FR2994181A1 - Nouveaux complexes de fer adaptes a la detection d'une entite chimique ou biochimique nitroreductrice, en particulier par irm in vivo et procede de detection in vitro - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des complexes de formule (I) : tels que définis à la revendication 1, ainsi que de tels complexes pour la détection in vivo par IRM d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -NO , ainsi que les complexes résultant de leur transformation et un procédé de détection in vitro d'un stimulus chimique ou biochimique entrainant la réduction d'une fonction -NO présente sur le complexes de formule (I).

Description

9 9 4 1 8 1 1 La présente invention concerne le domaine technique de la détection d'une enzyme nitroréductase ou d'autres entités chimiques ou biochimiques nitroréductrices. Plus précisément, l'invention concerne des complexes ferreux qui constituent les premiers exemples d'une sonde magnétogénique pour la détection de ce type d'activité, de tels complexes pour la détection in vivo par IRM d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -NO2, ainsi qu'un procédé de détection in vitro d'un stimulus chimique ou biochimique entrainant la réduction d'une fonction -NO2. La détection de nitroréductase a donné lieu à différents travaux. On peut notamment citer la demande WO 2011/012823 qui propose un substrat pour des analyses in vitro permettant de mettre en évidence une activité enzymatique nitroréductase grâce à un changement de couleur ou de fluorescence. D'autres systèmes utilisant la fluorescence pour la détection de nitroréductases sont également décrits dans la demande de brevet EP1252520 (A2), dans le brevet US 7,579,140 qui décrit une sonde CytoCy5 fluorescente pour la détection des bactéries E. Coli exprimant la nitroréductase (E.Coli NfsB) dans des lignées cellulaires. La 6-nitroquinoline est aussi utilisée, comme sonde fluorogène, pour le même type d'applications (Singleton et al, Cancer Gene Ther. 14 (12), 2007, 953-967). On peut également citer la demande WO 2011/012823 qui propose un substrat pour des analyses in vitro permettant de mettre en évidence une activité enzymatique nitroréductase grâce à un changement de couleur ou de fluorescence. L'utilisation de la 6-chloro-9-nitro-5-oxo-5H- benzo(a)phénoxazine (CNOB) pour la détection de l'expression de E. Coli nitroreductase NfsB (qui transforme la CNOB en aminophénoxazine détectable à 625 nm) dans des tumeurs de souris exprimant E.Coli NfsB a également fait l'objet de publications (Liu et al, Cancer Res 68, 19, 2008, 7995-8003 et Lei Cui et al, Organic Letters, 13, 2011, 928-931). Cependant, de tels substrats sont peu adaptés pour des analyses in 30 vivo. En effet, la fluorescence pose des problèmes de diffusion et d'atténuation/pénétration tissulaire du signal qui aboutissent à une mauvaise résolution spatiale (de l'ordre de plusieurs millimètres). Ses applications in vivo sont donc très limitées, et concernent en général des tumeurs de surface sous-cutanées. Or, la détection des nitroréductases présentent également un intérêt in vivo. Tout d'abord, les nitroréductases sont impliquées dans l'hypoxie. En effet, lorsque des cellules perdent brutalement leur alimentation en oxygène, elles meurent rapidement en général. Par contre, lorsque la teneur en oxygène diminue de manière progressive (cas des tumeurs hypoxiques, notamment), les cellules vont s'adapter via la production de protéines qui vont leur permettre de survivre en inhibant le processus d'apoptose, ou 10 encore en favorisant la vascularisation et en diminuant l'activité des mitochondries. La meilleure façon de mesurer la présence de l'hypoxie serait d'utiliser une sonde qui rentre directement en compétition avec la fourniture de la cellule en oxygène (Krohn et al. « Molecular Imaging of Hypoxia » ; 2008, J. Nuci. Med. ; 49 :129S-148S). De nombreuses nitroréductases ont 15 été trouvées dans les tissus, de sorte qu'une sonde pour une activité nitroréductase s'avère être un bon candidat. En effet, avec une telle sonde, plus il manquera d'oxygène pour accepter tous les électrons produits par la chaine de transport électronique du système de respiration cellulaire, plus la sonde sera transformée (réduite). 20 Afin d'éviter le recours à des biopsies qui ne sont pas toujours réalisables selon la localisation de la pathologie et qui ne peuvent en tout cas pas être réitérées de nombreuses fois, les tumeurs hypoxiques sont repérées préférentiellement par une méthode d'imagerie non-invasive. Actuellement la seule méthode employée et celle de la Tomographie par Emission de 25 Positrons (TEP). Des molécules traceurs qui présentent une unité nitro- hétéroaromatique et qui comportent également un atome radioactif ont été conçues. Le traceur le plus étudié est le 2-nitroimidazole marqué par du fluor 18 (EF5, FMISO...) pour cartographier les zones hypoxiques dans les tissus (The Journal of Nuclear Medicine, 49, 6, 2008, 129S-148S). Des études dans 30 le domaine de « virus-directed enzyme prodrug therapy » (VDEPT) utilisant la TEP ont été réalisées via la réduction de la 5-aziridiny1-2,4- dinitrobenzamide et d'autres dérivés nitrés ont également fait l'objet d'études par TEP (Singleton et al, Cancer Gene Ther 4, 12, 2007 953-967 ; Christofferson et al, Biochem Soc Trans, 37(2), 2009, 413-418). Mais, la technique TEP présente une faible résolution (de l'ordre de plusieurs millimètres), et fait appel à des rayonnements hautement ionisants. De plus, elle nécessite la préparation sur place des radio-pharmaceutiques utilisés. La détection de nitroréductases in vivo présentent également un intérêt pour la mise-en-évidence d'un gène spécifique dans un organisme vivant. Un gène bactérien nitroréductase (NTR) a été commercialisé, en tant que gène rapporteur (EP1252520). Sa mise-en-évidence se fait actuellement par réaction/incubation/contact avec une sonde fluorogènique (Gene Therapy (2012) 19, 295-302; doi:10.1038/gt.2011.101). Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir un substrat adapté à la détection d'une enzyme nitroréductase ou d'autres stimuli chimiques ou biochimiques qui présentent une activité nitroréductrice et qui utilisent d'autres techniques que la détection fluorimétrique et colorimétrique et la TER L'invention se propose également de fournir un substrat qui soit adapté à la détection in vivo et/ou en conditions physiologiques. L'invention concerne les complexes de formule (I) : N -N R3 (I) A /N N ____-- N' A , Fe2*- N / dans laquelle : - est un hétérocycle hydrocarboné insaturé azoté, substitué ou non substitué, comprenant de 5 à 6 chainons et pouvant comprendre un autre atome d'azote ou un atome d'oxygène ou de soufre, l'atome d'azote représenté de type imine présentant un doublet libre qui lui permet de se coordiner au fer, - Y1 est un atome d'azote ou CH, - Y2 est un atome d'azote ou CH, - -Z- représente -CHR4=CHR5-, -0- ou -S-, - R0 est un atome d'hydrogène, ou un groupe -CF3 ou -NO2 ; ou bien lorsque 10 Y2 est CH, R0 est lié à Y2 et à l'hétérocycle pour former un groupe : - R1, R2, R3, R4, R5 et R6 représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fluor ou iode, ou un groupe choisi parmi les groupes -NO2, les groupes alkyle substitués ou non substitués, les groupes 15 alcoxy substitués ou non substitués, les groupes -C(0)alkyle substitués ou non substitués, les groupe -C(0)Oalkyle substitués ou non substitués, les groupes amines primaires, secondaires ou tertiaires substitués ou non substitués ; étant entendu que R1 et/ou R3 représente(nt) -NO2, ainsi que leurs sels. 20 Les complexes (I) selon l'invention sont des chélates de fer(II) non- magnétiques (diamagnétiques) qui se transforment en milieu aqueux sous l'influence d'une activité nitroréductase ou analogue en un complexe magnétique (paramagnétique) et fonctionnent donc comme des sondes selon un mode éteint-allumé. La susceptibilité magnétique croissante due à une telle réaction peut être repérée par différentes méthodes de détection telles que les spectroscopies par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et Résonance Paramagnétique Electronique (RPE), ou encore les Imageries par Résonance Magnétique (IRM) et par Résonance de Spin Electronique (IRSE). La détection peut être réalisée in vivo, en fonction de la méthode de détection sélectionné, ou ex vivo ou in vitro sur des échantillons biologiques ou cellulaires notamment, placés sur des supports de détection adaptés, par exemple du type microplaques multi-puits.

Les complexes selon l'invention comportent un groupement nitroaryle, qui permet une réponse relativement spécifique à un stimulus biochimique tel que l'activité de nombreuses nitroréductases, mais aussi à des stimuli purement chimiques tels que les agents réducteurs. Selon des modes de réalisation particulier, les complexes (I) selon l'invention présentent une ou une combinaison des caractéristiques ci- dessous, voire toutes les caractéristiques ci-dessous lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre : correspond à l'une des structures suivantes : CD OH COO N Noc) R1, R2, R3, R4, R5 et R6 représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fluor ou iode, ou un groupe NO2, (C1-C6)alkyle, (C1-C6)alcoxy, -C(0)(C1-C6)alkyle, -C(0)0(C1C6)alkyle, -NRaRb avec Ra et Rb qui représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6)alkyle ; étant entendu que R1 et/ou R3 représente(nt) -NO2 ; Z est un atome d'oxygène ou un atome de soufre ou bien les complexes de formule (I) répondent à la formule (Ia) : N - Ns N I `-i-C--N / 9. I - R1 = NO2; dans ce cas, R3 est, par exemple, un atome d'hydrogène ; - R2 = H et/ou R5 = R6 = H dans le cas des composés de formule (1a) ; A N est un groupe pyridyle ; représente un groupe : Ro étant un atome d'hydrogène, ou un groupe -CF3 ou -NO2 et étant, de 10 préférence, un atome d'hydrogène. Les composés ci-dessous sont des exemples de complexes (I) selon l'invention. 1.3 N--- N \ / Fe --.- N Nil N7 N -N N.N)- 1.4 2+ La présente invention a également pour objet les complexes de formule (I) et (Ia), quelle que soit leur variante de réalisation décrite dans le cadre de la présente invention, pour la détection in vivo chez l'homme ou l'animal, par IRM, d'un stimulus chimique ou biochimique entrainant la réduction de la fonction -NO2 correspondant au substituant R1 ou R3 du cycle : tel que défini pour les complexes de formule (I). Selon un mode de réalisation préféré, le stimulus est une enzyme nitroréductase. Selon une première variante de mise en oeuvre, la nitroréductase est produite par un gène rapporteur dont on souhaite assurer le suivi. Selon une deuxième variante de mise en oeuvre, le stimulus est une hypoxie de tissus cancéreux.

L'invention a aussi pour objet les complexes obtenus à partir d'un complexe de formule (I) ou (Ia), quelle que soit sa variante de réalisation décrite dans le cadre de la présente invention, après réduction en milieu aqueux de la fonction -NO2, correspondant au substituant R1 ou R3.

En particulier, de tels complexes répondent à la formule (II) : 6DN /' N ' / , Fe2+ - N H d ) 0 - H H dans laquelle est tel que défini par les complexes de formule (I), et se trouvent éventuellement sous la forme d'un sel.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection in vitro ou ex vivo, dans un échantillon d'intérêt, d'un stimulus chimique ou biochimique entrainant la réduction d'une fonction -NO2, comprenant les étapes successives suivantes : a) La mise en présence de l'échantillon d'intérêt avec un complexe de formule (I), quelle que soit leur variante de réalisation décrite dans le cadre de la présente invention, en milieu aqueux, b) La détection d'un signal généré, suite à la réduction de la fonction -NO2 correspondant au substituant R1 ou R3 du cycle : du complexe (I), sous l'action du stimulus chimique ou biochimique. Selon un mode de réalisation préféré, le stimulus chimique ou biochimique est une enzyme nitroréductase. L'échantillon pourra être un échantillon biologique de pH physiologique. Selon des modes de réalisation préférés, la détection est réalisée à l'étape b) par RMN, IRM ou par chromatographie à haute performance couplée à la spectrométrie de masse. Le signal détecté correspond, dans ce cas, le plus souvent à la concentration du complexe (II) précédemment défini, au temps de relaxation et/ou à la relaxivité obtenue par RMN ou IRM du complexe (II). La description détaillée qui va suivre permet de mieux comprendre l'invention. En préliminaire, les définitions de certains termes utilisés dans le cadre de l'invention sont données.

Par groupe « alkyle », on entend une chaîne hydrocarbonée, saturée, linéaire ou ramifiée. A titre d'exemple de groupe alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, nommés (C1-C6)alkyle, on peut citer, notamment, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, tert-butyle, sec-butyle, n-pentyle, n-hexyle.

Lorsqu'il est indiqué qu'un groupe est « substitué », cela signifie qu'il est susbtitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode ou fluor, les groupes cyano, alkyle, trifluoroalkyle, trifluorométhyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alcoxy, aryloxy, -COOH. Les termes utilisés pour la définition de ces substituants sont ceux usuellement reconnus par l'homme du métier. Par « nitroréductase », on entend une enzyme capable de catalyser dans un milieux aqueux la réduction d'un groupe nitro-phényle ou nitro- hétéroaryle partiellement, ou totalement en amino-phényle ou aminohétéroaryle. Une telle action se produit, généralement, en présence de son 2ème substrat, le réducteur naturel cellulaire NADH (ou NADPH), ou, si l'on travaille dans un contexte ex vivo, en présence de certains autres substrats réducteurs tel que la cystéine, ou encore le 3-acétylpyridine-ribotide, le nicotineamide ribotide, le ribotide de l'acide nicotinique, et le 1- méthylnicotinamide (R. 3. Knox et al. « Virtual co-factors for an E. coli nitroreductase enzyme : relevance to reductively activated prodrugs in antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT), Biochem. Pharmacol. 1995, 49, 1641-1647). Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon issu d'un animal ou, de préférence, du corps humain, tel qu'un échantillon de sang, serum, urine, salive ... ou encore un échantillon alimentaire d'eau, de boissons, d'aliments quelconque. L'échantillon peut résulter d'un prélèvement direct ou obtenu à partir d'un prélèvement direct, notamment après une opération d'isolement et ou d'enrichissement. Les complexes selon l'invention présentent, en fonction des substituants, une charge globale neutre ou positive de +1 ou +2, notamment lorsqu'ils se trouvent dans une solution aqueuse de pH appartenant à la gamme allant de 7 à 8. Lorsqu'ils présentent une charge positive, ils pourront se trouver sous la forme d'un sel, et en particulier d'un sel physiologiquement acceptable. Ce sel peut comprendre un contre-ion, par exemple du type chlorure, carbonate, hydroxyde, perchlorate, tetrafluoroborate, sulfate ou phosphate.

Les complexes selon l'invention présentent une structure dans laquelle : (a) un atome de fer est complexé dans son état d'oxydation + II (« complexes ferreux ») et à état bas-spin / diamagnétique, qui conduit après activation à un complexe haut-spin / paramagnétique, (b) l'ion ferreux est complexé par des ligands multi-dentés comportant un 30 macrocycle et des bras coordinants, ce qui confère au complexe une très bonne stabilité, dans des applications in vivo, notamment, (c) le bras qui fait partie d'une fonction aminal mixte (N,N-acétal) comporte un hétérocycle de type azole (pyrazole ; 1,2,3-triazole ; 1,2,4-triazole ; et apparentés) qui permet la coordination de cet hétérocycle au centre ferreux et place ce dernier dans un état de bas-spin avant l'action d'un stimulus réducteur, (d) le bras de type aminal (N,N-acétal) comprend un cycle, du type phényle, thiophényle ou furanyle substitué par une fonction -NO2 réactive vis à vis d'une activité chimique/biochimique d'intérêt, telle que celle des enzyme nitroréductase, (e) le bras coordinant va subir une fragmentation spontanée suite à l'action d'un stimulus chimique (réactif tel que l'hydrogène en présence d'un catalyseur ou le dithionite) ou biochimique (enzyme nitroréductase) et va libérer un site de coordination sur le centre ferreux pour une molécule tierce faisant partie du milieu (préférentiellement une molécule d'eau), rendant ainsi le complexe haut-spin et donc visible en IRM, (f) le choix de la partie porteuse de la fonction -NO2 conduit à la génération d'un signal IRM selon un mode de fonctionnement éteint/allumé, le complexe de fer II passant d'un état de bas-spin à un état de haut-spin sous l'influence d'un stimulus réducteur.

Les complexes selon l'invention permettent de détecter/imager un stimulus chimique ou biochimique permettant la réduction d'un groupe NO2 présent sur le cycle : en position R1 et/ou R3 du complexe, par imagerie par résonance magnétique (IRM). Les complexes selon l'invention n'émettent un signal détectable en IRM qu'après leur rencontre avec ledit stimulus qui entraine une transformation du complexe avec passage d'une entité de bas spin qui est donc diamagnétique, à une entité de haut spin qui est donc paramagnétique. Le Schéma 1 ci-dessous illustre le processus mis à profit dans le cadre de l'invention : Schéma 1 stimulus chimique où biochimique substrat converti (substrat espaceur 'Fe ', éteint silencieux en IRM - bas-spin diamagnétique métastable H 'P:H H20 H20 spontané N(azole) substrat -(espaceur) converti N ALLUME actif en IRM haut-spin paramagnétique II Le complexe ferreux (I) selon l'invention est schématisé sous la forme d'une molécule cage qui entoure le centre métallique. Cette molécule cage comprend six atomes d'azote qui se coordinent au fer dans une architecture octaédrique (illustrée par des lignes pointillées). Dans les complexes selon l'invention, un des atomes d'azote se distingue des cinq autres du fait : (1) qu'il fait partie d'un hétérocycle de type azole, et (2) que cet azole fait partie d'un motif aminal (N,N-acétal) constitué également par un atome d'azote appartenant au ligand pentadenté formant le reste de la molécule cage qui complexe l'atome de fer. Laminai mixte qui en résulte conduit, en présence d'un stimulus donné, à une dégradation spontanée qui libère un site de coordination sur le centre métallique et permet ainsi d'accueillir une molécule d'eau. Cette transformation change le motif de coordination de l'atome de fer qui passe de "N6" à "N501". Le fer, très sensible à ce changement, ne peut plus maintenir son état de bas-spin initial et passe à un état de haut-spin, ce qui le rend ainsi détectable en IRM notamment. Une telle modification, déclenchée par un stimulus chimique/biochimique, est rendue possible grâce à la présence de l'espaceur sélectionné sous la forme du cycle : porté par un motif aminal mixte et stabilisé par l'inclusion dans la sphère de coordination d'un centre ferreux.

Les composés selon l'invention peuvent être préparés par analogie aux techniques présentées dans les exemples et selon le Schéma 2 suivant. Schéma 2 Ro On formera intermédiairement une molécule cage instable en milieu aqueux. Le complexe ferreux sera alors formé grâce à un sel ferreux du type tetrafluoroborate, par exemple. Les complexes selon l'invention sont adaptés à la détection par IRM de cibles biomacromoléculaires du type enzyme nitroréductase, qui sont le plus souvent présentes in vivo à de très faibles concentrations, ce qui était un challenge compte tenu de la faible sensibilité de détection de cette N-N R3 I stable à l'hydrolyse Ro instable à l'hydrolyse (ADN HN Y1N L Y; étape 2: Fe(X)2 étape 1 : R2 H2O o technique. En effet, il n'existe actuellement pas de moyens exploités commercialement permettant à un biologiste ou un radiologue de mettre en évidence la présence d'une quelconque activité enzymatique avec la modalité IRM et l'invention propose donc une solution tout à fait intéressante.

Les complexes selon l'invention sont parfaitement adaptés pour réaliser de l'imagerie moléculaire in vivo, par imagerie par IRM. Ils présentent une bonne stabilité en milieu aqueux à 37°C notamment et, en particulier, dans des milieux physiologiques présentant un pH de l'ordre de 7,4, ou plus généralement dans des solutions aqueuses de pH appartenant à la gamme allant de 7 à 8. Notamment du fait de leur grande stabilité, ils ne produisent pas de bruit de fond et conduisent donc à une bonne sensibilité de détection. Cette absence de bruit de fond conduit à des résultats d'imagerie qui sont donc très facilement interprétables, du fait du passage d'une absence de signal à la génération d'un signal IRM sous l'action du stimulus entrainant la réduction de la fonction -NO2 présente sur le complexe au niveau des positions R1 et/ou R3. Les complexes (I) selon l'invention réagissent à des stimuli chimiques/biochimiques réductifs, et permettent de réaliser notamment un suivi de phénomènes biochimiques impliquant des nitroréductases in vitro ou in vivo. Pour les applications in vitro, de manière classique, l'échantillon à étudier et le complexe (I) pourront être placés dans une solution aqueuse tamponnée. Une telle détection in vitro peut, par exemple, être utilisée pour la détection de bactéries présentant une activité nitroréductase telles que notamment les bactéries du genre Escherichia, Shigella, Salmonella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Kiebsiella, Proteus, Providentiel, Morganella, Yersinia, Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Bacillus, Candida, Cryptococcus ou Saccharomyces.

Les complexes (I) selon l'invention permettent, par exemple, de détecter une enzyme nitroréductase, en tant que produit d'un gène rapporteur. Les complexes selon l'invention permettront de mettre en évidence l'expression d'un gène spécifique au sein d'une cellule ou d'un animal génétiquement modifié, pour des applications en recherche médicale. Une transformation du génome par l'insertion d'un gène encodant pour une enzyme nitroréductase bactérienne (« NTR ») pourra être détectée dans le tissu qui exprime ce gène NTR grâce aux complexes selon l'invention. Les complexes selon l'invention peuvent donc permettre de suivre l'expression de la nitroréductase (NTR) utilisée comme système gène rapporteur (système ayant une bonne biocompatibilité et n'ayant pas de toxicité rapportée dans les cellules de mammifères).

L'activation des complexes (I) selon l'invention et l'apparition d'un signal IRM peuvent également être causés par un milieu hypoxique, tels que des tissus cancéreux. Les complexes selon l'invention pourront donc être utilisés pour suivre l'hypoxie de tissus cancéreux. Pour les applications in vivo, une solution aqueuse du complexe selon l'invention pourra, par exemple, être injectée directement au niveau des tissus ou cellules cancéreux ou par voie intraveineuse ou autre. Par ailleurs, contrairement à des sondes passives/non-activables qu'il serait nécessaire de greffer sur leur cible dans un rapport 1/1, dans le cas de l'invention, le suivi de l'enzyme nitroréductase met à profit le phénomène d'amplification enzymatique, c'est à dire qu'une seule molécule d'enzyme cible peut entrainer la transformation de milliers de complexes (I) selon l'invention, ce qui permet d'abaisser considérablement le seuil de détection de l'enzyme par IRM. De plus, les complexes selon l'invention étant à base de fer, ils peuvent être utilisés en quantité suffisante pour correspondre à un niveau de détection supérieur au seuil de détection imposé par l'imagerie IRM. En effet, le fer est un ion métallique géré homéostatiquement par le corps. En effet, si l'ion métallique est accidentellement libéré de sa molécule cage formé par les ligands aminés, l'ion ferreux sera géré par le corps et, ainsi, recyclé par des voies biochimiques. Par ailleurs, les complexes selon l'invention présentent un rapport taille/poids comparable à celui d'un médicament de 600 à 900 g/mol, ce qui 2 9 9 4 1 8 1 16 ne correspond donc pas au rapport taille/poids rencontrées dans les nanotechnologies. Ceci a pour conséquence que la vitesse de diffusion des complexes selon l'invention est plus importante que celle obtenue avec les nanotechnologies offrant des solutions IRM sous la forme de nanoparticules. 5 De plus, leur voie d'évacuation est différente de celle des nanoparticules. Les complexes selon l'invention trouvent donc de nombreuses applications notamment dans des activités de recherche en sciences de la vie, en clinique dans des services de radiologie IRM, pour des applications en cancérologie, caractérisation, compréhension de maladies génétiques, ou de 10 suivi thérapeutique, ou encore dans des gels aqueux exploités pour des technologies ayant besoin d'un interrupteur moléculaire. Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention. 15 La Figure 1 représente la structure du complexe 1.1 obtenue par diffraction des rayons X sur monocristal. La Figure 2 représente la structure du complexe L2 obtenue par diffraction des rayons X sur monocristal. La Figure 3 représente la structure du complexe Li obtenue par 20 diffraction des rayons X sur monocristal. La Figure 4 présente les spectres de masse obtenus en fonction du temps mettant en évidence la transformation du complexe Li en complexe II.1 sous l'action d'une enzyme nitroréductase. La Figure 5 présente les spectres de masse obtenus en fonction du 25 temps mettant en évidence la transformation du complexe Li en complexe 11.1 sous l'action d'hydrogène, en présence d'un catalyseur Pd/C et la Figure 6, les spectres de masse obtenus à t=0 et 24h, en l'absence de conditions réductrices. La Figure 7 présente l'évolution du temps de relaxation longitudinal T1 30 (secondes) des spins nucléaires d'hydrogène de l'eau en fonction du temps (min.), obtenu avec le complexe Li, avec et sans conditions réductrices H2Pd/C.

La Figure 8, quant à elle, présente les Images fantômes (IRM à 7 Tesla) de solutions d'incubation du composé 1.1 dans le cas de l'action de la nitroréductase (hydrogénation catalysée par de Pd/C (5%) dans de tampon PBS (colonne gauche) ; contrôle négatif en absence d'un stimulus réducteur (colonne centrale) ; niveau de contraste de PBS pur (colonne droite) ; contrôle positif d'une solution d'un agent de contraste passif utilisé en clinique (« Dotarem » à 4 mM dans du PBS à 50 mM ; en bas). La Figure 9 présente le % de viabilité en fonction de la concentration en composé L1 concentrations en mM (chaque expérience ayant été répétée six fois) de cellules HeLa (lignée cellulaire immortelle et cancéreuse issue du cancer cervical). Les abréviations suivantes sont utilisées : HPLC = Chromatographie en phase liquide à haute performance. NTR = nitroréductase IRM = Imagerie par Résonance Magnétique RMN = Résonance Magnétique Nucléaire LC-MS = chromatographie liquide couplée à une détection par spectrométrie de masse I.SYNTHESE DE DIFFERENTS SUBSTRATS Exemple 1 : Préparation du substrat 1.1 répondant à la formule (la) Le substrat 1.1 est préparé comme décrit sur le Schéma 3 ci-dessous. Schéma 3 : synthèse chimique de l'exemple 1.1 H DPTACN N=N ,rNH NO2 2+ NO2 étape 1 : H2O NO2 instable à l'hydrolyse 1.1 2 BF4 stable à l'hydrolyse Dans un monocol de 50 mL, à une solution de 25 mL de benzène contenant 0,8 g de DPTACN (Stavila, V., Allali, M., Canaple, L., Stortz, Y., Franc, C., Maurin, P., Beuf, O., et al. (2008). Significant relaxivity gap between a low-spin and a high-spin iron(II) complex of structural similarity: an attractive off/on system for the potential design of responsive MRI probes. New J Chem, 32, 428-435) fraîchement synthétisé est ajouté 0,38 g (1,5 éq) de p-nitro benzaldéhyde et 0,145 mL (1,5 éq) de 1,2,3-triazole commerciaux. Un appareil de Dean-Stark avec siphon est adapté sur le ballon à monocol et un reflux de 18 heures est maintenu, au bout desquels le brut réactionnel est amené à température ambiante sous argon, avant d'y ajouter une solution de sels de Fer (II) anhydres ([Fe(BF4)2 6 MeCN]) dans l'acétonitrile. La titration du ligand synthétisé (présenté entre crochets dans le SCHEMA de synthèse) par les sels ferreux est suivie par LC-MS et la solution est agitée pendant 15 minutes avant d'être filtrée. Les solvants sont évaporés sous pression réduite, puis repris dans un minimum de mélange eau/acétonitrile (95/5, v/v), afin d'être déposés sur une cartouche à silice phase-inverse (C18) pré-conditionnée avec de l'acétonitrile (2 volumes de cartouche), puis par de l'eau (2 volumes de cartouche). Après élution avec 250 mL d'eau pure, un gradient progressif eau/acétonitrile (99/1 jusqu'à 90/10, v/v) est établi, au bout duquel plusieurs fractions de couleur rouge intense sont collectées. Les diverses fractions rouges sont analysées par LC-MS et rassemblées, puis l'éluant est évaporé sous pression réduite pour conduire à une résine rouge. Celle-ci est recristallisée par diffusion liquide-liquide (acétonitrile-éther) à 4°C dans des tubes en pyrex de 50 mL, conduisant après plusieurs jours à l'obtention de cristaux rouge bourgogne qui sont collectés pour fournir 0,55 g (29%) d'une poudre micro cristalline d'une pureté de 100 %. La structure du composé 1.1 a été établie à partir d'une analyse par diffraction des rayons-X d'un monocristal et est présentée Figure 1. Par souci de clarté et pour faciliter l'interprétation de l'image présentée Figure 1, les atomes d'hydrogène ont été omis, sauf ceux du bras comprenant le triazole et le nitro-phényle. Exemple 2: Préparation du substrat 1.2 répondant à la formule (la) 2+ 1.2 NO2 Le composé 1.2 a été préparé de manière analogue au composé 1.1, en remplaçant le 1,2,3-triazole par le 1,2,3-benzotriazole. La structure du composé 1.2 a été établie à partir d'une analyse par diffraction des rayons-X d'un monocristal et est présentée Figure 2. Par souci de clarté et pour faciliter l'interprétation de l'image présentée Figure 2, les atomes d'hydrogène ont été omis, sauf ceux du bras comprenant le triazole et le nitro-phényle. 2 9 9 4 1 8 1 20 Exemple 3: Préparation du substrat 1.3 répondant à la formule (I) avec Z=S Le substrat 1.3 est préparé comme décrit sur le Schéma 4 ci-dessous. Schéma 4: synthèse chimique de l'exemple 1.3 étape 1 : H20 2+ étape 2: Fe(BF4)2 N -N 13 ni',- 2 1:IF,' 0 5 stable à l'hydrolyse instable à l'hydrolyse Dans un ballon à monocol de 50 mL contenant une solution de 15 mL de dichlorométhane anhydre et 0,4 g de DPTACN fraichement synthétisé, sont ajoutés 2,5 g de tamis moléculaire 3 Â, 0,11 mL de triazole (1,5 éq) et 0,3 g de 5-nitrothiophène-2-carboxaldéhyde (1,5 éq). Cette solution est 10 agitée, sous atmosphère inerte pendant 15 heures à température ambiante avant d'être titrée par une solution de sels de Fer (II) anhydres dans l'acétonitrile et agitée pendant quelques minutes avant d'être filtrée. Les solvants sont évaporés sous pression réduite, puis repris dans un minimum de mélange eau/acétonitrile (95/5, v/v), afin d'être déposés sur une 15 cartouche à silice phase-inverse (C18) pré-conditionnée. Après élution avec 150 mL d'eau pure, un gradient progressif eau/acétonitrile (99/1 jusqu'à 90/10, v/v) est établi, au bout duquel plusieurs fractions de couleur rouge intense sont collectées. Les diverses fractions rouges sont analysées par LCMS et rassemblées, puis l'éluant est évaporé sous pression réduite pour 20 conduire à une résine rouge. Celle-ci est recristallisée par diffusion liquide- vapeur (acétonitrile-éther) à 4 °C dans des tubes à hémolyse, conduisant à des cristaux rouge bruns qui sont collectés pour fournir 0,12 g (12,5%) de produit d'une pureté de 100 %. La structure du composé 1.3 a été établie à partir d'une analyse par diffraction des rayons-X d'un monocristal et est présentée Figure 3. Par souci de clarté et pour faciliter l'interprétation de l'image présentée Figure 3, les atomes d'hydrogène ont été omis, sauf ceux du bras comprenant le triazole et le nitro-thiophènyle. Les différentes analyses par diffraction des rayons X présentées ont été réalisées comme suit : Un cristal approprié est sélectionné et monté sur un diffractomètre Gemini kappa-geometry diffractomètre (Agilent Technologies UK Ltd) équipé avec un détecteur Atlas CCD et utilisant une radiation Mo (X-= 0.71073 Â). Les intensités sont mesurées à 100 K grâce au logiciel CrysalisPro software (CrysAlisPro, Agilent Technologies, Version 1.171.34.49 (release 20-01-2011 CrysAlis171.NET) (compiled Jan 20 2011,15:58:25), tout comme la détermination des indices de réflexion, l'affinement des paramètres par cellule unique, de la correction de Lorentz-polarisation, de l'intégration des pics et du bruit de fond. Une correction d'absorption analytique est appliqué en utilisant les faces modélisées du cristal (R.C. Clark, J.S. Reid Acta Cryst. 1995, A51, 887-897). Les structures sont résolues par method directe avec SIR97 (A. Altomare, M.C. Burla, M. Camalli, G.L. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Guagliardi, A. Grazia, G. Moliterni, G. Polidori, R. Spagna J. App. Cryst. 1999, 32, 115-119) et la méthode des moindres carrés sur F2 est effectué avec le logicile CRYSTALS (P.W. Betteridge, J.R. Carruthers, R.I. Cooper, K.

Prout, D.J. Watkin J. Appl. Cryst 2003, 36, 1487). Tous les atomes autres que les atomes d'hydrogène sont définis anisotropiquement. Tous les atomes d'hydrogène sont localisés sur une carte différente, mais ceux attachés à un atome de carbone sont repositionnés géométriquement. Les atomes d'hydrogène sont initialement positionnés avec de fiables contraintes sur les longueurs de liaison et les angles pour harmoniser leur géométrie (C---H dans la gamme 0.93--0.98 et N---H dans la gamme 0.86--0.89 Â) et Uiso(H) (dans la gamme 1.2-1.5 fois l'Ueq de 2 9 9 4 1 8 1 22 l'atome parent), après que les positions aient été affinées avec des contraintes du modèle de Riding. Exemple 4: Préparation du substrat 1.4 répondant à la formule 5 (I) avec Z=0 N.N NH DPTACN 2 BF4 stable à l'hydrolyse [M]2+ : m/z = 279.5 ; [M + HCOO] : m/z = 604.0 o 2+ étape 2: étape 1 : H20 1.4 1\4 Fe N N \) N -N Fe(BF4)2 instable à l'hydrolyse Le complexe 1.4 a été synthétisé selon le protocole de l'exemple 3 ci-dessus en remplaçant le 5-nitrothiophène-2-carboxaldéhyde par le 5- nitrofurane-2-carboxaldéhyde (commercial). Le spectre de masse obtenu qui 10 présente que deux pics de forte intensité à m/z = 279,5 et à m/z = 604,0 confirme la formation du complexe attendu. II.PROCESSUS D'ACTIVATION DES SONDES ET SUIVI PAR SPECTROMETRIE DE MASSE 15 Protocole d'activation par la nitroréductase (NTR) : 3,0 mg du complexe 1.1 sont dissous dans 1 mL (4 mM) de tampon phosphate salin (50 mM PBS), auxquels on ajoute 1 mg d'enzyme nitroréductase et 35 mg (12,5 éq) de NADH (commercial). On laisse évoluer à 37 °C la solution pendant plusieurs heures et la réaction est suivie par LC- 20 MS à intervalle régulier.

2 9 9 4 1 8 1 23 L'attribution des pics de masse apparaissant sur les spectres de masse et correspondant au déclenchement du processus engagé par l'action de la nitroréductase sont présentés sur le Schéma 5 ci-après. Schéma 5 N -N métastable [M]2+ :miz. 277.8 ; [M + Cr : m/z = 590.0 ; [M + HCOO]+ : m/z = 600.2. OH N H 2+ Nitroréductase + 4 e" NO2 NADH Fe N N -N I.1 ç*i'i [Mj2+ : m/z = 284.6; [M + Cr : m/z = 604.0 [M + HCOO]+ : m/z = 614.0 Les spectres de masse obtenus à t=0, 30mn, 2h et 4h sont présentés Figure 4. Protocole d'activation par H2, Pd/C (Images IRM) : 10 3,0 mg du complexe I.1 sont dissous dans 1 mL (4 mM) de tampon phosphate salin (50 mM PBS), auxquels on ajoute 10 mg de Pd/C (5% w/w). On fait buller pendant 10 minutes de l'hydrogène avec une aiguille, puis on vérifie au LC-MS que la totalité du complexe de départ a bien été réduite. La solution est ensuite filtrée et après vérification du pH, on laisse ensuite 15 évoluer la solution pendant plusieurs heures à 37 °C, et on prend une image (ou on mesure les temps de relaxation, ou on effectue une injection au LCMS) du tube à intervalle régulier. Nitroréductase + 2 e- NADH N-N métastable [Fe+ : m/z = 269.6 ; [M + Cr : m/z = 574.1 [M + HCOO]+ : m/z = 584.2 H [M + Cil+ : m/z = 402.0; [M + HCOO]+ m/z = 412.0.

5 L'attribution des pics de masse apparaissant sur les spectres de masse et correspondant au déclenchement du processus engendrée par l'hydrogénation catalytique qui mime l'action de la nitroréductase sont 5 présentés sur le Schéma 6 ci-après. Schéma 6 Les spectres de masse obtenus à t=0, 10mn, 80mn et 120mn sont 10 présentés Figure 5. Cela confirme donc que bien que les étapes intermédiaires soient différentes, l'hydrogénation catalytique conduit au même complexe final que l'action de la nitroréductase. La Figure 6, quant à elle, présente les spectres de masse obtenus à t= 0 et 24h dans les mêmes conditions, mais en l'absence de conditions 15 réductrices (ni hydrogénation, ni NTR/NADH) et joue donc le rôle de contrôle. métastable [M]2+ : m/z = 269.6 ; [M + : m/z = 574.1 [M + HCOOr : m/z = 584.2 m/z = 284.6; [M + : m/z = 604.0 [M + HCOO] : m/z = 614.0 2+ H20 H20 2+ / N- NO2 N -N 2+ / N H Fe-N N' N [M + CI]+ : m/z = 402.0; [M + HCOO]+ : m/z = 412.0.

2 9 9 4 1 8 1 25 Les différentes analyses par spectrométrie de masse présentées ont été réalisées comme suit : Un échantillon issu directement de l'incubation de la sonde avec le stimulus chimique/biochimique est injecté dans un spectromètre de masse de 5 type Agilent MSD 1100. Les spectres affichés ont été mesurés selon le mode « scan » et par ionisation positive dans une source de type electrospray. IILMISE EN EVIDENCE DU PASSAGE D'UN SIGNAL IRM ETEINT/ALLUME 10 L'hydrogénation catalytique conduisant au même complexe final que l'action de la nitroréductase, ces essais ont été réalisés, pour des raisons pratiques, en utilisant l'hydrogénation catalytique (conformément au protocole précédemment décrit), à la place d'un stimulus dû à l'action de la nitroréductase. Ces essais réalisés avec le composé I.1 sont, cependant, tout 15 à fait représentatifs du signal IRM obtenu par action de la nitroréductase. La Figure 7 met en évidence l'évolution du temps de relaxation longitudinal Tl (secondes) des spins nucléaires d'hydrogène de l'eau en fonction du temps (min.), dans le cas d'une hydrogénation catalytique par du Pd/C à 5 % w/w à 37 °C) (courbe losange), en l'absence de stimulus 20 réducteur (courbe carré). Le niveau de Ti du PBS à 50 mM est également présenté (tirets). La Figure 8, quant à elle, présente les Images fantômes (IRM à 7 Tesla) de solutions d'incubation dans le cas de l'action de la nitroréductase (hydrogénation catalysée par de Pd/C (5%) dans de tampon PBS (colonne 25 gauche) ; contrôle négatif en absence d'un stimulus réducteur (colonne centrale) ; niveau de contraste de PBS pur (colonne droite) ; contrôle positif d'une solution d'un agent de contraste passif utilisé en clinique (« Dotarem » à 4 mM dans du PBS à 50 mM ; en bas). Les résultats présentés Figure 8 montrent que le complexe I.1 répond 30 à un stimulus réducteur via une activation du signal en IRM, i.e. un hypersignal qui atteint un niveau de gris clair. Ce niveau de gris est 2 994 181 26 d'intensité approchant celui du Dotarem, agent de contraste clinique passif utilisé dans le domaine du diagnostic anatomique. Les différentes analyses par IRM présentées ont été réalisées comme suit : L'acquisition IRM est menée sur des échantillons de différentes concentrations en complexe 1.1, en utilisant un système 7 T Biospec system (Bruker, Ettlingen, Allemagne) associé à une spire de 32 mm de diameter interne (Rapid Biomedical, Würzburg, Allemagne). Le temps de relaxation longitudinal T1 theist mesuré avec la séquence IR-FISP (de l'angalis « Inversion-Recovery Fast Imaging with Steady-State Precession »). Les paramètres d'imagerie sont : TR/TE = 4.2/2.1 ms, temps d'inversion TI = (68 + i x 50) ms avec i = 0, 1, ..., 32. Les paramètres géométriques sont : 40 x 40 mm2 FOV, lame d'épaisseur 5 mm et taille de matrice 256 x 192 . Les valeurs de T1 sont obtenues avec des images multiples TI en appliquant une fonction mono-exponentielle aux données. IV-TEST DE VIABILITE CELLULAIRE EN PRESENCE DU COMPOSE 1.1 Des cellules HeLa (lignée cellulaire immortelle et cancéreuse issue du cancer cervical, no.

93021013 SIGMA-Aldrich), à raison de 10.000 cellules 20 HeLa par puit, ont été incubées pendant 24 h dans un milieu DMEM avec 10 % sérum FCS, avec ajout de différentes concentrations (de 4mM à 0,25 mM) de composé Li. La Figure 9 présente dans chaque colonne le taux de survie obtenue en fonction des concentrations en mM (chaque expérience ayant été répétée six fois).

25 Il ressort de ces résultats que le composé 1.1 ne montre pas de toxicité sur les cellules, même à une concentration élevée de 4 mM. En conclusion, les résultats présentés avec le complexe Li et qui peuvent être généralisés à l'ensemble des complexes revendiqués mettent en évidence une séquence reconnaissance/activation sélective et rapide par la 30 nitroréductase (activité qui peut être mimée par des réducteurs chimiques tels que l'hydrogène en présence d'un catalyseur tel que le palladium sur charbon). L'activation peut être réalisée à pH physiologique, compte tenu de la stabilité constatée en solution aqueuse. En l'absence de stimuli réducteur, une absence d'augmentation de relaxivité (en IRM ou RMN) ou d'apparition de produits de dégradation (suivi par HPLC couplée à la spectrométrie de masse) a été constatée, validant le mode d'action OFF/ON.5

Claims (5)

1. REVENDICATIONS1 - Complexes de formule (I) : N -N, R3 (I) dans laquelle : est un hétérocycle hydrocarboné insaturé, substitué ou non substitué, azoté comprenant de 5 à 6 chainons et pouvant comprendre un autre atome d'azote ou un atome d'oxygène ou de soufre, l'atome d'azote représenté de type imine présentant un doublet libre qui lui permet de se coordiner au fer, - Y1 est un atome d'azote ou CH, - Y2 est un atome d'azote ou CH, - -Z- représente -CHR4=CHR5-, -0- ou -S-, - R0 est un atome d'hydrogène, ou un groupe -CF3 ou -NO2; ou bien lorsque 15 Y2 est CH, R0 est lié à Y2 et à l'hétérocycle pour former un groupe :- R1, R2, R3, R4, R5 et R6 représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fluor ou iode, ou un groupe choisi parmi les groupes -NO2, les groupes alkyle substitués ou non substitués, les groupes alcoxy substitués ou non substitués, les groupes -C(0)alkyle substitués ou non substitués, les groupe -C(0)0alkyle substitués ou non substitués, les groupes amines primaires, secondaires ou tertiaires substitués ou non substitués ; étant entendu que R1 et/ou R3 représente(nt) -NO2, ainsi que leurs sels.
2. 2 - Complexes (I) selon la revendication 1 caractérisés en ce que correspond à l'une des structures suivantes : 8 OH CO 0 N , I N.
3. 3 - Complexes (I) selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce que R1, R2, R3, R4, R5 et R6 représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de brome, chlore, fluor ou iode, ou un groupe -NO2, (Cr C6)alkyle, (C1-C6)alcoxy, -C(0)(C1-C6)alkyle, -C(0)0(C1-C6)alkyle, -NRaRb avec Ra et Rb qui représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6)alkyle ; étant entendu que R1 et/ou R3 représente(nt) -NO2.
4. 4 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (Ta) :N- R1 R2 - Complexes selon la revendication 4 caractérisé en ce que R4=R5=H. 6 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que Z est un atome d'oxygène ou un atome de soufre.
5. 5 7 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés A en ce que est un groupe pyridyle. 8 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que R1 =NO2. 9 - Complexes selon la revendication 8 caractérisé en ce que R3=H. 10 - Complexes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que R2=H. 11 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que : représente un groupe :R0 étant un atome d'hydrogène, ou un groupe -CF3 ou -NO2 et étant, de préférence, un atome d'hydrogène. 12 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qu'il est choisi parmi : 1.1 1.2 N -N N 2+ /N N-N N , N,- NO2 NO2 2+ 2+ N -N 1.3 / e // Fe N ---- NN N -N 1.4 r-i',,, 13 - Complexes (I) selon l'une des revendications précédentes pour la détection in vivo chez l'homme ou l'animal, par IRM, d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction de la fonction -NO2 correspondant au 2 994 181 32 substituant R1 ou R3 du cycle : tel que défini dans les revendications 1 à 9. 14 - Complexes (I) selon la revendication 13 caractérisés en ce que le stimulus est une enzyme nitroréductase. 5 15 - Complexes (I) selon la revendication 14 caractérisés en ce que la nitroréductase est produite par un gène rapporteur dont on souhaite assurer le suivi. 16 - Complexes (I) selon la revendication 13 caractérisé en ce que le stimulus est une hypoxie de tissus cancéreux. 10 17 - Complexes générés à partir d'un complexe (I) selon l'une des revendications 1 à 12 après réduction en milieu aqueux de la fonction -NO2, correspondant au substituant R1 ou R3. 18 - Complexes selon la revendication 17 de formule (H) : A N , Fe - NH N ) 0 - H H étant tel que défini à la revendication 1, 2 ou 7, ainsi que leurs sels. 19 - Procédé de détection in vitro ou ex vivo d'un stimulus chimique ou biochimique entraînant la réduction d'une fonction -NO2 dans un échantillon d'intérêt comprenant les étapes successives suivantes : 2 994 181 33 a) La mise en présence de l'échantillon d'intérêt avec un complexe selon l'une des revendications 1 à 12, en milieu aqueux, b) La détection d'un signal généré, suite à la réduction de la fonction -NO2 correspondant au substituant R1 ou R3 du cycle : 5 du complexe (I), tel que défini dans les revendications 1 à 12, sous l'action du stimulus chimique ou biochimique. - Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le stimulus chimique ou biochimique est une enzyme nitroréductase. 10 21 - Procédé selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon biologique de pH physiologique. 22 - Procédé selon l'une des revendications 19 à 21 caractérisé en ce que la détection est réalisée à l'étape b) par RMN, IRM ou par chromatographie à haute performance couplée à la spectrométrie de masse. 15 23 - Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que le signal détecté correspond à la concentration du complexe (II) selon la revendication 18, au temps de relaxation et/ou à la relaxivité obtenue par RMN ou IRM du complexe (II) selon la revendication 18.