WO2014020113A1 - Scanner für die abtastung von schnellschnitt-proben - Google Patents

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WO2014020113A1
WO2014020113A1 PCT/EP2013/066193 EP2013066193W WO2014020113A1 WO 2014020113 A1 WO2014020113 A1 WO 2014020113A1 EP 2013066193 W EP2013066193 W EP 2013066193W WO 2014020113 A1 WO2014020113 A1 WO 2014020113A1
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WO
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imaging
cars
scanner
images
scanning
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PCT/EP2013/066193
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Bernd SÄGMÜLLER
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Leica Microsystems CMS GmbH
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Leica Microsystems CMS GmbH
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures

Definitions

  • the present invention relates to a scanner for the scanning of frozen section samples according to the preamble of patent claim 1 and to a corresponding method according to the preamble of patent claim 6.
  • CARS or SRS spectroscopy uses to investigate Ma ⁇ material characteristics coherent Ant i-Stokes Raman scattering and the associated effects.
  • either two laser beams of different frequency (pump and Stokes laser) are used with suitable frequencies, such as in the CARS method.
  • SRS methods are thus CARS-like methods in the language of the present application.
  • the thus provided rays are superimposed in the sample to be examined. Due to an interaction with the matter of the sample, a laser-like output beam is produced. This output beam can then be amplified resonantly if the superposition of the input frequencies corresponds to a Raman resonance.
  • the obtained signal appears at lower or higher frequencies by the amount of Raman resonance. zen shifted relative to the frequency of the input frequencies.
  • Such radiation is referred to as Stokes or anti-Stokes radiation.
  • CARS spectroscopy is also used to study thermodynamic properties, such as temperature, or to study materials. It is used for example in molecular spectroscopy, plasma and combustion diagnostics, as well as for the quality assurance of gemstones, such as diamonds, and in the investigation of biological systems for the visualization of different molecules by exciting characteristic modes of vibration.
  • To visualize lipids for example, CH 2 vibrations, for proteins amide vibrations, and for DNA-phosphate vibrations are used. Basically, superpositions of such vibration components can be linked in order to obtain more detailed results. It is advantageous here that kei ⁇ nerlei labeling with fluorescent dyes or other dyes is necessary.
  • the so-called frozen section diagnostics exists.
  • the pathologist laminates a tumor and describes it while the patient remains under anesthesia. Representative sections are then applied to an object holder and analyzed. For this, it is usually necessary to freeze representative cuts on a specimen holder and to cut them with a freeze microtome. The incision is then placed on a slide bear ⁇ and HE-stained. The findings can then be communicated to the surgeon after microscopic examination. The further operative steps are based on the result of such a frozen section diagnostics.
  • a disadvantage of the current frozen section diagnostics is that a cycle from the incision to the decision of the surgeon can take about 20 to 45 minutes, while the patient lies, for example, with the skull open in the operating room.
  • the object of the invention is therefore an improvement of the rapid cutting diagnostics. This object is achieved by a scanner with the shopping ⁇ paint of claim 1 and a method having the features of patent claim 6.
  • schwingungsspektrosko- European imaging by the CARS or SRS effect in the context of a scanner for scanning frozen section sample enables much faster analysis of quick ⁇ cut samples bypassing the drawback of the preceding freezing and staining.
  • a decision as to whether a tumor has been removed sufficiently far is much faster and more precise than with methods according to the prior art.
  • the examination method according to the invention operates in the region of the long-wavelength excitation light and can therefore penetrate into the tissue with low vibration.
  • the absorption cross section of the excitation light in the tissue is very low in the unfocused region.
  • the information gain therefore takes place only in the focused area.
  • the scanner according to the invention comprises means for evaluating acquired images by means of a comparison of at least parts of ⁇ he images with images from substance libraries containing vibration spectroscopic signatures of CARS and / or SRS-relevant substances or corresponding comparative samples of the patient or others Sources, up. With such a comparison, a particularly effective and rapid analysis of captured images is possible. Due to the substrate conservation schwingungsspektroskopischer imaging screening such as CARS or SRS an egg can be performed without substance gen part taking what the methodology described here fundamentally on the expiry of extraction freezing cutting-Färben- Rate differs from the herkömm ⁇ union.
  • ⁇ ips a modifiable in their output wavelength laser or light for vibration excitation of a frozen section sample on the scanner of the invention.
  • modifizierba ⁇ rer or adjustable laser or light means is adjustable, the scanner used in a variety of substances to be detected or target pattern in the frozen section specimens.
  • the PCA or principal component analysis is a method of multivariate statistics. It serves to structure, simplify, and illustrate large data sets by approximating a variety of statistical variables with a smaller number of highly meaningful linear combinations (the "main components").
  • At least one laser or light device with fixed output wavelength .
  • This solution proves to be inexpensive. They also builds small and be ⁇ reit bain with less effort.
  • polychromatic working systems which on based on spectral vibration spectroscopic imaging are included in the invention.
  • the scanner has a device for superimposing received images with further obtained images and / or reference images or graphics.
  • Such overlays may be, for example, with the aid of algorithms out ⁇ leads, which weight the individual signatures of images, for example to emphasize structural features.
  • Samples that are processed further after the flash cut, also in conventional manner, can be scanned for case study or documentation in the advanced imaging and superimposed or billed with the swing spectroscopic images to obtain further details for evaluation of the assay.
  • the scanner according to the invention it is possible to quickly and repeatedly, d. H. with high throughput, to analyze quick-cut samples and provide corresponding images.
  • vibration spectroscopic image acquisition technology such as e.g. CARS or SRS is such a scanner over conventional devices that use, for example, immunostaining, HE staining or other staining techniques, much faster and more efficient.
  • vibration spectroscopic Serolo ⁇ gie such as CARS or SRS
  • CARS or SRS vibration spectroscopic Serolo ⁇ gie
  • the features of a HE-stained image result from a background coloration and cell characteristics to be highlighted.
  • These also differ a priori in terms of their vibrational spectroscopic signatures in the Raman, CARS or SRS spectrum.
  • These spectra are reacted speed values in the imaging, for example according to their intensity in brightness, then a false color image erge ⁇ ben.
  • This image may, but not necessarily, be reproduced in a similar manner to a HE image in order to make the comparison as easy as possible, for example for HE-familiar pathologists, and to minimize the error susceptibility of the interpretation a priori.
  • Advantageous in the context of the invention is to add further components from the vibration spectroscopic image. This enables in particular a time ⁇ savings in interpretation if recent studies are under research results are integrated or in research when, should also be compared with the aid of mathematical analysis such as principal component analysis, results from studies with other samples.
  • CARS images may conveniently be evaluated on-site or remotely.
  • different images can be detected automatically, and be assembled ⁇ example by means of stitching to larger images. Since the vibrational spectroscopic methods are essentially methods with excitation in the long-wave IR range, the two-dimensional composable and / or joined images are also linked in the third dimension to so-called three-dimensional models.
  • Schwingungsspektro ⁇ scopic picture-taking technology such as CARS and SRS may in particular Suedes, Micro-tissue arrays gefrore ⁇ NEN samples or other types of samples are used.
  • the vibrational image ⁇ recording technology such as CARS and SRS in various in Vibrational spectroscopy opti ⁇ mized active substances, whereby also suitable marker substances or chemically induced processes in connection with the vibration spectroscopic image recording technology such as CARS or SRS can be used.
  • CARS imaging also makes it possible to detect relatively rare events, for example using CARS signatures, in which case it is also possible in particular to use changes in the image sections as well as optical and digital magnification processes.
  • the digital processing of the image data enables interpolating zoom and pan processes, ie the surgeon can quickly navigate to the substrate and gain overview to be operated locations in dreidimensio ⁇ dimensional space. Optically can swapped the overview to detail shots through different lenses ⁇ to, or even quick overview images are obtained.
  • the scanner according to the invention preferably has access to sub ⁇ substance libraries, which can be used in the identification of CARS signatures.
  • Such substance libraries may be integrated in the scanner or provided by peripheral devices.
  • Algorithms are known for finding CARS signatures and distinguishing them from background information. For example, it is possible to measure different peaks within a spectrum. In this case, it proves useful to carry out, for example, HWMH measurements, when it comes to the quantitative description with methods such as SRS, or to perform principal component analysis, if that's what it is is to find general features or characteristics and to compare with ⁇ on their parts of the substrate.
  • FIG. 1 shows a flowchart to illustrate a preferred embodiment of the invention
  • FIG. 2 shows a preferred embodiment of a scanner according to the invention.
  • a toomme ⁇ sponding sample is first provided in step one hundred and first In a subsequent step 102, a suitable sectioning of the sample takes place.
  • the produced during the sectioning individual sections are in a step 103 in a corresponding receptacle ⁇ means (so-called cradle) a CARS scanner gela ⁇ .
  • a subsequent step 104 the respective sections are detected by the scanner and processed in a subsequent sequent step ⁇ 105th
  • HE false color representation As an example of the processing in step 105, a HE false color representation is mentioned.
  • a preferred embodiment of a scanner according to the invention is designated as a whole by 200.
  • the scanner has a scanner table 202, and a scanner head 204 on.
  • the scanner head 204 is pivotable about an axis 206 with respect to the table 202.
  • the table 202 has a device (not shown) for the x-y positioning of the ob ectrages 208.
  • a CARS and SRS laser unit is positioned in the table 202 of the un ⁇ ter endeavour Whether ekttires 208, said laser unit also forms excluded displaceable in the xy direction can be.
  • a probe 210 is formed, which is expediently formed in a corresponding opening of the scanner head 204, so that it is flush with the lower surface of the scanner head 204.
  • the probe 210 may also be xy-displaceable surebil ⁇ det.
  • the scanner 200 is connected to a computer 220 (shown schematically).
  • the scanner head 210 are the necessary filters and detectors for performing CARS detection of the specimen held by the slide, i. H. for detecting radiation emitted from the sample due to the CARS control.
  • the inventive method can be repeated as desired until, for example, sufficient Einzelwellenilian- detections have been performed. If these are completely available, the evaluation can be done.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

Scanner für die Abtastung von Schnellschnitt-Proben
Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft einen Scanner für die Abtastung von Schnellschnitt-Proben nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie eine entsprechendes Verfahren nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 6. Stand der Technik
CARS- oder SRS-Spektroskopie nutzt zur Untersuchung von Ma¬ terialeigenschaften die kohärente Ant i-Stokes-Raman- Streuung und damit einhergehende Effekte aus. Hierbei wer- den entweder zwei Laserstrahlen unterschiedlicher Frequenz (Pump- und Stokes-Laser ) mit geeigneten Frequenzen verwendet, wie etwa beim CARS-Verfahren . Es ist auch möglich, mehrere Frequenzen eines einzelnen Laserstrahls (beispiels¬ weise bei SRS-Verfahren) einzusetzen. Bei SRS-Verfahren handelt es sich somit in der Sprache der vorliegenden Anmeldung um CARS-artige Verfahren. Die so bereitgestellten Strahlen werden in der zu untersuchenden Probe überlagert. Aufgrund einer Wechselwirkung mit der Materie der Probe entsteht ein Laser-ähnlicher Ausgangsstrahl. Dieser Aus- gangsstrahl kann dann resonant verstärkt werden, wenn die Überlagerung der Eingangsfrequenzen einer Raman-Resonanz entspricht. Das erhaltene Signal erscheint um den Betrag der Raman-Resonanz zu niedrigeren bzw. zu höheren Frequen- zen relativ zur Frequenz der Eingangs-Frequenzen verschoben. Derartige Strahlung wird als Stokes- bzw. Anti-Stokes- Strahlung bezeichnet. CARS-Spektroskopie dient auch zur Untersuchung von thermo- dynamischen Eigenschaften, beispielsweise der Temperatur, oder wird zur Untersuchung von Materialien verwendet. Sie wird unter anderem in der Molekülspektroskopie, der Plasma- und Verbrennungsdiagnostik, sowie zur Qualitätssicherung von Edelsteinen, beispielsweise Diamanten, verwendet, sowie bei der Untersuchung biologischer Systeme zur Visualisierung von unterschiedlichen Molekülen durch Anregung charakteristischer Schwingungsmodi. Zur Sichtbarmachung von Lipi- den werden beispielsweise CH2-Schwingungen, für Proteine Amid-Schwingungen, und für DNA-PhosphatSchwingungen genutzt. Grundsätzlich können auch Überlagerungen solcher Schwingungsbestandteile verknüpft werden, um detailliertere Ergebnisse zu erhalten. Vorteilhaft ist hierbei, dass kei¬ nerlei Markierung mit Fluoreszenz- oder anderen Farbstoffen notwendig ist.
In der Pathologie, hier insbesondere der Onkologie oder der Neurochirurgie, ist es gewünscht, noch während einer Opera¬ tion Klarheit über beispielsweise die Vollständigkeit einer Resektion oder die Schwere einer Läsion zu erhalten. Hierzu existiert die sogenannte Schnellschnittdiagnostik. Hierbei lamelliert der Pathologe, während der Patient in Narkose verbleibt, beispielsweise einen Tumor und beschreibt ihn. Es werden dann repräsentative Schnitte auf einen Objekthal- ter aufgebracht und analysiert. Hierzu ist es in der Regel notwendig, repräsentative Schnitte auf einem Objekthalter tiefzufrieren und mit einem Gefriermikrotom zu schneiden. Der Schnitt wird anschließend auf einen Objektträger aufge¬ tragen und HE-gefärbt. Das Befundergebnis kann dann nach mikroskopischer Untersuchung dem Operateur mitgeteilt werden. Die weiteren operativen Schritte richten sich nach dem Ergebnis einer derartigen Schnellschnittdiagnostik. Als nachteilig bei der bisherigen Schnellschnittdiagnostik wird angesehen, dass ein Zyklus vom Schnitt bis zur Entscheidung des Chirurgen ca. 20 bis 45 Minuten dauern kann, während der Patient beispielsweise mit geöffnetem Schädel im Opera- tionssaal liegt.
Aufgabe der Erfindung ist daher eine Verbesserung der SchnellSchnittdiagnostik . Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Scanner mit den Merk¬ malen des Patentanspruchs 1 sowie ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 6.
Die erfindungsgemäße Verwendung der schwingungsspektrosko- pischen Bildgebung durch den CARS oder SRS-Effekt im Rahmen eines Scanners für die Abtastung von Schnellschnitt-Proben ermöglicht eine wesentlich schnellere Analyse von Schnell¬ schnitt-Proben unter Umgehung des Nachteils der vorangehenden Einfrierung und Färbung. Erfindungsgemäß ist somit bei- spielsweise eine Entscheidung, ob ein Tumor genügend weit entfernt wurde, wesentlich schneller und präziser zu treffen als mit Verfahren gemäß dem Stand der Technik.
Als besonders vorteilhaft erweist sich in diesem Zusammen- hang, dass bei Verwendung der schwingungsspektroskopischen Bildgebung mit z.B. CARS oder SRS über die Dicke der Schnellschnitt-Probe, d. h. von der Oberseite bis zur Un- terseite, eine im Wesentlichen dreidimensionale Visualisie¬ rung bereitstellbar ist, die gegebenenfalls durch weitere Methoden wie die der Hauptkomponentenanalyse unterstützt wird. Hiermit ist der Operateur in der Lage, seine Ent- Scheidung, ob weiteres Gewebe entfernt werden muss, genauer zu treffen, da er nicht nur, wie bei herkömmlichen Techniken, einen Mittelwert bezüglich beispielsweise pathologi¬ schen Gewebes über die gesamte Schnellschnitt-Probe, son¬ dern die Verteilung derartigen Gewebes über die Dicke der Schnellschnitt-Probe erhält. Dies liegt unter anderem darin begründet, dass die erfindungsgemäße Untersuchungsmethode im Bereich des langwelligen Anregungslichts arbeitet, und daher schwingungstief in das Gewebe eindringen kann. Der Absorptionsquerschnitt des Anregungslichts im Gewebe ist im nicht-fokussierten Bereich sehr niedrig. Der Informationsgewinn findet daher nur im fokussierten Bereich statt. Mit Hilfe von Objektiven mit passendem und an die Probe ange- passtem Arbeitsabstand sowie passender numerischer Apertur kann eine Probe von 500 Mikrometer Dicke gerastert werden. Es sind dickere und dünnere Proben möglich, auch oberflächliches Eindringen und Rastern ist erfindungsgemäß möglich.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Scanner Mittel zur Auswertung erfasster Bilder mittels eines Vergleiches wenigstens von Teilen er¬ fasster Bilder mit Bildern aus Substanzbibliotheken, welche schwingungsspektroskopische Signaturen von CARS oder/und SRS-relevanten Substanzen enthalten oder von entsprechenden Vergleichsproben des Patienten oder anderer Quellen, auf. Mit einem derartigen Vergleich ist eine besonders effektive und schnelle Analyse von erfassten Bildern möglich. Aufgrund der SubstratSchonung schwingungsspektroskopischer bildgebender Rasterung wie z.B. CARS oder SRS kann ein Ei- genvergleich ohne Substanzentnahme durchgeführt werden, was die hier beschriebene Methodik fundamental von der herkömm¬ lichen, auf dem Ablauf Entnahme-Frieren-Schneiden-Färben- Bewerten unterscheidet. Zweckmäßigerweise weist der erfindungsgemäße Scanner we¬ nigstens eine in ihrer Ausgangswellenlänge modifizierbare Laser- oder Lichteinrichtung zur Schwingungsanregung einer Schnellschnitt-Probe auf. Mittels derartiger modifizierba¬ rer oder einstellbarer Laser- bzw. Lichteinrichtungen ist der verwendete Scanner auf unterschiedlichste zu erkennende Substanzen oder Zielmuster in den Schnellschnitt-Proben einstellbar. Man könnte auch die PCR (Principal Component Analyse) mit einbeziehen. Dadurch wird die Methodik hoch personalisiert und richtet sich sogar am einzelnen Patien- ten aus. Die PCA oder Hauptkomponentenanalyse ist ein Ver¬ fahren der multivariaten Statistik. Sie dient dazu, umfangreiche Datensätze zu strukturieren, zu vereinfachen und zu veranschaulichen, indem eine Vielzahl statistischer Variablen durch eine geringere Zahl möglichst aussagekräftiger Linearkombinationen (die „Hauptkomponenten") genähert wird.
Es kann ebenfalls zweckmäßig sein, wenigstens eine Laser¬ oder Lichteinrichtung mit fester Ausgangswellenlänge zu verwenden. Hier sei beispielsweise an die Verwendung von Faserlasern hingewiesen. Diese Lösung erweist als preiswert. Sie baut ferner klein und ist mit weniger Aufwand be¬ reitstellbar. Auch polychrom arbeitende Systeme, welche auf einer spektralen schwingungsspektroskopischen Bildgebung basieren, sind von der Erfindung umfasst.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Scanner eine Einrichtung zur Überlagerung von erhaltenen Bildern mit weiteren erhaltenen Bildern und/oder Referenzbildern oder Grafiken auf. Derartige Überlagerungen können beispielsweise unter Zuhilfenahme von Algorithmen ausge¬ führt werden, welche die einzelnen Signaturen der Bilder gewichten, beispielsweise um strukturelle Besonderheiten hervorzuheben. Proben, die nach dem Schnellschnitt weiter bearbeitet werden, auch in herkömmlicher Manier, können zur Falluntersuchung oder -dokumentation in der erweiterten Bildgebung gescannt und mit den schwinggungsspektroskopi- sehen Bildern überlagert oder verrechnet werden, um weitere Details für eine Bewertung der Untersuchung zu erhalten. Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Mit dem erfindungsgemäßen Scanner ist es möglich, schnell und wiederholt, d. h. mit hohem Durchsatz, Schnellschnitt- Proben zu analysieren und entsprechende Bilder zur Verfügung zu stellen. Durch Anwendung der schwingungsspektroskopischen Bildaufnahmetechnologie wie z.B. CARS oder SRS ist ein derartiger Scanner gegenüber herkömmlichen Vorrichtungen, welche beispielsweise Immunfärbung, HE-Färbung oder andere Färbetechniken verwenden, wesentlich schneller und leistungsfähiger .
Mittels schwingungsspektroskopischen Bildaufnahmetechnolo¬ gie wie z.B. CARS oder SRS ist es nicht nur möglich, eine Probe manuell oder halbautomatisch zu verarbeiten, wie dies in der Mikroskopie üblich ist, sondern es ist ferner mög¬ lich, mit hohem Durchsatz strukturelle Merkmale zur Verfü¬ gung zu stellen (beispielsweise als HE-Falschfarbenbild) . Die Merkmale eines HE-gefärbten Bildes ergeben sich durch eine Färbung des Hintergrundes und der hervorzuhebenden Zellmerkmale. Diese unterscheiden sich a priori ebenso durch ihre schwingungsspektroskopischen Signaturen im Ra- man, CARS oder SRS-Spektrum. Diese Spektren werden in der Bildgebung z.B. entsprechend ihrer Intensität in Hellig- keitswerte umgesetzt, die dann ein Falschfarbenbild erge¬ ben. Dieses Bild kann, muss aber nicht zwingend, ähnlich einem HE-Bild wiedergegeben werden, um z.B. für HE-gewohnte Pathologen den Vergleich so einfach wie möglich zu gestalten und die Fehleranfälligkeit der Interpretation a priori zu minimieren. Vorteilhaft im Sinne der Erfindung ist es , weitere Komponenten aus dem schwingungsspektroskopischen Bild hinzuzufügen. Dies ermöglicht insbesondere eine Zeit¬ ersparnis bei der Interpretation, wenn im Rahmen von Forschungsergebnissen neueste Untersuchungen eingebunden wer- den sollen oder im Forschungsbereich, wenn, auch unter Zuhilfenahme von mathematischen Analysemethoden wie z.B. der Hauptkomponentenanalyse, Ergebnisse aus Studien mit anderen Proben verglichen werden sollen. Insbesondere ist es möglich, chemische CARS-Sonden bildgebend darzustellen (mit sehr hoher Eindringtiefe) , und weitere Substanzen, bei¬ spielsweise aus einer Bibliothek abzurufen und als Datensatz oder Bild-Overlay in das ursprüngliche Bild oder den ursprünglichen Datensatz mit einzublenden und derartige überlagerte Bilder in geeigneter Software zu verarbeiten. CARS-Bilder können zweckmäßigerweise vor Ort oder per Fernabfrage bewertet werden. Vorteilhafterweise können im Rahmen eines Workflow verschiedende Bilder automatisiert erkannt werden, und bei¬ spielsweise mittels Stitching-Verfahren zu größeren Bildern zusammengesetzt werden. Da es sich bei den schwingungs- spektroskopischen Methoden im wesentlichen um Methoden mit Anregung im langwelligen IR-Bereich handelt, werden die zweidimensionalen zusammenfügbaren und/oder zusammengefügten Bilder auch in der dritten Dimension verknüpft zu sog. Dreidimensionalen Modellen. Diese können dann z.B. mit Hilfe von 3D-Brillen oder einem 3D-Polymerdrucker ausgegeben werden oder, was Stand der Technik ist, auf den Patienten projiziert oder mit Hilfe der sog. „augmented Reality" per Spiegelbrille dem Operateur eingeblendet werden, um die Qualität der Operation zu verbessern. Schwingungsspektro¬ skopischen Bildaufnahmetechnologie wie z.B. CARS oder SRS kann insbesondere auf Südes, Micro-Tissue-Arrays , gefrore¬ nen Proben oder anderen Probentypen angewendet werden. Zweckmäßigerweise ist die schwingungsspektroskopische Bild¬ aufnahmetechnologie wie z.B. CARS oder SRS auf verschiedene in der Schwingungsspektroskopie aktive Substanzen opti¬ miert, wobei auch geeignete Markersubstanzen oder chemisch induzierte Prozesse im Zusammenhang mit der schwingungs- spektroskopischen Bildaufnahmetechnologie wie z.B. CARS o- der SRS verwendet werden können.
Mit CARS-Bildgebung ist auch eine Erkennung relativ seltener Ereignisse, beispielsweise unter Verwendung von CARS- Signaturen, durchführbar, wobei hier auch insbesondere Veränderungen der beobachteten Bildausschnitte sowie optische und digitale Vergrößerungsprozesse einsetzbar sind. Durch die digitale Weiterverarbeitung der Bilddaten sind interpolierende Zoom und Pan-Vorgänge möglich, d.h. der Operateur kann sehr schnell auf dem Substrat navigieren und sich Übersicht über die zu operierenden Stellen im dreidimensio¬ nalen Raum verschaffen. Optisch kann durch verschiedene Objektive die Übersicht gegen Detailaufnahmen getauscht wer¬ den, oder auch schnelle Übersichtsaufnahmen erzielt werden.
Zur Optimierung der CARS-Bildgebung ist es möglich, die Laserleistung von Pump- oder Stokes-Laser oder gegebenenfalls auch anderer, aktivierender Typen von Lasern anzupassen. Ferner sind in diesem Zusammenhang chemische Einflussnahmen auf zu analysierendes Gewebe bekannt. Diese Vorgehensweise ist vorteilhaft, um z.B. bestimmte Schwingungsbanden hervorzuheben oder wenn gewünscht auch Reaktionen auszuführen, die sich schneller als der herkömmliche Färbeprozeß durch¬ führen lassen, da aufgrund der chemischen Markierung bestimmte Charakteristika schneller bestimmen lassen.
Der erfindungsgemäße Scanner hat bevorzugt Zugriff auf Sub¬ stanzbibliotheken, welche im Rahmen der Kennung von CARS- Signaturen verwendet werden können.
Derartige Substanzbibliotheken können in dem Scanner integriert oder im Rahmen von peripheren Vorrichtungen bereitgestellt werden.
Es sind Algorithmen bekannt, um CARS-Signaturen zu finden und von Hintergrundinformationen zu unterscheiden. Beispielsweise ist es möglich, verschiedene Peaks innerhalb eines Spektrums auszumessen. Hierbei erweist es sich als zweckmäßig, z.B. HWMH-Messungen vorzunehmen, wenn es sich um das quantitative Beschreiben mit Methoden wie z.B. SRS handelt, oder um Hauptkomponentenanalyse, wenn es darum geht generelle Features bzw. Merkmale zu finden und mit an¬ deren Teilen des Substrats zu vergleichen.
Besonders günstig ist die Nutzung von nichtresonanten Hintergründen oder auch anderer Hintergrundarten, wie z. B. Gegenfärbung, um eine bessere Orientierung auf der Probe zu ermöglichen .
Es ist ferner möglich, die CARS-Bildgebung mit anderweitigen immuno- oder fluoreszenzgefärbten Teilen der Probe zu überlagern, beispielsweise zur In-Situ-Validierung eines CARS-Falschfarbenbildes . Vorteilhaft ist dieses Verfahren insbesondere im Bereich der medizinischen Forschung einsetzbar, wenn auf große Archive zugegriffen werden kann, um gegenwärtige Forschung gegen historische Zustände zu ver¬ gleichen .
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt ein Ablaufdiagramm zur Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, und Figur 2 zeigt eine bevorzugte Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Scanners.
In der in Figur 1 dargestellten bevorzugten Ausgestaltung, insbesondere zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird zunächst in einem Schritt 101 eine zu untersu¬ chende Probe bereitgestellt. In einem anschließenden Schritt 102 erfolgt eine geeignete Sektionierung der Probe. Die bei der Sektionierung entstehenden einzelnen Schnitte werden in einem Schritt 103 in eine entsprechende Aufnahme¬ einrichtung (sogenanntes Cradle) eines CARS-Scanners gela¬ den .
In einem nachfolgenden Schritt 104 werden die jeweiligen Schnitte durch den Scanner erfasst, und in einem anschlie¬ ßenden Schritt 105 aufbereitet.
Als Beispiel für die Aufbereitung in Schritt 105 sei eine HE-Falschfarbendarstellung genannt .
Die so aufbereiteten Daten können anschließend in einem Schritt 106 mit archivierten Daten, und/oder in einem Schritt 107 weiteren Bildgebungsverfahren zugeführt werden. Alternativ zu den Schritten 102, 103 ist es auch möglich, aus der Probe eine Einzelprobe bzw. einen Schnellschnitt zu entnehmen (Schritt 102a), und diese in den Scanner bei Schritt 104 zu geben. In Figur 2 ist eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Scanners insgesamt mit 200 bezeichnet. Der Scanner weist einen Scannertisch 202, und einen Scannerkopf 204 auf. Der Scannerkopf 204 ist bezüglich des Tisches 202 um eine Achse 206 verschwenkbar.
Der Tisch 202 weist eine (nicht dargestellte) Einrichtung zur x-y-Positionierung des Ob ektträgers 208 auf.
Eine CARS- bzw. SRS-Lasereinheit ist in dem Tisch 202 un¬ terhalb des Ob ektträgers 208 positionierbar, wobei diese Lasereinheit ebenfalls in x-y-Richtung verschiebbar ausge- bildet sein kann.
In der bezüglich des Tisches 202 klappbaren Unterseite des Scannerkopfes 204 ist ein Tastkopf 210 ausgebildet, welcher zweckmäßigerweise in einer entsprechenden Öffnung des Scan- nerkopfes 204 ausgebildet wird, so dass er mit der unteren Fläche des Scannerkopfes 204 bündig ist.
Der Tastkopf 210 kann ebenfalls x-y-verschiebbar ausgebil¬ det sein.
Der Scanner 200 ist mit einem (schematisch dargestellten) Rechner 220 verbunden.
In dem Scannerkopf 210 befinden sich die notwendigen Filter und Detektoren zur Durchführung einer CARS-Erfassung der von dem Objektträger gehaltenen Probe, d. h. zur Erfassung von der Probe aufgrund der CARS-Steuerung emittierter Strahlung .
Alternativ zu der klappbaren Ausgestaltung des Scannerkop- fes 204 bezüglich des Tisches 202 sind auch andere Mecha¬ nismen zur Positionierung des Tastkopfes 210 über den Objektträger 208 möglich. Beispielsweise ist es möglich, den Scannerkopf 204 bezüglich des Tisches 202 verschiebbar oder wegdrehbar auszubilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beliebig wiederholt werden, bis beispielsweise ausreichende Einzelwellenlängen- detektionen ausgeführt worden sind. Wenn diese komplett verfügbar sind, kann die Auswertung erfolgen.
Alternativ ist es möglich, automatisch einen spektralen Scan durchzuführen, und nach Abschluss eines derartigen Scans zu entscheiden, ob zusätzliche Daten erforderlich o- der weitere Scanvorgänge notwendig erscheinen. Anschließend ist eine Auswertung in optimierter Weise möglich.

Claims

Patentansprüche
1. Scanner für die Abtastung von frisch gewonnen Gewebeproben, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Durchfüh- rung und Auswertung eines bildgebenden Verfahrens unter Verwendung einer schwingungsspektroskopischen Bildgebung, insbesondere ein CARS-Bildgebung oder CARS-artiger Bildgebung .
2. Scanner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung des bildgebenden Verfahrens einen Vergleich wenigstens von Teilen erfasster Bilder mit Substanzbiblio¬ theken, die CARS-Signaturen von möglicherweise relevanten Substanzen oder Gewebebibliotheken, auch mathematisch bear- beitet, enthält, umfasst.
3. Scanner nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet durch wenigstens eine in ihrer Ausgangswellenlänge modifizierbare Laser- oder Lichteinrichtung zur CARS- Anregung einer zu beobachtenden Schnellschnitt-Probe.
4. Scanner nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch wenigstens eine Laser- oder Lichteinrichtung mit fester Ausgangswellenlänge, die auch als Pumpquelle ge- nutzt werden kann.
5. Scanner nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Überlagerung eines auf der Grundlage der schwingungsspektroskopischen Bildgebung erhaltenen Bildes mit anderweitig erhaltenen Bildern oder Ausschnitten von Modellen, die zum Vergleich herangezogen werden können.
6. Verfahren für die Abtastung von frisch gewonnen Gewebeproben, gekennzeichnet durch Anwendung eines bildgebenden Verfahrens unter Verwendung einer schwingungsspektroskopi¬ schen Bildgebung, insbesondere einer CARS-Bildgebung oder CARS-artiger Bildgebung.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung des bildgebenden Verfahrens einen Vergleich wenigstens von Teilen erfasster Bilder mit Substanz- bibliotheken, die CARS-Signaturen von möglicherweise relevanten Substanzen oder Gewebebibliotheken, auch mathematisch bearbeitet, enthält, umfasst.
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