitosano-polimero se emplea preferiblemente un PEG donde los dos grupos hidroxilos terminales están modificados o protegidos por un grupo protector de formula general
X1 -(0-CH2-CH2)n-0-X2
Donde
X1 es un grupo protector que bloquea la función OH para reacciones posteriores. Los grupos protectores de hidroxilo son bien conocidos en la técnica, como se describe por ejemplo Protective Groups in Organic Synthesis de Greene y Wuts, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999. Grupos protectores representativos (incluyendo el oxigeno a proteger) pero no limitativos serian los silil éteres tales como trimetilsilil éter, trietilsilil éter, terc-butildimetilsilil éter, ter-butildifenilsilil éter, tri-isopropilsilil éter, dietilisopropilsilil éter, texildimetilsilil éter, trifenilsilil éter, di-terc-butilmetilsilil éter; alquil éteres tales como metil éter, terc-butil éter, bencil éter, p-metoxibencil éter, 3,4- dimetoxibencil éter, tritil éter; alil éter; alcoximetil éter tal como metoximetil éter, 2- metoxietoximetil éter, benciloximetil éter, p-metoxibenciloximetil éter, 2- (trimetilsilil)etoximetil éter; tetrahidropiranil éter y éteres relacionados; metiltiometil éter; ésteres tales como éster acetato, éster benzoato; éster pivalato; éster metoxiacetato; éster cloroacetato; éster levulinato; carbonatos tales como carbonato de bencilo, carbonato de p-nitrobencilo, carbonato de tere-butilo, carbonato de 2,2,2-tricloroetilo, carbonato de 2-(trimetilsilil)etilo, carbonato de alilo. Ejemplos adicionales de grupos protectores de hidroxilo pueden hallarse en libros de referencia tales como Protective Groups in Organic Synthesis de Greene y Wuts, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999. En una realización preferente el grupo protector X1 es un grupo alquilo, y más preferiblemente un metilo.
X2 puede ser un hidrógeno o bien un grupo puente que permita el anclaje a los grupos amino del quitosano. De entre las moléculas puente utilizadas la forma preferente, pero no exclusiva, es grupo succinimida o un derivado de la misma. Preferentemente, el grupo X2 es un grupo carboxilo.
En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas comprende 3 partes quitosano por cada 4, 3, 2 ó 1 parte de PEG; preferiblemente 2 partes quitosano por cada 4, 3, 2 ó 1 parte de PEG; y má s preferiblemente 1 parte quitosano por cada 4, 3, 2 ó 1 parte de PEG. n representa el grado de polimerización del PEG
El número de grupos amino del quitosano que reaccionan con el PEG, funcionalización o PEGilacion está comprendido entre 60 y 100%. Preferentemente, las nanopartículas comprenden un conjugado que comprende a) al menos un 70% en peso de quitosano o un derivado del mismo y b) menos de un 30% en peso de polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo. Preferiblemente, el conjugado de quitosano-PEG resultante tiene un peso molecular comprendido entre 5 y 3000 kDa, preferentemente entre 10 y 500 kDa.
Molécula biológicamente activa, agente terapéutico o fármaco Las moléculas biológicamente activas pueden incluir desde fármacos de bajo peso molecular hasta moléculas del tipo de polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos y ácidos nucléicos y combinaciones de las mismas.
Preferentemente, el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención puede comprender más de una molécula biológicamente activa distinta. En una realización preferida, la molécula biológicamente activa es de bajo peso molecular. En otra realización preferida esta molécula es hidrofílica. En otra realización preferentemente esta molécula es hidrofóbica, y más preferiblemente, esta molécula es pentamidina.
Las nanopartículas de quitosano-PEG son sistemas que presentan una gran capacidad de asociación de moléculas bioactivas. Esta capacidad de asociación depende del tipo de molécula incorporada así como de los parámetros de formulación señalados.
Así pues, la molécula biológicamente activa se puede incorporar al sistema transportador de forma no covalente, de manera general mediante interacciones electrostáticas, adsorción superficial o encapsulacion o intercalado en el interior de la misma. Preferentemente, el encapsulado sucede en el interior de la nanopartícula.
En una realización preferida, el sistema transportador de fármacos que comprende una nanopartícula de quitosano-polimero y una molécula biológicamente activa también comprende uno o más aditivos y/o agentes farmacológicamente aceptables. Transportador o Nanobody
El polipéptido o proteína (a partir de aquí referido como el polipéptido o proteína de la invención) presenta una secuencia aminoacídica que comprende:
- un Nanobody o nanocuerpo,
- anticuerpos de dominio, o
- anticuerpos de dominio simple o dAb ("dAb"- single domain antibody). Preferiblemente, el Nanobody, los anticuerpos de dominio o los anticuerpos de dominio simple o dAb se dirige contra un epítopo, antígeno, diana, proteína o polipéptido. En una realización aun mas preferida, el polipéptido o proteína de la invención consiste en un Nanobody (llamado el Nanobody de la invención). En otra realización preferida el Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb deriva de un dominio VH o VHH.
Los anticuerpos de dominio único son anticuerpos cuyas regiones determinantes de complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. De acuerdo con la invención, un anticuerpo de dominio único, como se usa en el presente documento, es un anticuerpo de dominio único de origen natural conocido como un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Dichos anticuerpos de dominio único se describen por ejemplo en el documento WO 94/04678. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera se conoce en el presente documento como un VHH o nanocuerpo, para diferenciarlo de la VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula de VHH puede proceder de anticuerpos generados en especies de Camelidae, por ejemplo, en camello, dromedario, llama, vicuña, alpaca y guanaco. Otras especies aparte de Camelidae pueden producir anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera; dichos VHH se incluyen en el ámbito de la invención.
En esta memoria, por tanto, se entiendo como "nanobody", también llamado "nanoanticuerpo" o "nanocuerpo" a un tipo de anticuerpos más pequeños que los habituales, siendo proteínas relativamente sencillas con un tamaño aproximado de un décimo del tamaño del correspondiente en los humanos y de apenas unos nanómetros de longitud. Las características y propiedades de dichos nanobodies, nanoanticuerpos o nanocuerpos son conocidas por el experto en la materia, y se describen, por ejemplo, pero sin limitarnos, en Hamers-Casterman et al., 1993. Nature Jun 3;363(6428):446-8; Muyldermans S, Baral TN, Retamozzo VC et al., 2009. Vet Immunol Immunopathol, 128(1 -3), 178-183 (2009). Vincke, C and Muyldermans, S. Introduction to heavy chain antibodies and derived nanobodies. 91 1 , 15-26, 2012.
En otra realización preferida, el nanobody o nanoanticuerpo es un nanobody o nanoanticuerpo formateado.
Nanobodies (Nbs) o nanoanticuerpos formateados son entidades obtenidas mediante la unión de nanoanticuerpos a diferentes moléculas. Este concepto abarca la unión entre varios Nbs, pudiendo ser: multivalente (dos o más Nbs enlazados), multiespecífica (Nbs unidos que reconocen diferentes antígenos) y multiparatópica (Nbs unidos que reconocen distintos epítopos dentro del mismo antígeno).
En otra realización preferida, el polipéptido o proteína de la invención, alternativamente, puede incluir un fragmento de un anticuerpo, que puede ser cualquier parte del anticuerpo que mantenga la función del anticuerpo completo. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos son Fv, Fab (fragmentos de unión a antfgeno) , Fab2 (fragmentos con dos sitios de unión a antfgeno) , todos ellos sobradamente conocidos por un experto en la materia. Los fragmentos variables monocadena (scFv) comprenden los dominios VH (dominio variable de la cadena pesada) y VL (dominio variable de la cadena ligera) del anticuerpo, estando estos dominios en una única cadena polipeptídica. Otros formatos de los anticuerpos de la presente invención pueden ser los conocidos como minianticuerpos o "minibodies", que comprenden un scFv y una región constante de tipo CH3, o los llamados scFv-Fc, que comprenden un scFv y las regiones constantes CH2 y CH3. Estos formatos aumentan el peso molecular de los scFv, evitan su rápida eliminación por el riñon y pueden ser muy útiles para el uso de un scFv en técnicas de imagen.
El polipéptido o proteína de la invención generalmente comprende una secuencia aminoacídica que puede considerarse que comprende la región determinante complementaria. También, dentro del marco de la invención se incluye el uso de partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de los Nanobodies, polipéptidos o proteínas de la invención y/o el uso de polipéptidos o proteínas que comprenden o consisten esencialmente en lo mismo, siempre que puedan usarse para los uso aquí descritos. En otra realización preferida, la secuencia aminocídica del Nanobody, polipéptido o proteína de la invención deriva de un dominio VH o VHH y puede ser "camelizada" "humanizada" respectivamente o modificada según se describe más adelante en los ejemplos (Vincke et al., 2009. J Biol Chem 284:3273-3284.Davies & Riechmann L. 1994. FEBS Lett 339:285-890).
En otra realización preferida, el Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb se dirige contra una proteína en sangre. Mas preferiblemente, el sistema que comprende un único Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb que permite al sistema transportador resultante dirigirse hacia su diana especifica penetrando y/cruzando la membrana mucosal y/o la barrera hematoencefálica o uniéndose a una proteína en sangre.
En otra realización preferida de la invención, dicho Nanobody reconoce específicamente la superficie de Tripanosoma brucei. En una realización aun mas preferida dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y en otra realización aun mas preferida, comprende el Nanobody An33.
La preparación de los Nanobodies de la invención se realiza siguiendo los protocolos descritos Stijlemans et al., 2004. J Biol Chem 279: 1256- 1261 ). Una descripción detallada de la preparación de Nanobodies, polipéptidos y proteínas de la invención pueden encontrarse también, por ejemplo pero sin limitarse, en WO 06/040153, WO 06/122825, WO 06/122786, WO 07/042289, WO 07/104529 y PCT/EP2007/058587
Composición, composición farmacéutica y composición cosmética
Otro aspecto de la presente invención seria una composición de ahora en adelante composición de la invención, que comprende un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, tal y como se ha definido previamente. En una realización preferida, la composición es una composición farmacéutica. En otra realización preferida, la composición es una composición cosmética. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, las composiciones farmacéuticas incluyen, sin limitarse, cualquier composición líquida (suspensión del sistema incluyendo las nanopartículas en agua o en agua con aditivos tales como viscosizantes, tampones de pH, etc) o sólida (el sistema incluyendo las nanopartículas liofílizadas o atomizadas formando un polvo que se puede utilizar para elaborar granulados, comprimidos o cápsulas) para su administración bien por vía oral, bucal o sublingual, bien tópica, o bien en forma líquida o semisólida para su administración por vía transdérmica, ocular, nasal, vaginal o bien parenteral. En el caso de las vías no parenterales el contacto de las nanopartículas con la piel o mucosas podrá mejorarse dotando a las partículas de una importante carga positiva, lo que favorecerá su interacción con las citadas superficies cargadas negativamente. En el caso de las vías parenterales, más en concreto para la administración intravenosa, estos sistemas ofrecen la posibilidad de modular la distribución in vivo de los fármacos o moléculas que puedan llevar asociadas. Pueden ser también suspensiones en fluidos biológicos, tales como el suero. Las suspensiones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes microbianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como acido alginico o almidón de maíz, etc.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico. Preferentemente la administración será parenteral. En otra realización preferida, la administración será tópica.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización aún más preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. Dicho principio o principios activos adicionales pueden estar incluidos en el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención o formar parte de la composición farmacéutica de la invención sin ser parte del sistema de transporte.
Esta invención también se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad que puede ser prevenida con la administración de un agente terapéutico a un paciente que sufre dicha enfermedad. Preferiblemente este método comprende la administración a un individuo de la cantidad terapéuticamente efectiva de la composición.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención, en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, al sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, o la composición farmacéutica de la invención para su uso en la elaboración de un medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la tripanosomiasis, o alternativamente, al sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, o la composición farmacéutica de la invención para la prevención o el tratamiento de la tripanosomiasis.
La tripanosomiasis es una enfermedad parasitaria causada por protozoos del género Trypanosoma. El género Trypanosoma pertenece al superreino Eukaryota, orden Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae.
En otra realización preferida, el Trypanosoma es el T. brucei. T. brucei pertenece al superreino Eukaryota, orden Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae, género Trypanosoma y subgénero Trypanozoon. La tripanosomiasis africana, también denominada enfermedad del sueño cuando afecta a humanos, y nagana o n'gana cuando afecta a animales, es una enfermedad causada por parásitos de la especie Tripanosoma brucei.
Se han descrito tres subespecies:
T. b. gambiense, que causa la tripanosomiasis africana crónica de inicio lento.
T. b. rhodesiense, que causa la tripanosomiasis africana aguda de inicio rápido.
T. b. brucei, que causa la tripanosomiasis animal africana (o nagana), al igual que otras especies de tripanosomas.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la tripanosomiasis es causada por un Trypanosoma que se selecciona de la lista que consiste en: T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, T. brucei brucei, T. congo tense, T. vivax, T evansi y Trypanosoma equiperdum. Más preferiblemente dicho tripanosoma es el T brucei.
KIT DE DIAGNÓSTICO Y USOS
Algunos nanosistemas, como el sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, permiten el desarrollo de novedosas, promisorias y fascinantes posibilidades de la nanotecnología en el diagnóstico y tratamiento médicos. Los nanodispositivos utilizados como agentes de contraste en la imaginología médica (especialmente, en resonancia magnética, ecografía y tomografía) tienen claras ventajas sobre los agentes tradicionales en cuanto a mejor dispersión óptica, incremento de la biocompatibilidad, disminución en la probabilidad de desnaturalización y, especialmente, su capacidad de unirse a ligandos, lo cual los convierte en dispositivos con múltiples funciones que se unen a las células blanco, permiten la imagen para el diagnóstico y acarrean medicamentos, permitiendo un tratamiento específico y eficientes posibilidades de la nanotecnología en el diagnóstico.
Así, la composición de la invención, adicionalmente puede comprender un marcador detectable. Un "marcador detectable" se refiere a cualquier marcador que se puede usar para localizar la composición in vivo o in vitro. Ejemplos de marcadores, pero sin limitarse a estos, serian fluoroforos, marcadores químicos o proteicos que permiten la visualización de un polipéptido. La visualización puede realizarse a simple vista o mediante un aparato (como por ejemplo, pero sin limitarse a un microscopio) y puede implicar una fuente de energía o de luz.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo de diagnóstico, que comprende un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, o una composición farmacéutica de la invención.
Los términos molécula biológicamente activa, fármaco o agente terapéutico, o marcador detectable, tienen significados análogos y se utilizan indistintamente en la memoria de esta invención. Se refieren a cualquier sustancia que proporcione actividad farmacológica y se emplea en el tratamiento, cura, prevención o diagnosis de una enfermedad o que se emplea en el diagnostico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. Estas moléculas biológicamente activas pueden incluir desde fármacos de bajo peso molecular hasta moléculas del tipo de polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos y ácidos nucléicos y combinaciones de las mismas. Estas moléculas, son bien conocidas para el experto en la material y incluye el significado de un compuesto que tiene las características que lo hacen aceptables para su uso en medicina, por ejemplo y sin limitarse al principio active en un medicamento. Por lo tanto, por ejemplo y sin limitarse a, estas moléculas pueden ser sintetizados por diferentes técnicas de química orgánica, o técnicas de biología molecular y bio química. Los términos aquí utilizados se entienden como cualquier compuesto que es administrado a un paciente para el tratamiento de una afección y que puede atravesar la membrana celular más eficientemente cuando esta unido a la nanopartícula de la invención que cuando es administrado sin la nanopartícula del a invención. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. El agente terapéutico incluye pero no está limitado a compuestos hidrofílicos y hidrofóbicos. Según esto, los agentes terapéuticos contemplados en esta invención incluyen aunque no se limitan a moléculas tipo fármaco, proteínas, péptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros y moléculas pequeñas. Un agente terapéutico proteína incluye pero sin limitar a péptidos, enzimas, proteínas estructurales, receptores, y otras proteínas circulantes o celulares así como fragmentos y derivados de los mismos cuya expresión aberrante dan pie a uno o más afecciones medicas. Un agente terapéutico también incluye compuestos quimioterapéuticos y materiales radioactivos,
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, pero, sexo, tolerancia,... del mamífero. La "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de principio activo, o de sus sales, pro-fármacos, derivados o análogos o de sus combinaciones, que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos pro-fármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
El término "excipiente" hacer referencia a una sustancia que ayuda a la absorción o distribución o acción de cualquiera de los principios activos de la presente invención, estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azucares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución del os componentes y su absorción en el intestino sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El termino excipiente "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a que el excipiente este permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, un expediente que permita la actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente invención.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.
El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a los principios activos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mayor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es liquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente
El término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto químico, por ejemplo un peptidomimético que se puede derivatizar o cualquier otro compuesto orgánico de bajo peso molecular, natural o sintético. Dichas moléculas pequeñas pueden ser sustancias terapéuticamente transportadas o pueden ser derivatizadas para facilitar el transporte Se entiende por "peso molecular bajo" compuestos cuyo peso molecular es menor de 1000 Daltons, normalmente entre 300 y 700 daltons. PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DEL SISTEMA PARA EL TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas de la invención, de ahora en adelante procedimiento de la invención, que comprende: a) la preparación de un copolímero en una disolución acuosa del conjugado quitosano-polímero;
b) la precipitación de las nanopartículas de quitosano-polímero, c) la incorporación de la molécula biológicamente activa y/o del polipéptido o proteína mediante agitación mecánica.
La incorporación de la molécula biológicamente activa y/o del polipéptido o proteína mediante agitación mecánica puede hacerse incorporando primero la molécula biológicamente activa mediante agitación mecánica, y posteriormente se incorpora el polipéptido o proteína mediante agitación mecánica.
Por tanto, en una realización preferida de este aspecto, en el procedimiento de la invención primero se incorpora la molécula biológicamente activa mediante agitación mecánica, y posteriormente se incorpora el polipéptido o proteína mediante agitación mecánica. En otra realización preferida, primero se incorpora el polipéptido o proteína mediante agitación mecánica, y posteriormente se incorpora la molécula biológicamente activa mediante agitación mecánica.
El primer paso en la preparación de las nanopartículas es la síntesis del copolímero quitosano-polimero. Preferentemente, esta se realiza mediante cross-coupling mediante técnicas conocidas para el experto en la materia como la descrita en el ejemplo 1 .
La molécula biológicamente activa y el Nanobody se unen al sistema transportador directamente y de forma independiente, pudiendo ser esta unión indistintamente covalente o no covalente. De manera que el polipéptido se encuentra unido a la nanoparticula covalentemente. Primero se introduce un grupo reactivo en el PEG (N-hydroxysuccinimide (NHS). Este grupo reactivo reaciona con las aminas primarias presentes en la proteína y se une covalentemente a ellas. El resultado final es la unión de la nopartícula y la proteína. El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
En el contexto de la presente invención, el término "prevención y/o tratamiento" no solo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino que generalmente también comprende prevenir el comienzo de la enfermedad, mostrando o revirtiendo su progresión, previniendo o mostrando el comienzo de uno más síntomas asociados a la enfermedad, reduciendo y/o aliviando dichos síntomas, reduciendo la severidad y/o la duración de la enfermedad y/o los síntomas asociados a ella y previniendo un futuro aumento del a severidad de la enfermedad y/o los síntomas asociados con ella, previniendo, reduciendo o revirtiendo los daños fisiológicos causados por la enfermedad, y generalmente cualquier acción farmacológica que es beneficiosa para el paciente Los términos "polipéptido", "péptido" o "proteína" se usan indistintamente en esta memoria.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo y para complementar esta descripción, se acompaña como parte integrante de la misma un juego de dibujos, cuyo carácter es ilustrativo y no limitativo.
FIG. 1. Caracterización de las nanopartículas de quitosano funcionalizadas superficialmente con PEG y "Nanobody", y cargadas con pentamidina mediante HRTEM (a) y FeSEM (b). Longitud de barra: 50 nm.
FIG. 2. Potencial zeta (£ mV) de nanopartículas cargadas con (·), o sin pentamidina (o), en función del pH (a) y en función de la concentración de KN03 (b).
FIG. 3. Liberación de pentamidina (%) en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2P04 (pH = 7.4 ± 0.1 ) a 37.0 ± 0.5 eC. FIG. 4. Parasitemia. El número de parásitos por mililitro de sangre frente a los días post-infección. El recuento se realizó en cámara de Neubauer.
FIG. 5. Estudio de supervivencia. Porcentaje de supervivencia frente a los días post- infección.
FIG.6. Imagen de microscopía de electrónica de barrido de las nanopartículas de PLGA. FIG.7. Efectividad del nanotransportador de fármacos Nb-pentamidina-PLGA. Eje X: porcentaje de supervivencia; eje Y: días post-infección.
EJEMPLOS
Para validar el sistema de trasporte de moléculas biológicamente activas auto dirigido de aplicación general que consiste en nanopartículas de polímero quitosano funcionalizadas con polietilenglicol y Nanobody se ha empleado para el tratamiento de la tripanosomiasis africana también llamada enfermedad del sueño [Baral et al., 2006. Nat Med. 2006;12:580-4]. Para ello se ha utilizado el Nanobody An33, que reconoce específicamente el parásito T. brucei, que es el causante de la enfermedad y el fármaco pentamidina, que se emplea en el tratamiento de la misma.
EJEMPLO 1 : Preparación de las nanopartículas funcionalizadas con PEG y Nanobody An33 y encapsuladas con pentadimina.
Como primer paso se realiza la síntesis del copolímero quitosano-polietilenglicol disolviendo bajo agitación clorhidrato de quitosano en agua bidestilada, y metoxi- polietilenglicol (MeO-PEG-CH2C02l-l) y A/-hidroxisuccinimida (NHS). Finalmente, y bajo agitación se adiciona lentamente 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), manteniendo la agitación durante 22 horas a temperatura ambiente. Por último, la solución se somete a un proceso de ultrafiltración y posterior liofilización.
A continuación se sintetizaron las nanopartículas mediante un método de coacervación que no precisa de disolventes orgánicos. Para ello se adiciona sulfato sódico a una solución de copolímero de quitosano-polietilenglicol en ácido acético. Como consecuencia de la reducción de la hidrosolubilidad del polímero, se produce la rápida precipitación del copolímero en forma de nanopartículas. Brevemente, se disolvió una cantidad suficiente de quitosano-polietilenglicol en agua bidestilada a una concentración final del 1 % (m/V). En la disolución resultante se disolvió también una cantidad adecuada de poloxámero (por ejemplo, pluronic® F-68) y de pentamidina a una concentración final del 1 % (m/V) y 0.01 M, respectivamente. A continuación, se añadió una solución acuosa de sulfato sódico al 20 % (m/V) despacio (velocidad: 0.5 mL/minuto) y bajo agitación mecánica (2000 r.p.m.) a la solución de copolímero y fármaco. Esta agitación mecánica se mantuvo durante una hora más para asegurar la formación de las nanopartículas de quitosano con cadenas de polietilenglicol (PEG) a nivel superficial, y cargadas con pentamidina. Finalmente, las nanopartículas fueron limpiadas mediante centrifugación y redispersión del sedimento en agua bidestilada hasta que la conductividad del último sobrenadante obtenido fue < 10 με/οηι.
Finalmente, se añadió una solución de Nanobody® de concentración 1 mg/mL a la suspensión de nanopartículas de quitosano-PEG cargadas con pentamidina y se la disolución se mantuvo en agitación mecánica durante 3 horas a 25.0 ± 0.5 eC. Tras este periodo de tiempo se añadió un volumen de de tampón fosfato salino (pH = 7.4) a la suspensión y se llevó a cabo un único proceso de centrifugación durante 30 min a 1 1 ,000 r.p.m. en una centrífuga de alta velocidad, Centrikon T-124 (Kontron, París, France).
La caracterización fisicoquímica de las nanopartículas se estudio mediante diversas técnicas, que incluyen microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) y espectroscopia de correlación de fotones (PCS) para la determinación de la geometría y tamaño de las nanopartículas, tal y como se muestra en la figura 1 , obteniéndose valores de diámetro medio en torno a los 130 nm, el cual facilitara una correcta biodistribución por vía parenteral (Decuzzi et al., 2009. Pharmaceutical Research, 26(1 ), 235-243).
Las propiedades eléctricas superficiales se estudiaron mediante electroforesis evaluando el tipo de absorción de pentamidina en la nanopartícula. Se utilizó la teoría de O'Brien and White (O'Brien et al., 1978. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions 2: Molecular and Chemical Physics, 74, 1607-1624) para transformar los datos experimentales obtenidos de movilidad electroforética (ue) en valores de potencial zeta (ζ). Los resultados relativos a esta cuantificación se muestran en la Fig. 2 indicaron homogeneidad de valores de potencial zeta indicando que la pentamidina se encuentra atrapada eficientemente en el interior de la matriz de las nanopartículas.
La cuantificación de la cantidad de pentamidina incorporada en las nanopartículas se realizo mediante espectrofotometría ultravioleta-visible. La cantidad de fármaco incorporado se expresó en términos de eficacia de atrapamiento {entrapment efficiency, EE) (%) [(pentamidina vehiculizada (mg) / cantidad total de pentamidina utilizada (mg)) x 100] y de carga de fármaco (drug loading, DL) (%) [(pentamidina vehiculizada (mg) / masa total utilizada de nanopartículas (mg)) x 100] ). Los resultados relativos a esta cuantificación se muestran en la tabla 1 .
Tabla 1. Eficacia de atrapamiento de pentamidina (EE, %) y carga de fármaco (DL, %).
Figure imgf000026_0001
Los ensayos de liberación del fármaco se realizaron mediante el método de diálisis y un tampón NaOH-KH2P04 (pH = 7,4 ± 0,1 ) como medio de liberación. Para ello se utilizaron bolsas de diálisis de tamaño de poro de 2000 Da (Spectrum® Spectra/Por® 6) que retiene las nanopartículas y deja pasar la pentamidina al medio de liberación. La cuantificación de la pentamidina liberada se realizo también mediante espectrofotometría ultravioleta-visible tal y como se muestra en la Fig. 3. EJEMPLO 2: Especificidad y efectividad de nanopartículas de quitosano funcionalizadas con PEG y Nanobody An33 en el reconocimiento especifico del parásito Tripanosoma brucei.
Como primer paso se determino la media (el 50%) de la concentración inhibitoria máxima (IC del 50%, o del IC50) de la pentadimina en T. brucei ce a AnTat1 .1 y en R25, una cepa resistente a pentamidina creada en el laboratorio. Parásitos en fase de crecimiento exponencial se recogieron y se prepararon a una densidad inicial de 2 x 105 tripanosomas por ml_. Los pocilios, de una placa de cultivo de 96 pocilios, fueron preparados con 50 μΐ de dobles diluciones seriadas de los diferentes tratamientos a testar. Éstos pocilios se inocularon con 50 μΐ de cultivo de tripanosomas anteriormente preparado, a excepción de los pocilios de dos filas que recibieron solamente medio de cultivo para actuar como blancos. Se probaron once puntos correspondientes a once diluciones, abarcando desde los 680 μΜ de máxima concentración hasta 165 pM de mínima concentración siempre referidos a concentración final de pentamidina. Los parásitos se incubaron durante 20 horas a 37° C y 5 % de C02. A continuación, 20 μΐ de 0,5 mM del colorante resarzurin sódico (Sigma, R701 7) se añadieron a cada pocilio y la placa se incubó durante otras 4 h. La reacción se detuvo añadiendo 50 μΐ de dodecil sulfato sódico (SDS) 3% y la placa se leyó en un lector Tecan Infinite F200 (Tecan Austria GmbH, Austria) usando una longitud de onda de excitación de 535 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Cada ensayo fue realizado con seis réplicas por punto de concetración y se repitió entre 3-6 veces. La IC50, definida como la concentración de fármaco necesaria para disminuir la producción de fluorescencia en un 50%, se calculó utilizando GraphPad Software Prism5. La tabla 2 muestra los resultados obtenidos que revelaron que las nanopartículas funcionalizadas con PEG y Nanobody cargadas con pentamidina reducen de manera considerable la IC50 en comparación con el fármaco solo.
Tabla 2. IC50 obtenidos en las cepas de T. brucei AnTatl .1 y R25.
Nanobody no afecta
NP(quitosano) vacía no afecta
Nb-NP(Quitosano) vacía no afecta
Pentamidina 9.58±0.27 nM
NP(Quitosano)-pentamidina 1 .94±0.1 2 nM (4.93 veces)
Nb-NP(Quitosano)-pentamidina 0.69±0.02 nM (13.83 veces) EJEMPLO 3: Efectividad del trasportador Nanobody-NP (quitosano)-pentamidina en el tratamiento de tripanosomiasis africana.
Se empleo un modelo de ratón de tripanosomiasis africana en fase aguda. Para ello, ratonas hembras de la cepa C57BL/6J de 8 semanas de edad fueron infectadas, por vía intraperitoneal (i.p.), con 10.000 parásitos de la cepa monomórfica AnTat1 .1 de T. brucei. A los 3 días post-infección se comprobó la infección de manera visual mediante la detección de parásitos en sangre extraída por punción venosa de la cola. En ese momento, los ratones se separaron al azar, en jaulas independientes, en grupos de 5 individuos y se inició el tratamiento. El tratamiento consistió en 4 dosis en 4 días consecutivos mediante inyección intraperitoneal. Se establecieron 7 grupos:
• Grupo control: administración de suero salino.
• Grupo control: administración de Nb-NP (quitosano)-vacía.
· Grupo pentamidina: 2.5 mg/ Kg. 4 dosis i.p.
• Grupo pentamidina: 0.25 mg/Kg. 4 dosis i.p.
• Grupo pentamidina: 0.025 mg/Kg. 4 dosis i.p.
• Grupo Nb-NP (Quitosano)-pentamidina: 0.25 mg/Kg. 4 dosis i.p.
• Grupo Nb-NP (Quitosano)-pentamidina: 0.025 mg/kg 4 dosis i.p.
Las variables estudiadas en el procedimiento fueron la parasitemia (millones de parásitos/mililitro de sangre) y la supervivencia.
La parasitemia de los individuos de todos los grupos de estudio fue seguida diariamente desde el día 3 post-infección hasta 1 día después de la muerte de los animales de los 2 grupos controles. Posteriormente, no se realizó el seguimiento de la parasitemia hasta que se produjo la muerte de algún animal con el objeto de asegurar que la muerte del animal había sido causada por la infección por T. brucei. La Fig. 4 muestra los resultados de este experimento. Brevemente, la parasitemia del grupo control "suero salino" y del grupo control "Nb-NP (quitosano)-vacía" produjo la muerte de todos los animales al día 6 post-infección. El grupo "pentamidina 0.025 mg/Kg, 4 dosis i.p." sufrió un retraso de un día en la aparición del pico de máxima de parasitemia, y en el grupo pentamidina 0.25 mg/Kg la parasitemia desapareció el día 6 post-infección tras la 3e dosis del tratamiento y en el grupo pentamidina 2.5 mg/Kg el día 4 post-infección tras la 1 e dosis. Sin embargo, en el caso del grupo "Nb-NP (Quitosano)-pentamidina 0.025 mg/Kg, la parasitemia desapareció el día 5 postinfección tras la 2- dosis del tratamiento y el grupo "Nb-NP (Quitosano)-pentamidina 0.25 mg/Kg. el día 4 post-infección tras la 1 e dosis de tratamiento, no volviendo aparecer en el transcurso del experimento. El estudio de supervivencia que se muestra en la Fig.5 se llevó a cabo durante 50 días post-infección. En el caso de los grupos tratados con pentamidina, los individuos tratados con 0.025 mg/Kg (1 00 veces inferior a la dosis curativa de la pentamidina) murieron entre los días 7-1 2 post-infección. Los individuos tratados con pentamidina 0.25 mg/Kg solamente sobrevivió un 20% de los individuos, iniciándose la contabilización de bajas a partir del día 21 post-infección. El 100 % de los individuos tratados con pentamidina a la dosis curativa 2.5 mg/kg sobrevivieron. En el caso de los grupos tratados con Nb-NP (Quitosano)-pentamidina, sobrevivieron todos los individuos, tanto los tratados con una dosis 10 veces inferior como los tratados con una dosis 100 veces inferior a la dosis curativa de pentamidina.
Este ensayo pone de manifiesto que el transporte de pentamidina mediante la nanopartícula de quitosano funcionalizada con Nanobody An33 mejora la efectividad de este fármaco disminuyendo 100 veces la dosis curativa del mismo, lo que posibilita la incorporación del fármaco en la nanopartícula a concentraciones mucho menores que las empleadas en formulaciones convencionales del estado de la técnica.
EJEMPLO 4. Nanopartículas de PLGA cargadas con pentamidina y recubiertas de un nano-anticuerpo (NbAn33) (Nb-Pentamidna-PLGA-Np). El poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) es un polímero versátil ampliamente utilizado en aplicaciones biomédicas, incluyendo la encapsulación de fármacos a través de la formulación de nanopartículas. El PLGA tiene propiedades atractivas para su uso en biomedicina. Es biodegradable y biocompatible, degradándose en el hígado a ácido láctico. El polímero PLGA está aprobado por la FDA y la Agencia Europea de Medicamentos para administración parenteral. Las formulaciones y los métodos de síntesis de nanopartículas de PLGA están bien estandarizados y las nanopartículas son adaptables a diferentes tipos de fármacos y vías de administración. Síntesis y caracterización de las nanopartículas
La síntesis de las nanopartículas del PLGA cargadas de pentamidina se realizó en un medio consistente en fase orgánica/fase acuosa/fase orgánica (w/o/w), mediante un método de doble emulsión y evaporación del solvente (DE/SEV). La pentamidina se incorporó junto con el PLGA en la fase orgánica (acetato de etilo). La emulsión se obtuvo añadiendo ácido pluronico F-68 como tensioactivo bajo fuerte agitación mecánica (20.000 rpm). Esta emulsión se vertió en una solución acuosa de alcohol polivinílico (PVA) bajo fuerte agitación (20.000 rpm) para obtener finalmente una emulsión w/o/w. La agitación es un parámetro crítico en la preparación de nanopartículas de PLGA por esta metodología DE / SEV ya que determina el tamaño final de partícula. Una velocidad de agitación muy alta (20.000 rpm) con un agitador de barilla genera el tamaño de partícula óptimo (100-200 nm). El disolvente orgánico se evaporó durante la noche a 25 ° C bajo agitación suave (1000 rpm). A continuación, la suspensión coloidal resultante se lavó varias veces por centrifugación (1 1 .000 rpm) y re-dispersado en agua hasta que se detectó baja conductividad en sobrenadante. Los grupos carboxilo en la superficie de las nanopartículas de PLGA se funcionalizaron con un tampón isotónico de 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) en solución salina (pH 5,5). A continuación se añadió polietilenglicol PEG activado como HCI · NH2-PEG- COOH (Mw: 3.400 Da) y se dejó reaccionar a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,5). El PEG no unido se eliminó mediente lavado con PBS (pH 7,5). Por último, el nano-anticuerpos se conjugó a las nanopartículas PLGA-b-PEG a temperatura ambiente en PBS (pH 7,5) bajo agitación suave (200 rpm). Después de la reacción, las nanopartículas se lavaron con PBS (pH 7,5) para eliminar la nanocuerpos no unido. El tamaño medio de las nanopartículas obtenido fue de: 145 ± 35 nm (Figura 1 ) y a concentración máxima pentamidina cargada, expresada como eficiencia de encapsulación y la capacidad de carga del fármaco, fue del 72% (SD ± 6). Ensayo de funcionalidad in vitro de la nanopartícula de PLGA cargada con pentamidina y recubierta con el nanobody NbAn33.
Para determinar la funcionalidad in vitro del sistema de transporte de fármacos Nb- Pentamidna-PLGA-Np se calculó la media (el 50%) de la concentración inhibitoria máxima (IC del 50%, o del IC50) tal y como se describe en el ejemplo 2. Tabla 3. IC50 obtenidos en la cepa Antat 1.1.
Figure imgf000031_0001
Efectividad del trasportador Nanobody-NP (quitosano)-pentamidina en el tratamiento de tripanosomiasis africana.
Se empleó un modelo de ratón de tripanosomiasis africana en fase aguda y se siguió el procedimiento descrito en el ejemplo 4 de esta solicitud.
La Fig. 7 muestra los resultados de este experimento. Brevemente, la parasitemia del grupo control "suero salino" y del grupo control "Nb-NP (PLGA)-vacía" produjo la muerte de todos los animales al día 5 post-infección. El estudio de supervivencia que se llevó a cabo durante 50 días post-infección. En el caso de los grupos tratados con pentamidina, los individuos tratados con 0.025 mg/Kg (100 veces inferior a la dosis curativa de la pentamidina) murieron entre los días 15-19 post-infección. Los individuos tratados con pentamidina 0.25 mg/Kg murieron entre los dias 24-27 postinfección. El 100 % de los individuos tratados con pentamidina a la dosis curativa 2.5 mg/kg sobrevivieron. En el caso de los grupos tratados con Nb-NP (PLGA)- pentamidina, sobrevivieron todos los individuos tratados con una dosis 10 veces inferior y un 60% de los tratados con una dosis 100 veces inferior a la dosis curativa de pentamidina.
Este ensayo pone de manifiesto que el transporte de pentamidina mediante la nanopartícula de PLGA funcionalizada con Nanobody An33 mejora la efectividad de este fármaco disminuyendo significativamente la dosis curativa del mismo, lo que posibilita la incorporación del fármaco en la nanopartícula a concentraciones mucho menores que las empleadas en formulaciones convencionales del estado de la técnica.

Claims

REIVINDICACIONES
Un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas que comprende:
a. una nanopartícula,
b. un polipéptido o proteína que comprende
i. un Nanobody,
¡i. un anticuerpo de dominio,
Ni. o un anticuerpo de dominio simple o "dAb" , y
c. una molécula biológicamente activa, agente terapéutico o fármaco.
El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde el transporte del fármaco es significativamente menor en ausencia del polipéptido o proteína que cuando está presente en el sistema.
El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde el agente terapéutico y el polipéptido o proteína se unen a la nanopartícula de manera independiente.
El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde la unión del agente terapéutico y el polipéptido o proteína a la nanopartícula puede ser covalente o no covalente.
El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación 4, donde la unión no covalente se realiza mediante interacciones electrostáticas, adsorción superficial o encapsulacion o intercalado en el interior de la misma.
El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, donde la nanopartícula comprende quitosano y un polímero.
7. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde el polímero se selecciona de la lista que consiste en: polietileneimina (PEI), poli (lisina) (PLL), poli(2-dimetil-amino)etil metacrilato (pDMAEMA), chitosan, polipéptidos con aminas primarias, polipéptidos con histidinas, ácido poliláctico (PLA), copolimeros de ácido poliláctico/glicólico (PLGA), polietilenglicol (PEG), poli[[Lambda]/-(2-hidroxipropil)metacrilamida] (PHPMA), o cualquiera de sus combinaciones.
8. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde el polímero es polietilenglicol (PEG)
9. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde el quitosano tiene un peso molecular entre 7 y 1200 kDa.
10. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde el quitosano tiene un peso molecular de entre 50 y 190 KDa. 1 1 . El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde el PEG es un PEG modificado que presenta una fórmula (II):
X1 -(0-CH2-CH2)n-0-X2
Fórmula (II)
donde X1 es un grupo protector del grupo hidroxilo, X2 es un hidrógeno o un grupo protector que permita el anclaje a los grupos amino del quitosano.
12. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde X1 es un grupo alquilo, preferentemente metilo. 13. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 -12, donde X2 es un grupo carboxilo.
14. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 -13, que comprende 1 parte de quitosano por cada 4, 3, 2 ó 1 partes de PEG.
15. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, donde la molécula biológicamente activa es capaz de diagnosticar, curar, mitigar, tratar o prevenir una enfermedad.
16. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, donde la molécula biológicamente activa se selecciona de entre moléculas de bajo peso molecular, polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos, ácidos nucléicos y combinaciones de las mismas.
17. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -16, donde la molécula biológicamente activa es una molécula de bajo peso molecular.
18. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, que comprende más de una molécula biológicamente activa.
19. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18, donde la molécula biológicamente activa es un agente terapéutico de bajo peso molecular.
20. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -19, donde la molécula biológicamente activa es hidrofílica.
21 . El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, donde la molécula biológicamente activa es hidrofóbica.
22. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -21 , donde la molécula biológicamente activa es pentamidina.
23. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -22, donde la unión de la molécula biológicamente activa a la nanoparticula es no covalente.
24. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde la unión de la molécula biológicamente activa a la nanopartícula es mediante una encapsulación o intercalado en el interior de la misma.
25. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -24, que adicionalmente comprende uno o más aditivos y/o agentes farmacológicamente aceptables.
26. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -25, donde el polipeptido o proteína vehiculiza selectivamente el fármaco hacia la respectiva diana molecular.
27. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -26, donde el polipeptido o proteína es un Nanobody, anticuerpos de dominio, o anticuerpos de dominio simple o dAb.
28. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -27, donde dicho Nanobody, anticuerpo de dominio o anticuerpo de dominio simple o "dAb" derivan de un dominio VH o VHH.
29. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -28, donde dicho Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb derivan de un dominio VH o VHH de humano o camélido.
30. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -29, donde dicho Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb se dirige contra una proteína en sangre.
31 . El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -30, donde el polipéptido o proteína que comprende un único Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb que permite al sistema transportador resultante dirigirse hacia su diana especifica penetrando y/cruzando la membrana mucosal y/o la barrera hematoencefálica o uniéndose a una proteína en sangre.
32. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -31 , donde dicho Nanobody, anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio simple o dAb reconoce específicamente la superficie de Tripanosoma brucei.
33. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -32, donde el poliéptido o proteína comprende un Nanobody.
34. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -33, donde el poliéptido o proteína comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 .
35. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación 33, donde el polipéptido o proteína comprende el Nanobody An33.
36. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, donde el tamaño medio de las nanopartículas está comprendido entre 1 y 1000 nanómetros.
37. El sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivinidicación 36, donde el tamaño medio de las nanopartículas está comprendido entre 70 y 130 nm.
38. Una composición farmacéutica que comprende un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 -37.
39. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
40. El uso de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -37, o de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 38-39, en la elaboración de un medicamento.
41 . El uso de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -37, o de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 38-39, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de tripanosomiasis.
42. El uso de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación 41 , donde la tripanosomiasis es latripanosomiasis africana.
43. Un kit o dispositivo de diagnóstico, que comprende un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -37, o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 38-39.
44. Un procedimiento de obtención de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -37, que comprende: a) preparación de un copolímero en una disolución acuosa del conjugado quitosano-polímero; b) precipitación de las nanopartículas de quitosano-polímero, c) incorporación de la molécula biológicamente activa y/o del polipéptido o proteína mediante agitación mecánica
45. El procedimiento de obtención de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde primero se incorpora la molécula biológicamente activa mediante agitación mecánica, y posteriormente se incorpora el polipéptido o proteína mediante agitación mecánica.
46. El procedimiento de obtención de un sistema para el transporte de moléculas biológicamente activas según la reivindicación 44, donde primero se incorpora el polipéptido o proteína mediante agitación mecánica, y posteriormente se incorpora la molécula biológicamente activa mediante agitación mecánica.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007039645A1 (en) * 2005-10-06 2007-04-12 Vib Vzw African trypanosomiasis therapy with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor
US20110268805A1 (en) * 2008-10-12 2011-11-03 Frank Alexis Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007039645A1 (en) * 2005-10-06 2007-04-12 Vib Vzw African trypanosomiasis therapy with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor
US20110268805A1 (en) * 2008-10-12 2011-11-03 Frank Alexis Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENOIT STIJLEMANS ET AL.: "High affinity nanobodies against the Trypanosome brucei VSG are potent trypanolytic agents that block endocytosis", PLOS PATHOGENS, vol. 7, no. 6, 1 June 2011 (2011-06-01), SAN FRANCISCO, CA, US, pages E1002072.1 *
BROCETA J D U ET AL.: "Nanobody-coated nanoparticles strongly reduce trypanocidal pentamidine curative dose and defeat drug resistance", FEBS JOURNAL, vol. 279, no. SUPPL., 1 September 2012 (2012-09-01), pages 355 *
DATE ET AL.: "Parasitic diseases: Liposomes and polymeric nanoparticles versus lipid nanoparticles", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 59, no. 6, 10 July 2007 (2007-07-10), pages 505 - 521 *

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