WO2014020264A1 - Nouveaux complexes de fer adaptes a la detection d'une entite chimique ou biochimique nitroreductrice, en particulier par irm in vivo et procede de detection in vitro - Google Patents

Nouveaux complexes de fer adaptes a la detection d'une entite chimique ou biochimique nitroreductrice, en particulier par irm in vivo et procede de detection in vitro Download PDF

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Jens Hasserodt
Philippe MAURIN
Fayçal TOUTI
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Ecole Normale Superieure de Paris
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Ecole Normale Superieure de Paris
Universite Claude Bernard Lyon 1
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    • C07F15/02—Iron compounds
    • C07F15/025—Iron compounds without a metal-carbon linkage

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of the detection of a nitroreductase enzyme or other nitroneductive chemical or biochemical entities. More specifically, the invention relates to ferrous complexes which are the first examples of a magnetogenic probe for the detection of this type of activity, such complexes for the in vivo detection by IM of a chemical or biochemical stimulus causing the reduction of a function ⁇ N02, as well as a method of in vitro detection of a chemical or biochemical stimuius leading to the reduction of a function -NO? ..
  • nitroreductase The detection of nitroreductase has given rise to various works.
  • Other systems using fluorescence for the detection of nitroreductases are also described in patent application EP1252520 (A2), in US Pat. No. 7,579,140 which describes a fluorescent CytoCyS probe for the detection of E, Coii bacteria expressing nitroreductase (E.
  • 6-nitroquinoline is also used as a fluorogenic probe for the same type of applications (Singieton et al, Cancer Gene Ther 14 (12), 2007, 953-967). It is also possible to cite WO 2011/012823, which proposes a substrate for in vitro analyzes making it possible to demonstrate enzymatic nitroreductase activity by means of a change of color or of fluorescence.
  • WO 2011/012823 proposes a substrate for in vitro analyzes making it possible to demonstrate enzymatic nitroreductase activity by means of a change of color or of fluorescence.
  • 6-chloro-9-nitro-5-oxo-5H-benzo (a) phenoxazine (CNOB) for the detection of the expression of E.
  • coli nitroreductase NfsB (which transforms CNOB into aminophenoxazine detectable at 625 nm) in mouse tumors expressing E. coli NfsB has also been published (Liu et al., Cancer es 68, 19, 2008, 7995-8003 and Les Cul et al, Organic Letters, 13). , 2011, 928-931).
  • substrates are poorly suited for in vivo analyzes. Indeed, fluorescence poses problems of diffusion and attenuation / tissue penetration of the signal which lead to a poor spatial resolution (of the order of several millimeters). Its in vivo applications are therefore very limited, and generally concern subcutaneous surface tumors.
  • nitroreductases are involved in hypoxia. Indeed, when cells suddenly lose their oxygen supply, they die quickly in general. On the other hand, when the oxygen content decreases progressively (hypoxic tumors in particular), the cells will adapt via the production of proteins that will allow them to survive by inhibiting the apoptosis process, or by favoring vascularization and decreasing the activity of mitochondria.
  • hypoxic tumors are preferentially identified by a non-invasive imaging method .
  • PET Positron Emission Tomography
  • Tracer molecules which have a nitro-heteroaromatic unit and which also include a radioactive atom have been designed.
  • the most studied tracer is fluorine-18-labeled 2-nitroimidazole (EF5, FMISG %) to map hypoxic zones in tissues (The Journal of Nuclear Median, 49, 6, 2008, 129S-148S).
  • VDEPT virus-directed enzyme prodrug therapy
  • nitroreductases In vivo detection of nitroreductases are also of interest for the detection of a specific gene in a living organism.
  • a bacterial nitro-reductase (MTR) gene has been marketed as a reporter gene (EP125252Q). is currently by reaction / incubation / contact with a fluorogenic probe ⁇ Gene Therapy (2012) 19, 295-302; iotc: 10.1038 / gt2011.101) _
  • the present invention proposes to provide a substrate suitable for the detection of a nitroreductase enzyme or other chemical or biochemical stirnuli which have a nitrreducing activity and which use other techniques than the fluorometric and calorimetric detection and PET.
  • the invention also proposes to provide a substrate that is suitable for detection in vivo and / or in physiological conditions.
  • the invention relates to the complexes of formula (!):
  • is a substituted or unsubstituted nitrogen-containing unsaturated hydrocarbon heterocycle comprising from 5 to 6 members and which may comprise at least one other nitrogen atom or an oxygen or sulfur atom, the represented nitrogen atom of the type having a free doublet that allows him to coordinate with iron,
  • Yi is a nitrogen atom or CH
  • - Y 2 is a nitrogen atom, CH or a carbon atom
  • - 3 ⁇ 4 is a hydrogen atom, or a group ⁇ CF 3 or ⁇ 0 2 ;
  • R f ⁇ 3 ⁇ 4 3 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 f and R 5 are each independently a hydrogen, bromine, chlorine, iodine or fiuor or a NIOHC group? among the substituted or unsubstituted alkyl groups, substituted or unsubstituted alkoxy groups, substituted or unsubstituted C (O) alkyl groups, substituted or unsubstituted -C (O) Oalkyl groups, substituted, unsubstituted primary, secondary or tertiary amines; it being understood that i and / or R3 represents ⁇ nt) ⁇ HQz f
  • the complexes (I) according to the invention are non-magnetic (diamagnetic) rer (II) chelates which are converted into an aqueous medium under the influence of a nitroreductase or analogous activity in a complex.
  • magnetic (paramagnetic) and therefore function as probes in a ételnt-lit mode.
  • the increasing magnetic susceptibility due to such a reaction can be identified by different detection methods such as Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopies, or Magnetic Resonance Imaging (MRI) and Resonant Electronic Spin (IRSE).
  • Detection can be performed in vivo f according to the selected detection method, or ex vivo or in vitro biological or cell samples include, placed on suitable media detection, by the exampIe micropiaques Muiti-well type.
  • the complexes according to the invention comprise an nltroaryl group, which allows a relatively specific response to a biochemical stimulus such as the activity of numerous nitroreductases, but also to purely chemical stimuli such as reducing agents,
  • the complexes (I) according to the invention have one or a combination of the characteristics below, or all of the following characteristics when they are not mutually exclusive;
  • R 1, R 2 , 3, R, s and R 6 each independently represent a hydrogen, bromine, chlorine, fluorine or iodine atom, or a group - NO 3 ⁇ 4 (CrG alkyl, (CC 6 ) aoxy) (G) (C 1-6 ) alkyl, -C (O) O (C C 6) alkyl f -MRaRb with Ra and R which each independently represent a hydrogen atom or a group (CVCs) alkyl; that R 1 and / or 3 is -NO 2; Z is an oxygen atom or a sulfur atom, or the complexes of formula (I) correspond to formula (Ia):
  • Ro being a hydrogen atom, or a group -CFs or ⁇ NG 2 and preferably being a hydrogen atom.
  • the compounds below are examples of complexes (I) according to the invention.
  • the present invention also relates to complexes of formula
  • the stimulus is a nitroreductase enzyme.
  • the nitroreductase is produced by a reporter gene which it is desired to insure.
  • the stimulus is a hypoxia of cancerous tissues.
  • Another object of the invention relates to a method of detection in vitro or ex vlva t in a sample of interest, a chemical or biochemical stimulus leading to the reduction of a function - ⁇ M0 2 ( comprising the following successive steps:
  • the chemical or biochemical stimulus is a nitroreductase enzyme.
  • the sample may be a biological sample of physiological pH.
  • the detection is carried out at stage b) by R N, IRM or by high performance chromatography coupled to mass spectrometry.
  • the detected signal corresponds, in this case, most often to the concentration of the previously defined complex (II) optionally in the form of a salt, to the relaxation time and / or the relaxivity obtained by RUH or MRI of the complex (II ) or a salt thereof.
  • alkyl group is meant a hydrocarbon chain, saturated, linear or branched.
  • alkyl group comprising from 1 to 6 carbon atoms, referred to as CCrCs) alkyl
  • substituents especially chosen from chlorine, bromine, iodine or fluorine, cyano, alkyl, trifluoroalkyl, trifluoromethyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkyl, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, aryloxy, -CGGH,
  • substituents especially chosen from chlorine, bromine, iodine or fluorine, cyano, alkyl, trifluoroalkyl, trifluoromethyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkyl, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, aryloxy, -CGGH,
  • substituents especially chosen from chlorine, bromine, iodine or fluorine, cyano, alkyl, trifluoroalkyl, trifluoromethyl, al
  • nitroreductase an enzyme capable of catalyzing in an aqueous medium the reduction of a nitro-phenyl or nitro- heteroaryl partially or totally amino-phenyl or amino-heteroaryl. Such an action occurs, generally, in the presence of its 2 efne substrate, the natural cellular reducer MADH (or NDPH), or, if one works in an ex vivo context, in the presence of certain other reducing substrates such as cysteine or 3-acetyipyridin-ribotide, nicotinamide ribotide, ribotlde nicotinic acid, and te-methylnicotine ide (R. I Knox et al "Virtual co-factors for an enzyme-linked enzyme enzyme, relevance to reductiveiv actrvated prodrugs in antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT), Biochem Pharmacol 1995, 49, 1641-1647).
  • ADPT antibody directed enzyme prodrug therapy
  • Bio sample means any sample from an animal or, preferably, from the human body, such as a sample of blood, serum, urine, saliva ... or a food sample of water, drinks, any food.
  • the sample may result from a direct sampling or obtained from a direct sample, especially after isolation and / or enrichment
  • the complexes according to the invention have, as a function of the substituents, a neutral or positive overall charge of +1 or +2, especially when they are in an aqueous pH solution belonging to the range of from 7 to 8, when they have a positive charge, they may be in the form of a salt, and in particular a physiologically acceptable salt.
  • This salt may comprise a counterion, for example of the chloride, carbonate, hydroxide, perchlorate, tetrafluoroborate, sulfate or phosphate type.
  • the complexes according to the invention have a structure in which:
  • ferrous lion is complexed by multi-toothed Sigands comprise a macrocycle and coordinating arms, which gives the complex a very good stability, in vivo applications, in particular, he
  • the arm which is part of a mixed aminyl functional group ( ⁇ , ⁇ -acetal) has an azoyl heterocyde (pyrazole, 1,2,3-triazole, 1,2,4-triazole, and the like) which allows the coordination of this heterocyde in the ferrous center and places the latter in a state of low-spin before the action of a reducing stimulus,
  • azoyl heterocyde pyrazole, 1,2,3-triazole, 1,2,4-triazole, and the like
  • the aminyl ( ⁇ , ⁇ -acetal) arm comprises a phenyl, thiophenyl or furanyie ring substituted by a reactive O2 function with respect to a chemical / biochemical activity of interest, such as that of nitroreductase enzymes,
  • the oordinant arm will undergo spontaneous fragmentation following the action of a chemical stimulus (reagent such as hydrogen in the presence of a catalyst or dithlonite) or biochemical (enzyme reductase) and will release a site of coordination on the ferrous center for a third molecule forming part of the medium (preferably a water molecule), thus making the high-spin complex and thus visible in MRI,
  • a chemical stimulus such as hydrogen in the presence of a catalyst or dithlonite
  • biochemical enzyme reductase
  • the complexes according to the invention make it possible to detect / image a chemical or biochemical stimulus allowing the reduction of an O 2 group present on the cycle:
  • the complexes according to the invention emit a detectable signal in MRI only after their encounter with said stimulus which causes a transformation of the complex with passage of a a low-spin entity which is therefore magnetic, to a high-spin entity which is îaramagnétlqye.
  • Figure i illustrates the process taken advantage of in the context of linve
  • the ferrous complex (I) according to the invention is schematized in the form of a cage molecule which surrounds the metal center.
  • This cage molecule comprises six nitrogen atoms that coordinate with iron in a GCtaednque architecture (illustrated by dot-born lines).
  • one of the nitrogen atoms differs from the other five in that: (i) it is part of an azoie-type heteroeyele and (2) this azole is part of a amlnal pattern (N, N ⁇ acétai) constituted also by a nitrogen atom belonging to Iigand pentadentate forming the remainder of Her molecule cage S f complex iron atom, the friend mixed nai resulting conduit ,, in the presence of a given stimulus, a spontaneous degradation that releases a coordination site on the metal center and thus allows to accommodate a molecule dau.
  • This transformation changes the coordination pattern of the iron atom from !, N6 "to" ⁇ 50 ⁇ .
  • Iron very sensitive to this change, can no longer maintain its initial low-spin state and goes to a state of high-spin, which makes it detectable in particular MRI.
  • Such a modification, triggered by a stimulus chemical / biochemical, is made possible by the presence of the spacer selected in the form of the cycle:
  • An unstable cage molecule will be intermedially formed in an aqueous medium.
  • the ferrous complex will then be formed by means of a ferrous salt of the tetrafiuoroborate type, for example.
  • the complexes according to the invention are suitable for the detection by IH of biomacromolecular targets of the enzyme nitroreductase type f which are most often present in vivo at very low concentrations, which was a challenge given the low detection sensitivity of this technical. Indeed, there is currently no commercially exploited means allowing a biologist or a radiologist to demonstrate the presence of any enzymatic activity with the IR modality and the invention therefore proposes a very interesting solution.
  • the complexes according to the invention are perfectly suitable for performing in vivo molecular imaging by MRI imaging. They exhibit good stability in an aqueous medium at 37 ° C. in particular and, in particular, in physiological media having a pH of 1%. 7.4, or more generally in aqueous pH solutions in the range of 7 to 8,
  • the complexes (I) according to the invention react to chemical / biochemical reductive stimuli, and make it possible in particular to monitor biochemical phenomena involving nitroreductases in vitro or in vitro.
  • the sample with study and the complex (I) can be placed in a buffered aqueous solution.
  • Such detection in vitm may, for example, be used for the detection of bacteria expressing nitroreductase such as in particular bacteria of the genus Escherfcnia, Shigella, Saimoneifa, Serratta, Enterobacter Ot ⁇ bacter, Klebsieila, Protsus, Dispensational Morganeila f Yersinia Vibrio, Pseudomonas , Acinetobacter, Enûenxoccus, Staphylococcus, Streptxoccus, Listeria, Candida, Cryptococcus 8ac ⁇ us f or Sacd ⁇ romy ⁇ s.
  • bacteria expressing nitroreductase such as in particular bacteria of the genus Escherfcnia, Shigella, Saimoneifa, Serratta, Enterobacter Ot ⁇ bacter, Klebsieila, Protsus, Dispensational Morganeila f Yersinia Vibrio, Pseudomonas , Acineto
  • the complexes (I) according to the invention make it possible, for example, to detect a nitroreductase enzyme as a product of a reporter gene.
  • the complexes according to the invention will make it possible to evidence of the expression of a specific gene within a genetically modified cell or animal for medical research applications.
  • a transformation of the genome by the insertion of a gene encoding a bacterial nitroreductase enzyme ("MTR") may be detected in the tissue that expresses this MTR gene by means of the complexes according to the invention.
  • the complexes according to the invention may therefore make it possible to monitor the expression of the nitroreductase (MTR) used as a reporter gene system (system having a good biocompatibility and having no reported toxicity in mammalian cells),
  • the activation of the complexes (I) according to the invention and the appearance of an IR signal can also be caused by a hypoxic medium, such as cancerous tissues.
  • the complexes according to the invention may therefore be used to monitor the hypoxia of cancerous tissues .
  • an aqueous solution of the complex according to the invention may, for example, be injected directly into the tissues or cancer cells or by intravenous or other means.
  • the monitoring of the enzyme nitroreductase makes the most of the enzymatic amplification phenomenon. that is to say that a single molecule of target enzyme can cause the transformation of thousands of complexes (I) according to the invention, which can significantly reduce you alone! detection of the enzyme by MRI.
  • the complexes according to the invention being based on iron, they can be used in an amount sufficient to correspond to a detection level higher than the detection threshold imposed by MRI imaging.
  • iron is a metal ion managed by the body hornéostatique, Indeed, if the metal ion is accidentally released from its cage molecule formed by the amino ligands, ferrous lion will be managed by the body and, thus, recycled by biochemical pathways.
  • the complexes according to the invention have a size / weight ratio comparable to that of a drug of 600 to 900 g / mol, which
  • the diffusion rate of the complexes according to the invention is greater than that obtained with nanotechnologies offering MRI solutions in the form of nanoparticles. Pius f of their discharge flow path is different from that of the nanoparticles.
  • the complexes according to the invention therefore have many applications, particularly in life science research activities, in the field of MRI radiology services, for applications in oncology, characterization, understanding of genetic diseases, or therapeutic monitoring. or in aqueous gels operated for technologies in need of a molecular switch.
  • FIG. 1 represents the structure of the Li complex obtained by single crystal X-ray diffraction
  • Figure 2 shows the structure of complex 1.2 obtained by X-ray diffraction on single crystal.
  • Fyrgyre 3 represents the structure of the L3 complex obtained by single crystal X-ray diffraction
  • FIG. 4 shows the mass spectra obtained as a function of time highlighting the transformation of the Li complex into an ILi complex under the action of a nitroreductase enzyme
  • FIG. 8 shows the evolution of the longitudinal relaxation time Ti (seconds) of the nuclear hydrogen spins of water as a function of time (min), obtained with the complex 1.1, with and without reducing conditions Hj-Pd /VS
  • FIG. 8 presents the ghost images (Testa MRI) of incubation solutions of the compound Ii in the case of the action of the nitroreductase (Pd / C catalyzed hydrogenation (5%) in FIG. PBS buffer (left coion), negative control in the absence of a reducing stimulus (central column), contrast level of pure PBS (right column), positive control of a solution of a passive contrast agent used clinically ( "Dotarem" at 4 m H in PBS at 50 mM e low),
  • Fig. 9 shows Se% viability as a function of compound concentration Li mH concentrations (each experiment having been repeated six times) of HeLa cells (immortal and cancer cell line derived from cervical cancer).
  • the substrate L1 is prepared as described in Scheme 3 below, Scheme 3: chemical synthesis of Example 1.
  • New J Chem, 32 s 428-435 ⁇ freshly synthesized is added 0.38 g (1.5 eq) of p-nitro benzaldehyde and 0.145 ml (1.5 eq) of commercial 1,2,3-triazole.
  • Dean-Stark with siphon is fitted on the monocolumn flask and a reflux of 18 hours is maintained, after which the crude reaction is brought to room temperature under argon, before adding a solution of iron salts (I) anhydrous ([FeCBF-th 6 eCN]) in acetonitrile
  • the titratlon of the synthesized ligand presented in square brackets in the synthetic SCHEMA
  • the ferrous salts is followed by LC-MS and the solution stirred for 15 minutes before being filtered.
  • the solvents are evaporated under reduced pressure and then taken up in a minimum of water / acetonitrile mixture (95/5, y /), in order to be deposited on a reverse phase silica cartridge.
  • C18 pre-conditioned with acetonitrile (2 cartridge volumes), then with water (2 cartridge volumes).
  • a progressive water / acetonitrile gradient (99: 1 to 90: 10, v / v) is established, after which several intense red-colored fractions are collected.
  • the various red fractions are analyzed by LC-MS and pooled, then Teluant is evaporated under reduced pressure to yield a red resin.
  • the structure of the compound 1.1 was established from an X-ray diffraction analysis of a monocrystal and is shown in FIG. 1. For the sake of clarity and to facilitate the interpretation of the image presented in FIG. Hydrogen was omitted except for the arm comprising triazole and nitro-phenyl.
  • the structure of the compound 1.2 was established from an X-ray diffraction analysis of a single crystal and is shown in Figure 2.
  • the hydrogen atoms were omitted, except those of the arm comprising triazole and nitro-phenyl. mildew 3; Substrate Preparation 1.3 reissue to form the wire
  • the intensities are measured at 100 K using the software CrysalisPro software ( ⁇ rysAlisPro, Agitant Technologies, Version 1.171,34.49 (release 20-01-2011 OYsAlisl71.NET) (compiled Jan 20 2011,15: 58: 25), just like the determination of reflection indices, refinement of single-cell parameters, Lorentz-polarization correction, peak integration and background noise-
  • An analytical absorption correction is applied using the modeled faces of the crystal (RC Clark, 3, S, et al.
  • All atoms other than hydrogen atoms are defined anisotropically. All hydrogen atoms are located on a different map, but those attached to a carbon atom are repositioned geometrically. Hydrogen atoms are initially positioned with slight constraints on the link lengths and angles to harmonize their geometry ⁇ C-H in the range 0.93-0.98 and -H in the range 0.86-0.89 ⁇ ) and Uiso (H) (in the range i " 2-1.5 as the Ueq of the parent atom), after the positions have been refined with constraints of the sding model.
  • the 1.4 complex was synthesized according to the protocol of Example 3 above, replacing the 5 ⁇ nitrothiophene ⁇ 2 ⁇ carboxaldehyde by I ⁇ 5-nitrafuran-2 ⁇ carboxaldehyde (commercial).
  • FIG. 1 shows the mass spectra obtained at t ⁇ 0 and 24h under the same conditions, but in the absence of reducing conditions (neither hydrogenation nor MTR ADH) and therefore plays the role of control.
  • a sample resulting directly from the incubation of the probe with the chemical / biochemical stimulus is injected into an Agitate HSD 1100 mass spectrometer.
  • the displayed spectra were measured according to the "scan" mode and by positive ionization in a source of electrospray type.
  • FIG. 7 shows the evolution of the longitudinal relaxation time Ti (seconds) of the hydrogen nuclear splns of water as a function of time (min.), In the case of a catalytic hydrogenation with Pd / C at 5 ° C. % w / w è 37 ° C) (diamond curve), in the absence of reducing stimulus (square curve). Tl level of PBS at 50 mH is also shown (dashes),
  • FIG. 8 presents the ghost images (MRI at 7 Tesla) of incubation solutions in the case of the action of the nitroreductase (hydrogenation catalysed by Pd / C (5%) in PBS buffer (left column), negative control in the absence of a reducing stimulus (central column), contrast level of pure PBS (right column), positive control of a solution of a passive contrast agent used clinically ("Dotarem") at 4 mH in PBS at 50 nm, bottom).
  • Dotarem a passive contrast agent used clinically
  • the results presented in FIG. 8 show that the L1 complex responds to a reducing stimulus via a signaling action in IM, Le. a hypersignal that reaches a level of light gray. This gray level is of intensity approaching that of Dotarem, a passive clinical contrast agent used in the field of anatomical diagnosis.
  • the MRI acquisition is conducted on samples of different complex 1.1 concentrations, using a 7 T Biospec System system (Bruker, Ettlingen, Germany) associated with a 32 mm coil of internal ammunition (Apsd Biomedical, Wurzburg, Germany).
  • the longitudinal relaxation time Tl theist measured with the IR-FISP sequence (from the "Inversion-Recovery Fast Imaging with Steady-State Precession" studies).
  • the geometrical parameters are: 40 x 40 mm 2 OV , 5 mm thick blade and 256 x 192 die size.
  • the values of T1 are obtained with multiple images T1 by applying a mono-exponential function to the data. IV-TEST OF CELLULAR VIABILITY IN THE PRESENCE OF COMPOUND 1.1
  • Hela cells (immortal and cancer cell line derived from cervicoid cancer, no. 93021013 SIGNA-Aldrich), at a rate of 10,000 HeLa cells per well, were incubated for 24 h in D EM medium with 10% FCS serum, with addition different concentrations (from 4mM to 0.25mM) of compound 1.1.
  • Figure 9 shows in each column the survival rate obtained as a function of the mH concentrations (each experiment having been repeated six times).
  • the results presented with the complex 1.1 and which can be generalized to all the claimed complexes show a selective and rapid recognition / activation sequence by the N -troreductase (activity that can be mimicked by chemical reducers such as hydrogen in the presence of a catalyst such as palladium on charcoal).
  • the lactation can be carried out at physiological pH, taking into account the stability observed in aqueous solution.
  • an absence of increase of reiaxivity (in MRI or RMM) or appearance of degradation products was found, validating the mode of action OFF / ON.

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Abstract

La présente invention concerne des complexes de formule (I) tels que définis à la revendication 1, ainsi que de tels complexes pour la détection in vivo par IRM d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -NO?., ainsi qu'un procédé de détection in vitro d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -NQ2 présente sur le complexes de formule (I).

Description

i
NOUVEAUX CO PLEXES DE FER ADAPTES Â LA DETECTION D'UNE ENTITE CHIMIQUE OU BIOCHIMIQUE NIT OREDUCTRICE, EN
PARTICULIER PA ∑ M VIVO ET PROCEDE DE DETECTION IN VITRO
La présente invention concerne ie domaine technique de la détection d'une enzyme nitroréductase ou d'autres entités chimiques ou biochimiques nitronéductrices. Plus précisément, l'invention concerne des complexes ferreux qui constituent les premiers exemples d'une sonde magnëtogénique pour la détection de ce type d'activité, de tels complexes pour la détection in vivo par I M d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction ~~N02, ainsi qu'un procédé de détection in vitro d'un stimuius chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -NO?..
La détection de nitroréductase a donné lieu à différents travaux. On peut notamment citer la demande WO 2011/012823 qui propose un substrat pour des analyses in vitro permettant de mettre en évidence une activité enzymatique nitroréductase grâce è un changement de couleur ou de fluorescence. D'autres systèmes utilisant la fluorescence pour la détection de nitroréductases sont également décrits dans la demande de brevet EP125252Ô (A2), dans le brevet US 7,579,140 qui décrit une sonde CytoCyS fluorescente pour la détection des bactéries E, Coii exprimant la nitroréductase (E.Coli NfsB) dans des lignées cellulaires, La 6-nitroquinoline est aussi utilisée, comme sonde fluorogène, pour le même type d'applications (Singieton et al, Cancer Gene Ther. 14 (12), 2007, 953-967). On peut également citer la demande WO 2011/012823 qui propose un substrat pour des analyses in vitro permettant de mettre en évidence une activité enzymatique nitroréductase grâce à un changement de couleur ou de fluorescence. L'utilisation de la 6~chiQro~9-nitro-5-oxo-5H- ben∑o(a)phénoxa∑ine (CNOB) pour la détection de l'expression de E. Coli nitroréductase NfsB (qui transforme la CNOB en aminophénoxazine détectable à 625 nm) dans des tumeurs de souris exprimant E.Coli NfsB a également fait l'objet de publications (Liu et ai, Cancer es 68, 19, 2008, 7995-8003 et Les Cul et al, Organîc Letters, 13, 2011, 928-931). Cependant, de tels substrats sont peu adaptés pour des analyses in vivo, En effet, la fluorescence pose des problèmes de diffusion et d'atténuation/pénétration tissulalre du signai qui aboutissent à une mauvaise résolution spatiale (de l'ordre de plusieurs millimètres). Ses applications in vivo sont donc très limitées, et concernent en générai des tumeurs de surface sous-cutanées.
Or, la détection des nitroréductases présentent également un intérêt in vivo. Tout d'abord, les nitroréductases sont impliquées dans hypoxie. En effet, lorsque des cellules perdent brutalement leur alimentation en oxygène, elles meurent rapidement en générai. Par contre, lorsque la teneur en oxygène diminue de manière progressive (cas des tumeurs hypoxiques, notamment), les cellules vont s'adapter via la production de protéines qui vont leur permettre de survivre en inhibant le processus d'apoptose, ou encore en favorisant la vascularisation et en diminuant l'activité des mitochondries. La meilleure façon de mesurer ia présence de hypoxie serait d'utiliser une sonde qui rentre directement en compétition avec ta fourniture de la ceilule en oxygène (Krohn et al « Moiecuiar îmaging of Hypoxia » ; 2008, 1 NucL Med ; 49 : 1295-1485), De nombreuses nitroréductases ont été trouvées dans Ses tissus, de sorte qu'une sonde pour une activité nitroréductase s'avère être un bon candidat. En effet, avec une telle sonde, pius il manquera d'oxygène pour accepter tous les électrons produits par ia chaîne de transport électronique du système de respiration c llulaire; plus la sonde sera transformée (réduite).
Afin d'éviter le recours à des biopsies qui ne sont pas toujours réalisables selon la localisation de la pathologie et qui ne peuvent en tout cas pas être réitérées de nombreuses fois, les tumeurs hypoxiques sont repérées préférentieilement par une méthode d'imagerie non-invasive, Actuellement la seule méthode employée et ceiie de la Tomographie par Emission de Positrons (TEP). Des molécules traceurs qui présentent une unité nitro- hétéroaroma tique et qui comportent également un atome radioactif ont été conçues. Le traceur le plus étudié est le 2-nitroimidazole marqué par du fluor 18 (EF5, FMISG...} pour cartographier les zones hypoxiques dans les tissus (The Journal of Nuclear Médiane, 49, 6, 2008, 129S-148S). Des études dans le domaine de « virus-directed enzyme prodrug therapy » (VDEPT) utilisant la TEP ont été réalisées via !a réduction de îa 5-aziridiny!-2,4- dinitrobenzamïde et d'autres dérivés nitrés ont également fait l'objet d'études par TEP (Singleton et ai, Cancer Gene Ther 4, 12, 2007 953-987 ; Christofferson eî ai, Biochem Soc Trans, 37(2), 2009, 413-418). Mais, la technique TEP présente une faible résolution (de l'ordre de plusieurs millimètres), et fait appel à des rayonnements hautement ionisants. De plus, elle nécessite la préparation sur place des radio-pharmaceutiques utilisés.
La détection de nitroréductases In vivo présentent également un intérêt pour la mise en évidence d'un gène spécifique dans un organisme vivant Un gène bactérien nitroréductase (MTR) a été commercialisé, en tant que gène rapporteur (EP125252Q), Sa mise-en-évidence se fait actuellement par réaction/incubation/contact avec une sonde fluorogénique {Gene Therapy (2012) 19, 295-302; ctoi:10.1038/gt2011.101)_
Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir un substrat adapté à la détection d'une enzyme nitroréductase ou d'autres stirnuli chimiques ou biochimiques qui présentent une activité nitroréductrice et qui utilisent d'autres techniques que la détection fluori métrique et calorimétrique et la TEP. L'invention se propose également de fournir un substrat qui soit adapté â la détection in vivo et/ou en conditions physiologiques.
L'invention concerne les complexes de formule (!) :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle :
Figure imgf000005_0001
est un hétérocycle hydrocarboné insaturé azoté, substitué ou non substitué, comprenant de 5 à 6 chaînons et pouvant comprendre au moins un autre atome d'azote ou un atome d'oxygène ou de soufre, l'atome d'azote représenté de type îmine présentant un doublet libre qui iui permet de se coordïner au fer,
- Yi est un atome d'azote ou CH,
- y 2 est un atome d'azote, CH ou un atome de carbone ;
- -Z- représente ~€HR*™CH s-v -0- ou -S-,
- ¾ est un atome d'hydrogène, ou un groupe ~CF3 ou ~ 02 ;
ou bien iorsque Y2 ~ C , ¾ est lié à Y2 et à i'hétérocycle pour former un groupe :
Figure imgf000005_0002
~ Rif ¾ 3, ¾f ¾ et R5 représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fiuor ou iode, ou un groupe chois? parmi les groupes™NG¾ tes groupes alkyie substitués ou non substitués, les groupes alcoxy substitués ou non substitués, les groupes™C{0)alkyie substitués ou non substitués, les group -C(0)Oalkyie substitués ou non substitués., les groupes aminés primaires, secondaires ou tertiaires substitués ou non substitués ; étant entendu que i et/ou R3 représente{nt) ~HQzf
ainsi que leurs sels.
tes complexes (I) selon l'invention sont des chélates de rer(Iî) non- magnétiques (diamagnétiques) qui se transforment en milieu aqueux sous l'influence d'une activité nitroréductase ou anaiogue en un complexe magnétique (paramagnétique) et fonctionnent donc comme des sondes selon un mode ételnt-allumé. La susceptibilité magnétique croissante due à une telle réaction peut être repérée par différentes méthodes de détection telles que ies spectroscopies par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et Résonance Paramagnétique Electronique (RPE), ou encore les Imageries par Résonance Magnétique (IRM) et par Résonanc de Spin Electronique (IRSE). La détection peut être réalisée in vivof en fonction de la méthode de détection sélectionnée, ou ex vivo ou in vitro sur des échantillons biologiques ou cellulaires notamment, placés sur des supports de détection adaptés, par exempie du type micropiaques muîti-puîts.
Les complexes selon l'invention comportent un groupement nltroaryle, qui permet une réponse relativement spécifique à un stimulus biochimique tel que l'activité de nombreuses nitroréductases, mais aussi à des stimuli purement chimiques tels que les agents réducteurs,
Selon des modes de réalisation particulier, les complexes (ï) selon i'invention présentent une ou une combinaison des caractéristiques ci- dessous, voire toutes les caractéristiques ci-dessous lorsqu'elles ne s'excluent pas l'u 'autre ;
Figure imgf000006_0001
correspond à Tune des structures suivantes
Figure imgf000006_0002
~ Rj, R2, 3, R , s et R6 représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore,, fluor ou iode, ou un groupe - NO¾ (CrG alkyie, (C C6)aScoxy, (G)(Ci I6}alkyle, ~C{0)0(C C6)alkylef -MRaRb avec Ra et R qui représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (CVCs)aikyle ; étant entendu que Ri et/ou 3 représentant} --NO2 ; - Z est un atome d'oxygène ou un atome de soufre ou bien les complexes de formule (I) répondent à la formule (la) :
Figure imgf000007_0001
- Ri = NO2 ; dans ce cas, 3 est, par exemple, un atome d'hydrogène ; - 2 = H et ou - 5 = H dans le cas des composés de formule (
Figure imgf000007_0002
Ro étant un atome d'hydrogène, ou un groupe -CFs ou ~NG2 et étant, de préférence, un atome d'hydrogène. Les composés ci-dessous sont des exemples de complexes (I) selon Invention.
Figure imgf000008_0001
La présente Invention a également pour objet les complexes de formule
(I) et (la), quelle que soit leur variante de réalisation décrite dans ie cadre de la présente invention, pour la détection in vivo chez l'homme ou l'animal, par IRM, d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction de la fonction - <¼ correspondant au substituant Rt ou 3 du cycle :
Figure imgf000008_0002
te! que défini pour les complexes de formule (I).
Selon un mode de réalisation préféré, le stimulus est une enzyme nitroréductase. Selon une première variante de mise en œuvre, !a nitroréductase est produite par un gène rapporteur dont on souhaite assurer !e suivi Selon une deuxième variante de mise en œuvre, le stimulus est une hypoxie de tissus cancéreux.
Les complexes obtenus à partir d'un complexe de formule (I) ou (la), quelle que soit sa variante de réalisation décrite dans le cadre de la présente invention, après réduction en milieu aqueux de la fonction -HO?., correspondant au substituant Ri ou F¾, répondent à la formule (II) :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle
Figure imgf000009_0002
est tel que défini pour les complexes de formule (I), et se trouvent éventuellement sous la forme d'un sel.
Un autre objet de l'Invention concerne un procédé de détection vitro ou ex vlvat dans un échantillon d'intérêt, d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant ia réduction d'une fonction -~M02( comprenant les étapes successives suivantes :
a) La mise en présence de l'échantillon d'intérêt avec un complexe de formule (I), quelle que soit leur variante de réalisation décrite dans le cadre de ia présente invention, en milieu aqueux,
b) La détection d'un signal généré, suite à Sa réduction de ia fonction -NO2 correspondant au substituant Ri ou R3 du cycle :
Figure imgf000010_0001
du complexe (I), sous l'action du stimulus chimique o biochimique,
Selon un mode de réalisation préféré, le stimulus chimique ou biochimique est une enzyme nitroréductase. L'échantillon pourra être un échantillon biologique de pH physiologique.
Selon des modes de réalisation préférés, la détection est réalisée à étape b) par R N, ÎRM ou par chromatographie à haute performance couplée à la spectrométrie de masse. Le signal détecté correspond, dans ce cas, le plus souvent à la concentration du complexe (II) précédemment défini éventuellement sous la forme d'un sel, au temps de relaxation et/ou à la relaxivité obtenue par RUH ou IRM du complexe (II) ou d'un de ses sels.
La description détaillée qui va suivre permet de mieux comprendre l'invention. En préliminaire, les définitions de certains termes utilisés dans le cadre de l'invention sont données.
Par groupe « alkyie », on entend une chaîne hydrocarbonée, saturée, linéaire ou ramifiée. A titre d'exemple de groupe alkyie comprenant de i à 6 atomes de carbone, nommés CCrCs)aikyle,, on peut citer, notamment, les groupes méthyie, éthyte, />propyie /S£>propylef />butyle, te/t-butyle, sec- butyle n~pent îe, n-hexyïe.
Lorsqu'il est indiqué qu'un groupe est « substitué », cela signifie qui! est susbtitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode ou fluor, les groupes cyano, alkyie, trifluoroalkyfe, trifluorométhyle, alcényle, alcynyle, cycJoaikyie, aryle, hétérocycloalkyle, amino, alkyiamlno, dialkylamino, hydroxy, aîcoxy, aryloxy, -CGGH, Les termes utilisés pour la définition de ces substituants sont ceux usuellement reconnus par l'homme du métier.
Par « nitroréductase », on entend une enzyme capable de catalyser dans un milieu aqueux la réduction d'un groupe nîtro-phényie ou nitro- hétéroaryle partiellement, ou totalement en amino-phényle ou amsno- hétéroaryle. Une telle action se produit, généralement, en présence de son 2efne substrat, le réducteur naturel cellulaire MADH (ou NÂDPH), ou, si l'on travaille dans un contexte ex vivo, en présence de certains autres substrats réducteurs tel que la cystéine, ou encore le 3-acétyipyrïdine-ribotide, le nicotineamide ribotide, le ribotlde de l'acide nicotinique, et te i- méthvlnicotina ide (R. I Knox et al « Virtual co-factors for an E coli nttroreductase enzyme ; relevance to reductiveiv actlvated prodrugs in antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT), Biochem. PharmacoL 1995, 49, 1641-1647).
Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon issu d'un animal ou, de préférence, du corps humain, tel qu'un échantillon de sang, sérum, urine, salive ... ou encore un échantillon alimentaire d'eau, de boissons, d'aliments quelconque. L'échantillon peut résulter d'un prélèvement direct ou obtenu à partir d'un prélèvement direct, notamment après une opération d'isolement et/ou d'enrichissement
Les complexes selon l'invention présentent, en fonction des substituants, une charge globale neutre ou positive de +1 ou +2, notamment lorsqu'ils se trouvent dans une solution aqueuse de pH appartenant à la gamme ailant de 7 à 8, Lorsqu'ils présentent une charge positive, ils pourront se trouver sous la forme d'un sel, et en particulier d'un sel physiologiquement acceptable. Ce sel peut comprendre un contre-ion, par exemple du type chlorure, carbonate, hydroxyde, perchlorate, tetrafluoroborate, sulfate ou phosphate.
Les complexes selon l'invention présentent une structure dans laquelle :
(a) un atome de fer est complexé dans son état d'oxydation + II (« complexes ferreux ») et à état bas-spin / dla magnétique, qui conduit après activation à un complexe haut-spin / paramagnétsque,
(b) lion ferreux est complexé par des Sigands multi -dentés comportent un macrocycle et des bras coordinants, ce qui confère au complexe une très bonne stabilité, dans des applications in vivo, notamment, il
(c) ie bras qui fait partie d'une fonction aminai mixte (Ν,Ν-acétai) comporte un hétérocyde de type azoie (pyrazole ; 1,2,3-triazoie ; 1,2,4-triazole ; et apparentés) qui permet la coordination de cet hétérocyde au centre ferreux et place ce dernier dans un état de bas-spin avant l'action d'un stimulus réducteur,
(d) le bras de ty aminai (Ν,Ν-acétai) comprend un cycle, du type phényle, thiophén le ou furanyie substitué par une fonction - O2 réactive vis à vis d'une activité chimique/biochimique d'intérêt, telle que celle des enzymes nitroréductases,
(e) le bras oordinant va subir une fragmentation spontanée suite â l'action d'un stimulus chimique (réactif tel que l'hydrogène en présence d'un catalyseur ou le dithlonite) ou biochimique (enzyme nïtroréductase) et va libérer un site de coordination sur le centre ferreux pour une molécule tierce faisant partie du milieu (préférentieilement une molécule d'eau), rendant ainsi le complexe haut-spin et donc visible en IRM,
(f) le choix de la partie porteuse de la fonction -NO2 conduit à ia génération d'un signal IRM selon un mode de fonctionnement éteint/allumé, l complexe de fer Π passant d'un état de bas-spin à un état de haut-spin sous l'influence d'un stimulus réducteur.
Les complexes selon l'invention permettent de détecter/imager un stimulus chimique ou biochimique permettant la réduction d'un groupe O2 présent sur ie cycle :
Figure imgf000012_0001
en position i et/ou 3 du complexe, par imagerie par résonance magnétique (IRM), Les complexes selon iinvention n'émettent un signal détectable en IRM qu'après leur rencontre avec ledit stimulus qui entraine une transformation du complexe avec passage d'une entité de bas- spin qui est donc dîamagnétique, à une entité de haut-spin qui est donc îaramagnétlqye. Le Schéma i ci-dessous lustre le processus mis à profit Jans le cadre de linve
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Figure imgf000013_0002
Le complexe ferreux (I) selon l'invention es schématisé sous la forme d'une molécule cage qui entoure le centre métallique. Cette molécule cage comprend six atomes d'azote qui se coordinent au fer dans une architecture GCtaédnque (illustrée par des lignes points nées).
Dans les complexes selon l'invention,, un des atomes d'azote se distingue des cinq autres du fait : (i) qu'il fait partie d'un hétéroeyele de type azoie et (2) que cet azoie fait partie d'un motif amlnal (N,N~acétai) constitué également par un atome d'azote appartenant au Iigand pentadenté formant le reste de Sa molécule cage qui complexe Sfatome de fer, L'ami nai mixte qui en résulte conduit,, en présence d'un stimulus donné,, à une dégradation spontanée qui libère un site de coordination sur le centre métallique et permet ainsi d'accueillir une molécule d¾au. Cette transformation change l motif de coordination de l'atome de fer qui passe de !,N6" à "Ν50Γ. Le fer, très sensible à ce changement, ne peut plus maintenir son état de bas-spin initial et passe à un état de haut-spin, ce qui le rend ainsi détectable en IRM notamment. Une telle modification, déclenchée par un stimulus chimique/biochimique,, est rendue possible grâce à la présence de i'espaceur sélectionné sous la forme du cycle :
Figure imgf000014_0001
porté par un motif arninal mixte et stabilisé par dans la sphère de coordination d'un centre ferreux,
composés selon l'invention peuvent être préparés par analogie aux présentées dans tes exemples et selon le Scliéma 2 suivant.
Figure imgf000014_0002
instabie à !^drd se
Figure imgf000014_0003
On formera intermédial rement une molécule cage instable en milieu aqueux. Le complexe ferreux sera alors formé grâce à un sel ferreux du type tetrafiuoroborate,, par exemple.
Les complexes selon l'invention sont adaptés à la détection par I H de cibles biomacromoléculaires du type enzyme nitroréductasef qui sont le plus souvent présentes in vivo à de très faibles concentrations, ce qui était un challenge compte-tenu de la faible sensibilité de détection de cette technique. En effet, il n'existe actuellement pas de moyens exploités commercialement permettant à un bioiogiste ou un radiologue de mettre en évidence la présence d'une quelconque activité enzymatique avec ia modalité IR et l'invention propose donc une solution tout à fait intéressante.
Les complexes selon l'invention sont parfaitement adaptés pour réaliser de {Imagerie moléculaire in vivo, par imagerie par IRM, Ils présentent une bonne stabilité en milieu aqueux à 37°C notamment et, en particulier, dans des milieux physiologiques présentant un pH de l'ordre de 7,4, ou plus généralement dans des solutions aqueuses de pH appartenant à la gamme allant de 7 à 8,
Notamment du fait de leur grande stabilité, ils ne produisent pas de bruit de fond et conduisent donc à une bonne sensibilité de détection. Cette absence de bruit de fond conduit à des résultats d'imagerie qui sont donc très facilement interprétables, du fait du passage d'une absence de signal à Sa génération d'un signai IRM sous l'action du stimulus entraînant la réduction de ia fonction -NOs présente sur le complexe au niveau des positions Ri et/ou R3,
Les complexes (ï) selon l'invention réagissent à des stimuii chimiques/biochimiques réductifs, et permettent de réaliser notamment un suivi de phénomènes biochimiques impliquant des nitroréductases in vitro ou in vi Pour les applications in vitro, de manière classique, l'échantillon à étudier et le complexe (ï) pourront être placés dans une solution aqueuse tamponnée. Une telle détection in vitm peut, par exemple, être utilisée pour la détection de bactéries présentant une activité nitroréductase telles que notamment les bactéries du genre Escherfcnia, Shigella, Saimoneifa, Serratta, Enterobacter Otœbacter, Klebsieila, Protsus, Providentiel Morganeilaf Yersinia Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, Enûenxoccus, Staphyiococcus, Streptxoccus, Listeria, 8acÊusf Candida Cryptococcus ou Sacdœromyœs.
Les complexes (I) selon linvention permettent, par exemple de détecter une enzyme nitroréductase en tant que produit d'un gène rapporteur. Les complexes selon linvention permettront de mettre en évidence l'expression d'un gène spécifique au sein d'une cellule ou d'un animal génétiquement modifié, pour des applications en recherche médicale. Une transformation du génome par l'insertion d'un gène encodant pour une enzyme nitroréductase bactérienne (« MTR ») pourra être détectée dans ie tissu qui exprime ce gène MTR grâce aux complexes selon l'invention. Les complexes selon l'invention peuvent donc permettre de suivre l'expression de la nitroréductase (MTR) utilisée comme système gène rapporteur (système ayant une bonne biocompatiblltté et n'ayant pas de toxicité rapportée dans les cellules de mammifères),
L'activation des complexes (ï) seion l'invention et i'apparition d'un signal IR peuvent également être causés par un milieu hypoxique, tels que des tissus cancéreux. Les complexes selon linvention pourront donc être utilisés pour suivre i'hypoxie de tissus cancéreux*
Pour les applications in ivo, une solution aqueuse du complexe selon linvention pourra par exemple, être injectée directement au niveau des tissus ou cellules cancéreux ou par vole intraveineuse ou autre.
Par ailleurs, contrairement à des sondes passives/non-aetivables qu'il serait nécessaire de greffer sur leur cible dans un rapport î/l, dans le cas de linvention le suivi de l'enzyme nitroréductase met à profit te phénomène d'amplification enzymatîque, c'est à dire qu'une seule molécule d'enzyme cible peut entraîner la transformation de milliers de complexes (I) selon linvention, ce qui permet d'abaisser considérablement te seul! de détection de l'enzyme par IRM.
De plus, les complexes selon linvention étant à base de fer, lis peuvent être utilisés en quantité suffisante pour correspondre à un niveau de détection supérieur au seuil de détection imposé par l'imagerie IRM. En effet, le fer est un ion métallique géré hornéostatiquement par le corps, En effet, si l'ion métallique est accidentellement libéré de sa molécule cage formée par les ligands aminés, lion ferreux sera géré par le corps et, ainsi, recyclé par des voies biochimiques.
Par ailleurs, les complexes selon l nvention présentent un rapport taille/poids comparable à celui d'un médicament de 600 à 900 g/mol, ce qui ne correspond donc pas au rapport tailie/poids rencontré dans tes nanotechnologies, Ceci a pour conséquence que la vitesse de diffusion des complexes selon l'invention est pius importante que celie obtenue avec les nanotechnologies offrant des solutions IRM sous ia forme de nanoparticuies. De piusf leur voie d'évacuation est différente de celle des nanopartîcules.
Les complexes selon l'invention trouvent donc de nombreuses applications notamment dans des activités de recherche en sciences de ia vie, en di nique dans des services de radiologie IRM, pour des applications en cancérologie, caractérisation, compréhension de maladies génétiques, ou de suivi thérapeutique, ou encore dans des gels aqueux exploités pour des technologies ayant besoin d'un interrupteur moléculaire.
Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer ilnvention,
La Figure 1 représente la structure du complexe Li obtenue par diffraction des rayons X sur monocristal,
La Figure 2 représente la structure du complexe 1.2 obtenue par diffraction des rayons X sur monocristal.
La Fîgyre 3 représente la structure du complexe L3 obtenue par diffraction des rayons X sur monocristal
La Figure 4 présente les spectres de masse obtenus en fonction du temps mettant en évidence la transformation du complexe Li en complexe ILi sous l'action d'une enzyme nîtroréductase,
La Figure 5 présente les spectres de masse obtenus en fonction du temps mettant en évidence la transformation du complexe 1,1 en complexe ILI sous l'action d'hydrogène, en présence d'un catalyseur Pd/C et la Figure 6, les spectres de masse obtenus à t=O et 2411, en l'absence de conditions réductrices,
La Figure 7 présente l'évolution du temps de relaxation longitudinal Ti (secondes) des spins nucléaires d'hydrogène de i'eau en fonction du temps (min.), obtenu avec ie complexe 1.1, avec, et sans conditions réductrices Hj- Pd/C La Fig re 8, quant à elle, présente les images fantômes (IRM à 7 Testa) de solutions d'incubation du composé I.i dans le cas de l'action de ia nitroréductase (hydrogénation catalysée par de Pd/C (5%) dans de tampon PBS (coionne gauche) ; contrôle négatif en absence d'un stimulus réducteur (colonne centrale) ; niveau de contraste de PBS pur (colonne droite) ; contrôle positif d'une solution d'un agent de contraste passif utilisé en clinique (« Dotarem » à 4 m H dans du PBS â 50 mM ; e bas),
La Figyre 9 présente Se % de viabilité en fonction de la concentration en composé Li concentrations en mH (chaque expérience ayant été répétée six fois) de cellules HeLa (lignée cellulaire immortelle et cancéreuse issue du cancer cervical).
Les abréviations suivantes sont utilisées :
HPLC - Chromatographie en phase liquide à haute performance,
MTR ~ nitroréductase
IRM ~ Imagerie par Résonance Magnétique
M = Résonance Magnétique Nucléaire
LC-MS - chromatographie liquide couplée à une détection par spectrométrie de masse
L
Le substrat Ll est préparé comme décrit sur le Schéma 3 ci-dessous, Schéma 3 : synthèse chimique de l'exemple 1.
DPTACN
Figure imgf000019_0001
instable à i'hyctroiy
Figure imgf000019_0002
Dans un monocol de 50 ml, à une solution de 25 ml de benzène contenant 0,8 g de DPTACN (Stavila, V.« Âllali, M Canapie, L, Stortz, Y., Franc, C, aurln, P., Beuf, <X, et al. (2008). Signîficant reiaxivil gap bet een a iow-spln and a high-spirs iron(l!) compiex of structural simiianty; an attractive off/on System for the potentiel design of responsive MRI probes. New J Chem, 32s 428-435} fraîchement synthétisé est ajouté 0,38 g (1,5 éq) de p-nitro benzaldéhyde et 0,145 ml (1,5 éq) de 1,2,3-triazoie commerciaux. Un appareil de Dean-Stark avec siphon est adapté sur le ballon à monocol et un reflux de 18 heures est maintenu, au bout desquels le brut réactionnel est amené à température ambiante sous argon, avant d'y ajouter une solution de sels de Fer (ÎI) anhydres ([FeCBF-th 6 eCN]) dans l'acétonltrile. La titratlon du Iigand synthétisé (présenté entre crochets dans le SCHEMA de synthèse) par les sels ferreux est suivie par LC-MS et la solution est agitée pendant 15 minutes avant d'être filtrée. Les solvants sont évaporés sous pression réduite, puis repris dans un minimum de mélange eau/acétonitrile (95/5, y / ), afin d'être déposés sur une cartouche à silice phase-inverse (C18) pré-conditionnée avec de î'acétonîtriie (2 volumes de cartouche), puis par de l'eau (2 volumes de cartouche). Après élution avec 250 ml d'eau pure, un gradient progressif eau/acétonitrile (99/ i jusqu'à 90/10, v/v) est établi, au bout duquel plusieurs fractions de couleur rouge intense sont collectées. Les diverses fractions rouges sont analysées par LC-MS et rassemblées, puis Téluant est évaporé sous pression réduite pour conduire à une résine rouge. Celle-ci est recristailisée par diffusion liquide-liquide Cacétonitriie-éther) à 4°C dans des tubes en pyre de 50 ml, conduisant après plusieurs jours à l'obtention de cristaux rouge bourgogne qui sont coiiectés pour fournir 0,55 g (29%) d'une poudre micro cristalline d'une pureté de 100 %.
La structure du composé 1.1 a été établie à partir d'une analyse par diffraction des rayons-X d'un monocristal et est présentée Figure 1. Par souci de clarté et pour faciliter l'interprétation de limage présentée Figure 1, les atomes d'hydrogène ont été omis, sauf ceux du bras comprenant ie triazole et le nitro-phényle.
Figure imgf000020_0001
Le composé 1,2 a été préparé de manière analogue au composé 1.1, en remplaçant ie 1,2,3-trlazole par ie 1,2,3-benzotriazo!e,
La structure du composé 1.2 a été établie à partir d'une analyse par diffraction des rayons-X d'un monocristal et est présentée Figure 2. Par souci de clarté et pour faciliter l'interprétation de limage présentée Figure 2, les atomes d'hydrogène ont été omis,, sauf ceux du bras comprenant le triazole et le nitro-phényle. muîe 3 ; Préparation du substrat 1.3 réiMffldant à la form le fil
Le substrat 1.3 est préparé comme décrit sur le Schéma 4 ci-dessous. Schéma 4 : synthèse chimique de l'exemple L
DPTÀCN
ir»sî3i>te à !ftydrcsiyse
étape 2:
e
Figure imgf000021_0001
Dans un ballon à monocol de 50 mL contenant une solution de 15 mL de dichforométhane anhydre et 0,4 g de DPTÂCN fraîchement synthétisé, sont ajoutés 2,5 g de tamis moléculaire 3 kf 0,11 mL de triazole (1,5 éq) et 0,3 g de 5-nitrothiophène~2"Carboxaldéhyde (1,5 éq), Cette solution est agitée, sous atmosphère inerte pendant 15 heures à température ambiante avant d'être titrée par une solution de sels de Fer (Π) anhydres dans acétonitriie et agitée pendant quelques minutes avant d'être filtrée. Les solvants sont évaporés sous pression réduite, puis repris dans un minimum de mélange eau/acétoni rite (95/5, v/v), afin d'être déposés sur une cartouche à silice phase-inverse (C1S) pré-conditionnée. Après élution avec 150 mL d'eau pure, un gradient progressif eau/acétonltrile (99/1 jusqu'à 90/10, v/v) est établi, au bout duquel plusieurs fractions de couleur rouge intense sont collectées. Les diverses fractions rouges sont analysées par LC- HS et rassemblées^, puis i'éiuant est évaporé sous pression réduite pour conduire à une résine rouge. Celle-ci est recristaîlîsée par diffusion liquide- vapeur (acétonitrile-éther) à 4 °C dans des tubes à hémolyse, conduisant à des cristaux rouge bruns qui sont collectés pour fournir 0,12 g (12,5%) de produit d'une pureté de 100 %.
La structure du composé 13 a été établie à partir d'une analyse par diffraction des rayons-X d'un monocristal et est présentée Figura 3, Par souci de clarté et pour faciliter l'interprétation de l'image présentée Figure 3f les atomes d'hydrogène ont été omis sauf ceux du bras comprenant le triazole et le nitro-thiophènyle,
Les différentes analyses par diffraction des rayons X présentées ont été réalisées comme suit ;
Un cristal approprié est sélectionné et monté sur un diffractometre Gemini kappa-geometry diffractomètre (Agitent Technologies UK Ltd) équipé avec un détecteur Atlas CCD et utilisant une radiation Mo (λ·= 0.71073 Â). Les intensités sont mesurées à 100 K grâce au logiciel CrysalisPro software (ÇrysAlisPro, Agitent Technologies, Version 1.171,34.49 (release 20-01-2011 OYsAlisl71.NET) (compilée! Jan 20 2011,15:58:25), tout comme la détermination des indices de réflexion, raffinement des paramètres par cellule unique, de la correction de Lorentz-polarîsation, de l'intégration des pics et du bruit de fond- Une correction d'absorption analytique est appliqué en utilisant les faces modélisées du cristal (R.C. Clark, 3,S, eîd Acta Qyst 1995, A52f 887-897), Les structures sont résolues par method directe avec SI 97 (A, Altomare, MX, Buria, M, Camalit, G.L Cascarano, C. Gacovazzo, Â. Guagliardi, Â, Grazia, G. Mofiterni, G, Polidori, FL Spagna 1 App. Qyst 1999, 32, 115-119) et la méthode des moindres carrés sur F2 est effectué avec ie iogicile CRYSTALS (P.W. Betteridge, j.R. Carruthers, R.L Cooper, K. Prout DJ. Watkin 1 AppL Qyst. 2003, 36, 1487),
Tous ies atomes autres que les atomes d'hydrogène sont définis anisotropiquement Tous les atomes d'hydrogène sont localisés sur une carte différente, mais ceux attachés à un atome de carbone sont repositionnés géométriquement. Les atomes d'hydrogène sont Initialement positionnés avec de faibles contraintes sur ies longueurs de liaison et les angles pour harmoniser leur géométrie {C— H dans ia gamme 0.93-0.98 et — H dans la gamme 0,86-0.89 Â) et Uiso(H) (dans la gamme i «2-1.5 fols l'Ueq de l'atome parent), après que les positions aient: été affinées avec des contraintes du modèle de sding.
Figure imgf000023_0001
instable à l'hydrolyse
Figure imgf000023_0002
{M + HCOO : m « 604.0
Le complexe 1,4 a été synthétisé selon le protocole de l'exemple 3 ci- dessus en remplaçant le 5~nitrothiophène~2~carboxaldéhyde par I e 5- nitrafurane-2~carboxaldéhyde (commercial). Le spectre de masse obten présente que deux pics de forte intensité â m/z = 279,5 et à m/z = confirme la formation du complexe attendu.
3,0 mg du complexe Ll sont dissous dans 1 mL (4 mM) de tampon sphate salin (50 mH PBS), auxquels on ajoute i mg d'enzyme nitroréductase et 35 mg (12,5 éq) de ADH (commercial). On laisse évoluer à 37 °C la solution pendant plusieurs heures et la réaction est suivie par LC- HS à intervalle régulier.
L'attribution des pics de masse apparaissant sur les spectres de niasse et correspondant eu déclenchement du processus engagé par l'action de la nitroréductase sont présentés sur le Schéma 5 ci-après.
Figure imgf000024_0001
[M + Ci]* '. ÎÏSAE = &74.1 ·> GÎVs- : m z - 402.0;
P + HCOO - : m'z = 584.2 + HCOO]- : m/z = 412.0.
Les spectres de masse obtenus à t=0, 30mn, 2h et 4h sont présentés
Protocole cFactivatîOT par H¾ Pd/C {Images IR.M) :
3,0 mg du complexe Lî sont dissous dans 1 ml (4 mM) de tampon phosphate salin (50 mM PBS), auxquels on ajoute 10 mg de Pd/C (5% w/w). On fait bufier pendant 10 minutes de l'hydrogène avec une aiguille, puis on vérifie au LC-MS que la totalité du complexe de départ a bien été réduite. La solution est ensuite filtrée et après vérification du H, on laisse ensuite évoluer la solution pendant plusieurs heures à 37 °C, et on prend une Image (ou on mesure les temps de relaxation ou on effectue une injection au LC- MS) du tube à intervalle régulier.
L'attribution des pics de masse apparaissant sur les spectres de masse et correspondant au déclenchement du processus engendrée par l'hydrogénation catalytique qui mime l'action de la nitroréductase sont présentés sur le Scf éma 6 ci-après»
Figure imgf000025_0001
\ -f- Cij+ : m/z « 402.0;:
Les spectres de masse obtenus à t~0f 10mnr 80mn et 120mn sont présentés Fîg ra 5. Cela confirme donc que bien que les étapes intermédiaires soient différentes, l'hydrogénation catalytique conduit au même complexe final que l'action de la nitroréductase. 2
La Figyre i, quant à elle, présente ies spectres de masse obtenus à t~ 0 et 24h dans les mêmes conditions, mais en l'absence de conditions réductrices (ni hydrogénation, ni MTR ADH) et joue donc ie rôle de contrôle.
Les différentes analyses par spectrométrie de masse présentées ont été réalisées comme suit :
Un échantillon issu directement de l'incubation de la sonde avec le stimulus chimique/biochimique est injecté dans un spectromètre de masse de type Agitent HSD 1100, Les spectres affichés ont été mesurés selon le mode « scan » et par ionisation positive dans une source de type electrospray.
IIL ISE EU EVIDENCE DU PASSAGE D*UH SIGNAL I M
Figure imgf000026_0001
L'hydrogénation catalytique conduisant au même complexe final que l'action de la nitroréductase, ces essais ont été réalisés, pour des raisons pratiques, en utilisant l'hydrogénation catalytique (conformément au protocole précédemment décrit), à la place d'un stimulus dû à l'action de la nitroréductase. Ces essais réalisés avec le composé I.i sont, cependant, tout à fait représentatifs du signal IRM obtenu par action de la nftroréductase.
La Figure 7 met en évidence évolution du temps de relaxation longitudinal Ti (secondes) des splns nucléaires d'hydrogène de l'eau en fonction du temps (min.), dans le cas d'une hydrogénation catalytique par du Pd/C à 5 % w/w è 37 °C) (courbe losange), en l'absence de stimulus réducteur (courbe carré). Le niveau de Tl du PBS à 50 mH est également présenté (tirets),
La Fig re 8, quant à elle, présente les images fantômes {IRM à 7 Tesla) de solutions d'incubation dans le cas de l'action de la nitroréductase (hydrogénation catalysée par de Pd/C (5%) dans de tampon PBS (colonne gauche) ; contrôle négatif en absence d'un stimulus réducteur (colonne centrale) ; niveau de contraste de PBS pur (colonne droite) ; contrôle positif d'une solution d'un agent de contraste passif utilisé en clinique (« Dotarem » à 4 mH dans du PBS à 50 rnM ; en bas). Les résultats présentés Figyre 8 montrent que le complexe Ll répond à un stimulus réducteur via une actlvatlon do signai en I M, Le. un hypersignal qui atteint un niveau de gris clair. Ce niveau de gris est d'intensité approchant celui du Dotarem, agent de contraste clinique passif utilisé dans ie domaine du diagnostic anatomique.
Les différentes analyses par IRM présentées ont été réalisées comme suit :
L'acquisition IRM est menée sur des échantillons de différentes concentrations en complexe 1.1, en utilisant un système 7 T Biospec System (Bruker, Ettlingen, Allemagne) associé à une spire de 32 mm de dîameter interne ( apsd Biomédical, Wûrzburg, Allemagne). Le temps de relaxation longitudinal Tl theist mesuré avec la séquence IR-FISP (de l'angaits « Inversion-Recovery Fast îmaging with Steady-State Precession »). Les paramètres d'Imagerie sont : TR/TE = 4.2/2.1 ms, temps d'inversion Ή ™ (68 + 1 x 50) ms avec î = 0, 1, 32. Les paramètres géométriques sont : 40 x 40 mm2 OV, lame d'épaisseur 5 mm et taille de matrice 256 x 192 . Les valeurs de Tl sont obtenues avec des images multiples Tl en appliquant une fonction mono-exponentielle aux données. IV-TEST DE VIABILITE CELLULAIRE EN PRESENCE DU COMPOSE 1.1
Des cellules Hela (lignée cellulaire immortelle et cancéreuse issue du cancer cervicai, no, 93021013 SIGNA-AIdrich), à raison de 10.000 cellules HeLa par puit, ont été incubées pendant 24 h dans un milieu D EM avec 10 % sérum FCS, avec ajout de différentes concentrations (de 4mM à 0,25 mM) de composé 1.1. La Figure 9 présente dans chaque colonne le taux de survie obtenue en fonction des concentrations en mH (chaque expérience ayant été répétée six fois) .
Il ressort de ces résultats que ie composé 1,1 ne montre pas de toxicité sur les cellules, même à une concentration élevée de 4 mH.
En conclusion,, les résultats présentés avec le complexe 1.1 et qui peuvent être généralisés à l'ensemble des complexes revendiqués mettent en évidence une séquence reconnaissance/activatlon sélective et rapide par la nltroréductase (activité qui peut être mimée par des réducteurs chimiques tels que l'hydrogène en présence d'un catalyseur te! que ie palladium sur charbon). Uactlvatîon peut être réaiîsée à pH physiologique, compte-tenu de la stabilité constatée en solution aqueuse. En l'absence de stimuEi réducteur, une absence d'augmentation de reiaxîvite (en IRM ou RMM) ou d'apparition de produits de dégradation (suivi par HPLC couplée à ia spectrometrie de masse) a été constatée,, validant le mode d'action OFF/ON.

Claims

2i
1 - Complexes de formule (î)
Figure imgf000029_0001
5 d î
Figure imgf000029_0002
est un hétérocycle hydrocarboné insaturé, substitué ou non substitué, azoté comprenant de 5 à 6 chaînons et pouvant comprendre au moins un autre atome d'azote ou un atome d'oxygène ou de soufre, l'atome d'azote représenté de type Imine présentant un doublet libre qui lui permet 10 de se coordiner au fer,
- Yi est un atome d'azote ou CH,
- Ύ î est un atome d'azote, CH, ou un atome de carbone,
- -Z- représente
Figure imgf000029_0003
-0~ ou ~S~,
- î¾ est un atome dfhydrogènef ou un groupe -CF3 ou -NG2 ; ou bien lorsque Î5 Y2™ Cf g est lié à Y2 et à Itiétérocyde pour former un groupe :
Figure imgf000029_0004
2 :;9
- Ri, ¾ί s et Rg représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fluor ou iode, ou un groupe choisi parmi les groupes™ G2, les groupes alkyîe substitués ou non substitués, les groupes aîcoxy substitués ou non substitués, les groupes ~C(0)aikyie substitués ou non substitués, les groupe ~C(G)Galkyle substitués ou non substitués, ies groupes aminés primaires, secondaires ou tertiaires substitués ou non substitués ; étant entendu que i et/ou î¾ représente(nt) -UQ2?
ainsi que leurs sels.
» Complexes (I) selon la revendication I caractérisés en ce que
Figure imgf000030_0001
correspond à i'une des structures suivantes :
Figure imgf000030_0002
3 ~ Complexes (I) selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce que ¾, R2- f R3, R¾ s et Rg représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fluor ou iode, ou un groupe™NO¾ (Q- Cs)alkyie, (Ci-C6)aScoxyî ~C(0)(C C6}alkyiei
Figure imgf000030_0003
-NRaRb avec Ra et Rb qui représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (CrCs)aikyle ; étant entendu que ¾ et/ou R3 représentée nt) - Ο2·
4 - Complexes (I) selon l' ne quelconque des revendications 1 à 3 caractérisés en ce qulls répondent à la formule (la) :
Figure imgf000031_0001
5 - Complexes selon ia revendication 4 caractérisé en ce que F - s-H,
6 ~ Complexes (I) selon Tune quelconque des revendications 1 à 5 actérisés en ce qu Z est un atome d'oxygène ou un atome de soufre.
7 ~ Complexes (1) e quelconque des revendications 1 à 6
Figure imgf000031_0002
risés en ce que est un groupe pyridyle,
S - Complexes (I) selon l'une quelconque des revendications i à 7 caractérisés en ce que Ri =Ν(¼.
9 - Complexes selon la revendication 8 caractérisé en ce que ¾-H.
W ~ Complexes selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisés en ce que z-H,
îi - Complexes (I) selon Tune quelconque des revendications 1 à 10 caractérisés en ce que i
Figure imgf000031_0003
représente un groupe
Figure imgf000032_0001
RQ étant un atome d'hydrogènef ou un groupe -€F3 ou -M02 et étant, de préférence, un atome d'hydrogène.
12 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qull est choisi parmi :
Figure imgf000032_0002
13 - Complexes (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la détection in vivo chez Fhomme ou ranimai, par IRM, d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction de la fonction -NO2
Figure imgf000033_0001
correspondant au substituant Rt ou ¾ du cycle : tel que défini dans les revendications 1 à 9.
14 - Complexes (I) selon la revendication 13 caractérisés en ce que le stimulus est une enzyme nitroréductase.
15 - Complexes (I) selon la revendication 14 caractérisés en ce que la nitroréductase est produite par un gène rapporteur dont on souhaite assurer le suivi.
16 - Complexes (I) selon la revendication 13 caractérisé en ce que le stimulus est une hypoxle de tissus cancéreux.
17 - Procédé de détection in vitro ou ex vivo d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -~NC¾ dans un èchantiilon d'intérêt comprenant les étapes successives suivantes :
a) La mise en présence de l'échantillon d'intérêt avec un complexe selon l'une des revendications 1 à 12, en milieu aqueux,
b) La détection d'un signal généré, suite à la réduction de la fonction ~H02 correspondant au substituant Rt ou R3 du cycle :
Figure imgf000033_0002
du complexe (I), tel que défini dans les revendications i à 12, sous l'action du stimulus chimique ou biochimique,
18 - Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que le stimulus chimique ou biochimique est une enzyme nitroréductase.
19 » Procédé selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon biologique de pH physiologique. 20 » Procédé selon Tune des revendications 17 à 19 caractérisé en ce que la détection est réalisée à étape b) par RMHf IF
chromatographie à haute performance couplée à la spectrométrie de masse.
21 - Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que !e signai détecté correspond à la concentration du complexe (II) :
Figure imgf000034_0001
( ou d'un de ses seis,
Figure imgf000034_0002
étant tel que défini à la revendication 1, 2 ou 7;
ou bien au temps de relaxation et/ou à la relaxîvité obtenue par RM ou I dudit complexe (II), ou d'un de ses sels.
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