WO2014021267A1 - 生体内アセチルコリン産生促進装置 - Google Patents

生体内アセチルコリン産生促進装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2014021267A1
WO2014021267A1 PCT/JP2013/070492 JP2013070492W WO2014021267A1 WO 2014021267 A1 WO2014021267 A1 WO 2014021267A1 JP 2013070492 W JP2013070492 W JP 2013070492W WO 2014021267 A1 WO2014021267 A1 WO 2014021267A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pump
cells
pressure
artery
chat
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/070492
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
由彦 柿沼
英俊 池
Original Assignee
国立大学法人高知大学
株式会社カンキョー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人高知大学, 株式会社カンキョー filed Critical 国立大学法人高知大学
Priority to SG11201500759PA priority Critical patent/SG11201500759PA/en
Priority to JP2014528147A priority patent/JPWO2014021267A1/ja
Publication of WO2014021267A1 publication Critical patent/WO2014021267A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/12—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets for ligaturing or otherwise compressing tubular parts of the body, e.g. blood vessels, umbilical cord
    • A61B17/132—Tourniquets
    • A61B17/135—Tourniquets inflatable
    • A61B17/1355—Automated control means therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/12—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets for ligaturing or otherwise compressing tubular parts of the body, e.g. blood vessels, umbilical cord
    • A61B17/132—Tourniquets
    • A61B17/1322—Tourniquets comprising a flexible encircling member

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for promoting acetylcholine production in vivo.
  • Acetylcholine is an acetate ester of choline and is a substance that is released from the end of parasympathetic nerves and motor nerves in response to stimulation and becomes an excitatory transmitter (neurotransmitter) at the synapse and end plate.
  • Acetylcholine exhibits physiological actions such as blood pressure lowering, heart depression (decrease in heart rate), intestinal contraction, and skeletal muscle contraction.
  • acetylcholine bound to the acetylcholine receptor is hydrolyzed into choline and acetic acid by acetylcholinesterase or cholinesterase, and the muscle relaxes.
  • Cholinesterase inhibitors that increase acetylcholine levels in vivo are known to be used to prevent, treat or improve senile dementia, cerebrovascular dementia, attention deficit hyperactivity disorder, glaucoma, myasthenia gravis or migraine (Patent Document 1).
  • Acetylcholine also stimulates the parasympathetic nerves to create a relaxed state, lowering blood pressure and lowering heart rate, thus eliminating hypotension and insomnia, as well as impaired glucose tolerance during sympathetic nervous system enhancement. It is also useful to suppress the increase in blood glucose level due to induction.
  • cholinesterase inhibitors that increase the concentration of acetylcholine in vivo are well studied, and various compounds are known. However, no device that promotes the production of acetylcholine in vivo is known at all.
  • An object of the present invention is to provide a device that promotes the production of acetylcholine in vivo.
  • a device capable of repeating the ischemia-reperfusion cycle of the limb arteries can promote the production of acetylcholine in vivo.
  • the present invention is in contact with any part of the extremity and is connected to the arterial compression member that compresses the artery at that part when pressed, and pressurizes the arterial compression member during use.
  • an in vivo acetylcholine production promoting device comprising pressurizing means for compressing and blocking the artery and releasing pressurization to reperfuse blood into the artery.
  • the present invention also provides a method for promoting in vivo acetylcholine production, comprising repeating one or more cycles of pressing an artery of an animal to pressurize and then reperfuse blood into the artery.
  • the device of the present invention By applying the device of the present invention to an animal and repeating ischemia-reperfusion of the limb arteries, the production of acetylcholine can be promoted and the concentration of acetylcholine in the living body can be increased. Therefore, by applying the apparatus of the present invention, senile dementia, cerebrovascular dementia, attention deficit hyperactivity disorder, glaucoma, myasthenia gravis or migraine which are the medicinal effects of cholinesterase inhibitors known so far Prevention, treatment or improvement, reduction of blood pressure, elimination of insomnia, creation of a relaxed state, suppression of increase in blood sugar level due to impaired glucose tolerance, and the like. In particular, regarding the blood glucose level, as is apparent from animal experiments using mice described later, the device of the present invention can reduce blood glucose level or suppress increase in blood glucose level.
  • FIG. 1A to FIG. 1C are diagrams showing the results of experiments on choline acetyltransferase (ChAT) gene deletion performed in Example 1 below.
  • ChAT gene deficiency affects intercellular communication through ⁇ -catenin and Cx43.
  • A ChAT knockdown was confirmed in human tubular epithelial cells HEK293 cells by transiently infecting a miR RNAi expression vector specific for ChAT. In transformed cells surrounded by a broken line indicating a GFP signal (green), it was shown that the immunoreactive activity (red) of ChAT was weakened.
  • ChAT KO (knockdown) cells stably transformed with these HEK293 cells have less ⁇ -catenin immune activity observed between cells compared to control LacZ KO cells, Cells were easily dispersed by agitation. In ChAT KO cells, there were fewer ACh immune activity signals seen on the cell membrane.
  • C From the immunocytochemistry and Western blot analysis, in the ChAT KO HL-1 cells, which are HL-1 cells derived from mouse myocardium stably transformed with the miR RNAi expression vector specific for ChAT, the control LacZ KO HL -1 cells were found to have less expression of Cx43.
  • FIG. 2A to FIG. 2E are diagrams showing experimental results relating to ChAT suppression performed in Example 1 described below. Inhibiting cellular ChAT enhances energy metabolism with more oxygen and ATP consumption.
  • A MTT activity is increased in ChAT KO HEK cells (384.8 ⁇ 20.8%, P ⁇ 0 based on control) with low ACh levels (9.3 ⁇ 3.5% based on control) .01), in parallel with this, more oxygen was consumed ( ⁇ 239.4 ⁇ 26.4%, P ⁇ 0.01, relative to the control).
  • ChAT knockdown (KO) HL-1 cells were more sensitive to norepinephrine (NE) -induced cell death.
  • ChAT KO cells produced more reactive oxygen species and showed more red fluorescence due to APF than controls.
  • active caspase-3 was highly expressed under standard conditions (0 hours), and when NE was used, caspase-3 activation was further increased in ChAT KO cells. It is a figure which shows the experimental result regarding the hind limb ischemia-reperfusion performed in Example 1 below.
  • Hindlimb ischemia-reperfusion enhances ChAT and CHT1 expression in the heart as well as the hindlimb with the procedure applied.
  • ischemia-reperfusion By performing ischemia-reperfusion on the left hind limb, protein expression of ChAT and CHT1 increased within 16 hours compared to the right hind limb (R). Concomitant with the increased protein expression in these skeletal muscles, the expression of both ChAT and CHT1 also increased with similar time course in the heart.
  • IR ischemia-reperfusion
  • ChAT activity ChAT activity performed in Example 1 below. Ischemia-reperfusion (IR) treatment protects the heart more from myocardial infarction during ischemic reperfusion loads throughout the heart via ChAT activity.
  • FIG. 6A to FIG. 6D are graphs showing the experimental results regarding the relationship between hindlimb ischemia-reperfusion and cardiac ATP level conducted in Example 1 below.
  • the remote effect of hindlimb ischemia-reperfusion on cardioprotection contributes to the activation of the non-neuronal cholinergic system in the heart that maintains cardiac ATP levels.
  • ATP levels in the heart increased gradually over 16 hours due to IR (256.4 ⁇ 13.1%, 4 h, P ⁇ 0.01 based on IR).
  • B Increase in cardiac ATP levels caused by IR (IR: 11.5 ⁇ 0.9 mM / g protein vs. control: 5.9 ⁇ 0.5 mM / g protein, P ⁇ 0.01) is increased by hemicolinium (HC ) -3 was suppressed by pretreatment with HC-3 (HC-3: 6.4 ⁇ 1.0 mM / 1 g protein, P ⁇ 0.05 based on IR).
  • FIG. 8 is a diagram showing a pressurization-release cycle programmed in the apparatus shown in FIG. 7.
  • FIG. 8 is a diagram showing a pressurization-release cycle programmed in the apparatus shown in FIG. 7.
  • FIG. 8 is a diagram showing changes over time in heart rate when the device shown in FIG. 7 is applied to a plurality of subjects and the ischemia-reperfusion cycle is repeated three times. As a control, the changes over time in the heart rate of subjects who did not undergo the ischemia-reperfusion cycle are also shown.
  • FIG. 8 is a diagram showing changes over time in heart rate when the device shown in FIG. 7 is applied to a plurality of subjects and the ischemia-reperfusion cycle is repeated once. As a control, the changes over time in the heart rate of subjects who did not undergo the ischemia-reperfusion cycle are also shown.
  • Example 3 mice were given a high fat diet, and IR (3 min ischemia 2 min reperfusion repeated 3 times) on the hind limbs were performed daily for 11 days. It is a figure which shows the result of having compared (value).
  • Example 4 that is, a high-fat diet was given to mice, IR (3 minutes ischemia 2 minutes reperfusion repeated 3 times) was performed every other day (Day 0, Day 2, Day 4), IR It is a figure which shows the result of having compared untreated mouse
  • Example 5 that is, a high fat diet was given to mice, and IR (2 minutes ischemia 2 minutes reperfusion repeated 3 times) was different from Example 4 and BS (blood glucose level) was performed every day for 11 days. ).
  • FIG. The results of Example 6 below are the results of comparison of changes in body weight by daily IR (2 minutes ischemia 2 minutes reperfusion repeated 3 times) while ingesting a high fat diet for 7-11 days. is there.
  • Example 1 the inventors of the present invention are designed to occlude the limb by blocking the artery and release the occlusion of the artery after a certain period of blocking to reperfuse. It has been found that the production of acetylcholine in vivo is promoted by repetition (however, in human subjects, it is impossible to directly measure intracardiac ACh, so the heart rate has the effect of reducing heart rate. The parasympathetic nervous system was increased, that is, increased ACh secretion from nerve endings, and thereby increased intramyocardial ACh production). The present invention is based on this new knowledge. That is, the apparatus of the present invention performs ischemia and reperfusion of the limb arteries.
  • the in vivo acetylcholine production promoting device of the present invention includes an arterial compression member that comes into contact with any part of the limb and presses the artery at that part when pressurized.
  • the “any part of the limb” may be an arm or a leg.
  • the upper arm or the elbow may be used.
  • the thigh or the knee may be used.
  • a cuff can be preferably used as the arterial compression member.
  • the cuff is a belt-like bag that wraps around the limb, and is inflated by sending air, and as a result, the limb is tightened and the artery is compressed.
  • the cuff is a well-known cuff that is commonly used in blood pressure measurement, and a well-known cuff can also be used in the present invention. Since the cuff itself is well known and commercially available, a commercially available product can also be used.
  • the arterial compression member is not limited to the cuff, and may be of any configuration as long as the artery can be compressed by being compressed.
  • a belt-like or string-like member is wrapped around the extremities and directly tightened with a motor without sending air, and a ring-like member is composed of two rigid members, and these members are slid with a motor.
  • a device that tightens the limbs inserted into the ring-shaped member by reducing the diameter of the ring-shaped member may be used.
  • the device of the present invention is further connected to an arterial compression member, and in use, pressurizes the arterial compression member to squeeze the arteries for ischemia, and releases the pressurization to reperfuse blood into the arteries.
  • Pressure means may be manually driven and stopped, but if it is automatically driven and stopped, the user can perform other work or watch TV while using the device. Or even sleep, which is convenient and preferable.
  • the pressurizing means has a cycle of pressurization for 1 to 15 minutes and release after the pressurization once or more, preferably 2 to 10 times, more preferably 2 It is preferably programmed to repeat 5 to 5 times.
  • a preferable example includes a pump, an air supply pipe that connects the pump and the cuff, and sends air from the pump to the cuff, and a valve provided in the air supply pipe.
  • the pump is operated to pressurize the cuff, and the valve is opened to release the pressurization.
  • the valve is an electric valve, and the power source of the electric valve and the power source of the pump are connected to the electric valve and the pump via a program relay, respectively.
  • Those programmed to repeat a cycle consisting of pressure and release after pressurization by releasing the electric valve at least once are preferred.
  • the apparatus further comprises a pressure switch connected to the air supply pipe and the program relay, the pressure switch detects a pressure in the air supply pipe, and a signal indicating whether or not the detected pressure is less than a set pressure.
  • the pressure switch detects a pressure in the air supply pipe, and a signal indicating whether or not the detected pressure is less than a set pressure.
  • the pressurization time is 1 minute to 15 minutes
  • the pressurization release time is 1 minute to 15 minutes
  • the cycle is programmed to repeat 2 to 5 times.
  • the set pressure is a pressure required to achieve ischemia (that is, to prevent blood from flowing through the artery) in order to prevent damage to the limb tissue as much as possible, and the pressure as low as possible. Therefore, a pressure about 5 to 10 mmHg higher than the maximum blood pressure of the user is preferable.
  • FIG. 7 schematically shows the configuration of a specific example of the apparatus of the present invention. This specific example will be described below.
  • the specific examples include various numerical values such as the voltage of the power supply, but these numerical values are only preferable numerical values, and other numerical values can be adopted as long as no trouble occurs. is there.
  • 1 is a power switch connected to a home AC power supply (AC100V)
  • 2 is a DC power supply that converts AC100V (AC100V) to DC24V (DC24V) and supplies DC24V
  • DC power supply that converts AC100V to DC6V and supplies DC6V
  • 4 is a pressure switch
  • 5 is a program relay
  • 6 is a pump
  • 7 is an electric valve
  • 8 is an air supply pipe that sends air from the pump 6 to the cuff
  • 9 is a cuff It is.
  • Each of these parts is well-known and a commercial item can be used.
  • each time and the number of repetitions of the ischemia-reperfusion cycle can be appropriately changed.
  • the pump 6 When DC 6 V is supplied, the pump 6 sucks air outside the pump and sends air into the pipe 8 to pressurize the cuff 9. Since the valve 7 opens at 0V and closes at DC6V, the inside of the tube 8 and the cuff 9 is equivalent to the atmospheric pressure at 0V, and is closed to the atmosphere at DC6V.
  • the pressure switch 4 detects the pressure in the cuff 9 via the pipe 8 and sends different signals to the program relay when the atmospheric pressure difference is less than an arbitrary set pressure of +50 to 250 mmHg and above the set pressure.
  • the program relay 5 supplies DC 6V to the pump 6 and the valve 7 in response to a signal less than the set pressure from the pressure switch 4 to pressurize the pipe 8 and the cuff 9. Stops supplying only 6V DC to the pump 6 with a signal exceeding the set pressure (continues 6V DC supply to the valve 7). For this reason, the internal pressure of the cuff 9 is maintained at an arbitrary pressure set in the pressure switch 4.
  • the program relay 5 can simultaneously stop the supply of DC 6V to the pump 6 and the valve 7 to make the internal pressure of the pipe 8 and the cuff 9 equal to the atmospheric pressure.
  • these operations that is, the operation of maintaining the internal pressure of the cuff 9 at the pressure set by the pressure switch 4 and the operation of making it equal to the atmospheric pressure can be repeated in an arbitrary pattern for an arbitrary time.
  • the control program shown in FIG. 8 is written in the program relay 5 of the device of this specific example.
  • the internal pressure of the cuff 9 becomes the pressure set by the pressure switch 4, and the upper arm portion and thigh portion of the subject are tightened to block the blood.
  • the cuff 9 internal pressure is almost equal to the atmospheric pressure and perfuses.
  • Example 1 An animal experiment demonstrating that acetylcholine (Ach) production in vivo is promoted by repeating the ischemia-reperfusion cycle is described as Example 1.
  • Example 1 Method 1 Knockdown of ChAT gene Knockdown of ChAT gene using pcDNA TM 6.2-GW / EmGFP-miR (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif., USA) which is a BLOCK-iT TM Pol II miR RNAi expression vector. Went. Double-stranded oligos were prepared according to the manufacturer's protocol, using commercially desirable and predesigned RNAi sequences specific for human or mouse ChAT, which were subcloned into expression vectors. As a negative control, a negative control expression vector was constructed by subcloning a LacZ-specific RNAi sequence, which is also commercially desirable.
  • HEK293 cells transiently transformed with Effectene transfection regent were examined by immunocytochemical experiments. Stable transformants of the ChAT knockdown expression vector were produced using selective antibiotics suitable for HEK293 cells, ChAT KO HEK cells, HL-1 cells derived from mouse atrial myocardium, and ChAT KO HL-1 cells. Transformed cells were easily detected by GFP expression.
  • Immunocytochemical test Goat anti-ChAT polyclonal antibody diluted 200-fold as primary antibody (MILLIPORE, Billerica, Massachusetts, USA), rabbit anti-catenin polyclonal antibody diluted 200-fold (Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc., Danvers, Massachusetts) USA), rat anti-ACh polyclonal antibody (MILLIPORE) diluted 500-fold, and rabbit anti-Cx43 polyclonal antibody (ZYMED Laboratories Inc., South San Francisco, California, USA), were used for immunocytochemical analysis. After overnight incubation at 4 ° C., the plate was washed with PBS, treated with immunofluorescence bound to the appropriate secondary antibody, and then observed with a laser confocal microscope (OLYMPUS, Tokyo, Japan).
  • ChAT KO HL-1 cells which are HL-1 cells in which ChAT is permanently knocked down. It was. These cells were seeded in a petri dish with a glass bottom (Cyto Graph, Dai Nippon Printing Co., Ltd., Tokyo, Japan) treated so that the cells were arranged in a straight line with a width of 60 m. The cells arranged in a straight line were separated from each other by 200 ⁇ m and formed parallel pattern bands.
  • the linearly aligned cells were scraped vertically with a 27 gauge needle and placed in the center of the area scraped with 1% lucifer yellow dye. After 1 minute, the cells were washed 3 times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes, and then the distance that the dye moved from the scraped area was evaluated with an immunofluorescence microscope.
  • HEK293 cells and H9c2 cells which are myocardial blasts that were naturally immortalized from rat embryos, were cultured in DMEM (Japan, Osaka, Japan) supplemented with 10% FBS and antibiotics. Specifically, HEK293 cells were cultured on a culture dish coated with type I collagen (Cellmatrix, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan). HL-1 cells derived from atrial myocytes were added to Claycomb medium (SAFC Biosciences, Inc., Lenexa, Kansas) supplemented with 10% FBS, 4 mM L-glutamine, 0.1 mM norepinephrine and 3M L-ascorbic acid. USA) and cultured on a culture dish coated with 0.02% gelatin and 25 g / mL fibronectin.
  • MTT activity was measured using Cell Counting Kit-8 (DOJINDO LABORATORIES, Kumamoto, Japan) according to the manufacturer's protocol. Although it is already known that this activity depends on cell viability, ie the number of complete cells, it has been reported that this activity is determined not only by cell number, but also by cell metabolism [10, 12 ]. In particular, the MTT activity of cells with abnormal mitochondrial function tended to decrease even with the same number of cells.
  • the hearts perfused with Langendorff were put into total ischemia by stopping the perfusion of Krebs-Henseleit buffer for 30 minutes and then reperfused for 60 minutes. Thereafter, the heart was immersed in 1% TTC staining solution for 10 minutes at 37 ° C., and a cross section of the central part of the stained heart was prepared, and the infarcted part was compared. The percentage of infarct was determined by distinguishing the infarct from the whole using NIH image software.
  • the non-neural cholinergic system controls intercellular communication.
  • the ChAT gene was knocked down using a ChAT-specific miRNA expression vector, and after confirming its effect, HEK293 cells and mouse atrial myocardial origin Permanent ChAT KO cells were prepared using HL-1 cells.
  • the knockdown of the ChAT gene in transiently transformed HEK293 cells was confirmed immunocytochemically (FIG. 1A). Transformed cells were confirmed by GFP expression (green area in FIG. 1A). ChAT immunoreactivity as observed in non-transformants (red) was completely attenuated in ChAT KO cells.
  • ChAT KO cells proliferated without delay compared to control HEK293 cells stably transformed with a LacZ gene knockdown vector (control cells).
  • control cells when seeded with ChAT KO cells again and then separated by agitation, it was revealed that cell characteristics, ie, efficient intercellular communication, was impaired compared to control cells (FIG. 1B). ).
  • ChAT KO cells readily disperse as single cells, whereas control cells maintain cell-cell interactions and form aggregates.
  • an ACh-positive signal was detected on the cell membrane, but this signal was weaker in ChAT KO cells.
  • a more attenuated signal was detected between ChAT KO cells, in contrast to the very strong signal of immunoreactive ⁇ -catenin between control cells.
  • ChAT KO HL-1 cells were also prepared in the same manner as the control cells (control cells) in which the LacZ gene was knocked down.
  • Cx43 protein expression was suppressed, as confirmed by Western blot and immunocytochemical analysis (FIG. 1C).
  • the Cx43 positive signal that can be clearly detected between the control cells is significantly weakened in the ChAT KO HL-1 cells, suggesting that intercellular communication was hindered.
  • the dye transfer assay also revealed that the LY dye did not migrate efficiently between ChAT KO HL-1 cells. In contrast, the dye loaded on the control cells traveled a significantly longer distance, suggesting that the non-neuronal cholinergic system controlled the gap junction function.
  • Non-neuronal cholinergic system functions to suppress energy metabolism
  • ChAT KO HEK cells with the ability to synthesize ACh with a production level of less than 10% compared to control cells ( Control vs. ChAT KO: 100 ⁇ 8.7 vs. 9.3 ⁇ 3.5%, P ⁇ 0.01) was evaluated for cellular energy metabolism. Even when the same number of cells was used for each, the MTT activity in ChAT KO HEK cells was higher than the control activity (384.8 ⁇ 20.8%, P ⁇ 0.01 relative to the control). ). Consistent with this result, ChAT KO HEK cells consumed more oxygen than controls (-239.4 ⁇ 26.4%, P ⁇ 0.01, relative to controls) (FIG.
  • ChAT KO HEK cells are more susceptible to cell death than cobalt cells even when cobalt chloride is administered.
  • Control vs. ChAT KO: 100.0 ⁇ 0.35 vs. 26.6 ⁇ 2.33%, P ⁇ 0.01) (FIG. 2C).
  • ChAT KO HL-1 cells caused more cell death in ChAT KO HL-1 cells (based on controls: 29.4 ⁇ 2.4%, P ⁇ 0.01), which is higher caspase-3 than controls. Accompanied by activity.
  • ChAT KO HL-1 cells produced more reactive oxygen species, as assessed by APF, the indicator of ROS, during this cell death by NE. It was speculated that such an increase in ROS production was due in part to cell death.
  • IR upregulates ChAT protein expression in the heart, with ACh in the heart (IR: 2.78 ⁇ 0.17 nmol / g protein vs. control: 2.32 ⁇ ). 0.12 nmol / g protein, P ⁇ 0.05) and ATP levels (IR: 11.5 ⁇ 0.9 mM / g protein vs control: 5.9 ⁇ 0.5 mM / g protein, P ⁇ 0.01). Increased.
  • the ChAT inhibitor hemicolinium-3 surprisingly attenuated the increase in cardiac ATP levels to the control level (HC-3: 6.4 ⁇ 1.0 mM / g protein, P ⁇ 0, relative to IR) .05) (FIG. 6B).
  • eNOS vascular endothelial nitric oxide synthase
  • Example 2 The apparatus of the present invention specifically described with reference to FIGS. 7 and 8 was produced. Using this device, the right thigh was blocked for 5 minutes and reperfused for 3 minutes in humans. This ischemia-reperfusion cycle was performed once or three times. The changes over time in the heart rate in this case are shown in FIGS. 9 and 10, respectively.
  • “trained” is a human who has been subjected to ischemia-reperfusion with the apparatus of the present invention
  • “untrained” is a human who has not been subjected to ischemia-reperfusion (control).
  • heart rate decreased immediately after the ischemia-reperfusion cycle (indicating increased ACh in the heart and centrally activated parasympathetic nervous system). This lasted about 16 hours. This effect persisted within about 24 hours, but the heart rate returned to normal again after a further interval, and the heart rate decreased after another ischemia-reperfusion (data not shown). This suggests that the parasympathetic nervous system in the whole body is enhanced and the acetylcholine synthesis system in the heart is further enhanced.
  • the blood glucose level increased in the IR-untreated mice, but the blood glucose level-lowering effect was observed in the IR-treated mice.
  • Example 4 Give mice a high-fat diet, perform IR (3 min ischemia 2 min reperfusion 3 times) every other day (Day 0, Day 2, Day 4), IR untreated mice and BS (blood glucose level) ). The results are shown in FIG.
  • Example 5 Mice were fed a high fat diet and IR (2 min ischemia 2 min reperfusion repeated 3 times) was performed daily for 11 days to compare IR untreated mice with BS (blood glucose level). The results are shown in FIG.
  • Example 6 IR was performed daily while mice were fed a high fat diet for 7-11 days. For IR, 2 to 3 minutes ischemia and 2 minutes reperfusion were repeated 3 times. During this time, body weight was measured. The results are shown in FIG.
  • Donepezil an acetylcholinesterase inhibitor against Alzheimer's dementia, promotes angiogenesis in an ischemic hindlimb model.J Mol Cell Cardiol. 2010; 48: 680 -693.
  • Botker HE Kharbanda R, Schmidt MR, Bottcher M, Kaltoft AK, Terkelsen CJ, Munk K, Andersen NH, Hansen TM, Trautner S, Lassen JF, Christiansen EH, Krusell LR, Kristensen SD, Thuesen L, Nielsen SS, Rehling M, Sorensen HT, Redington AN, Nielsen TT.Remote ischaemic conditioning before hospital admission, as a complement to angioplasty, and effect on myocardial salvage in patients with acute myocardial infarction: a randomized trial. Lancet 2010; 375: 727-734. 27. Hausenloy DJ, Yellon DM.Remote ischaemic preconditioning: underlying mechanisms and clinical application.Cardiovasc Res 2008; 79: 377-386.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Massaging Devices (AREA)
  • Surgical Instruments (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

要約　生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置が開示されている。生体内アセチルコリン産生促進装置は、四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材と、該動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する。この装置を動物に適用して四肢の動脈の阻血－再灌流を繰り返すことにより、アセチルコリンの産生を促進することができ、生体内でのアセチルコリンの濃度を高めることができる。

Description

生体内アセチルコリン産生促進装置
　本発明は、生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置に関する。
　アセチルコリンは、コリンの酢酸エステルであり、副交感神経や運動神経の末端から刺激に応じて遊離され、シナプス部および終板で興奮伝達物質(神経伝達物質)となる物質である。アセチルコリンは、血圧降下、心臓抑制（心拍数の低下）、腸管収縮、骨格筋収縮などの生理作用を示す。また、アセチルコリン受容体に結合したアセチルコリンはアセチルコリンエステラーゼやコリンエステラーゼによってコリンと酢酸に加水分解されて筋肉は弛緩する。
　生体内でのアセチルコリン濃度を高めるコリンエステラーゼ阻害剤を、老人性痴呆、脳血管性痴呆、注意欠陥多動障害、緑内障、重症筋無力症又は偏頭痛の予防、治療又は改善に用いることが知られている（特許文献１）。また、アセチルコリンは、副交感神経を刺激してリラックス状態を作り出し、血圧を下げ、心拍数を低下させる作用があるので、降圧や不眠症の解消、さらには、交感神経系亢進時における耐糖能異常を誘発することによる血糖値の上昇を抑制することにも有用であると考えられる。
　上記の通り、生体内でのアセチルコリンの濃度を増大させるコリンエステラーゼ阻害剤はよく研究され、種々の化合物が知られている。しかしながら、生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置は全く知られていない。
再表03/082820
　本発明の目的は、生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、四肢の動脈を閉塞することにより阻血し、一定時間阻血後に動脈の閉塞を解放して再灌流することを繰り返すことにより、生体内でのアセチルコリンの産生が促進されることを見出した。従って、四肢の動脈の阻血－再灌流のサイクルを繰り返すことが可能な装置は、生体内でのアセチルコリンの産生を促進することができる。
　すなわち、本発明は、四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材と、該動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する、生体内アセチルコリン産生促進装置を提供する。また、本発明は、動物の動脈を圧迫して阻血し、次いで前記動脈に血液を再灌流するサイクルを１回以上繰り返すことを含む、生体内アセチルコリン産生促進方法を提供する。
　本発明の装置を動物に適用して四肢の動脈の阻血－再灌流を繰り返すことにより、アセチルコリンの産生を促進することができ、生体内でのアセチルコリンの濃度を高めることができる。従って、本発明の装置を適用することにより、これまでに知られているコリンエステラーゼ阻害剤の薬効である老人性痴呆、脳血管性痴呆、注意欠陥多動障害、緑内障、重症筋無力症又は偏頭痛の予防、治療又は改善や、血圧の低下、不眠症の解消、リラックス状態の作出、耐糖能異常による血糖値上昇の抑制等を達成できる。特に、血糖値に関しては、後述のマウスを用いた動物実験により明らかなとおり、本発明の装置により、血糖値の低下、又は血糖値の上昇抑制を行うことができる。
図１Ａ～図１Ｃは、下記実施例１において行った、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)遺伝子欠損に関する実験結果を示す図である。ＣｈＡＴ遺伝子の欠損は、β－カテニン及びＣｘ４３を介して細胞間コミュニケーションに影響を及ぼす。（Ａ）ＣｈＡＴに特異的なｍｉＲ　ＲＮＡｉ発現ベクターを一過的に感染させることにより、ＣｈＡＴのノックダウンをヒト尿細管上皮細胞HEK293細胞において確認した。ＧＦＰのシグナル（緑色）を示す破線によって囲まれた形質転換細胞では、ＣｈＡＴの免疫応活性（赤色）が弱まったことが示された。 （Ｂ）このHEK293細胞を用いて安定的に形質転換したＣｈＡＴ　ＫＯ（ノックダウン）細胞では、対照のＬａｃＺ　ＫＯ細胞と比較して、細胞間で観察されるβ－カテニンの免疫活性がより少なく、細胞は撹拌により容易に分散した。ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞では、細胞膜で見られるＡＣｈの免疫活性シグナルがより少なかった。 （Ｃ）免疫細胞化学及びウェスタンブロット解析から、ＣｈＡＴに特異的なｍｉＲ　ＲＮＡｉ発現ベクターで安定に形質転換したマウス心筋由来のＨＬ－１細胞であるＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞では、対照のＬａｃＺ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞と比較して、Ｃｘ４３の発現がより少ないことが分かった。ＬＹ色素を用いてその細胞間物質輸送を評価する方法においては、ＬＹ色素移動は、対照細胞と比較して、直線上に並べたＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞で抑制された。 図２Ａ～図２Ｅは、下記実施例１において行った、ＣｈＡＴの抑制に関する実験結果を示す図である。細胞のＣｈＡＴを抑制すると、より多くの酸素及びＡＴＰの消費を伴うエネルギー代謝が亢進する。（Ａ）ＡＣｈレベルが低い（対照を基準として、９．３±３．５％）ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞ではＭＴＴ活性が上昇し（対照を基準として、３８４．８±２０．８％、Ｐ＜０．０１）、これと並行してより多くの酸素が消費された（対照を基準として、－２３９．４±２６．４％、Ｐ＜０．０１）。 （Ｂ）ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞に含まれるＡＴＰは、対照よりも少なかった（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：７６５．１±５６．９対４２５．７±１８．７ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）。 （Ｃ）２ｍＭのＣｏＣｌ２により化学的に誘導した低酸素条件では、対照よりも多いＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞が死んだ（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：１００．０±０．３５対２６．６±２．３３、Ｐ＜０．０１）。 （Ｄ）同様にＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞も対照よりも多いＡＴＰを消費した（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：２７１．９±２８．２対８３．１±８．８ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）。 （Ｅ）ＣｈＡＴ阻害薬であるＢｒＡＣｈ（１０μＭ）及びヘミコリニウム－３（１０μＭ）もまた、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞で見られたのと同様に、ラット心筋由来Ｈ９ｃ２細胞でのＭＴＴ活性を上昇させた。ヘミコリニウム－３はさらに、Ｈ９ｃ２細胞でのＡＴＰ含量を低下させた。 下記実施例１において行った、ＣｈＡＴノックダウン（ＫＯ）ＨＬ－１細胞に関する実験結果を示す図である。ＣｈＡＴノックダウン（ＫＯ）ＨＬ－１細胞は、ノルエピネフリン（ＮＥ）誘導性細胞死により感受性が高かった。対照細胞との比較により評価した、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞の生存率は、２ｍＭのＮＥで処理した対照細胞がほぼ100％であったのとは対照的に、ＮＥにより用量依存的に低下した。２ｍＭのＮＥを用いた場合、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞はより多くの活性酸素種を産生し、ＡＰＦによる赤色の蛍光を、対照よりも多く示した。これと一致して、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞では、基準条件（０時間）での活性型カスパーゼ－３の発現が高く、ＮＥを使用すると、カスパーゼ－３の活性化はＣｈＡＴ　ＫＯ細胞でさらに高まった。 下記実施例１において行った、マウスの後肢の阻血－再灌流に関する実験結果を示す図である。後肢阻血－再灌流はＣｈＡＴとＣＨＴ１の発現を、手技を加えた後肢だけでなく心臓でも増強する。左の後肢に阻血－再灌流を行ったことで、右の後肢（Ｒ）と比較して、１６時間以内のＣｈＡＴ及びＣＨＴ１のタンパク質発現が上昇した。これらの骨格筋での蛋白発現上昇に付随して、心臓でもまたＣｈＡＴ及びＣＨＴ１の両方の発現が、それぞれ同様な経時変化で増加した。 下記実施例１において行った、阻血－再灌流（ＩＲ）処置とＣｈＡＴ活性の関係に関する実験結果を示す図である。　阻血－再灌流（ＩＲ）処置は、ＣｈＡＴ活性を介して、心臓全体の虚血再灌流負荷における心筋梗塞から心臓をより多く保護する。ＩＲを行わなかった対照と比較して（０．６１±０．０３）、ＩＲ処置は、より心臓を保護し、そしてＴＴＣ染色で示される梗塞部を減少させた（０．２６±０．０３、Ｐ＜０．０１）。ヘミコリニウム－３を用いた前処理により、ＩＲによる心保護効果は完全に失われた（ＩＲを基準として、０．５６±０．０３、Ｐ＜０．０５）。 図６Ａ～図６Ｄは、下記実施例１において行った、後肢阻血－再灌流と心臓ＡＴＰレベルとの関係に関する実験結果を示す図である。　後肢阻血－再灌流が心保護に及ぼす遠隔効果は、心臓ＡＴＰレベルを維持する、心臓での非神経性コリン作動系の活性化に寄与する。（Ａ）心臓でのＡＴＰレベルは、ＩＲにより、１６時間の間に徐々に増加した（ＩＲを基準として、２５６．４±１３．１％、４ｈ、Ｐ＜０．０１）。 （Ｂ）ＩＲによって引き起こされる心臓ＡＴＰレベルの増加（ＩＲ：１１．５±０．９ｍＭ／タンパク質１ｇ対対照：５．９±０．５ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）は、ヘミコリニウム（ＨＣ）－３を用いた前処理により抑制された（ＨＣ－３：６．４±１．０ｍＭ／タンパク質１ｇ、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５。 （Ｃ）これらの条件では、心臓ＡＣｈレベルもまたこれらの傾向に続き、ＡＴＰレベルと並行して、ＡＣｈレベルもＩＲによって増加し（ＩＲ：２．７８±０．１７ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ対対照：２．３２±０．１２ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０５）、そしてＨＣ－３によって弱まった（ＨＣ－３：２．１４±０．０７、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５）。 （Ｄ）ｅＮＯＳ　ＫＯマウスでは、心臓でのＡＣｈ合成はＩＲによってはアップレギュレートされなかった（ＮＳ：有意差なし）。 本発明の装置の一具体例の構成を模式的に示す図である。 図７に示す装置においてプログラムした、加圧－解除のサイクルを示す図である。 図７に示す装置を複数の被検者に適用して阻血－再灌流サイクルを３回繰り返した場合の心拍数の経時変化を示す図である。対照として、阻血－再灌流サイクルを行わなかった被検者の心拍数の経時変化も併せて示す。 図７に示す装置を複数の被検者に適用して阻血－再灌流サイクルを１回繰り返した場合の心拍数の経時変化を示す図である。対照として、阻血－再灌流サイクルを行わなかった被検者の心拍数の経時変化も併せて示す。 下記実施例３の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を与え、後脚に対するIR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日、11日間行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した結果を示す図である。 下記実施例４の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を与え、IR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を隔日(0日目、2日目、4日目)で行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した結果を示す図である。 下記実施例５の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を与え、IR(2分虚血2分再灌流3回繰り返し)を実施例４とは異なり、毎日11日間行った時のBS（血糖値）を比較した結果の図である。 下記実施例６の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を7－11日間摂取させながら、IR（2分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日行い、体重変化を比較した結果の図である。
　下記実施例１において、動物実験に基づき具体的に記載するとおり、本願発明者らは、四肢の動脈を閉塞することにより阻血し、一定時間阻血後に動脈の閉塞を解放して再灌流することを繰り返すことにより、生体内でのアセチルコリンの産生が促進されることを見出した（ただし、ヒト被験者においては、直接的に心臓内AChの測定が不可能であることから、心拍数減少効果をもって、心臓への副交感神経系の亢進すなわち神経終末からのACh分泌亢進およびそれによる心筋内ACh産生増加とみなした）。本発明は、この新知見を基礎とする。すなわち、本発明の装置は、四肢の動脈の阻血と再灌流を行うものである。
　本発明の生体内アセチルコリン産生促進装置は、四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材を具備する。ここで、「四肢のいずれかの部位」は、腕でも脚でもよく、腕の場合、上腕部でも肘部でもよく、脚の場合、大腿部でも膝部でもよい。
　動脈圧迫部材としては、カフを好ましく用いることができる。カフは、四肢に巻き付ける帯状の袋で、空気を送り込むことによって膨張し、その結果、四肢が締付けられて動脈が圧迫されるものである。カフは、血圧測定において常用されている周知のものであり、本発明においても周知のカフを用いることができる。カフ自体は周知であり、市販されているので、市販品を用いることも可能である。
　動脈圧迫部材はカフに限定されるものではなく、動脈を圧迫して阻血可能なものであればどのような構成のものでもよい。例えば、帯状又は紐状の部材を四肢に巻き付け、空気を送ることなく直接モーターで締め付けるようにしたもの、剛性のある２つの部材でリング状部材を構成し、これらの部材をモーターでスライドさせてリング状部材の直径を小さくすることにより、リング状部材の中に挿入された四肢を締め付けるもの等でもよい。
　本発明の装置はさらに、動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する。加圧手段は、手動により駆動と停止を行うものでもよいが、自動的に駆動と停止を行うようにしておけば、使用者は、装置の使用中に他の作業をしたり、テレビを見たり、さらには寝ることもできるので便利で好ましい。自動的に駆動と停止を行う場合、加圧手段は、１～１５分間の加圧と、該加圧後の解除から成るサイクルを１回以上、好ましくは２回～１０回、さらに好ましくは２回～５回繰り返すようにプログラムされていることが好ましい。
　動脈圧迫部材がカフの場合には、好ましい例として、ポンプと、該ポンプと前記カフを連結し、該ポンプから前記カフに空気を送る送気管と、該送気管に設けられたバルブとを具備し、該ポンプを作動させて前記カフを加圧し、前記バルブを開いて加圧を解除するように構成されているものが挙げられる。この場合、前記バルブが電動バルブであり、該電動バルブの電源と、前記ポンプの電源がプログラムリレーを介して該電動バルブ及び該ポンプにそれぞれ接続され、該プログラムリレーにおいて、該ポンプの駆動による加圧と、前記電動バルブの解放による加圧後の解除から成るサイクルを１回以上繰り返すようにプログラムされているものが好ましい。さらに、前記送気管及び前記プログラムリレーに接続された圧力スイッチをさらに具備し、該圧力スイッチは、前記送気管内の圧力を検知し、検知した圧力が設定圧力未満か否かの信号を前記プログラムリレーに送り、設定圧力未満では前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されて該ポンプが駆動して前記カフを加圧し、設定圧力以上では、前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されずポンプが駆動しないように構成されているものが好ましい。この装置の場合、阻血－再灌流のサイクルが、１～１５分間の加圧と、１分間～３時間の加圧解除とから成り、該サイクルを２回～１０回繰り返すようにプログラムリレーにおいてプログラムされていることが好ましく、特に、加圧時間が１分間～１５分間であり、加圧解除時間が１分間～１５分間であり、前記サイクルを２回～５回繰り返すようにプログラムされているものが好ましい。なお、設定圧力は、四肢の組織をできるだけ損傷しないようにするために、阻血を達成できる（すなわち、動脈内を血液が流れないようにする）のに必要な圧力であって、できるだけ低い圧力が好ましく、従って、使用者の最大血圧よりも５～10mmHg程度高い圧力が好ましい。
　以下、図面に基づき、本発明の装置の好ましい具体例を説明する。
　図７に、本発明の装置の一具体例の構成を模式的に示す。以下、この具体例について説明する。なお、具体例には、電源の電圧等、種々の数値が含まれるが、これらの数値は好ましい数値を例示的に示すものであり、支障が生じない限り他の数値を採用することも可能である。
　図７中、１は、家庭用の交流電源(AC100V)に接続された電源スイッチ、２は、交流100V(AC100V)を直流24V(DC24V)に変換し、DC24Vを供給する直流電源、３は、AC100VをDC6Vに変換し、DC6Vを供給する直流電源、４は圧力スイッチ、５はプログラムリレー、６はポンプ、７は電動バルブ、８はポンプ６からカフ９に空気を送る送気管、９はカフである。これらの各部品は周知のものであり、市販品を利用可能である。また、阻血－再灌流サイクルの各時間や、繰り返し回数も適宜変更することができる。
　電源スイッチ1を閉じると電源2及び電源3にAC100Vが供給され、電源2はDC24Vを、電源3はDC6Vを出力可能となる。電源2は、圧力スイッチ4及びプログラムリレー5に直接繋がっている（開閉スイッチを介さない）ので、電源スイッチ1閉で圧力スイッチ4とプログラムリレー5にはDC24Vが供給され起動状態となる。一方、電源3は、ポンプ6及びバルブ7にプログラムリレー5を介して繋がっているので、電源スイッチ1閉でもプログラムリレー5内のリレースイッチが閉じないとポンプ6やバルブ7にはDC6Vは供給されない。圧力スイッチ4、ポンプ6、バルブ7、カフ9は、送気管8を介して繋がっている。ポンプ6は、DC6Vが供給されると、ポンプ外の空気を吸い込んで管8内に空気を送り込みカフ9を加圧する。バルブ7は、0Vで開きDC6Vで閉じるので、0V時には管8及びカフ9内部は大気圧と同等となり、DC6V時には大気に対して閉じられる。圧力スイッチ4は、管8を介してカフ9内の圧力を検知し、大気圧差で+50～250mmHgの任意の設定圧力未満と設定圧力以上でそれぞれ別の信号をプログラムリレーに送っている。プログラムリレー5は、圧力スイッチ4からの設定圧力未満の信号ではポンプ6及びバルブ7にDC6Vを供給し管8及びカフ9内を加圧する。設定圧力以上の信号でポンプ6へのDC6Vのみ供給を停止（バルブ7へはDC6V供給は続ける）する。このため、カフ9内圧は、圧力スイッチ4において設定した任意の圧力に保たれる。
　プログラムリレー5は、ポンプ6及びバルブ7へのDC6Vの供給を同時に停止し、管8及びカフ9内圧を大気圧と同等にすることもできる。また、これらの動作、すなわち、カフ9の内圧を圧力スイッチ4で設定された圧力に保つ動作と大気圧と同等にする動作を任意の時間、任意のパターンで繰り返すことができる。
　この具体例の装置のプログラムリレー5には、図８に示した制御プログラムが書き込まれている。阻血時には、カフ9内圧が圧力スイッチ4で設定された圧力となり、被検者の上腕部や大腿部を締付け阻血する。解除時には、カフ9内圧は大気圧とほぼ同等となり灌流する。
　使用時に、電源スイッチ1閉で、1～15分の任意の時間阻血後、1～15分の任意の時間灌流し、これを任意の0～5回繰り返した後、0～3時間の任意の時間灌流し、この動作を0～5回の任意の回数繰り返すようにプログラムされている。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
　先ず、阻血－再灌流サイクルを繰り返すことにより生体内でのアセチルコリン(Ach)産生が促進されることを証明する動物実験を実施例１として記載する。
実施例１
方法
１．ＣｈＡＴ遺伝子のノックダウン
　BLOCK-iT（商標）Pol II miR RNAi発現ベクターであるpcDNA（商標）6.2-GW/ EmGFP-miR（Invitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を用いて、ＣｈＡＴ遺伝子のノックダウンを行った。製造業者によるプロトコールに従って、商業上望ましく、かつ、予め設計されているヒト又はマウスＣｈＡＴに特異的なＲＮＡｉ配列を用いて二本鎖オリゴを調製し、これを発現ベクター中にサブクローニングした。ネガティブコントロールとしては、これもまた商業上望ましいとされている、ＬａｃＺに特異的なＲＮＡｉ配列をサブクローニングし、ネガティブコントロール発現ベクターを構築した。標的遺伝子であるＣｈＡＴの発現が抑制されたかを確認するために、Effectene transfection regent（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて一過的に形質転換したＨＥＫ２９３細胞を、免疫細胞化学的な実験により試験した。ＨＥＫ２９３細胞、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞、並びにマウス心房心筋由来のＨＬ－１細胞、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞に適した選択的抗生物質を用い、ＣｈＡＴノックダウン発現ベクターの安定な形質転換体を作出した。形質転換された細胞は、ＧＦＰの発現により容易に検出された。
２．免疫細胞化学的試験
　一次抗体として２００倍に希釈したヤギ抗ＣｈＡＴポリクローナル抗体（MILLIPORE、ビルリカ、マサチューセッツ、米国）、２００倍に希釈したウサギ抗－カテニンポリクローナル抗体（Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc.、ダンヴァーズ、マサチューセッツ、米国）、５００倍に希釈したラット抗ＡＣｈポリクローナル抗体（MILLIPORE）、及びウサギ抗Ｃｘ４３ポリクローナル抗体（ZYMED Laboratories Inc.、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア、米国）を用い、免疫細胞化学的解析を行った。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、それぞれに適した二次抗体に結合した免疫蛍光で処理し、その後レーザー共焦点顕微鏡（OLYMPUS、東京、日本）で観察した。
３．ウェスタンブロット解析
　本願発明者らによる研究で既に報告しているように、ウェスタンブロット解析を行った［２、３、７、１０、１１］。この試験では一次抗体として、５００倍に希釈したヤギ抗ＣｈＡＴポリクローナル抗体（MILLIPORE）、５００倍に希釈したウサギ抗ＣＨＴ１ポリクローナル抗体（Antagene, Inc.、リモネスト、フランス）、５００倍に希釈したウサギ抗切断型カスパーゼ－３モノクローナル抗体（Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc.）を使用した。適したＨＲＰ結合二次抗体と反応させた後、１ＴＢＳＴで洗浄し、Luminata（商標）Forte Western HRP基質（MILLIPORE）を用いてシグナルを検出した。
４．ＬＹ色素移動アッセイ
　心筋細胞由来の細胞に及ぼす非神経性コリン作動系の効果を評価するために、恒久的にＣｈＡＴがノックダウンされているＨＬ－１細胞である、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－ｌ細胞を得た。これらの細胞を、細胞が６０ｍの幅で直線状に並ぶように処理した、ガラス底のシャーレに播種した（Cyto Graph, Dai Nippon Printing Co., Ltd.、東京、日本）。直線状に並べた細胞は、それぞれが２００μｍ離れ、並行したパターンのバンドを形成した。培地を除去した後、直線状に並んだ細胞を２７ゲージの針で垂直に掻き取り、１％のルシファーイエロー色素を掻き取った領域の中央に乗せた。１分後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、その後、掻き取った領域から色素が移動した距離を免疫蛍光顕微鏡で評価した。
５．細胞培養
　ＨＥＫ２９３細胞と、ラット胚由来で自然に不死化した心筋芽細胞であるＨ９ｃ２細胞を、１０％ＦＢＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭ（日本、大阪、日本）中で培養した。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＩ型コラーゲン（Cellmatrix, Nitta Gelatin Inc.、大阪、日本）でコーティングした培養シャーレ上で培養した。心房筋細胞由来のＨＬ－１細胞を、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのノルエピネフリン及び３ＭのＬ－アスコルビン酸を添加したＣｌａｙｃｏｍｂ培地（SAFC Biosciences, Inc.、レネクサ、カンザス、米国）を用い、０．０２％のゼラチンと２５ｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコーティングした培養シャーレ上で培養した。
６．細胞内ＡＣｈ濃度の測定
　本願発明者らの最近の研究で既に報告しているように、ＨＰＬＣを用いて細胞内の又は心臓ＡＣｈ濃度を決定した[11]。細胞溶解物を調製するために、１０ｃｍの培養シャーレから掻き取った細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１ｍＭフィソスチグミンと２×１０－８ＭのＩＰＨＣを内部対照として含む、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。その後、これらの試料を３回凍結融解した。マウスから摘出した心臓を十分に細かくし、０．１Ｍ過塩素酸、０．１ｍＭフィソスチグミン及び２×１０－８ＭのＩＰＨＣを含む１ｍＬの均一化溶液存在下でホモジナイズした。０℃、２×１０４Ｇで１５分間遠心分離した後、１Ｍの重炭酸カリウムでｐＨを調製し、Ultrafree MCカラム（MILLIPORE）でろ過し、そして溶出液をＡＣｈ濃度の定量に用いた。
７．ＭＴＴ活性の測定
　Cell Counting Kit-8（DOJINDO LABORATORIES、熊本、日本）を用い、製造業者によるプロトコールに従ってＭＴＴ活性を測定した。この活性が細胞の生死、すなわち完全な細胞の数に依存することが既に知られているが、この活性が細胞数だけでなく、細胞代謝によっても決定されることが報告された［１０、１２］。特に、ミトコンドリアの機能が正常でない細胞のＭＴＴ活性は、同等の細胞数であっても活性が低下する傾向を示した。
８．細胞での酸素消費の測定
　我々のこれまでの研究と同様に［１１］、Fibox 3（PreSense Precision Sensing、レーゲンスブルク、ドイツ）を用いて、培地中の酸素含量を決定した。特定の酸素感受性の感知装置を培養シャーレの底部に接着し、その培養シャーレ中で細胞をインキュベートした。酸素含量を連続して測定し、記録し、そして０時間での含量と比較した。
９．細胞でのＡＴＰ含量の測定
　XL-ATPキット（APRO Life Science Institute、徳島、日本）を用い、プロトコールに従って、細胞及び心臓のＡＴＰレベルを決定した。溶解物からのＡＴＰレベルはタンパク質濃度を基に修正した。
１０．細胞での活性酸素種産生の評価
　活性酸素種の指示物質であるアミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ、SEKISUI MEDICAL CO., LTD.、東京、日本）を用い、それぞれの濃度（０．５、１．０、２．０ｍＭ）のノルエピネフリン存在下でのＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞又は対照であるＨＬ－１細胞による産生レベルを評価した。ＡＰＦを最終濃度が１０μＭになるように培地に加えた。細胞をＡＰＦと共に１時間インキュベートし、その後レーザー共焦点顕微鏡により観察した。
１１．ランゲンドルフ装置を用いた、マウス心臓の全虚血モデル
　ネンブタールを腹腔内注入して麻酔した後、外科的ではなくて物理的な方法により、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊの左後肢に阻血（５分）－再灌流（３分）を３回繰り返し行った。再灌流から１６時間後のＣｈＡＴ及びＣＨＴ１タンパク質の発現を評価するために、右と左の大腿四頭筋を摘出した。さらに、再灌流の４時間、８時間又は１６時間後に、タンパク質発現を評価するために心臓を摘出し、また別の心臓にはランゲンドルフ装置を接続し、５％二酸化炭素と９５％酸素で平衡化し、ろ過したクレブス－ヘンゼライト緩衝液を９０ｍｍＨｇで灌流した。安定した後、ランゲンドルフで灌流した心臓を、クレブス－ヘンゼライト緩衝液の灌流を３０分間停止することで全虚血にし、その後６０分間再灌流した。その後その心臓を１％のＴＴＣ染色液中に１０分間、３７℃で浸漬し、染色した心臓の中央部の横断切片を作成し、梗塞部を比較した。梗塞部の割合は、ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて梗塞部を全体から区別することによって決定した。
１２．統計分析
　データを平均±標準誤差として表した。２群間の比較を行うためのノンパラメトリック検定を、マン－ホイットニーＵ検定により行った。３群間でのノンパラメトリック多重比較検定を、クラスカル・ワリス検定と、それに続くフィッシャーのＰＬＳＤ検定により行った。Ｐ＜０．０５の場合に差が有意であると見なした。
結果
１．非神経性コリン作動系は細胞間コミュニケーションを制御する。
　非神経性コリン作動系の具体的な役割をインビトロで明らかにするために、ＣｈＡＴ特異的なｍｉＲＮＡ発現ベクターを用いてＣｈＡＴ遺伝子をノックダウンし、その効果を確認後ＨＥＫ２９３細胞とマウス心房心筋由来のＨＬ－１細胞を用いて恒久的なＣｈＡＴ　ＫＯ細胞を調製した。一過性に形質転換したＨＥＫ２９３細胞でのＣｈＡＴ遺伝子のノックダウンを免疫細胞化学的に確認した（図１Ａ）。形質転換された細胞は、ＧＦＰの発現（図１Ａの緑色部分）によって確認された。非形質転換体（赤色）で観察されるようなＣｈＡＴの免疫活性は、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞では完全に弱まっていた。
　恒久的なＣｈＡＴ　ＫＯ細胞は、ＬａｃＺ遺伝子ノックダウンベクター（対照細胞）で安定に形質転換した対照のＨＥＫ２９３細胞と比較して、成長が遅れることなく増殖した。しかしながら、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞を再度播種し、その後撹拌によって細胞を分離させると、細胞の特徴、すなわち、効率的な細胞間コミュニケーションが対照細胞と比較して損なわれたことが明らかになった（図１Ｂ）。撹拌後、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞は単一細胞として容易に分散するが、対照細胞は細胞間相互作用を維持して凝集体を形成する。対照細胞では、ＡＣｈ－陽性シグナルは細胞膜上で検出されたが、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞ではこのシグナルは弱くなっていた。同様に、免疫反応性β－カテニンのシグナルが対照細胞間では非常に強いこととは対照的に、ＣｈＡＴ　ＫＯ細胞間では、より減弱したたシグナルが検出された。
　ＬａｃＺ遺伝子をノックダウンさせた対照細胞（対照細胞）と同様に、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞もまた調製した。ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞では、ウェスタンブロット及び免疫細胞化学的解析で確認したように（図１Ｃ）、Ｃｘ４３タンパク質の発現が抑制された。対照細胞間でははっきりと検出できるＣｘ４３陽性のシグナルは、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞では顕著に弱まっており、このことは細胞間コミュニケーションが妨げられたことを示唆している。色素移動アッセイでもまた、ＬＹ色素がＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞間を効率的に移動しなかったことが明らかになった。対照的に、対照細胞に乗せた色素は顕著に長い距離を移動し、このことは、非神経性コリン作動系がギャップ結合機能を制御したことを示唆している。
　総合すると、これらのデータは、非神経性コリン作動系が細胞間コミュニケーションで機能していることを示唆している。
２．非神経性コリン作動系はエネルギー代謝の抑制に機能している
　この系のさらなる機能を解析するために、対照細胞と比較して産生レベルが１０％未満のＡＣｈ合成能をもつＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：１００±８．７対９．３±３．５％、Ｐ＜０．０１）の細胞のエネルギー代謝について評価した。それぞれについて同等の細胞数を使用した場合であっても、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞におけるＭＴＴ活性は対照の活性よりも高かった（対照を基準として、３８４．８±２０．８％、Ｐ＜０．０１）。この結果と一致して、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞は対照よりも多い酸素を消費した（対照を基準として、－２３９．４±２６．４％、Ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。その結果、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞のＡＴＰレベルは有意に低下した（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：７６５．１±５６．９対４２５．７±１８．７ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。これらの結果は、ＭＴＴ活性並びに酸素消費及びＡＴＰ含量の相互変化を示しており、これは、非神経性コリン作動系が細胞のエネルギー代謝を負に制御していること、そしてこの系が細胞のＡＴＰ含量を維持していることを示唆している。従って、化学的に擬似的な低酸素を生じる塩化コバルト（２ｍＭ）で酸素の使用を阻害した場合、塩化コバルトを投与しても対照細胞と比較して、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＥＫ細胞は細胞死を起こしやすい（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：１００．０±０．３５対２６．６±２．３３％、Ｐ＜０．０１）（図２Ｃ）。　
　同様にＨＬ－１細胞では、非神経性コリン作動系は細胞のエネルギー代謝の制御に重要な役割を果たしている。ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞でのＡＴＰ含量は対照よりもずっと少ない（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：２７１．９±２８．２対８３．１±８．８ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）（図２Ｄ）。この結果は、ラット心筋由来のＨ９ｃ２細胞でもまた同様であった。ＣｈＡＴ遺伝子を欠損させる代わりに、２種類のＣｈＡＴ阻害薬、すなわち、ブロモアセチルコリン（ＢｒＡＣｈ）とヘミコリニウム－３を使用して、ＣｈＡＴ活性を阻害した。１０μＭの各阻害薬を使用した場合、Ｈ９ｃ２細胞はいかなる形態的な変化も示さなかった。各阻害剤はＨ９ｃ２細胞でのＭＴＴ活性を上昇させ、また、ヘミコリニウム－３は、ＣｈＡＴ遺伝子を欠損させた場合と同様に、ＡＴＰレベルを相互に減少させた（対照対ＣｈＡＴ　ＫＯ：９２．０±１．０対６１．０±１．１ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０５）（図２Ｅ）。これらのデータもまた、細胞のＡＴＰを保存するために、非神経性コリン作動系はエネルギー代謝を負に制御し、かつ、酸素消費を抑制することを示唆している。
３．非神経性コリン作動系は、ノルエピネフリンの毒性から細胞を保護する
　ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞をノルエピネフリン（ＮＥ）で処理した（図３）。この実験では、細胞の生存能力の指標として、ＮＥ処理したＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞と対照細胞との間の細胞の生存率を用いた。従って、１００％の割合は、ＮＥが存在する場合であっても、両方の細胞が同様に生存していることを示した。それにもかかわらず、図３ではっきりと示されたように、ＮＥはＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞の細胞生存率を用量依存的に低下させた（対照を基準として：０．５ｍＭのＮＥで７３．６±１．４％、Ｐ＜０．０１；１．０ｍＭのＮＥで６２．０±１．０％、Ｐ＜０．０１）。２ｍＭのＮＥは、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞でより多くの細胞死を引き起こし（対照を基準として：２９．４±２．４％、Ｐ＜０．０１）、これは対照よりも高いカスパーゼ－３活性を伴った。加えて、ＣｈＡＴ　ＫＯ　ＨＬ－１細胞はＮＥによるこの細胞死の間に、ＲＯＳの指示物質であるＡＰＦで評価される、より多くの活性酸素種を産生した。そのようなＲＯＳ産生の増加は、部分的には細胞死によるものだと推測された。これらの結果は、心筋における非神経性コリン作動系は、ＮＥの毒性から細胞を保護するのに必須であることをはっきりと示している。
　これらのインビトロでのデータを総合すると、非神経性コリン作動系は、細胞間コミュニケーションの維持、細胞のエネルギー代謝の負の制御、及び細胞死からの細胞の保護に関与している。
４．骨格筋の非神経性コリン作動系のインビボでの促進
　この系のインビボでの制御機構を解析するために、プレコンディショニングのプロトコールと同様に、阻血（５分）と再灌流（３分）を断続的に３回、左大腿動脈の流動性を手で弱めることによりマウスで一過的な後肢阻血－再灌流（ＩＲ）を行った（図４）。ＩＲから１６時間後、試験した左の大腿四頭筋では、反対側と比較して、ＣｈＡＴとＣＨＴ１のタンパク質発現が顕著に上昇した。このことは、ＩＲそれ自体が骨格非神経性コリン作動系を活性化させる引き金として機能することを示唆している。
　注目すべきことに、この処置の間、心臓でもまたこの系は活性化されており、このことは、ＩＲが心臓の非神経性コリン作動系を遠隔的に活性化させることを示唆している。ＣｈＡＴのタンパク質発現は２４時間の間に徐々に増加した。ＣＨＴ１タンパク質発現の経時変化には、同様のＣｈＡＴのパターンが続いた。これらのデータは、ＩＲが試験を行った器官だけでなく、離れた器官、例えば心臓の非神経性コリン作動系もまたアップレギュレートすることを示唆している。
５．インビボでの後肢阻血再灌流は、心臓の非神経性コリン作動系を介して心臓全体を全虚血から救出する
　ＩＲが全虚血から心臓を保護するかを確認するために、ＩＲの１６時間後に摘出し、ランゲンドルフ装置を用いて灌瘤した心臓に、全阻血－再灌流、すなわち３０分の阻血と６０分の再灌流を加えた（図５）。再灌流傷害においては、ＩＲを受けていない対照マウスでの梗塞部の割合は０．６１±０．０３であった。対照的に、ＩＲを加えたマウスから摘出した心臓での割合は０．２６±０．０３（対照を基準として、Ｐ＜０．０１）まで有意に低下し、このことから、マウスの心臓に及ぼすＩＰの遠隔的な保護効果が確認された。この現象は後期プレコンディショニングとして周知であるが、ＩＲ処理マウスをＩＲの前にＣｈＡＴ阻害薬であるヘミコリニウム－３で前処理すると、ＩＲによるこの心筋梗塞抑制効果が弱まり、かつ、割合が対照の０．５６±０．０３（ＩＲに対する、Ｐ＜０．０５）と同等のレベルまで回復した。これらの結果は、ヘミコリニウム－３がこの効果を打ち消すことから、心臓を保護する遠隔効果が心臓でのＣｈＡＴのアップレギュレーションにより仲介されたことを示唆している。
６．遠隔効果による心保護の根底をなす機序
　ＩＲ後、４時間、８時間及び１６時間でそれぞれ心臓を摘出し、心臓でのＡＴＰレベル含量を測定した。１６時間の心臓においてもより高いレベルのＡＴＰ含量が含まれていることが明らかとなり（ＩＲを基準として、２５６．４±１３．１％、４時間、Ｐ＜０．０１）、このことは、ＩＲが心臓でのＡＴＰレベルの上昇を引き起こすことを示唆している（図６Ａ）。　心臓でのＡＴＰレベルの上昇が、心臓の非神経性コリン作動系のアップレギュレーションによるものであるかどうかを調べるために、ＩＲの前にヘミコリニウム－３を投与した。図４及び６Ｃに示されたように、ＩＲは心臓でのＣｈＡＴタンパク質の発現をアップレギュレートし、心臓でのＡＣｈ（ＩＲ：２．７８±０．１７ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ対対照：２．３２±０．１２ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０５）とＡＴＰレベル（ＩＲ：１１．５±０．９ｍＭ／タンパク質１ｇ対対照：５．９±０．５ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）を増加させた。しかしながら、ＣｈＡＴ阻害薬であるヘミコリニウム－３は驚くことに、心臓ＡＴＰレベルの上昇を対照レベルまで弱めた（ＨＣ－３：６．４±１．０ｍＭ／タンパク質１ｇ、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。これは、心臓の非神経性コリン作動系が心臓のＡＴＰレベルの維持に確かに関与していることを示唆している。ＩＲに用いたマウスの心臓でのＡＣｈレベルの測定もまた、この課題を支持した。ヘミコリニウム－３での前処理は、心臓ＡＣｈレベルの上昇を完全に抑制した（ＨＣ－３：２．１４±０．０７、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５）（図６Ｃ）。
　ｅＮＯＳ（血管内皮型一酸化窒素合成酵素）ＫＯマウスでは、心臓におけるＩＲ誘導性のＡＣｈ合成のアップレギュレーションが失われた。ＩＲの１６時間後でも、野生型マウスでは増加するはずの心臓ＡＣｈレベルが、ＩＲ前と同等であった。これは、ＩＲの遠隔効果によって誘導される心臓の非神経性コリン作動系のアップレギュレーションに、ＮＯが部分的に関与していることを示唆している。
実施例２
　図７及び図８を参照して具体的に説明した本発明の装置を作製した。この装置を用いて、ヒトにおいて右大腿部を5分阻血し3分再灌流させた。この阻血－再灌流サイクルを１回又は３回行った。この場合の心拍数の経時変化をそれぞれ図９及び図１０に示す。
　図９及び図１０中、「trained」は、本発明の装置により阻血－再灌流を行ったヒト、「untrained」は、阻血－再灌流を行わなかったヒト（対照）である。図９及び図１０に示す通り、阻血－再灌流サイクル直後より心拍数の低下（心臓におけるAChが増加していることおよび、中枢性に副交感神経系が活性化していることを示す）が認められ、これが約16時間持続した。なお、この効果は約24時間以内であれば持続が認められるが、それ以上間隔をあけると心拍数は再び元に戻り、再度改めて阻血再灌流をすると心拍数は低下した（データ示さず）。これは、全身の副交感神経系が亢進し、さらに心臓におけるアセチルコリン合成系が亢進したことを示唆している。
実施例３
　マウスに高脂肪食を与え、後脚に対するIR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日、11日間行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した。結果を図１１に示す。
　図１１に示されるとおり、IR未処理マウスでは血糖値が増加したが、IR処理マウスでは血糖値低下作用が認められた。
実施例４
　マウスに高脂肪食を与え、IR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を隔日(0日目、2日目、4日目)で行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した。結果を図１２に示す。
　図１２に示されるとおり、IR未処理マウスでは血糖値が増加したが、IR処理マウスでは血糖値低下作用が認められた。この血糖低下作用は、１日おきの隔日でも明らかな効果が認められた。
実施例５
　マウスに高脂肪食を与え、IR（2分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日、11日間行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した。結果を図１３に示す。
　図１３に示すように、IR処理マウスでは血糖値低下作用が認められた。この血糖値低下作用は、阻血時間を、侵襲の少ない短時間である２分間にしても１１日間持続した。
実施例６
　マウスに高脂肪食を7-11日間摂取させながらIRを毎日行った。IRは２分～３分虚血・２分再灌流を３回繰り返した。この間の体重を測定した。結果を図１４に示す。
　図１４に示すように、対照群(control)と比較して、pc (IR)群では、有意に体重増加が認められなかった。共に、１日摂取量に差はなかった。一方１日おき（隔日）にIRを行った場合は、体重減少効果は見られなかった。しかし、図１２が示すように、血糖低下作用はまだ認められた。
参考文献リスト
1. Kakinuma Y, Ando M, Kuwabara M, Katare RG, Okudela K, Kobayashi M, Sato T. Acetylcholine from vagal stimulation protects cardiomyocytes against ischemia and hypoxia involving additive non-hypoxic induction of HIF-1alpha. FEBS Lett. 2005;579:2111-2118.
2. Ando M, Katare RG, Kakinuma Y, Zhang D, Yamasaki F, Muramoto K, Sato T. Efferent vagal nerve stimulation protects heart against ischemia-induced arrhythmias by preserving connexin43 protein. Circulation. 2005;112:164-170.
3. Zhang Y, Kakinuma Y, Ando M, Katare RG, Yamasaki F, Sugiura T, Sato T. Acetylcholine inhibits the hypoxia-induced reduction of connexin43 protein in rat cardiomyocytes. J Pharmacol Sci. 2006;101:214-222.
4. Katare RG, Ando M, Kakinuma Y, Arikawa M, Handa T, Yamasaki F, Sato T. Vagal nerve stimulation prevents reperfusion injury through inhibition of opening of mitochondrial permeability transition pore independent of the bradycardiac effect. J Thorac Cardiovasc Surg.
2009;137:223-231.
5. Handa T, Katare RG, Kakinuma Y, Arikawa M, Ando M, Sasaguri S, Yamasaki F, Sato T. Anti-Alzheimer's drug, donepezil, markedly improves long-term survival after chronic heart failure in mice. J Card Fail. 2009;15:805-811.
6. Katare RG, Ando M, Kakinuma Y, Arikawa M, Yamasaki F, Sato T. Differential regulation of TNF receptors by vagal nerve stimulation protects heart against acute ischemic injury. J Mol Cell Cardiol. 2010;49:234-244.
7. Kakinuma Y, Furihata M, Akiyama T, Arikawa M, Handa T, Katare RG, Sato T. Donepezil, an acetylcholinesterase inhibitor against Alzheimer's dementia, promotes angiogenesis in an ischemic hindlimb model. J Mol Cell Cardiol. 2010;48:680-693.
8. Arikawa M, Katare RG, Kakinuma Y, Handa T, Ando M, Yamasaki F, Sato T. Progression of ventricular dysfunction after myocardial infarction is prevented by anti-Alzheimer's disease drug, donepezil. Circulation 116: II_291.
9. Okazaki Y, Zheng C, Li M, Sugimachi M. Effect of the cholinesterase inhibitor donepezil on 19 cardiac remodeling and autonomic balance in rats with heart failure. J Physiol Sci. 2010;60:67-
74.
10. Kakinuma Y, Katare RG, Arikawa M, Muramoto K, Yamasaki F, Sato T. A HIF-1alpha-related gene involved in cell protection from hypoxia by suppression of mitochondrial function. FEBS Lett. 2008;582:332-340.
11. Kakinuma Y, Akiyama T, Sato T. Cholinoceptive and cholinergic properties of cardiomyocytes involving an amplification mechanism for vagal efferent effects in sparsely innervated ventricular myocardium. FEBS J. 2009;276:5111-5125.
12. Rapoport N, Marin AP, Timoshin AA. Effect of a polymeric surfactant on electron transport in HL-60 cells. Arch Biochem Biophys. 2000;384:100-108.
13. Kirkpatrick CJ, Bittinger F, Nozadze K, Wessler I. Expression and function of the non-neuronal cholinergic system in endothelial cells. Life Sci. 2003;72:2111-2116.
14. Kawashima K, Fujii T. Expression of non-neuronal acetylcholine in lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function. Front Biosci. 2004;9:2063-2085.
15. Lips KS, Volk C, Schmitt BM, Pfeil U, Arndt P, Miska D, Ermert L, Kummer W, Koepsell H. Polyspecific cation transporters mediate luminal release of acetylcholine from bronchial epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 2005;33:79-88.
16. Li M, Zheng C, Sato T, Kawada T, Sugimachi M, Sunagawa K. Vagal nerve stimulation markedly improves long-term survival after chronic heart failure in rats. Circulation. 2004;109:120-124.
17. Schwartz PJ, De Ferrari GM, Sanzo A, Landolina M, Rordorf R, Raineri C, Campana C, Revera M, Ajmone-Marsan N, Tavazzi L, Odero A. Long term vagal stimulation in patients with advanced heart failure: first experience in man. Eur J Heart Fail 2008;10:884-891.
18. De Ferrari GM, Schwartz PJ. Vagus nerve stimulation: from pre-clinical to clinical application: challenges and future directions. Heart Fail Rev. 2011;16:195-203.
19. Hoover DB, Ganote CE, Ferguson SM, Blakely RD & Parsons RL. Localization of cholinergic 20 innervation in guinea pig heart by immunohistochemistry for high-affinity choline transporters. Cardiovasc Res 2004;62:112-121.
20. Kawano H, Okada R & Yano K. Histological study on the distribution of autonomic nerves in the human heart. Heart Vessels 2003;18:32-39.
21. Kuwabara M, Kakinuma Y, Katare RG, Ando M, Yamasaki F, Doi Y, Sato T. Granulocyte colony-stimulating factor activates Wnt signal to sustain gap junction function through recruitment of beta-catenin and cadherin. FEBS Lett. 2007;581:4821-4830.
22. Kostin S, Hein S, Bauer EP, Schaper J. Spatiotemporal development and distribution of intercellular junctions in adult rat cardiomyocytes in culture. Circ Res 1999;85:154-167.
23. Wu JC, Tsai RY, Chung TH. Role of catenins in the development of gap junctions in rat cardiomyocytes. J Cell Biochem 2003;88: 823-835.
24. Hausenloy DJ, Mwamure PK, Venugopal V, Harris J, Barnard M, Grundy E, Ashley E, Vichare S, Di Salvo C, Kolvekar S, Hayward M, Keogh B, MacAllister RJ, Yellon DM. Effect of remote ischaemic preconditioning on myocardial injury in patients undergoing coronary artery bypass graft surgery: a randomised controlled trial. Lancet 2007;370:575-579.
25. Ali ZA, Callaghan CJ, Lim E, Ali AA, Nouraei SA, Akthar AM, Boyle JR, Varty K, Kharbanda RK, Dutka DP, Gaunt ME. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: a randomized controlled trial. Circulation 2007;116 (11 Suppl):I98-105.
26. Botker HE, Kharbanda R, Schmidt MR, Bottcher M, Kaltoft AK, Terkelsen CJ, Munk K, Andersen NH, Hansen TM, Trautner S, Lassen JF, Christiansen EH, Krusell LR, Kristensen SD, Thuesen L, Nielsen SS, Rehling M, Sorensen HT, Redington AN, Nielsen TT. Remote ischaemic conditioning before hospital admission, as a complement to angioplasty, and effect on myocardial salvage in patients with acute myocardial infarction: a randomised trial. Lancet 2010 ;375:727-734.
27. Hausenloy DJ, Yellon DM. Remote ischaemic preconditioning: underlying mechanisms and clinical application. Cardiovasc Res 2008;79:377-386.
　１　電源スイッチ
　２　直流電源
　３　直流電源
　４　圧力スイッチ
　５　プログラムリレー
　６　ポンプ
　７　電動バルブ
　８　送気管
　９　カフ

Claims (12)

  1. 　四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材と、該動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する、生体内アセチルコリン産生促進装置。
  2. 　前記加圧手段が、１～１５分間の加圧と、該加圧後の解除から成るサイクルを１回以上繰り返すようにプログラムされている請求項１記載の装置。
  3. 　前記加圧手段が前記サイクルを２回～１０回繰り返すようにプログラムされている請求項２記載の装置。
  4. 　前記動脈圧迫部材がカフである請求項１～３のいずれか１項に記載の装置。
  5. 　前記加圧手段が、ポンプと、該ポンプと前記カフを連結し、該ポンプから前記カフに空気を送る送気管と、該送気管に設けられたバルブとを具備し、該ポンプを作動させて前記カフを加圧し、前記バルブを開いて加圧を解除する請求項４記載の装置。
  6. 　前記バルブが電動バルブであり、該電動バルブの電源と、前記ポンプの電源がプログラムリレーを介して該電動バルブ及び該ポンプにそれぞれ接続され、該プログラムリレーにおいて、該ポンプの駆動による加圧と、前記電動バルブの解放による加圧後の解除から成るサイクルを１回以上繰り返すようにプログラムされている請求項５記載の装置。
  7. 　前記送気管及び前記プログラムリレーに接続された圧力スイッチをさらに具備し、該圧力スイッチは、前記送気管内の圧力を検知し、検知した圧力が設定圧力未満か否かの信号を前記プログラムリレーに送り、設定圧力未満では前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されて該ポンプが駆動して前記カフを加圧し、設定圧力以上では、前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されずポンプが駆動しない請求項６記載の装置。
  8. 　前記サイクルが、１～１５分間の加圧と、１分間～３時間の加圧解除とから成り、該サイクルを２回～１０回繰り返す請求項７記載の装置。
  9. 　加圧時間が１分間～１５分間であり、加圧解除時間が１分間～１５分間であり、前記サイクルを２回～５回繰り返す請求項８記載の装置。
  10. 　血糖値低下装置又は血糖値上昇抑制装置である請求項１～９のいずれか１項に記載の装置。
  11. 　動物の動脈を圧迫して阻血し、次いで前記動脈に血液を再灌流するサイクルを１回以上繰り返すことを含む、生体内アセチルコリン産生促進方法。
  12. 　血糖値低下方法又は血糖値上昇抑制方法である請求項１１記載の方法。
PCT/JP2013/070492 2012-07-30 2013-07-29 生体内アセチルコリン産生促進装置 WO2014021267A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG11201500759PA SG11201500759PA (en) 2012-07-30 2013-07-29 In vivo acetylcholine production-promoting device
JP2014528147A JPWO2014021267A1 (ja) 2012-07-30 2013-07-29 生体内アセチルコリン産生促進装置

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-167996 2012-07-30
JP2012167996 2012-07-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014021267A1 true WO2014021267A1 (ja) 2014-02-06

Family

ID=50027942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/070492 WO2014021267A1 (ja) 2012-07-30 2013-07-29 生体内アセチルコリン産生促進装置

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2014021267A1 (ja)
SG (1) SG11201500759PA (ja)
WO (1) WO2014021267A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531212A (ja) * 1998-12-10 2002-09-24 ウエスタン クリニカル エンジニアリング リミテッド 外科的止血装置のための危険監視装置
US20030216775A1 (en) * 2000-09-26 2003-11-20 Hill Michael R.S. Method and system for directing blood flow during a medical procedure
WO2006080075A1 (ja) * 2005-01-27 2006-08-03 Japan Health Sciences Foundation 頚部圧力負荷による自律神経治療装置
JP2007522889A (ja) * 2004-02-23 2007-08-16 タイコ・ヘルスケアー・グループ・エルピー 圧迫処置システム
WO2008050609A1 (fr) * 2006-10-18 2008-05-02 Sato Sports Plaza Co., Ltd. Système thérapeutique, appareil thérapeutique et procédé de commande
WO2010132115A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 The Hospital For Sick Children Performance enhancement

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531212A (ja) * 1998-12-10 2002-09-24 ウエスタン クリニカル エンジニアリング リミテッド 外科的止血装置のための危険監視装置
US20030216775A1 (en) * 2000-09-26 2003-11-20 Hill Michael R.S. Method and system for directing blood flow during a medical procedure
JP2007522889A (ja) * 2004-02-23 2007-08-16 タイコ・ヘルスケアー・グループ・エルピー 圧迫処置システム
WO2006080075A1 (ja) * 2005-01-27 2006-08-03 Japan Health Sciences Foundation 頚部圧力負荷による自律神経治療装置
WO2008050609A1 (fr) * 2006-10-18 2008-05-02 Sato Sports Plaza Co., Ltd. Système thérapeutique, appareil thérapeutique et procédé de commande
WO2010132115A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 The Hospital For Sick Children Performance enhancement

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2014021267A1 (ja) 2016-07-21
SG11201500759PA (en) 2015-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kuznetsov et al. H9c2 and HL-1 cells demonstrate distinct features of energy metabolism, mitochondrial function and sensitivity to hypoxia-reoxygenation
Lafargue et al. Ionizing radiation induces long-term senescence in endothelial cells through mitochondrial respiratory complex II dysfunction and superoxide generation
He et al. Ablation of SIRT3 causes coronary microvascular dysfunction and impairs cardiac recovery post myocardial ischemia
Froger et al. Inhibition of cytokine-induced connexin43 hemichannel activity in astrocytes is neuroprotective
Hsu et al. Sirtuin 1 protects the aging heart from contractile dysfunction mediated through the inhibition of endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis in cardiac-specific Sirtuin 1 knockout mouse model
Montaigne et al. Doxorubicin induces mitochondrial permeability transition and contractile dysfunction in the human myocardium
Katare et al. Chronic intermittent fasting improves the survival following large myocardial ischemia by activation of BDNF/VEGF/PI3K signaling pathway
Kakinuma et al. Donepezil, an acetylcholinesterase inhibitor against Alzheimer's dementia, promotes angiogenesis in an ischemic hindlimb model
Zhang et al. RETRACTED: Thapsigargin triggers cardiac contractile dysfunction via NADPH oxidase-mediated mitochondrial dysfunction: Role of Akt dephosphorylation
Jin et al. Activation of AMP‐activated protein kinase during sepsis/inflammation improves survival by preserving cellular metabolic fitness
Haddad et al. Nox2-derived reactive oxygen species contribute to hypercholesterolemia-induced inhibition of neovascularization: effects on endothelial progenitor cells and mature endothelial cells
Zhou et al. Apelin/APJ system: a novel promising target for anti-aging intervention
Qi et al. Astragaloside IV attenuates glycated albumin-induced epithelial-to-mesenchymal transition by inhibiting oxidative stress in renal proximal tubular cells
Zhang et al. Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling
Chen et al. Ghrelin induces cell migration through GHSR1a-mediated PI3K/Akt/eNOS/NO signaling pathway in endothelial progenitor cells
Kron et al. Hypoxia‐driven Hif2a coordinates mouse liver regeneration by coupling parenchymal growth to vascular expansion
Soltow et al. Cessation of cyclic stretch induces atrophy of C2C12 myotubes
Li et al. Knockdown of the AIM2 molecule attenuates ischemia-reperfusion-induced spinal neuronal pyroptosis by inhibiting AIM2 inflammasome activation and subsequent release of cleaved caspase-1 and IL-1β
Ryan et al. Mitochondrial therapy improves limb perfusion and myopathy following hindlimb ischemia
Lu et al. Activation of the mechanosensitive Ca2+ channel TRPV4 induces endothelial barrier permeability via the disruption of mitochondrial bioenergetics
Yang et al. Hemopexin reduces blood–brain barrier injury and protects synaptic plasticity in cerebral ischemic rats by promoting EPCs through the HO-1 pathway
Huang et al. Signaling pathways involved in HSP32 induction by hyperbaric oxygen in rat spinal neurons
Li et al. Targeting TFE3 protects against lysosomal malfunction-induced pyroptosis in random skin flaps via ROS elimination
Yu et al. Sulfiredoxin-1 protects primary cultured astrocytes from ischemia-induced damage
Liu et al. Tuberostemonine may enhance the function of the SLC7A11/glutamate antiporter to restrain the ferroptosis to alleviate pulmonary fibrosis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13824957

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014528147

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13824957

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1