WO2014019994A1 - Utilisation de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans un procédé d'insémination programmée chez les mammifères - Google Patents

Utilisation de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans un procédé d'insémination programmée chez les mammifères Download PDF

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WO2014019994A1
WO2014019994A1 PCT/EP2013/065924 EP2013065924W WO2014019994A1 WO 2014019994 A1 WO2014019994 A1 WO 2014019994A1 EP 2013065924 W EP2013065924 W EP 2013065924W WO 2014019994 A1 WO2014019994 A1 WO 2014019994A1
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WO
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methyl
heptene
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mammal
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PCT/EP2013/065924
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Inventor
Birte L NIELSEN
Nathalie JEROME
Olivier RAMPIN
Yves Maurin
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Institut Francais Du Cheval Et De L'equitation
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/64—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving ketones

Definitions

  • the present invention is in the field of programmed insemination methods in mammals. More particularly, it relates to the use of a molecule, 6-methyl-5-heptene-2-one, in such a method, particularly for the detection of oestrus in female mammals, and / or to stimulate reproductive functions in male mammals.
  • the invention also relates to a kit for implementing such a method for detecting oestrus in female mammals.
  • oestrus In female mammals, such as mares, cows, foxes, etc., oestrus is the period during which the female is receptive to males and fecundable, as opposed to the diestrus, defined as a period of sexual quiescence between two periods of oestrus. Depending on the species, the estrus period may be relatively brief. The detection of the occurrence of this period allows the breeders to optimize the implementation of programmed insemination methods, whether artificial insemination or natural insemination, that is to say by mating of the male and the female, and consequently of optimizing breeding programs.
  • estrus is, however, difficult to identify, and existing methods have many disadvantages.
  • blower stallion For example, in horses, it is common to have recourse to a particular stallion, called blower stallion, which identifies the mares in a state of being inseminated. Such a process is laborious to implement, and it is also dangerous, insofar as the blower standard is not allowed to mate.
  • Another method that can be implemented is based on the ultrasound technique. Such an examination must however be implemented by a veterinarian, so that it is binding and expensive.
  • fox whose breeding has a certain interest in the context of fur production, it has been proposed by the prior art to determine the sexual status of females by measuring vaginal electrical resistance, by clinical signs.
  • the present invention aims in particular to provide such a detection method. More generally, the present invention aims to provide solutions for optimizing programmed insemination methods in mammals, whether artificial insemination or natural.
  • 6-methyl-5-heptene-2-one also called methylheptenone
  • methylheptenone a particular volatile molecule
  • carnivorous species such as foxes, omnivores such as rats, and herbivores such as horses.
  • this molecule is present in body fluids derived from female mammals in higher concentrations during estrus than during diestrus.
  • 6-Methyl-5-heptene-2-one is a naturally occurring volatile molecule known in itself, which is found especially in human sweat, and which has been described in particular as an alarm pheromone in certain ant species (Duffield et al., 1977. Ann Entomol, Soc.Am 70, 309-310). It has also been described as more abundant in the urine of female foxes than in males (Jorgenson et al., 1978, Science 199, 796-798).
  • 6-methyl-5-heptene-2-one exhibits an erectile effect in the male mammal, particularly in the rat, and that it contributes significantly to the olfactory determination, by the male, of the sexual receptivity of the female.
  • 6-Methyl-5-heptene-2-one therefore constitutes a particularly useful marker for the detection of estrus in mammals, and, more generally, an advantageous tool for programmed insemination methods in mammals.
  • the present invention thus relates to the use of 6-methyl-5-heptene-2-one in a programmed artificial or natural insemination process in mammals.
  • the present invention proposes to take advantage of the characteristics of this molecule discovered by the present inventors to determine the optimum period for the insemination of a female mammal. It is thus proposed by the present invention to perform the detection of estrus in a female mammal by a method comprising a step of assaying 6-methyl-5-heptene-2-one present in a sample of a body fluid. of the mammal. According to a first aspect, the present invention is thus expressed in terms of a method for detecting estrus in a female mammal, according to which the assay of the present 6-methyl-5-heptene-2-one is carried out. in a sample of a body fluid from the mammal.
  • estrous detection method may advantageously be implemented for all mammalian species for which it may be advantageous to detect the estrus periods of the female, which moreover is easily and non-invasively, particularly for cash (horse, fox, cow, etc.), or for example species kept in zoos, such as mink, camel or giraffe.
  • dosing is meant in the present description a a quantitative measurement that can be both absolute and relative, for example with respect to the same molecule in a reference control sample, or with respect to another molecule in the same sample, or with respect to the same molecule in a sample of a biological fluid taken from the same individual on the previous day or days.
  • the assay consists of an absolute quantification of the 6-methyl-5-heptene-2-one present in the sample.
  • the estrus detection method may then comprise a step of comparing the measured quantity of this molecule in the sample with a predetermined threshold value to be indicative of estrus, more specifically a threshold value determined so that any value above it indicates a period of oestrus in the tested female.
  • This method may further comprise a step of deducing the occurrence of estrus in the female, depending on the result of this comparison, the "estrus" state being attributed to females for which the measured amount of 6-methyl- 5-heptene-2-one is greater than the predetermined threshold value.
  • the assay consists of a relative quantification of 6-methyl-5-heptene-2-one present in the sample, relative to 6-methyl-5-heptene. -2-one in a reference control sample which contains it in a threshold concentration that is predetermined for the mammal studied, so that any concentration above this threshold concentration is indicative of oestrus.
  • the method may then include a step of deducing the occurrence of estrus in the female, depending on the result of this relative quantification.
  • the oestrus status is attributed to females for whom the amount of 6-methyl-5-heptene-2-one the sample tested is greater than the amount of this same molecule in the reference control sample.
  • the assay may consist of a relative quantitation of the 6-methyl-5-heptene-2-one present in the sample, relative to the 6-methyl-5-heptene-2-one present in a sample of the same biological fluid of the same individual, but taken at a different time, for example the day before, or a few days before.
  • the method comprises: sampling of a body fluid from the mammal at different time intervals, in particular every day or a few days apart,
  • increase is meant here a significant increase over the value obtained for an earlier sampling time.
  • the importance of the increase testifying to the occurrence of oestrus is dependent on the mammal under consideration, and can be determined by those skilled in the art, by adequate experimental tests.
  • This increase may for example be greater than or equal to 5%, or greater than or equal to 10%, depending on the particular mammal, with respect to the value obtained for an earlier sampling time.
  • any conventional method for determining a molecule in a sample, in particular a body fluid can be implemented. in the context of the present invention. Low cost and easy to implement dosing methods are particularly preferred in the context of the invention.
  • the body fluid of the mammal on a sample from which the assay is performed may be saliva, cervico-vaginal mucus, secretion of the anal glands, etc.
  • Body fluids that can be non-invasively collected, such as urine or feces, are particularly preferred in the context of the invention.
  • the assay step is preceded by a step of extracting the 6-methyl-5-heptene-2-one present in the body fluid sample, by example by the thermo-desorption technique.
  • the invention also relates to a kit for implementing a programmed insemination method in mammals, more particularly for the detection of estrus in a female mammal meeting one or more of the above characteristics.
  • This kit comprises means for assaying 6-methyl-5-heptene-2-one present in a sample of a body fluid derived from the mammal, that is to say means allowing the relative or absolute quantification of the 6-methyl-5-heptene-2-one present in the body fluid sample from the mammal.
  • These means of assay may for example comprise one or a plurality of reagents capable of producing a detectable and measurable signal in contact with the 6-methyl-5-heptene-2-one, present in the sample, in particular in dissolved form in a sample of body fluid, or released by the sample and present as vapor in the atmosphere surrounding the sample.
  • This detectable signal may include the generation of an electric current, a color change, the release of a particular gas, etc.
  • This or these reagents may in particular be immobilized on an inert support, such as a nitrocellulose membrane, for example in the form of a strip, or in a closed container inside which may be introduced a sample of atmosphere taken around the body fluid sample of the mammal.
  • the dosing means then also preferably comprise detection and measurement means, for example a small apparatus, able to detect and measure the detectable and measurable signal which is produced in the presence of 6-methyl-5-heptene-2-one. . It can especially be an apparatus for measuring low-intensity electrical currents, an optical cell measurement apparatus, etc.
  • the kit according to the invention may also comprise means allowing the deduction of the occurrence of estrus in the tested female, depending on the results of this assay.
  • These deduction means may in particular comprise a correspondence table indicating, for each of several types of mammals given, a threshold value beyond which it can be concluded that the female mammal is in estrus period.
  • kit according to the invention further comprises instructions for use.
  • the kit further comprises a control sample containing 6-methyl-5-heptene-2-one in a threshold concentration that is predetermined so that any concentration greater than this threshold concentration is indicative of estrus in the tested mammalian female.
  • the present invention proposes to use 6-methyl-5-heptene-2-one to improve the reproductive function of a male mammal, in particular the libido of said mammal, by bringing it into contact with a mammal.
  • composition containing 6-methyl-5-heptene-2-one The present invention thus relates to the use of a composition containing 6-methyl-5-hepten-2-one to improve the reproductive function of a male mammal, in particular the libido of this mammal.
  • 6-methyl-5-heptene-2-one is an interesting solution, and can improve the reproductive capacity of male mammals, especially in order to recover their semen in order to subsequent artificial insemination and / or to mate with females in the oestrus stage.
  • Reproductive abilities are defined here as behavioral abilities, including libido, and / or physiological abilities, including the quality and / or quantity of semen.
  • 6-methyl-5-heptene-2-one is used in solution in a solvent, for example in an alcohol.
  • composition is preferably packaged as a spray, so that it can be sprayed into the nasal areas of the male to be treated, and thus allow a high and accurately measured concentration of 6-methyl-5-heptene-2-one to be inhaled by the male.
  • FIG. 1a is a bar graph showing the frequency, on average less square, +/- the standard error, erections of male sexually naive rats during a 30 min test of exposure to odors respectively of grass, 6-methyl-5-heptene-2-one ("MH”), faeces of rats in diestrus ("Diestrus”) and feces of oestrus rats ("oestrus");
  • MH 6-methyl-5-heptene-2-one
  • Diestrus faeces of rats in diestrus
  • oestrus feces of oestrus rats
  • FIG. 1b is a bar graph showing the frequency, on average less square, +/- the standard error, of erections of sexually trained male rats during a 30 minute test of odor exposure respectively.
  • herb 6-methyl-5-heptene-2-one ("MH"), faeces of rats in diestrus ("Diestrus”) and feces of oestrus rats ("oestrus").
  • Hormonal status of female rats (Brown Norway, mean age 17 weeks) is determined from vaginal smears obtained from cotton swabs and deposited on glass slides. These slides are stained with 8% Giemsa solution and examined under a microscope to identify the cell profiles present in each sample and their proportions. Immediately after determining the status in the estrous cycle of each female, their feces are collected on the floor of the cages that contain them individually. Only females for whom sexual status has been clearly established are tested. The hormonal status of the foxes is also determined by vaginal smear. Their feces are collected on the floor of the cages containing them individually, immediately after determination of this status.
  • the hormonal status of mares is determined by determination of progesterone and total estrogen, as well as by transrectal ovarian ultrasound.
  • the feces are collected by intra rectal sampling.
  • Samples of faeces thus collected, of 6 g each, are subjected to a heat-desorption treatment, in order to recover 6-methyl-5-heptene-2-one.
  • the samples are placed on glass cotton at the bottom of a Pyrex extractor equipped with a volatile molecule trap (Tenax® TA 35/60 / carbograph 1 TD 40/60 Mesh).
  • the extractor is flushed with a stream of nitrogen at a rate of 70 ml / min for 30 minutes.
  • the trapped volatile compounds are recovered by thermal desorption implemented in a conventional thermal desorber itself.
  • the temperature program is determined for purging for 1 minute, desorption at 250 ° C for 5 min, cold trapping at -10 ° C for 3 min, then immediately heating at 300 ° C for injection into a gas chromatography column.
  • the analysis of the compounds after their desorption is carried out by gas chromatography.
  • the gas chromatography column is a SPB-5 capillary column (60 m ⁇ 0.32 mm ⁇ 1 ⁇ , Supelco).
  • the temperature in the oven of the chromatograph is maintained at 40 ° C for 5 min, gradually increased at 3 ° C / min to 250 ° C, and maintained at this value for 2 min.
  • the experimental spectra obtained are compared with a control spectrum obtained from a solution of 6-methyl-5-heptene-2-one, in order to identify the peak corresponding to this molecule.
  • the abundance of 6-methyl-5-heptene-2-one is determined from the surface of this peak.
  • the values obtained are indicated in the Table 1 below, for each species, for the male (M), the female diestrus (D) and the female in estrus (O).
  • the rats are successively placed in the presence of oestrus feces, female faeces in diestrus, 6-methyl-5-heptenen-2-one and grass, neutral odor, as a negative control. These smells are obtained respectively from:
  • a behavioral test is implemented as follows.
  • the rats are accustomed to be transferred to a test chamber, 50 x 30 x 30 cm 3 in glass, having 3 opaque walls and 1 transparent wall.
  • the chamber is covered with a perforated transparent cover, and the floor covered with clean sawdust.
  • the chamber contains an empty odor container, in the form of a weighted cylinder of 690 g, 8.5 cm high and 6.0 cm in diameter, placed at one end of the chamber. bedroom.
  • the test starts when the male rats have reached the age of 11 weeks. For each test, the rats get used for 5 minutes in the presence of the empty odor container. Then, a 15 x 45 mm glass vial, containing 4 ml of odor solution to be tested, is placed in the container.
  • a perforated cover by 35 holes of diameter 5 mm.
  • Odor exposure is carried out for 30 minutes.
  • the behavior of the rats is filmed and observed continuously by a trained experimenter, who records and time stamps each behavioral component of the rat, including each erection.
  • the rat is returned to its cage, the chamber is washed and disinfected, and the room ventilated for 20 minutes before the next test.
  • rats are successively exposed to the four smells, first to the sexually naive state, then again after undergoing sexual training, as described below.
  • 6-methyl-5-hepten-2-one and the herb are tested first, and the 2 faeces are then tested according to a Latin square plan.
  • 5.6 rats are tested per day, and at least 3 days, and an average of 6.4 days separate the test phases for the same rat. No female is present during these odor tests.
  • Behavioral data are analyzed using generalized linear models (Minitab ver 12.2).
  • Odor test data are analyzed separately for naive males and experimented males, then whole and individual analyzes are performed by comparing the "naive" and "experienced” group responses to each odor.
  • analyzes reveal a significant effect of odor or sexual experience on the latency, frequency, or duration of a behavioral component, comparisons are made using the Tukey test. Similar analyzes are performed for the number of behavior changes, that is, the total number of behavioral events recorded during a test.
  • the effect of 6-methyl-5-heptene-2-one on periods of immobility is different before and after sexual training: naive rats show fewer periods of immobility with the smell of grass and 6-methyl-5-heptene-2-one, with the diestrus and estrus feces (1.1 and 1.7 vs.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans un procédé d'insémination programmée chez les mammifères, en particulier selon laquelle on réalise la détection de l'œstrus chez un mammifère femelle par un procédé comportant une étape de dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans un échantillon d'un fluide corporel issu dudit mammifère.

Description

UTILISATION DE LA 6-MÉTHYL-5-HEPTÈNE-2-ONE DANS UN PROCÉDÉ D'INSÉMINATION PROGRAMMÉE CHEZ LES MAMMIFÈRES
La présente invention s'inscrit dans le domaine des procédés d'insémination programmée chez les mammifères. Plus particulièrement, elle concerne l'utilisation d'une molécule, la 6-méthyl-5-heptène-2-one, dans un tel procédé, en particulier pour la détection de l'œstrus chez les mammifères femelles, et/ou pour stimuler les fonctions reproductives chez les mammifères mâles. L'invention concerne également un kit pour la mise en œuvre d'un tel procédé de détection de l'œstrus chez les mammifères femelles.
Chez les mammifères femelles, telles que les juments, les vaches, les renardes, etc., l'œstrus correspond à la période pendant laquelle la femelle est réceptive aux mâles et fécondable, par opposition au diestrus, défini comme une période de quiescence sexuelle entre deux périodes d'œstrus. Selon les espèces, la période d'œstrus peut s'avérer relativement brève. La détection de l'occurrence de cette période permet aux éleveurs d'optimiser la mise en œuvre des procédés d'insémination programmée, qu'il s'agisse d'insémination artificielle ou d'insémination naturelle, c'est-à-dire par accouplement du mâle et de la femelle, et par voie de conséquence d'optimiser les programmes d'élevage.
Il existe à l'heure actuelle plusieurs types de procédés de détection de l'œstrus chez les mammifères. Chez certaines espèces, comme le cheval et le renard domestique, l'œstrus est cependant difficilement identifiable, et les procédés existants présentent de multiples inconvénients.
Par exemple, chez les équins, il est fréquent d'avoir recours à un étalon particulier, dit étalon souffleur, qui identifie les juments en état d'être inséminées. Un tel procédé est laborieux à mettre en œuvre, et il est en outre dangereux, dans la mesure où l'étalon souffleur n'est pas autorisé à s'accoupler. Un autre procédé pouvant être mis en œuvre repose sur la technique de l'échographie. Un tel examen doit cependant être mis en œuvre par un vétérinaire, si bien qu'il est contraignant et coûteux. Chez le renard, dont l'élevage présente un intérêt certain dans le cadre de la production de fourrure, il a été proposé par l'art antérieur de déterminer le statut sexuel des femelles par la mesure de la résistance électrique vaginale, par les signes cliniques d'élargissement de la vulve, ou encore par la mesure de la progestérone sanguine (Barta M et al. 1991 , Veterinarni Medicina. 36, 355-360). Ces méthodes présentent toutes un ou plusieurs inconvénients, parmi ceux d'être invasives, laborieuses à mettre en œuvre, et/ou peu fiables.
Il subsiste ainsi un besoin pour un procédé de détection de l'œstrus chez les mammifères, qui soit fiable, peu contraignant à réaliser, non invasif, et qui soit commun à de multiples espèces de mammifères, voire à toutes, de sorte à permettre d'optimiser les procédés plus globaux d'insémination programmée mis en œuvre chez les mammifères. La présente invention vise notamment à proposer un tel procédé de détection. De manière plus générale, la présente invention vise à proposer des solutions pour optimiser les procédés d'insémination programmée chez les mammifères, qu'il s'agisse d'insémination artificielle ou naturelle.
A l'origine de la présente invention, il a été découvert par les présents inventeurs qu'une molécule volatile particulière, la 6-méthyl-5-heptène-2-one, également nommée méthylhepténone, est indicative de l'œstrus chez plusieurs espèces de mammifères différentes, notamment des espèces carnivores telles que le renard, omnivores telles que le rat, et herbivores telles que le cheval. Plus précisément, les présents inventeurs ont découvert que cette molécule est présente dans des fluides corporels issus des mammifères femelles dans des concentrations plus élevées pendant l'œstrus que pendant le diestrus.
La 6-méthyl-5-heptène-2-one est une molécule naturelle volatile connue en elle-même, qui se retrouve notamment dans la sueur humaine, et qui a en particulier été décrite comme une phéromone alarme chez certaines espèces de fourmis (Duffield et al. 1977. Ann. Entomol. Soc. Am. 70, 309- 310). Elle a également été décrite comme plus abondante dans l'urine des renards femelles que dans celle des mâles (Jorgenson et al. 1978, Science 199, 796-798).
En outre, et de manière inattendue, il a également été découvert par les présents inventeurs que la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente un effet érectile chez le mammifère mâle, en particulier chez le rat, et qu'elle contribue de manière significative à la détermination olfactive, par le mâle, de la réceptivité sexuelle de la femelle. La 6-méthyl-5-heptène-2-one constitue de ce fait un marqueur particulièrement pertinent pour la détection de l'œstrus chez les mammifères, et, plus généralement, un outil avantageux pour les procédés d'insémination programmée chez les mammifères. De manière générale, la présente invention concerne ainsi l'utilisation de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans un procédé d'insémination programmée, artificielle ou naturelle, chez les mammifères.
Selon un premier aspect, la présente invention propose de tirer parti des caractéristiques de cette molécule découvertes par les présents inventeurs pour déterminer la période optimale pour l'insémination d'un mammifère femelle. Il est ainsi proposé par la présente invention de réaliser la détection de l'œstrus chez un mammifère femelle par un procédé comportant une étape de dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans un échantillon d'un fluide corporel du mammifère. Selon un premier aspect, la présente invention s'exprime ainsi dans les termes d'un procédé de détection de l'œstrus chez un mammifère femelle, selon lequel on réalise le dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans un échantillon d'un fluide corporel issu du mammifère.
Un tel procédé de détection de l'œstrus peut avantageusement être mis en œuvre pour toutes espèces de mammifères pour lesquelles il peut être intéressant de détecter les périodes d'œstrus de la femelle, qui plus est facilement et de manière non invasive, en particulier pour les espèces de rente (cheval, renard, vache, etc.), ou par exemple pour les espèces conservées dans des zoos, telles que le vison, le chameau ou la girafe. Par le terme dosage, on entend dans la présente description une mesure quantitative qui peut aussi bien être absolue que relative, par exemple par rapport à la même molécule dans un échantillon témoin de référence, ou par rapport à une autre molécule dans le même échantillon, ou encore par rapport à la même molécule dans un échantillon d'un fluide biologique prélevé chez le même individu le ou les jours précédents.
Ainsi, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le dosage consiste en une quantification absolue de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans l'échantillon. Le procédé de détection de l'œstrus peut alors comporter une étape de comparaison de la quantité mesurée de cette molécule dans l'échantillon avec une valeur seuil prédéterminée pour être indicative de l'œstrus, plus précisément une valeur seuil déterminée de telle sorte que toute valeur qui lui est supérieure indique une période d'œstrus chez la femelle testée. Ce procédé peut en outre comporter une étape de déduction de l'occurrence de l'œstrus chez la femelle, en fonction du résultat de cette comparaison, l'état « œstrus » étant attribué aux femelles pour lesquelles la quantité mesurée de 6-méthyl-5-heptène-2-one est supérieure à la valeur seuil prédéterminée.
L'homme du métier saura déterminer cette valeur seuil, en fonction de chaque espèce de mammifères donnée, par des dosages réalisés sur des femelles dont le statut sexuel (œstrus ou diestrus) a été préalablement déterminé par des méthodes proposées par l'art antérieur.
Dans des modes de mise en œuvre différents de l'invention, le dosage consiste en une quantification relative de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans l'échantillon, par rapport à la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans un échantillon témoin de référence qui la contient dans une concentration dite seuil qui est prédéterminée, pour le mammifère étudié, de sorte à ce que toute concentration supérieure à cette concentration seuil soit indicative de l'œstrus.
Le procédé peut alors comporter une étape de déduction de l'occurrence de l'œstrus chez la femelle, en fonction du résultat de cette quantification relative. L'état « œstrus » est attribué aux femelles pour lesquelles il est observé que la quantité de 6-méthyl-5-heptène-2-one dans l'échantillon testé est supérieure à la quantité de cette même molécule dans l'échantillon témoin de référence.
Autrement, le dosage peut consister en une quantification relative de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans l'échantillon, par rapport à la 6- méthyl-5-heptène-2-one présente dans un échantillon du même fluide biologique du même individu, mais prélevé à un temps différent, par exemple le jour précédent, ou quelques jours avant.
Ainsi, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend : - le prélèvement d'échantillons d'un fluide corporel du mammifère à différents intervalles de temps, notamment chaque jour ou à quelques jours d'intervalle,
- le dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans chacun des échantillons ainsi prélevés, de sorte à obtenir pour chaque échantillon une valeur représentative de sa concentration en 6-méthyl-5-heptène-2-one,
- et la comparaison des valeurs représentatives ainsi obtenues pour les différents échantillons, une augmentation de la valeur représentative obtenue à un temps de prélèvement donné, par rapport à un temps antérieur, étant indicative de l'œstrus. Ainsi, lorsqu'il est observé que la valeur représentative obtenue pour un échantillon prélevé à un temps donné, est supérieure à la valeur représentative obtenue pour un ou plusieurs échantillons prélevés à des temps antérieurs, on en déduit que le mammifère est entré en période d'œstrus.
On entend ici, par le terme augmentation, une augmentation significative par rapport à la valeur obtenue pour un temps de prélèvement antérieur. L'importance de l'augmentation témoignant de l'occurrence de l'œstrus est dépendante du mammifère considéré, et peut être déterminée par l'homme du métier, par des tests expérimentaux adéquats. Cette augmentation peut par exemple être supérieure ou égale à 5 %, ou encore supérieure ou égale à 10 %, en fonction du mammifère particulier, par rapport à la valeur obtenue pour un temps de prélèvement antérieur.
De manière générale, au-delà des modes de mise en œuvre particuliers plus précisément décrits ci-avant, toute méthode classique en elle- même de dosage d'une molécule dans un échantillon, notamment d'un fluide corporel, peut être mise en œuvre dans le cadre de la présente invention. Les procédés de dosage de faible coût de revient et faciles à mettre en œuvre sont particulièrement préférés dans le cadre de l'invention.
Le fluide corporel du mammifère sur un échantillon duquel le dosage est réalisé peut être la salive, le mucus cervico-vaginal, une sécrétion des glandes anales, etc. Les fluides corporels pouvant être collectés de manière non invasive, tels que l'urine ou les fèces, sont particulièrement préférés dans le cadre de l'invention.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'étape de dosage est précédée d'une étape d'extraction de la 6-méthyl-5-heptène-2- one présente dans l'échantillon de fluide corporel, par exemple par la technique de thermo-désorption.
L'invention concerne également un kit pour la mise en œuvre d'un procédé d'insémination programmée chez les mammifères, plus particulièrement pour la détection de l'œstrus chez un mammifère femelle répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant.
Ce kit comporte des moyens de dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2- one présente dans un échantillon d'un fluide corporel issu du mammifère, c'est- à-dire des moyens permettant la quantification relative ou absolue de la 6- méthyl-5-heptène-2-one présente dans l'échantillon de fluide corporel issu du mammifère.
Ces moyens de dosage peuvent par exemple comprendre un ou une pluralité de réactifs aptes à produire un signal détectable et mesurable au contact de la 6-méthyl-5-heptène-2-one, présente dans l'échantillon, notamment sous forme dissoute dans un échantillon de liquide corporel, ou libérée par l'échantillon et présente sous forme de vapeur dans l'atmosphère environnant l'échantillon. Ce signal détectable peut notamment consister en la génération d'un courant électrique, un changement de couleur, la libération d'un gaz particulier, etc. Ce ou ces réactifs peuvent en particulier être immobilisés sur un support inerte, tel qu'une membrane de nitrocellulose, par exemple sous forme de bandelette, ou dans un contenant fermé à l'intérieur duquel peut être introduit un échantillon d'atmosphère prélevée autour de l'échantillon de fluide corporel du mammifère.
Les moyens de dosage comprennent alors également de préférence des moyens de détection et de mesure, par exemple un petit appareillage, aptes à détecter et mesurer le signal détectable et mesurable qui est produit en présence de 6-méthyl-5-heptène-2-one. Il peut notamment s'agir d'un appareillage de mesure de courants électriques de faible intensité, d'un appareillage de mesure à cellule optique, etc.
Le kit selon l'invention peut également comporter des moyens permettant la déduction de l'occurrence de l'œstrus chez la femelle testée, en fonction des résultats de ce dosage. Ces moyens de déduction peuvent notamment comprendre un tableau de correspondance indiquant, pour chacun de plusieurs types de mammifères donnés, une valeur seuil au-delà de laquelle il est possible de conclure que le mammifère femelle se trouve en période d'œstrus.
Le cas échéant, le kit selon l'invention comprend en outre des instructions d'utilisation.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le kit comporte en outre un échantillon témoin contenant de la 6-méthyl-5-heptène-2- one dans une concentration seuil qui est prédéterminée de sorte à ce que toute concentration supérieure à cette concentration seuil soit indicative de l'œstrus, chez le mammifère femelle testé.
Selon un autre aspect, visant toujours à améliorer les procédés d'insémination programmée chez les mammifères, notamment les procédés d'insémination artificielle, mais ici plus particulièrement l'étape de collecte de la semence du mâle, la présente invention propose d'utiliser la 6-méthyl-5- heptène-2-one pour améliorer la fonction reproductive d'un mammifère mâle, en particulier la libido dudit mammifère, par mise en présence de ce dernier avec une composition contenant de la 6-méthyl-5-heptène-2-one. La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'une composition contenant de la 6-méthyl-5-heptène-2-one pour améliorer la fonction reproductive d'un mammifère mâle, en particulier la libido de ce mammifère.
L'utilisation de la 6-méthyl-5-heptène-2-one, telle que préconisée par la présente invention, constitue une solution intéressante, et permet d'améliorer les capacités reproductives des mammifères mâles, notamment afin de récupérer leur semence en vue d'inséminations artificielles ultérieures et/ou afin de procéder à un accouplement avec des femelles au stade œstrus. Les capacités reproductives s'entendent ici des capacités comportementales, et notamment la libido, et/ou des capacités physiologiques, et notamment la qualité et/ou la quantité de semence.
Comme il a déjà été exposé ci-avant, il a en effet été découvert par les présents inventeurs que suite à la diffusion de cette molécule volatile depuis la composition qui la contient, son inhalation par le mammifère mâle modifie le comportement sexuel de ce dernier, et notamment augmente le nombre d'érections dans une période de temps donnée.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la 6- méthyl-5-heptène-2-one est utilisée en solution dans un solvant, par exemple dans un alcool.
La composition est préférentiellement conditionnée en spray, de sorte à pouvoir être pulvérisée dans les naseaux du mâle à traiter, et à permettre ainsi qu'une concentration élevée et précisément dosée de 6-méthyl-5- heptène-2-one soit inhalée par le mâle.
Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 a et 1 b, dans lesquelles :
- la figure 1 a est un graphe en barres montrant la fréquence, en moyenne par moindre carré, +/- l'erreur standard, des érections de rats mâles sexuellement naïfs durant un test de 30 min d'exposition à des odeurs respectivement d'herbe, de 6-méthyl-5-heptène-2-one (« MH »), de fèces de rattes en diestrus (« Diestrus ») et de fèces de rattes en œstrus (« Œstrus ») ;
- et la figure 1 b est un graphe en barres montrant la fréquence, en moyenne par moindre carré, +/- l'erreur standard, des érections de rats mâles sexuellement entraînés durant un test de 30 min d'exposition à des odeurs respectivement d'herbe, de 6-méthyl-5-heptène-2-one (« MH »), de fèces de rattes en diestrus (« Diestrus ») et de fèces de rattes en œstrus (« Œstrus »).
A/ Exemple 1 - Dosage comparatif de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans des fèces de mammifères respectivement femelles en œstrus, femelles en diestrus et mâles
Dans cette première expérience, on détermine les concentrations relatives de 6-méthyl-5-heptène-2-one dans des fèces respectivement de mammifères femelles en œstrus ou en diestrus, et de mammifères mâles de la même espèce, ceci pour trois espèces différentes que sont le renard domestique (Vulpes vulpes), le rat (Rattus norvegicus) et le cheval (Equus ca bail us).
Les statuts hormonaux des rats femelles (Brown Norway, d'âge moyen de 17 semaines) sont déterminés à partir de frottis vaginaux obtenus au moyen de cotons-tiges et déposés sur des lames de verre. Ces lames sont colorées avec une solution Giemsa à 8 % et examinées au microscope pour identifier les profils cellulaires présents dans chaque échantillon et leurs proportions. Immédiatement après avoir déterminé le statut dans le cycle œstral de chaque femelle, leurs fèces sont collectées sur le sol des cages qui les contiennent individuellement. Seules les femelles pour lesquelles le statut sexuel a pu être clairement établi sont testées. Le statut hormonal des renardes est également déterminé par des frottis vaginaux. Leurs fèces sont collectées sur le sol des cages les contenant individuellement, immédiatement après détermination de ce statut.
Enfin, le statut hormonal des juments est déterminé par dosage de la progestérone et des œstrogènes totaux, ainsi que par échographie ovarienne transrectale. Les fèces sont collectées par prélèvement intra rectal.
Des échantillons des fèces ainsi collectées, de 6 g chacun, sont soumis à un traitement par thermo-désorption, afin d'en récupérer la 6-méthyl- 5-heptène-2-one. A cet effet, les échantillons sont placés sur du coton de verre au fond d'un extracteur Pyrex, pourvu d'un piège à molécules volatiles (Tenax® TA 35/60/carbograph 1 TD 40/60 Mesh). L'extracteur est balayé par un courant d'azote à un débit de 70 ml/min pendant 30 minutes. Les composés volatiles piégés sont récupérés par désorption thermique mise en œuvre dans un désorbeur thermique classique en lui-même. A cet effet, le programme de températures est déterminé pour réaliser une purge pendant 1 minute, une désorption à 250 °C pendant 5 min, un piégeage à froid à -10 °C pendant 3 min, puis immédiatement un chauffage à 300 °C pour injection dans une colonne de chromatographie en phase gazeuse.
L'analyse des composés après leur désorption est réalisée par chromatographie en phase gazeuse. La colonne de chromatographie en phase gazeuse est une colonne capillaire SPB-5 (60 m x 0,32 mm x 1 μητι, Supelco). La température dans le four du chromatographe est maintenue à 40 °C pendant 5 min, augmentée progressivement à raison de 3 °C/min jusqu'à 250 °C, puis maintenue à cette valeur pendant 2 min. Les spectres expérimentaux obtenus sont comparés à un spectre témoin obtenu à partir d'une solution de 6-méthyl-5-heptène-2-one, afin d'y identifier le pic correspondant à cette molécule.
Pour chaque échantillon, il est déterminé, à partir de la surface de ce pic, l'abondance de la 6-méthyl-5-heptène-2-one, exprimée en unités arbitraires de surface (U.A.S.). Les valeurs obtenues sont indiquées dans le Tableau 1 ci-après, pour chaque espèce, pour le mâle (M), la femelle diestrus (D) et la femelle en œstrus (O).
Figure imgf000012_0001
Tableau 1 - Abondance relative de la 6-méthyl-5-heptène-2-one extraite des échantillons de fèces de mâles (M), femelles en diestrus (D) et femelles en œstrus (O), pour trois espèces de mammifères
Les résultats ci-avant montrent que, pour les 3 espèces examinées, la 6-méthyl-5-heptène-2-one est présente dans les fèces des femelles en œstrus en quantité nettement supérieure que dans celles des femelles en diestrus et des mâles. Un procédé de dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans les fèces des femelles, et plus généralement dans leurs fluides corporels, permet ainsi de réaliser une détection fiable de l'œstrus, ceci facilement et de manière non invasive.
B/ Exemple 2 - Etude comportementale chez le rat
16 rats mâles Brown Norway dits naïfs, c'est-à-dire n'ayant pas été sexuellement éduqués, sont étudiés dans cet exemple.
Matériel et Méthodes
Ces rats âgés de 7 semaines n'ont jamais eu de contact avec des femelles depuis leur sevrage. Ils sont maintenus dans des cages, par paires, avec un accès libre à des aliments pour rats (Diet M25, Spécial Diet Services) et à de l'eau du robinet. Pendant une période de 3 semaines, ils sont accoutumés à des cycles de lumière inversés, de 12 h d'obscurité par 24 h, à partir de 05h15. Toute manipulation, entraînement ou analyse sur les rats est réalisée sous lumière rouge pendant la période d'obscurité, durant laquelle les rats sont naturellement actifs.
Les rats sont mis successivement en présence d'odeurs de fèces de femelles en œstrus, de fèces de femelles en diestrus, de 6-méthyl-5-heptène- 2-one et d'herbe, odeur neutre, en tant que témoin négatif. Ces odeurs sont obtenues respectivement à partir de :
- échantillons de fèces de femelles en œstrus et de fèces de femelles en diestrus collectées sur les sols des cages contenant individuellement des rats femelles Brown Norway d'âge moyen de 17 semaines. Le statut vaginal de ces femelles a été préalablement déterminé comme dans l'Exemple 1 ci-avant, à partir de frottis vaginaux.
- une solution de 6-méthyl-5-heptène-2-one à une concentration de 165 ppm dans le 1 ,2-propanediol - une solution de 1 -hexanol (odeur de l'herbe) à une concentration de 5000 ppm dans le 1 ,2-propanediol
Un test comportemental est mis en œuvre comme suit.
Les rats sont accoutumés à être transférés dans une chambre de test, de dimensions 50 x 30 x 30 cm3 en verre, présentant 3 parois opaques et 1 paroi transparente. La chambre est couverte d'un couvercle transparent perforé, et le sol recouvert de sciure propre. Lors de la phase d'accoutumance, la chambre contient un conteneur d'odeur vide, sous la forme d'un cylindre lesté de 690 g, 8,5 cm de haut et 6,0 cm de diamètre, placé à une extrémité de la chambre. Le test démarre lorsque les rats mâles ont atteint l'âge de 1 1 semaines. Pour chaque test, les rats s'habituent durant 5 minutes à la présence du conteneur d'odeur vide. Ensuite, un flacon en verre, de dimensions 15 x 45 mm, contenant 4 ml de solution odorante à tester, est placé dans le conteneur. Ce dernier est fermé par un couvercle perforé (par 35 trous de diamètre 5 mm). Lorsque des échantillons de fèces sont utilisées, ils sont placés au fond du conteneur. L'exposition à l'odeur est réalisée pendant 30 min. Pendant cette période, le comportement des rats est filmé et observé en continu par un expérimentateur entraîné, qui enregistre et horodate chaque composante comportementale du rat, notamment chaque érection. A la fin du test, le rat est ramené dans sa cage, la chambre est lavée et désinfectée, et la pièce aérée pendant 20 min avant le test suivant.
Tous les rats sont successivement exposés aux quatre odeurs, tout d'abord à l'état sexuellement naïf, puis à nouveau après avoir subi un entraînement sexuel, comme décrit ci-après. Dans les 2 séries, la 6-méthyl-5- heptène-2-one et l'herbe sont testées d'abord, et les 2 fèces sont testées ensuite selon un plan en carré latin. En moyenne, 5,6 rats sont testés par jour, et au moins 3 jours, et en moyenne 6,4 jours séparent les phases de test pour un même rat. Aucune femelle n'est présente durant ces tests d'odeur.
L'entraînement sexuel des rats mâles est mis en œuvre avec 12 rats femelles Brown Norway, âgées de 29 semaines, en œstrus. Sur 3 jours différents, chaque rat est exposé à une femelle sexuellement réceptive pour une durée maximale de 30 min ou jusqu'à ce qu'il se produise une éjaculation. Dans ce dernier cas, le test se termine à l'issue de la période réfractaire subséquente. Le comportement, en termes de latences de la première monte et de l'éjaculation, nombre de montes avec intromissions, durée de la période réfractaire (Agmo, A. 1997, Brain Res. Protoc. 1 , 203-209) est enregistré durant chaque session d'entraînement.
Les données comportementales sont analysées en utilisant des modèles linéaires généralisés (Minitab ver. 12.2). Les données obtenues durant l'entraînement sexuel sont analysées en prenant la session d'entraînement (n = 3) comme effet fixe et les mâles (n = 16) et femelles (n = 5) utilisés comme effet aléatoire. Les données des tests d'odeurs sont analysées séparément pour les mâles naïfs et les mâles expérimentés, puis, des analyses globales et individuelles sont réalisées par comparaison des réponses du groupe « naïf » et du groupe « expérimenté » à chaque odeur.
La fréquence, la durée et la latence de chacune des catégories comportementales enregistrées durant les tests sont analysées en prenant l'odeur (n = 4) comme effet fixe et le rat (n = 16) comme effet aléatoire. Lorsque les analyses révèlent un effet significatif de l'odeur ou de l'expérience sexuelle sur la latence, la fréquence ou la durée d'une composante comportementale, des comparaisons sont effectuées en utilisant le test de Tukey. Des analyses similaires sont réalisées pour le nombre de changements de comportements, c'est-à-dire le nombre total d'événements comportementaux enregistrés durant un test.
Tous les résultats sont donnés en moyennes par moindre carré avec erreur standard, sauf indication contraire.
Résultats
Concernant l'entraînement sexuel, tous les mâles copulent jusqu'à l'éjaculation dans les 14 minutes suivant le début d'une session d'entraînement, ceci pendant les 3 sessions réalisées. La latence de la première monte est significativement plus longue dans la première session, par rapport aux deux suivantes (1 ,9 (± 0,20), 0,9 (± 0,20) et 0,6 (± 0,20) min pour les 3 sessions d'entraînement, respectivement ; F2,3o = 10,6 ; P < 0,001 ). Aucune différence n'a été observée entre les sessions concernant le comportement durant la monte et la durée de la période réfractaire, avec une fréquence de monte et d'intromission globale de 17 ± 0,9, un taux de succès de 50 ± 2,3 %, et une période réfractaire de 5,8 ± 0,12 min en moyenne.
En ce qui concerne la réponse comportementale aux odeurs, tous les rats ont exploré le conteneur à odeur dans les 77 s après le début du test (médiane [Q1 ;Q3] : 12 [6;18] s). Le nombre moyen d'érections durant les 30 min de durée du test, pour chaque odeur, est montré, pour les rats naïfs et pour les rats entraînés, respectivement sur les figures 1 a et 1 b.
On y observe qu'il existe un effet de l'odeur sur le nombre d'érections, effet qui est significatif tant pour les rats naïfs (F3,45 = 4,0 ; P = 0,013) que pour les rats entraînés (F3,45 = 7,2 ; P = 0,001 ). Des comparaisons par paires montrent une augmentation significative du nombre d'érections suite à l'entraînement pour les fèces œstrus (Fi,i5=5,1 ; P = 0,040) et pour la 6- méthyl-5-heptène-2-one (Fi,i5=9,5; P = 0,008), alors qu'aucun effet de l'entraînement n'est observé pour les fèces diestrus et l'odeur d'herbe.
La latence de la première érection est réduite après l'entraînement sexuel (16,7 vs 11,9 (±1,57) min ; Fi,43=5,0; P = 0,031). La latence de la première érection chez les rats naïfs est bien plus grande lorsqu'ils sont exposés à l'odeur d'herbe que lorsqu'ils sont exposés à la 6-méthyl-5-heptène- 2-one, les fèces diestrus et les fèces œstrus (25,3 vs 13,7, 14,9 et 11,0 (± 1,91) min ; Fi,43= 5,0 ; P = 0,031).
Les rats naïfs explorent le conteneur à odeurs plus souvent que les rats entraînés (19,3 vs 16,6 (±0,58) fois;
Figure imgf000016_0001
11,3 ; P = 0,001), mais avec une latence légèrement plus longue avant la première investigation (17 vs 12
Figure imgf000016_0002
Comparés aux rats naïfs, les rats entraînés montrent un nombre plus élevé d'épisodes d'immobilité (10,8 vs 13,3 (±0,60);
Figure imgf000016_0003
P = 0,005), de durée plus importante (2,3 vs 3,4 (± 0,18) min ; Fi,ios= 17,6 ; P < 0,001). L'effet de la 6-méthyl-5-heptène-2-one sur les périodes d'immobilité est différent avant et après l'entraînement sexuel : les rats naïfs montrent moins de périodes d'immobilité avec l'odeur d'herbe et la 6-méthyl-5-heptène-2-one, qu'avec les fèces diestrus et œstrus (1,1 et 1,7 vs 3,0 et 3,3 (±0,32) min, respectivement; F3,45=10,8; P< 0,001), alors que l'effet de la 6-méthyl-5- heptène-2-one ne diffère pas de celui des deux odeurs de fèces après l'entraînement sexuel (1,6 vs 4,1, 3,7 et 4,1 (±0,40) min, respectivement; F3,45=9,0; P< 0,001). Ceci est du à des différences dans le nombre des d'épisodes d'immobilité, plus que dans leur durée.
En conclusion, il ressort de cet exemple que les rats naïfs réagissent plus, en termes de nombre d'érections, avec la 6-méthyl-5-heptène-2-one qu'avec l'odeur d'herbe. Après l'entraînement sexuel, la fréquence des érections lors de l'exposition à la 6-méthyl-5-heptène-2-one augmente significativement, et ne diffère que peu de celle observée pour les fèces œstrus. La réponse des rats à l'odeur des fèces diestrus est également élevée, ce qui peut s'expliquer par la conception même de l'expérience réalisée : l'odeur d'herbe et la 6-méthyl-5-heptène-2-one sont naturellement présentes dans les fèces des rats, si bien qu'une exposition initiale aux molécules seules a pu rendre les rats entraînés plus sensibles à l'odeur de la 6-méthyl-5- heptène-2-one. Il est ainsi probable que les rats entraînés aient associé cette odeur à l'acte sexuel, et y aient été plus sensibles lorsqu'ils l'ont retrouvée dans les fèces diestrus. A l'opposé, l'odeur d'herbe, également présente dans les fèces diestrus, n'a pas provoqué plus d'érections après entraînement sexuel qu'avant.
Ces résultats démontrent que la 6-méthyl-5-heptène-2-one joue un rôle significatif dans l'odeur de l'œstrus des rats femelles, et qu'elle provoque une stimulation de la libido des mâles.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de l'œstrus chez un mammifère femelle, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de dosage de la 6-méthyl-5- heptène-2-one présente dans un échantillon d'un fluide corporel issu dudit mammifère.
2. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel ledit dosage consiste en une quantification absolue de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans ledit échantillon.
3. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel ledit dosage consiste en une quantification relative de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans ledit échantillon, par rapport à la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans un échantillon témoin la contenant dans une concentration seuil prédéterminée, pour ledit mammifère, de sorte à ce que toute concentration supérieure à ladite concentration seuil soit indicative de l'œstrus.
4. Procédé selon la revendication 1 , comprenant : - le prélèvement d'échantillons d'un fluide corporel dudit mammifère à différents intervalles de temps,
- le dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans chacun des échantillons ainsi prélevés, de sorte à obtenir pour chacun desdits échantillons une valeur représentative de sa concentration en 6-méthyl-5- heptène-2-one,
- et la comparaison des valeurs représentatives ainsi obtenues, une augmentation de la valeur représentative obtenue à un temps de prélèvement donné, par rapport à un temps antérieur, étant indicative de l'œstrus.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel l'échantillon d'un fluide corporel dudit mammifère est un échantillon de fèces.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, selon lequel ladite étape de dosage est précédée d'une étape d'extraction de la 6- méthyl-5-heptène-2-one dudit échantillon de fluide corporel.
7. Kit pour la mise en œuvre d'un procédé de détection de l'œstrus chez un mammifère femelle selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comportant des moyens de dosage de la 6-méthyl-5-heptène-2-one présente dans un échantillon d'un fluide corporel issu dudit mammifère.
8. Kit selon la revendication 7, comportant un échantillon témoin contenant de la 6-méthyl-5-heptène-2-one dans une concentration seuil prédéterminée de sorte à ce que toute concentration supérieure à ladite concentration seuil soit indicative de l'œstrus chez ledit mammifère femelle.
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