WO2014019099A1 - Procedimiento para obtener y detectar un marcador de objetos a identificar, el marcador, método para la autenticación y método para la verificación - Google Patents

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    • G16C20/60—In silico combinatorial chemistry

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, specifically molecular biology, which refers to a method for obtaining a marker of objects to be identified that comprises at least one DNA fragment and, preferably, a plurality of polymorphic fragments.
  • DNA of the microsatellite and single-base polymorphism type modified in its three-dimensional structure, adsorbed to metallic nanoparticles and micro encapsulated that are active to RAMAN radiation.
  • the method of detecting the marker obtained by the indicated procedure is also protected, the method to instantly authenticate the objects marked with the obtained marker, the method to verify the objects marked with the obtained marker and the method to incorporate a marker to an object to identify.
  • the inventors know the existence of elements that are characteristic of each of the people. Such is the case of fingerprints and such is also the case of DNA.
  • each individual has a biological trace that is particular and that current techniques allow to identify with practically, absolute certainty.
  • the inventors have determined that it is an object of the present invention to obtain a marker formed from polymorphic DNA fragments of any living being existing in nature. This implies that the fragments to be used can be obtained from both humans and animals and plants as well as microorganisms and viruses. To obtain the marker disclosed in this documentation, a combination of polymorphic DNA fragments obtained from all such species is ideal.
  • This greater degree of complexity prevents the counterfeiter from discovering the structure of the marker, especially when it is integrated with relative and absolute concentrations of the STRs and SNPs used.
  • a second objective of the present invention is to have a method and an apparatus that allow the detection and instantaneous authentication, in real time, of the marked objects.
  • a third objective of the present invention is to have a method composed of multiple levels of security; levels that a counterfeiter should overcome in order to reproduce the marker.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • DNA is a macromolecule in which the genetic information of a specific individual is stored.
  • the three-dimensional geometric structure of DNA is the widely disclosed double helix, in whose three-dimensional structure a major groove and a minor groove can be observed. The first one is deep and wide while the minor groove is shallow and narrow.
  • the event destabilizes the DNA molecule.
  • All living beings of the same species share many identical parts of DNA but there are other parts that are different. These different parts are the so-called "polymorphic fragments" that are defined as one of the two or more forms (alleles) existing in a chromosomal locus that differs in a nucleotide sequence or that has a variable number of tandem repeats.
  • the polymorphic fragments are millions, and make each living being existing in nature unique.
  • polymorphic DNA sites may eventually be used for identification purposes as occurs in forensic science.
  • fragments of polymorphic DNA some have tandem variations such as the Minisatélites or VNTR and the Micro-satellites or STRs, denominations that depend on the length of the repetitions of the tandem variations while other fragments have variations of a single nucleotide such as called SNPs.
  • Any fragment of polymorphic DNA has two allelic variants, each inherited from one of the parents.
  • allelic variants exist on average in a number that varies between 7 and 15; while SNPs, they only have two allelic variants per locus. SNPs, however, even when they have less discriminatory power than STRs, have the great advantage of being present in the genome in millionaire amounts, being responsible for the phenotypic characters of living beings.
  • STRs microsatellites
  • SNPs single base polymorphisms
  • STRs or SNPs are used, on the one hand for the feasibility of being analyzed and detected by PCR amplification methods and, on the other hand, because there are millions to choose from among all living things that exist in nature.
  • SERS Raman Surface enhanced Raman Spectroscopy
  • the aforementioned apparatus allows a solution of 0.9 nM (nanomolar) of STR / SNP to be detected by SERS Raman, the minimum detection volume being 100-150 phentoliters, containing at least 60 STR molecules.
  • a Raman spectrum is similar to an infrared spectrum and consists of a wavelength whose band distribution corresponds to the specific molecular vibrations of the sample to be analyzed.
  • a Raman spectroscope is composed of a light source, usually a laser, that is focused on the sample generating inelastic scattered radiation, which is collected optically and directed within a spectrophotometer of selective wavelength, where the detector converts the energy that the photons print into an electrical intensity signal.
  • the Raman signal can be increased by 10 6 to 10 14 , so it is possible to achieve a sensitivity that allows the detection of a single molecule.
  • the adsorption of the STRs and / or SNP polymorphic fragments in nanoparticles of at least one metal selected from gold, silver, platinum and copper is caused, where the size of said nanoparticles ranges in a range between 5 and 200 nm
  • This increase in sensitivity is achieved because the metal particles form a rough surface in the order of 10 nanometers, which is small compared to the wavelength of the incident radiation.
  • the small particle size (the optimum is between 50 and 100 nm) allows the excitation of the metal and increases the sensitivity of detection of adsorbed DNA on its surface.
  • document number CN 1302905 refers to an anti-counterfeiting material containing metal ions prepared by mixing an aqueous solution of a soluble metal salt with high coordination power with a DNA solution and alcohol to obtain a water soluble M-DNA decant with the addition of gelatin, dexthna, the aqueous solution of a soluble starch or gum for marking or ink to impress.
  • Document number US2008 / 0189066 refers to the use and modifications of a Raman spectroscope to authenticate objects that have been marked with different fragments of STR or SNP.
  • fragments to be detected have been obtained without modifying them, that is, selecting them as they occur in nature.
  • US20030235836 refers to the use of polymorphic fragments STRs or micro encapsulated SNPs that are used to mark objects that will then be detected in the laboratory with molecular biology techniques.
  • US Patent 20080189066 refers to a method and apparatus for authentication by Raman spectroscopy, to authenticate items that have a security mark containing a DNA fragment to prevent fraud using a Raman spectrometer.
  • Raman spectrum peaks are detected to generate data from Raman peaks as a security mark.
  • the security of Raman peak data is compared to a Raman peak library to determine if there is a match.
  • the disclosed invention consists of a procedure for obtaining and detecting a marker of objects to be identified, the method for instant authentication of the marked objects and the method for verifying said objects and the marker obtained with said procedure. .
  • the present invention consists of a marker of objects to be identified which discloses the incorporation of at least one polymorphic DNA fragment and, specifically, the incorporation of a plurality of polymorphic DNA fragments of the microsatellite type (STR) and single base polymorphism ( SNP) modified in its molecular structure, adsorbed to metal nanoparticles in the objects to be identified for their subsequent detection or authentication instantaneously and their identification by molecular biology techniques.
  • STR microsatellite type
  • SNP single base polymorphism
  • the invention also comprises a method for obtaining said object marker comprising a first step of selecting at least one living being to proceed to the extraction of DNA from any of its cells; a second step of purifying the obtained DNA; a third step of amplifying the polymorphic fragments of the microsatellite type and / or polymorphism of a base only; a fourth step of determining the allelic variants of the at least one living being chosen; a fifth step of modifying the geometric structure of the at least one polymorphic fragment of the microsatellite type and single base polymorphism; a sixth step of concentration and microencapsulation of DNA; a seventh step of solubilization of the microcapsules containing DNA; an eighth step of determination and / or correction of the degree of fluidity and concentration of the solution and a ninth step of incorporation of the solution by means of a suitable applicator and marking of the desired object.
  • the invention also comprises a method of instantly detecting the Raman SERS marker of the polymorphic fragments used.
  • the invention also comprises a method that includes a first stage of instant validation or authentication by comparison of the spectrum obtained with the spectra stored in a database and a second stage of identification of the polymorphic fragments used in the laboratory with molecular biology techniques that they use the appropriate pairs of primers to amplify said STRs fragments or SNPs used by determining allelic variants.
  • Figure 1 corresponds to a scheme of the different modifications of the three-dimensional structure of DNA.
  • Figure 2 corresponds to a DNA-nano tag scheme. It shows the union of metal particles with DNA form characteristic aggregates forming a true molecular network feasible to be detected by SERS Raman.
  • Figure 3 corresponds to a diagram of the representation of DNA bound to dendrimers, which form three-dimensional structures with a characteristic Raman spectrum.
  • Figure 4 corresponds to a schematic representation of oligonucleotide or peptide aptamers that bind to the DNA molecule that form three-dimensional structures with a characteristic Raman spectrum.
  • Figure 5 corresponds to a representation of an intercalating agent in DNA such as Ethidium Bromide, which affects the three-dimensional structure of DNA and causes changes in the Raman spectrum.
  • Figure 6 corresponds to a Raman spectrum of DNA intercalated with Ethidium Bromide.
  • Figure 7 is a schematic representation of different proteins that bind to the major and minor grooves of the double DNA helix, destabilizing their three-dimensional structure and generating a characteristic Raman spectrum.
  • Figure 8 corresponds to divalent DNA-Metal complexes that produce aggregates producing alteration in the Raman spectrum between 1300-1400 cm "1 .
  • Figure 9 corresponds to a Raman emission spectrum, where it is observed that the peaks corresponding to the wavelength are characteristic of the structure and molecular chemical composition of each analyzed substance, while the intensity of the Raman light dispersed by the molecules in the sample it is dependent on their concentration.
  • Figure 10 corresponds to a diagram of the use of inter-species DNA as an anti-counterfeit tag.
  • Figure 1 1 corresponds to a diagram of the use of personal DNA as an anti-counterfeit tag.
  • Figure 12 corresponds to a diagram of the use of Phenotypic SNPs to authenticate passports.
  • Figure 13 A shows DNA extracted from a person's saliva and the six detailed SNPs genes are amplified.
  • Figure 13 B shows the possible hypothetical scenario for the determination of blue and brown eye color according to the genotypic variants of these six SNPs.
  • Figure 14 is a representation of the use of microspheres with polymorphic DNA as an anti-counterfeit bill tag. Detailed description of the invention
  • the present invention advocates a chemical compound that can be used as a marker and a method by which said marker and where the incorporation of it into an object allows the individualization and validation of said object.
  • said marker should be a chemical compound that can be detected later but only by people who know its structure and use a Raman spectroscope or in the case of ignoring the structure, those who use a Raman spectroscope associated to a database where the structure of the polymorphic fragment is stored and encoded.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • said marker of the objects to be identified consists of at least one polymorphic DNA fragment.
  • the present invention comprises a plurality of steps where at least one living being is selected in order to proceed with extraction of the DNA to be used.
  • the use as a marker of at least one polymorphic DNA fragment of a living being advocated by the inventors must be interpreted in a broad sense, that is to say that whoever makes the decision to make the marking of an object, can select himself as a donor of the DNA fragment or can select any living being, whether of animal, plant, human origin, bacteria and / or viruses, so the possibility of falsifying the marker is further reduced.
  • DNA extraction is carried out from cells or body fluids obtained by common techniques such as, for example, oral swab, blood puncture, collection of epithelial samples or hair follicles, etc.
  • the DNA obtained is released in a solution composed of 10 mM Tris-HCI - 0.1 mM EDTA, 20% SDS (weight / volume) and Proteinase K 10 mgr / ml., Then proceed to purification in the middle of Phenol / Chloroform - 10: 9 (volume / volume).
  • STRs and / or SNPs are amplified by means of the Polymerase Chain Reaction as recommended in US Patent Nos. 4683195; 4683202 and 4800159.
  • the mixture that is placed in a thermocycler comprises the DNA sample in a concentration between 6 pgr and 0.05 pgr; a 10X PCR Buffer solution, 10X dNTP, oligonucleotides flanking the 10X polymorphic region of each and Taq polymerase of 5000 units per mi.
  • allelic variants of the polymorphic fragments chosen in an automatic sequencer type ABI PRISM 310 - Applied Biosystem or higher are determined.
  • the three-dimensional structure of DNA can be modified from the three structures that are known in nature A-DNA, B-DNA and Z-DNA and their other possible conformations such as C-DNA, D-DNA, E-DNA, L -DNA, P-DNA, S-DNA, etc., as well as the triple-stranded H-DNA and the G4-DNA or quadruple DNA.
  • the inventors know that there are multiple ways to modify the three-dimensional structure of DNA so that the procedure described has been performed by any of the following methods: a. -The metal nanoparticles with the adsorbed DNA that are incorporated as a marker, allow to increase the SERS Raman signal between 10 6 and 10 14 times and can be added individually or in the form of colloids producing aggregates such as dimers, trimers, tetramers, etc. . with the DNA molecules. This property is enhanced when at least one bonding group is added to the metal nanoparticles, such as, for example, a polymer selected from phenylacetylene, polytetrafluoroethylene, polypropylene, polyacrylamide, etc .; as depicted in Figure 2.
  • the binding group can also be selected from other types of molecules such as silanes, aliens or their derivatives that bind to DNA molecules forming characteristic aggregates that form a true molecular network that is detected as a unique Raman spectrographic signal.
  • b.-The structure can also be modified with DNA-dendrimer complexes of the PAMAM or similar type that form a characteristic three-dimensional structure giving a unique Raman spectrum as described by Caminade AM, in "Characterization of dendrimers", Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 2130-2166, 2005; as depicted in Figure 3.
  • C. -Another form of modification is made from the covalent union of the polymorphic fragments with synthetic DNA of the PNAs (peptide nucleic acid) type.
  • PNAs are a type of DNA-like polyamides with monomer units of Adenine, Guanine, Thiamine and Cytosine where the sugar junctions corresponding to an oligonucleotide are replaced by amide junctions.
  • PNAs compounds discovered by Nielsen (Science, 254: 1497-15; 1991) can be obtained from companies such as PE Biosystem (Foster City, California); as depicted in Figure 4.
  • d. -Another binding group that can be used arises from the union of polymorphic fragments to "aptamers", the latter resulting in a kind of DNA created through repeated in vitro selection cycles.
  • SELEX systematic evolution of ligands by exponential enrichment
  • a potential aptamer DNA ligand
  • SNP polymorphic fragment a potential aptamer
  • aptamers exhibit high affinity and specificity and preserve the DNA against the polymorphic fragments used as targets. Since aptamers are composed of oligonucleotides, they can easily be incorporated into STRs or SNPs fragments; as depicted in Figure 5.
  • aptamer preparation methods are well known in patents such as US 5,270163, US.5.567588, US.5.670637 and US.5.843653. and. -The intercalating agents fit between the bases along the DNA so that the intercalated molecules of said agents affect the structure of the
  • intercalating agents we can mention the Ethidium bromide, adriamicyn, 9-aminoacridine (9AA) and proflavine (PF) (3,6-diaminoacridine) well described by James M. Benevides in "Mechanisms of drugs - DNA recognition distinguished by Raman spectroscopy "Journal of Raman Spectroscopy-Vol 39 Pag. 1627-1624 among others; as depicted in Figure 6.
  • F. -Another binding group that allows the protein to be linked to the major and minor DNA grooves it mainly uses a drug that interacts with both the minor and the major groove since it is there when precipitation or aggregation occurs by changing the structure three-dimensional DNA. Examples of these types of drugs are Spermine that interacts with the major groove and Spermidine, putrescine, Hoechst 33258, Netropsin, Pentamidine, etc. Among others that react with the minor groove.
  • NMR drug -DNA complexes A detail of each drug that interacts with the major and minor DNA grooves can be seen in "NBD Atlax index NMR drug -DNA complexes".
  • the interaction of these drugs with the major and minor DNA grooves is directly related to the amount of AT, therefore a characteristic spectrum of the polymorphic fragment used to mark the object can be obtained from the sequence of each STR or SNP fraction; as depicted in Figure 7. g.
  • DNA-metal complexes such as Sr +2 , Ba +2 , Mg +2 , Ca +2 , Mn +2 , Co +2 , Ni +2 and Cd +2 , which produce variations between 1300-1400cm-1 forming aggregates as they react with phosphate and / or with nitrogenous bases, destabilizing the double helix by breaking the axial hydrogen bridges as described by JG Duguid in his work "Raman Spectroscopy of DNA-Metal Complexes" (Biophisical Journal Volume 69 Dec .1995- Page 2623-2641; as depicted in Figure 8.
  • the ultracentrifugation concentrate is used for which microconcentrators of the Centricon 100 type are used; subsequently and in order to avoid degradation, the polymorphic fragments are microencapsulated by the phase inversion technique. It is in this step where the polymorphic DNA to be microencapsulated is dissolved in a solvent, and then in the same solvent, to dissolve an aggregate polymer with a concentration of between 0.25% and 0% weight / volume.
  • This polymer used can be selected, interchangeably between those biodegradable and non-biodegradable.
  • lactic and glycolic acids and esters such as polyanhydrides, polyurethanes, butyric polyacid, valerin polyacid, etc. are preferred.
  • vinyl ethylene acetate and acrylic polyacid are preferred, and the use of polyamides and copolymers, as well as mixtures thereof, is also acceptable.
  • the polymers used can also be selected from among the natural ones, in which case it is preferred to use at least one of the group comprising dextran, cellulose, collagen, albumin, casein, or the like.
  • the resulting mixture is subsequently introduced into a non-solvent in a solvent / non-solvent ratio of at least ⁇ 1/40 and up to 4/200 to obtain spontaneous microcapsule formation.
  • the solvent is an organic solvent selected from chloroform and methylene chloride, while the non-solvents that are preferred are ethanol and hexane.
  • a seventh step we proceed to solubilize the DNA microspheres or the
  • Microencapsulated DNA in a neutral solution to detection by Raman spectroscopy Microencapsulated DNA in a neutral solution to detection by Raman spectroscopy.
  • Microspheres with the polymorphic fragment or fragments can be solubilized in different varieties of ink, such as flexographic ink, lithographic ink, screen printing ink, gravure ink, reactive ink coin, erasable ink , reactive pen ink, heat reaction ink, infrared visible ink, optimally variable inks, penetrating inks, photochromic inks, chemical solvent and water reactive ink.
  • ink such as flexographic ink, lithographic ink, screen printing ink, gravure ink, reactive ink coin, erasable ink , reactive pen ink, heat reaction ink, infrared visible ink, optimally variable inks, penetrating inks, photochromic inks, chemical solvent and water reactive ink.
  • the degree of fluidity should allow the applicator to deposit a solution with a concentration between 6 pg and 10 pg of marker per mm2 of surface.
  • the marker is incorporated into an applicator that can be selected from a pen pen, microfiber, pen, various types of filters, atomizer, drawing instrument, brush, seal or an automatic machine such as an electrophotographic printer of the inkjet type or offset lithography machine, letterpress, gravure, xerography, screen printing and textile printing systems or the like, etc.
  • an intermediate means is used between the solution containing the marker and the object to be marked, in which case, said intermediate means is embedded in said solution.
  • the intermediate medium can be selected from various substances, such as nitrocellulose, paper, wood, cardboard, plastic material, charged nylon, cloth, organic substances in the form of droplets or gel, inorganic, etc.
  • the invention also comprises a method of detecting the marker from the detection of the polymorphic DNA fragments that are included in the marker applied by a suitable method for the detection of nucleotides, which include but are not limited to: Normal Raman scattering, Resonance Raman scattering, surface enhanced Raman scattering, surface enhanced resonance Raman scattering, coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS), stimulated Raman scattering, inverse Raman spectroscopy, stimulated gain Raman spectroscopy, hyper-Raman scattering, molecular optical laser examiner (MOLE) or Raman microprobe or Raman microscopy or confocal Raman microspectrometry, three-dimensional or scanning Raman, Raman saturation spectroscopy, time resolved resonance Raman, Raman decoupling spectroscopy or UV-Raman microscopy.
  • a suitable method for the detection of nucleotides include but are not limited to: Normal Raman scattering, Resonance Raman scattering, surface enhanced Raman scattering, surface enhanced resonance
  • the Raman spectrometer used to generate the spectrum of the polymorphic fragment present in the marked object can be desktop or portable, with a laser whose wavelength is in the range of 400 to 1200 nm, with variable voltage; preferably in the present invention portable Raman detectors of 633 and 785 nm have been used, being illustrative but not limiting to devices of other characteristics; as depicted in Figure 9.
  • the invention also comprises a method for validation comprising a first step of suppressing the characteristic fluorescence of DNA; a second stage of comparing the upper and lower values of the intensity of the peaks obtained in the spectrum emitted by the polymorphic DNAs with the limit reference values that were previously stored in a spectrum library, giving an instant authentication response either For positive or negative.
  • the fluorescence suppression is achieved with a series of steps comprising a step of determining an average intensity value in the spectrum data obtained within a section around each point of the mark of said response spectrum and a step of subtracting said mean value from each of the points that produced the DNA used as a marker.
  • said second stage comprises a step of comparing the data of the Raman peaks obtained, with the data of the Raman peaks stored in the database and a step of comparing the wave numbers and intensity of each peak, with the spectrographic data stored in the aforementioned database.
  • the wavelengths in a Raman emission spectrum are characteristic of the chemical composition and structure of the molecules in a sample, while the intensity of the light dispersed is dependent on the concentration of molecules in the sample. That is why in the present development variable concentrations from 0.9 nM (nanomolar) of the STR or SNP polymorphic fragments are used, which is the limit of detection of SERS Raman, thus creating a new level of safety since the possible forger must also know the concentration of the polymorphic fragment or fragments to reproduce the spectrum emitted by the marked object.
  • the detected values of the Raman spectrum emitted by the polymorphic fragments can be sent through a telecommunication system, an analog telephone line, a digital telephone line, a cell phone and / or a device linked to a data network among others.
  • the polymorphic fragments of STRs or SNPs are identified by typing them preferably by means of the Polymerase Chain Reaction. For this, it is absolutely necessary in the first instance to know their name in order to use the appropriate reagents and amplification conditions to perform the corresponding analysis.
  • the typing is carried out by the Polymerase Chain Reaction method although it can also be carried out by procedures and techniques that are common in the prior art such as the use of gels as JM advocate. Robertson (1994); capillary electrophoresis according to Me. Cord (1993); detection by multiple hybridization or multiple capillarity proposed by Y. Wang (1995), by using microchips as established by Woolley (1996); by mass spectrometry according to Becker (1997); etc.
  • single-base polymorphisms can be detected through a single-chain conformational analysis as demonstrated by Orita et al. (1989); oligonucleotide specific allele as indicated by Landeegren et al. (1988); multiple extension of first according to Syvanen et al. (1990) or by any of other technologies among which chip, mass spectrometry, etc. can be mentioned.
  • SNPs are responsible for the phenotypic characters of living beings, so that a procedure with the same twelve steps mentioned is included in the present invention, where the only polymorphic genetic markers used are SNPs and specifically those who are responsible for phenotypic characters that serve to individualize the living being or any product derived from them, for example, a wine can be marked with SNPs that give it color, smell or taste, or a passport can be placed gout with all the fragments of SNPs responsible for the phenotypic characters of a person, such as eye color, hair, skin color etc. Creating, then being detected by SERS Raman and digitized a "genetic photo" that can be checked against the person who has the passport.
  • variants in SNP SLC24A4 are associated with the color of eyes and hairs
  • a variant close to KITLG is associated with hair color
  • two variants of TYR are associated with the color of eyes and freckles
  • a variant in 6p 25.3 is associated with freckles
  • the blue-eyed color was found in three variant SNPs of the OCA2 as well as the different skin color tones are related to the 5 'proximal region of the OCA2 regulatory control.
  • Different authors are investigating and finding more and more genes related to phenotypic characters among the We can cite Sulen, P, Gudbjartsson in "Genetic determinants of hair, eye and skin pigmentation in Europeans" Nat.
  • the present invention provides various complexities aimed at preventing the falsification of marked objects. They have the following security levels:
  • First Level It consists in the determination of the chemical structure of the polymer. In order for a counterfeiter to analyze the composition of the polymorphic fragment or fragments used to mark the object, it must, in the first instance, know the structure of the polymer used to microencapsulate said fragments in order to achieve its opening without altering the DNA inside .
  • Second Level It consists of the identification of the polymorphic fragment.
  • the forger passes the first level, to identify the polymorphic fragment or fragments used to mark the object, he must use the technique of greater detection sensitivity, which is the polymerase chain reaction (PCR) for which he must know the name of the STRs or SNPs polymorphic fragments for the purpose of identifying their sequence and, consequently, the necessary pairs of primers as well as the appropriate reaction conditions to achieve amplification thereof.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Third Level It consists of the typification of the polymorphic fragment (s), since assuming that the forger has managed to evade the previous levels, he must also know the allelic variants of each of the polymorphic fragments to reproduce exactly those used to mark the object.
  • Fourth Level It consists of working with a concentration of the markers that is consistent with the lower limit of the polymorphic fragments of STR or SNP used to make it impossible to use the molecular cloning technique.
  • Fifth Level It consists of the modification of the three-dimensional structure of the DNA molecule using one or a combination of three-dimensional conformations of said molecule, making it difficult for the forger to reverse the process if he is not aware of the modification produced in the structure.
  • Sixth Level It consists of masking the markers with different DNA fragments so that the forger must know which or which of the fragments identified by him have been used to mark the object. With that intention, to the combination of polymorphic fragments used to create that unique code other DNA fragments other than those chosen are added.
  • Seventh Level The use of the Raman spectrum of modified polymorphic fragments determines that the forger must know which or which are the peaks of wavelengths corresponding to the polymorphic fragments whose three-dimensional structure of the DNA molecule has been modified.
  • Eighth Level It consists of masking the Raman spectra of the markers with different spectra of active Raman substances and determines that even if the forger obtains by SERS Raman methodology an emission spectrum must distinguish which are the peaks corresponding to the polymorphic DNA fragments used to generate that unique code or PIN and those corresponding to the active Raman chemicals that are added to mask those corresponding to the remaining DNA fragments.
  • Ninth Level It consists of coding the database so that, after exceeding the previous levels, the forger must decode them to interpret them and apply the response spectra.
  • Tenth Level It consists of the variation of the relative concentration of each polymorphic fragment, so that the authentication is carried out by comparing between the upper and lower values of the intensity of the peaks obtained in the spectrum emitted by the polymorphic DNAs with the values limit that was previously stored in a database of response spectra. Since the values corresponding to the intensity in a Raman spectrum are directly related to the concentration of each polymorphic fragment of STRs or SNPs used to label, the forger should detect what is the relative concentration of each polymorphic fragment used in the markers.
  • a DNA molecule is formed that does not exist in nature. To achieve this, 6 pg is amplified. DNA extracted from the corn gene ZmZ1 P5, the Human gene D13S317 and the canine gene ZUBECA6, Allelic valencies of each of them are determined using an ABI PRIS 310 sequencer from Applied Biosystem. The final PCR product is mixed with a final solution of 0.25 M Silver atoms according to the technique described by Lee. Subsequently micro encapsulated in polystyrene dissolve in sufficient amount of water, in order to apply on the object to be marked.
  • Raman SERS detection is performed using a DeltaNu Raman Inspector with a 120 mW laser at 785 nm, a resolution of 8 cm “1 and a spectrum range of 200-2000cm " 1 .
  • the data was compared with the NuSpec data acquisition and library software.
  • any specialized laboratory in the world can identify the genetic profile used as a tag.
  • the microspheres must be dissolved with a suitable organic solvent and once the pin formed with the access codes to the gene banks of each species has been revealed, eg ZmZIP5ZUBECA6D13S3 7, the appropriate reagents (primers) can be used so that through the PCR can be amplified again the allelic variants used (See figure 10).
  • Example No. 2 Use of personal DNA as anti-counterfeit Taq.
  • a personal DNA molecule is formed.
  • the pin formed with the access codes to the gene banks of each STR / SNP is revealed, added to the allelic variant of each of the fragments used so that any specialized laboratory in the world can recreate the genetic profile of the polymorphic fragments used as Tags without depending on their manufacturer, such as pin: X0629288X14720101 1 M8652545.
  • Example No. 4 Micro spheres with polymorphic DNA as anti-counterfeit banknote tag Its use for this purpose is shown in Figure 14.

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Description

PROCEDIMIENTO PARA OBTENER Y DETECTAR UN MARCADOR DE OBJETOS A IDENTIFICAR, EL MARCADOR, MÉTODO PARA LA AUTENTICACIÓN Y
MÉTODO PARA LA VERIFICACIÓN
DESCRIPCIÓN
Campo de la Invención
La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología, específicamente de la biología molecular, el cual se refiere a un procedimiento para obtener un marcador de objetos a identificar que comprende al menos un fragmento de ADN y, preferentemente, una pluralidad de fragmentos polimórficos de ADN del tipo microsatélites y polimorfismo de una única base modificados en su estructura tridimensional, adsorbidos a nanopartículas metálicas y micro encapsulados que son activos a la radiación RAMAN. Un método para realizar su detección/autenticación instantánea, y su posterior identificación por técnicas de biología molecular y un sistema de seguridad compuesto por diez niveles.
También se protege el método de detección del marcador obtenido por el procedimiento señalado, el método para autenticar instantáneamente los objetos marcados con el marcador obtenido, el método para verificar los objetos marcados con el marcador obtenido y el método para incorporar un marcador a un objeto a identificar.
Los componentes a los que se hace referencia podrán seleccionarse entre diversos equivalentes sin que ello implique apartarse de los principios de la invención establecidos en la presente documentación.
Antecedentes de la invención Resulta permanente la búsqueda de elementos, disposiciones y mecanismos que otorguen mayor seguridad a las transacciones que habitualmente se realizan. Desde tiempos remotos el hombre ha intentado evitar los robos, los engaños y las falsificaciones utilizando para ello documentos que, a poco de estar en el comercio, debieron modificarse para incorporar elementos que resultaran de difícil reproducción. Los lacres con figuras obtenidas a partir de distintos cuños de uso reservado cumplieron las expectativas de las primeras épocas pero debieron prontamente modificarse los métodos de impresión así como los de incorporación de elementos de seguridad que los avances técnicos y la incipiente calidad de los equipos puestos a disposición del gran público han ido superando.
Al borrado de los valores de los cheques para rehacerlos por valores superiores se les ha opuesto el marcado del papel.
La falsificación de papel moneda y documentación en general ha llevado a la adopción de papeles y tintas especiales, tintas ópticas, incorporación de elementos de seguridad en la pasta, protección con películas traslúcidas, etc.
Los inventores conocen la existencia de elementos que resultan propios de cada una de las personas. Tal es el caso de las huellas digitales y tal es también, el caso del ADN.
En efecto, cada individuo posee un rastro biológico que resulta particular y que las técnicas actuales permiten identificar con prácticamente, certeza absoluta.
Si bien esto es así, no escapa al conocimiento de los inventores que la incorporación del ADN completo de un ser vivo a un objeto para lograr una identificación positiva certera resultaría fácilmente aprovechada por los falsificadores ya que bastaría con estar cerca del poseedor de tal ADN para obtener una muestra del mismo.
En efecto, un cabello, la saliva depositada en una copa, una gota de sangre y hasta una mota de piel serían suficientes para obtener el ADN necesario para agregarlo al objeto falsificado que, entonces, aparentará ser verdadero.
Esto ya ha sido previsto por los inventores en el documento 200020102319 AR que diera origen a las presentaciones US 10/307012 y EP 33801366 que se consideran el arte previo más cercano al tema que se desarrolla en la presente documentación. En efecto, teniendo en cuenta la posibilidad enunciada, los inventores han divulgado en los documentos citados que el objeto a identificar debería ser marcado con al menos un determinado fragmento polimórfico de ADN.
Al utilizar solamente un fragmento polimórfico de dicho ADN, al falsificador no le basta con conseguir el ADN completo, sino que deberá conocer cual es la fracción (o combinación de fracciones) del ADN utilizado. Considerando que se encuentra ante miles de millones de combinaciones posibles, resulta prácticamente imposible utilizar la combinación seleccionada por el usuario, obteniéndose en consecuencia, un marcador sumamente efectivo. Si bien el marcador amparado por los documentos citados resulta sumamente efectivo, los inventores han considerado que la capacidad de procesamiento de los ordenadores permite realizar millones de operaciones por segundo incrementando las posibilidades de los falsificadores.
Los inventores conocen que, como se ha divulgado en los documentos citados, la detección de los fragmentos de ADN utilizados como marcador de objetos requiere de una infraestructura que no se encuentra a disposición de todos los laboratorios, de forma que una simplificación del método de detección de los fragmentos de ADN permitiría ampliar el uso de los marcadores de la clase que se preconiza. Además, como todo especialista en biología molecular sabe, aunque el laboratorio que quiera realizar la falsificación sea muy especializado en estas técnicas, este tipo de fragmentos polimórficos detallados en la presente invención (STR/SNP) NO PUEDEN DUPLICADOS SINO SE DETERMINA LA EXACTA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS Y LA DE LOS SITIOS VECINOS A LOS MISMOS
(ya que los reactivos (primers) necesarios para realizar su detección se fabrican a partir de ese conocimiento.
Con tales observaciones realizadas sobre la materia divulgada, los inventores han determinado que resulta un objeto del presente invento el de obtener un marcador conformado a partir de fragmentos polimórficos del ADN de cualquier ser vivo existente en la naturaleza. Ello implica que los fragmentos a utilizarse pueden obtenerse tanto de seres humanos como de animales y de plantas así como de microorganismos y virus. Para la obtención del marcador que se divulga en la presente documentación, resulta ideal una combinación de fragmentos polimórficos del ADN obtenido de todas dichas especies.
Con el fin de realizar la detección instantánea por espectroscopia RAMAN y además aumentar el grado de complejidad que servirá para alejar la falsificación del marcador que se divulga, los inventores han procedido a modificar geométricamente la estructura tridimensional de dichos fragmentos polimórficos para luego adsorberlos sobre nano partículas metálicas.
Este mayor grado de complejidad evita que el falsificador descubra la estructura del marcador, máxime cuando la misma se integra con concentraciones relativas y absolutas de los STRs y SNPs utilizados.
Un segundo objetivo del presente invento es el de contar con un procedimiento y un aparato que permitan la detección y la autenticación instantánea, en tiempo real, de los objetos marcados. Un tercer objetivo del presente invento es el de contar con un procedimiento compuesto por múltiples niveles de seguridad; niveles que un falsificador debería superar para poder reproducir el marcador.
El Acido Desoxirribonucleico (ADN) es una macromolécula en la que se encuentra almacenada la información genética de un individuo determinado. Si bien la estructura geométrica tridimensional del ADN es la tan divulgada doble hélice, en cuya estructura tridimensional se puede observar un surco mayor y un surco menor. El primero de ellos es profundo y amplio mientras el surco menor es poco profundo y estrecho.
Es del conocimiento de los inventores que hay moléculas como las moléculas de las proteínas, que se unen a la parte interior de los surcos del ADN, mediante uniones específicas denominadas puentes de hidrógeno, y uniones no específicas conocidas como interacciones de Van der Waals así como otras interacciones electrostáticas generales. En el caso de las proteínas, las mismas reconocen donantes y aceptores de puentes de hidrógeno y grupos metilo (hidrofóbicos), siendo éstos últimos exclusivos del surco mayor.
Hay cuatro patrones posibles de reconocimiento en el surco mayor, y sólo dos en el surco menor tal y como se ha representado en la Figura número 1 .
Sabemos que algunas moléculas se unen al ADN por el surco mayor mientras otras lo hacen por el surco menor, en tanto que algunas otras se unen por ambos surcos.
En éste tercer caso, el evento desestabiliza la molécula de ADN. Todos los seres vivos de una misma especie comparten muchas partes idénticas de ADN pero existen otras partes que son diferentes. Estas partes diferentes son los llamados "fragmentos polimórficos" que se definen como una de las dos o más formas (alelos) existentes en un locus cromosomico que difiere en una secuencia de nucleótidos o que tiene un número variable de repeticiones en tándem. Los fragmentos polimórficos son millones, y hacen que cada ser vivo existente en la naturaleza sea único.
Estos sitios del ADN polimórfico pueden eventualmente utilizarse con propósito de identificación tal como ocurre en la ciencia forense.
Entre los fragmentos de ADN polimórfico, algunos presentan variaciones en tándem como los Minisatélites o VNTR y los Microsatélites o STRs, denominaciones que dependen de la longitud de las repeticiones de las variaciones en tándem mientras que otros fragmentos presentan variaciones de un solo nucleótido como son los denominados SNPs.
Cualquier fragmento de ADN polimórfico tiene dos variantes alélicas, cada una heredada de uno de los progenitores.
En el caso de los STRs, las variantes alélicas existen en promedio en un número que varía entre 7 y 15; mientras que los SNPs, sólo tienen dos variantes alélicas por locus. Los SNPs, sin embargo, aun cuando tienen menor poder discriminatorio que los STRs, tienen la gran ventaja de estar presentes en el genoma en cantidades millonarias, siendo responsables de los caracteres fenotípicos de los seres vivos.
En resumen, cada ser vivo es, único y es, en consecuencia, diferente de cualquier otro existente en el planeta. Esta diversidad en la naturaleza depende de los sitios polimórficos del ADN, tales y como los microsatélites (STRs) y polimorfismos de una única base (SNPs), ente otros.
En la documentación a la que se hiciera referencia, así como en la presente, se utilizan STRs o SNPs, por una parte por la viabilidad de ser analizados y detectados por métodos de amplificación por PCR y, por otra parte, porque hay millones para elegir entre todos los seres vivos que existen en la naturaleza.
Se ha dicho que es un objeto del presente invento la detección instantánea de los fragmentos polimórficos, para lo cual los inventores utilizan la técnica de espectroscopia Raman, y preferiblemente, SERS Raman (Surface enhanced Raman Spectroscopy) que provee uno de los más sensibles métodos de análisis cuantitativo y cualitativo no destructivo del material a analizar. La aparatología mencionada permite detectar por SERS Raman una solución de 0,9 nM (nanomolar) de STR/SNP, siendo el volumen mínimo de detección de 100 -150 fentolitros, conteniendo al menos 60 moléculas de STR. Un espectro Raman es similar a un espectro infrarrojo y consiste en una longitud de onda cuya distribución de bandas se corresponde con las vibraciones moleculares específicas de la muestra que va a ser analizada.
Por tal causa cuando se analiza un espectro de emisión Raman se observa que los picos correspondientes a la longitud de onda son característicos de la estructura y composición química molecular de cada sustancia analizada, mientras que la intensidad de la luz Raman dispersada por las moléculas en la muestra, depende de la concentración de las mismas.
En la práctica, un espectroscopio Raman está compuesto por una fuente de luz, generalmente un láser, que es focalizado sobre la muestra generando una radiación dispersa inelástica, la cual es recolectada ópticamente y dirigida dentro de un espectrofotómetro de selectiva longitud de onda, en donde el detector convierte la energía que imprimen lo fotones en una señal de intensidad eléctrica. Con las técnicas de SERS se puede aumentar la señal de Raman en 106 a 1014, por lo que es posible lograr una sensibilidad que permite la detección de una sola molécula. Para lograr una máxima sensibilidad, se provoca la adsorción de los fragmentos polimórficos STRs y/o SNPs en nanopartículas de al menos un metal seleccionado entre oro, plata, platino y cobre, donde el tamaño de dichas nanopartículas oscila en un rango comprendido entre 5 y 200 nm. Este aumento de sensibilidad se logra debido a que las partículas metálicas forman una superficie rugosa en el orden de los 10 nanómetros, que resulta pequeña comparada con la longitud de onda de la radiación incidente. El pequeño tamaño de las partículas (lo óptimo es de entre 50 a 100nm) permite la excitación del metal y aumenta la sensibilidad de detección del ADN adsorbido en su superficie.
Se ha procedido a la compulsa de diversos documentos determinándose que el documento número CN 1302905 se refiere a un material antifalsificación conteniendo iones metálicos de ADN preparados por mezcla de una solución acuosa de una sal metálica soluble con alto poder de coordinación con una solución de ADN y alcohol para obtener un decantado de M-ADN soluble en agua con el agregado de gelatina, dexthna, la solución acuosa de un almidón soluble ó goma para el marcado ó tinta para impresionar.
El documento número US2008/0189066 se refiere al uso y modificaciones de un espectroscopio Raman para autenticar objetos que han sido marcados con distintos fragmentos de STR o de SNP.
En el caso del documento citado precedentemente, se hace notar que los fragmentos a detectar han sido obtenidos sin modificarlos, es decir, seleccionándolos tal y como se presentan en la naturaleza.
El documento número US20030235836 se refiere al uso de fragmentos polimórficos STRs o SNPs micro encapsulados que son utilizados para marcar objetos que luego serán detectados en laboratorio con técnicas de biología molecular. La patente US 20080189066 se refiere a un método y aparato de autentificación mediante espectroscopia de Raman, para autentificar artículos que tienen una marca de seguridad que contiene un fragmento de ADN para evitar el fraude utilizando un espectrómetro Raman. Los picos en el espectro Raman se detectan para generar datos de los picos de Raman como marca de seguridad. La seguridad de los datos de picos de Raman es comparada con una biblioteca de picos de Raman para determinar si existe una coincidencia.
Estas técnicas permiten una individualización instantánea que podemos denominar indirecta ya que se produce por detección de diversas sustancias químicas incorporadas en el medio de transporte.
Como sucede en el documento relativo a las modificaciones del espectroscopio Raman, los fragmentos polimórficos mencionados son obtenidos sin modificaciones.
Resumen de la Invención El invento que se revela consiste en un procedimiento para obtener y detectar un marcador de objetos a identificar, el método para la autenticación instantánea de los objetos marcados y el método para la verificación de dichos objetos y el marcador obtenido con dicho procedimiento.
El presente invento consiste en un marcador de objetos a identificar que divulga la incorporación de al menos un fragmento polimórfico de ADN y, específicamente, la incorporación de una pluralidad de fragmentos polimórficos de ADN del tipo microsatélites (STR) y polimorfismo de una única base (SNP) modificados en su estructura molecular, adsorbidos a nanopartículas metálicas en los objetos a identificar para su posterior detección o autenticación en forma instantánea y su identificación por técnicas de biología molecular.
El invento comprende también un procedimiento para obtener dicho marcador de objetos que comprende un primer paso de selección de al menos un ser vivo para proceder a la extracción de ADN de cualquiera de sus células; un segundo paso de purificación del ADN obtenido; un tercer paso de amplificación de los fragmentos polimórficos del tipo microsatélites y/o polimorfismo de una base única; un cuarto paso de determinación de las variantes alélicas del al menos un ser vivo elegido; un quinto paso de modificación de la estructura geométrica del al menos un fragmento polimórfico del tipo microsatélite y polimorfismo de una base única; un sexto paso de concentración y microencapsulado del ADN; un séptimo paso de solubilización de las microcápsulas conteniendo ADN; un octavo paso de determinación y/o corrección del grado de fluidez y concentración de la solución y un noveno paso de incorporación de la solución mediante un aplicador adecuado y marcación del objeto deseado.
El invento comprende asimismo un método para detectar en forma instantánea el marcador por SERS Raman de los fragmentos polimórficos utilizados.
También el invento comprende un método que incluye una primera etapa de validación o autenticación instantánea por comparación del espectro obtenido con los espectros almacenados en una base de datos y una segunda etapa de identificación de los fragmentos polimórficos utilizados en el laboratorio con técnicas de biología molecular que utilizan los pares de primers adecuados para amplificar dichos fragmentos STRs o SNPs empleados determinando las variantes alélicas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 , corresponde a un esquema de las diferentes modificaciones de la estructura tridimensional del ADN. La Figura 2, corresponde a un esquema de ADN-nano tag. Se muestra la unión de partículas metálicas con el ADN forman agregados característicos formando una verdadera red molecular factible de ser detectada por SERS Raman.
La Figura 3, corresponde a un esquema de la representación del ADN unido a dendrímeros, los cuales forman estructuras tridimensionales con un espectro de Raman característico.
La Figura 4, corresponde a una representación esquemática de aptámeros de oligonucleótidos o péptidos que se unen a la molécula de ADN que forman estructuras tridimensionales con un espectro de Raman característico. La Figura 5, corresponde a una representación de un agente intercalante en el ADN como el Bromuro de Etidio, los cuales afectan la estructura tridimensional del ADN y provocan cambios en el espectro de Raman.
La Figura 6, corresponde a un espectro de Raman del ADN intercalado con Bromuro de Etidio.
La Figura 7, es una representación esquemática de distintas proteínas que se unen a los surcos mayores y menores de la doble hélice de ADN, desestabilizando su estructura tridimensional y generando un espectro Raman característico.
La Figura 8, corresponde a complejos ADN-Metal divalente que producen agregados produciendo alteración en el espectro Raman entre 1300-1400 cm"1.
La Figura 9, corresponde a un espectro de emisión Raman, donde se observa que los picos correspondientes a la longitud de onda son característicos de la estructura y composición química molecular de cada sustancia analizada, mientras que la intensidad de la luz Raman dispersada por las moléculas en la muestra es dependiente de la concentración de las mismas.
La Figura 10, corresponde a un diagrama de la utilización de ADN inter-especie como Tag anti falsificación.
La Figura 1 1 , corresponde a un diagrama de la utilización de ADN personal como Tag anti falsificación. La Figura 12, corresponde a un diagrama de la utilización de SNP Fenotípicos para autenticar pasaportes.
La Figura 13 A, muestra ADN extraído de la saliva de una persona y se amplifican los seis genes SNPs que se detallan.
La Figura 13 B, muestra el posible escenario hipotético para la determinación de color de ojos azules y marrones según las variantes genotípicas de estos seis SNPs.
La Figura 14, es una representación de la utilización de Microesferas con ADN polimórfico como tag anti-falsificación de billetes. Descripción detallada de la invención
Una vez establecidos los componentes del invento, así como la secuencia de pasos desarrollados para explicar su naturaleza, se los complementa seguidamente con la relación funcional y operativa de los mismos y del resultado que proporcionan.
Con el objeto de contar con un marcador de objetos a identificar que constituya un medio seguro para proteger objetos de valor, y su detección instantánea, el presente invento propugna un compuesto químico que pueda ser utilizado como marcador y un procedimiento mediante el cual se obtenga dicho marcador y donde la incorporación del mismo a un objeto permita la individualización y validación de dicho objeto.
Preferentemente, los inventores han considerado que dicho marcador deberá ser un compuesto químico que pueda ser detectado con posterioridad pero únicamente por las personas que conocen su estructura y utilicen un espectroscopio Raman o bien en el caso de desconocer la estructura, aquellos que utilicen un espectroscopio Raman asociado a una base de datos en donde la estructura del fragmento polimórfico esté almacenada y codificada.
Dentro de todos los compuestos químicos que pueden utilizarse y conforme las explicaciones que se divulgan en la presente documentación, los inventores prefieren utilizar el ácido desoxirribonucleico (ADN) como marcador de los objetos a identificar.
Preferentemente dicho marcador de los objetos a identificar, consiste en al menos un fragmento polimórfico de ADN.
Con relación al procedimiento para incorporar el marcador consistente en al menos un fragmento polimórfico de ADN en los objetos a identificar, el presente invento comprende una pluralidad de pasos donde en un primer paso se procede a seleccionar al menos un ser viviente para proceder a la extracción del ADN que se habrá de utilizar.
La utilización como marcador de al menos un fragmento polimórfico de ADN de un ser viviente que propugnan los inventores, debe ser interpretada en un sentido amplio, es decir que quien tome la decisión de realizar la marcación de un objeto, podrá seleccionarse a sí mismo como donante del ó de los fragmentos de ADN ó podrá seleccionar a cualquier ser viviente, ya sea de origen animal, vegetal, humano, bacteria y/o virus, por lo cual se reduce aún más la posibilidad de falsificar el marcador.
La extracción del ADN se realiza a partir de células o fluidos corporales obtenidos por técnicas comunes tal y como resultan, por ejemplo, el hisopado bucal, la punción sanguínea, la recolección de muestras epiteliales o folículos pilosos, etc.
En un segundo paso se libera el ADN obtenido en una solución compuesta por Tris-HCI 10 mM - EDTA 0, 1 mM, SDS al 20% (peso/ volumen) y Proteinasa K 10 mgr/ml., para proceder luego a la purificación en medio de Fenol/Cloroformo - 10:9 (volumen/volumen).
En un tercer paso se amplifican STRs y/o SNPs por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa tal y como se preconiza en las patentes norteamericanas números 4683195; 4683202 y 4800159. La mezcla que se coloca en un termociclador, comprende la muestra de ADN en una concentración de entre 6 pgr y 0,05 pgr; una solución Buffer de PCR 10X, dNTP 10X, oligonucleótidos que flanquean la región polimórfica 10X de cada uno y Taq polimerasa de 5000 unidades por mi.
En un cuarto paso se determinan las variantes alélicas del o de los fragmentos polimórficos elegidos en un secuenciador automático tipo ABI PRISM 310 - Applied Biosystem o superior.
En un quinto paso y debido a que las moléculas de ADN tienen un único espectro Raman porque están formadas por los mismos cuatro nucleótidos, se procede a modificar la estructura tridimensional del o de los fragmentos polimórficos STRs o SNPs para posteriormente obtener una adsorción a nanopartículas de al menos un metal seleccionado entre oro, plata, platino y cobre; al mismo tiempo que se van formando a partir de la reducción de sus cationes cuando se aplica el método de Lee and Meisel (J. PHYS. CHEM. 86:3391 - 3395, 1982) las nanopartículas metálicas tienen un tamaño de entre 5 y 200 nm. La estructura tridimensional del ADN puede ser modificada a partir de las tres estructuras que se conocen en la naturaleza A-ADN, B-ADN y Z-ADN y sus otras conformaciones posibles como C-ADN, D-ADN, E-ADN, L-ADN, P-ADN, S-ADN, etc., así como el H-ADN de triple cadenas y el ADN-G4 o ADN cuádruples. Es de destacar que muchas de las conformaciones que posee el ADN son debidas a la cantidad de G-C que poseen en su secuencia nucleotídica, siendo esta característica la usada en el presente desarrollo para obtener una firma espectrográfica Raman única y especifica para los fragmentos polimórficos usados para marcar objetos, agregando de esta manera un nivel de seguridad adicional a la propia identificación de los fragmentos polimórficos STRs o SNPs evitando así su reproducción por un posible falsificador.
Los inventores saben que hay múltiples formas de modificar la estructura tridimensional del ADN por lo que el procedimiento que se describe ha sido realizado mediante alguno de los siguientes métodos: a. -Las nanopartículas metálicas con el ADN adsorbido que son incorporadas como marcador, permiten aumentar la señal de SERS Raman entre 106 y 1014 veces y pueden ser agregadas en forma individual o en forma de coloides produciendo agregados como dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. con las moléculas de ADN. Esta propiedad se ve potenciada cuando a las nanopartículas metálicas se agrega al menos un grupo de unión tal y como por ejemplo un polímero seleccionado entre fenílacetileno, politetrafluoretileno, polipropileno, poliacrilamida, etc.; tal y como se ha representado en Figura 2.
También el grupo de unión puede ser seleccionado entre otros tipos de moléculas como silanos, aléanos o sus derivados que se unen a las moléculas de ADN formando agregados característicos que conforman una verdadera red molecular que se detecta como una señal espectrográfica Raman única. b.-La estructura puede ser modificada asimismo con complejos ADN - dendrimeros del tipo PAMAM o similar que forman una estructura tridimensional característica dando un espectro Raman único tal y como lo describe Caminade A.M, en "Characterization of dendrimers", Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 2130- 2146, 2005; tal y como se ha representado en Figura 3. c. -Otra forma de modificación se realiza a partir de la unión covalente de los fragmentos polimórficos con ADN sintético del tipo PNAs (peptide nucleic acid). En efecto, los PNAs son un tipo de poliamidas análogas al ADN con unidades monoméricas de Adenina, Guanina, Tiamina y Citosina en donde las uniones de azúcar correspondientes a un oligonucleótido son reemplazadas por uniones amida. Los compuestos PNAs, descubiertos por Nielsen (Science, 254:1497-15; 1991 ) se pueden conseguir de empresas como PE Biosystem (Foster City, California); tal y como se ha representado en Figura 4. d. -Otro grupo de unión que puede utilizarse surge de la unión de fragmentos polimórficos a "aptámeros" resultando éstos últimos una especie de ADN creado a través de repetidos ciclos de selección in vitro. El proceso denominado SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) consiste en producir ciclos repetitivos de exposición de un potencial aptámero (ligando de ADN) al fragmento polimórfico STR o SNP, permitiendo que ocurra la unión para luego separar el ADN libre de ligandos y simplificar éstos para repetir el proceso de unión. Después de un número de ciclos, los aptámeros exhiben alta afinidad y especificidad y preservan el ADN contra los fragmentos polimórficos usados como blanco. Como los aptámeros están compuestos por oligonucleótidos se pueden incorporar fácilmente a los fragmentos STRs o SNPs; tal y como se ha representado en Figura 5.
Para éste caso, los métodos de preparación de aptámeros son bien conocidos en patentes como US 5.270163, US.5.567588, US.5.670637 y US.5.843653. e. -Los agentes intercalantes se encajan entre las bases a lo largo del ADN de forma que las moléculas intercaladas de dichos agentes afectan la estructura del
ADN produciendo cambios en la torsión de la doble hélice en el sitio de intercalación, sitio que, en la mayoría de los agentes intercalantes, resulta una secuencia G-C.
Como ejemplo de agentes intercalantes podemos citar al Bromuro de Etidio, adriamicyn, 9-aminoacridine (9AA) y proflavine (PF) (3,6-diaminoacridine) bien descriptos por James M. Benevides en "Mechanisms of drugs - DNA recognition distinguished by Raman spectroscopy" Journal of Raman Spectroscopy-Vol 39 Pag. 1627-1624 entre otros; tal y como se ha representado en Figura 6. f. -Otro grupo de unión que permite la vinculación de la proteína con los surcos mayores y menores del ADN, principalmente utiliza alguna droga que interaccione tanto con el surco menor como con el surco mayor ya que es allí cuando se produce precipitación o agregación cambiando la estructura tridimensional del ADN. Ejemplos de éste tipo de drogas son la Spermina que interacciona con el surco mayor y la Spermidina, putrescina, Hoechst 33258, Netropsin, Pentamidine, etc. Entre otras que reaccionan con el surco menor.
Un detalle de cada droga que interacciona con los surcos mayores y menores del ADN puede verse en "NBD Atlax índex NMR drug -DNA complexes". La interacción de estas drogas con los surcos mayores y menores del ADN está directamente relacionada con la cantidad de A-T, por lo tanto de la secuencia de cada fracción de STR o SNP se puede obtener un espectro característico del fragmento polimórfico usado para marcar el objeto; tal y como se ha representado en Figura 7. g. -Existen complejos DNA- metal dívalentes como Sr+2, Ba+2, Mg+2, Ca+2, Mn+2, Co+2, Ni+2 y Cd+2, que producen variaciones entre 1300-1400cm-1 formando agregados ya que reaccionan con el fosfato y/o con las bases nitrogenadas, desestabilizando la doble hélice por ruptura de los puentes de hidrógeno axial como lo describe J.G. Duguid en su trabajo "Raman Spectroscopy of DNA-Metal Complexes" (Biophisical Journal Volume 69 Dic.1995- Pag 2623-2641 ; tal y como se ha representado en Figura 8.
En el sexto paso se procede al concentrado por ultracentrifugación para lo cual se utilizan microconcentradores del tipo del Centricon 100; posteriormente y a fin de evitar la degradación, se microencapsulan los fragmentos polimórficos mediante la técnica de inversión de fase. Es en este paso donde el ADN polimórfico a ser microencapsulado se disuelve en un solvente, para luego y en el mismo solvente, pasar a disolver un polímero agregado con una concentración de entre 0,25% y 0% peso/volumen. Este polímero utilizado puede ser seleccionado, indistintamente entre aquellos biodegradables y los no bíodegradables.
Dentro de los primeros resultan preferidos aquellos tales como los ácidos láctico y glicólico y ésteres tales como polianhídridos, poliuretanos, el poliácido butírico, el poliácido valerino, etc. Por su parte, dentro de los polímeros no biodegradables resultan de utilización preferida el acetato de viniletileno y el poliácido acrílico, resultando también aceptable el empleo de poliamidas y copolímeros, así como sus mezclas. Los polímeros utilizados también pueden seleccionarse entre los naturales, en cuyo caso resulta preferido el empleo de al menos uno de entre el grupo que comprende dextrán, celulosa, colágeno, albúmina, caseína, o los similares.
La mezcla resultante es posteriormente introducida en un no solvente en una relación solvente/no solvente de al menos^ 1 /40 y hasta 4/200 para obtener la formación espontánea de microcápsulas. En este paso, el solvente es un solvente orgánico seleccionado entre cloroformo y cloruro de metileno, mientras que los no solventes que resultan preferidos son el etanol y el hexano.
Adicionalmente, para enmascarar el o los fragmentos polimórficos de ADN seleccionados y dificultar aún más la falsificación del correspondiente marcador, se pueden incorporar otros fragmentos de ADN distintos a los elegidos. En un séptimo paso se procede a solubilizar las microesferas de ADN o el
ADN microencapsulado en una solución neutra a la detección por espectroscopia Raman.
Con el fin de enmascarar el espectro Raman del o los fragmentos polimórficos de ADN seleccionados y dificultar aún más la falsificación del correspondiente marcador, se puede usar una mezcla de sustancias orgánicas que siendo Raman activas, no influyan en el espectro emitido por los fragmentos polimórficos, obteniendo en teoría un millón de espectros únicos y característicos de las mismas en un rango de emisión de entre 500 y 2000 cm-1 . Estas sustancias están bien descriptas en la patente US 20060234248. Las microesferas con el o los fragmentos polimórficos pueden estar solubilizadas en distintas variedades de tinta, tal y como tinta flexográfica, tinta litográfica, tinta serigráfica, tinta de huecograbado, tinta reactiva moneda, tinta borrable, tinta reactiva de bolígrafo, tinta de reacción al calor, tinta visible al infrarrojo, tintas variables óptimamente, tintas penetrantes, tintas fotocromáticas, tinta reactiva a disolvente químico y al agua. En un octavo paso se procede a determinar y en su caso a corregir el grado de fluidez y concentración de la solución que debe ser apropiada para posibilitar su aplicación en los objetos a marcar.
Se ha estimado que el grado de fluidez debe permitir que el aplicador deposite una solución con una concentración de entre 6 pg y 10 pg de marcador por mm2 de superficie.
Por último, en el noveno paso, el marcador se incorpora a un aplicador que puede ser seleccionado entre una lapicera de pluma, microfibra, bolígrafo, diversos tipos de filtros, atomizador, instrumento de dibujo, pincel, sello o bien una máquina automática tal como una impresora electrofotográfica del tipo chorro de tinta o máquina de litografía offset, letterpress, huecograbado, xerografía, serigrafía y sistemas de impresión textil o similar, etc.
En una alternativa de realización se emplea un medio intermediario entre la solución conteniendo el marcador y el objeto a marcar, en cuyo caso, dicho medio intermediario se embebe en dicha solución.
El medio intermediario puede seleccionarse entre diversas sustancias, tales como nitrocelulosa, papel, madera, cartón, material plástico, nylon cargado, tela, sustancias orgánicas en forma de gotitas o gel, inorgánicas, etc.
Una vez seleccionado el aplicador, se procede a la marcación de los objetos designados.
El invento comprende asimismo un método de detección del marcador a partir de la detección de los fragmentos de ADN polimórficos que se incluyen en el marcador aplicado mediante un método adecuado para la detección de nucleótidos, entre los cuales se incluyen pero no se limitan a: Normal Raman scattering, Resonance Raman scattering, surface enhanced Raman scattering, surface enhanced resonance Raman scattering, coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS), stimulated Raman scattering, inverse Raman spectroscopy, stimulated gain Raman spectroscopy, hyper-Raman scattering, molecular optical láser examiner (MOLE) or Raman microprobe or Raman microscopy or confocal Raman microspectrometry, three-dimensional or scanning Raman, Raman saturación spectroscopy, time resolved resonance Raman, Raman decoupling spectroscopy or UV-Raman microscopy.
El espectrómetro Raman usado para generar el espectro del fragmento polimórfico presente en el objeto marcado, puede ser de escritorio o portátil, con un láser cuya longitud de onda esta comprendida en el rango de 400 a 1200 nm, con voltaje variable; preferentemente en la presente invención se han utilizado detectores Raman portátiles de 633 y de 785 nm, siendo ilustrativo pero no limitante a aparatos de otras características; tal y como se ha representado en Figura 9.
El invento comprende asimismo un método para validación que comprende una primera etapa de suprimir la fluorescencia característica del ADN; una segunda etapa de comparación de los valores superior e inferior de la intensidad de los picos obtenidos en el espectro emitido por los ADN polimórficos con los valores de referencia límite que previamente se almacenaron en una biblioteca de espectros, dando una respuesta de autenticación instantánea ya sea por positivo o negativo. En relación con dicha primera etapa y con la utilización y funcionamiento del espectrógrafo Raman utilizado, la supresión de la fluorescencia se logra con una serie de pasos que comprenden un paso de determinación de un valor medio de intensidad en los datos del espectro obtenido dentro de una sección en torno a cada punto de la marca de dicho espectro de respuesta y un paso de restar dicho valor medio de cada uno de los puntos que produjo el ADN utilizado como marcador.
Por su parte dicha segunda etapa comprende un paso de comparación de los datos de los picos Raman obtenidos, con los datos de los picos Raman almacenados en la base de datos y un paso de comparación de los números de onda e intensidad de cada pico, con los datos espectrográficos almacenados en la ya mencionada base de datos.
Dichos datos almacenados corresponden al espectro de cada uno de los fragmentos polimórficos STRs o SNP que hayan sido utilizados para marcar el objeto.
Es de conocimiento de los inventores que las longitudes de onda en un espectro de emisión Raman son características de la composición química y estructura de las moléculas en una muestra, mientras que la intensidad de la luz dispersa es dependiente de la concentración de moléculas en la muestra. Es por ello que en el presente desarrollo se utilizan concentraciones variables a partir de 0,9 nM (nanomolar) de los fragmentos polimórficos STR o SNP que es el limite de detección de SERS Raman, creando de ésta manera un nuevo nivel de seguridad ya que el posible falsificador deberá conocer también la concentración del o de los fragmentos polimórficos para reproducir el espectro emitido por el objeto marcado.
Los valores detectados del espectro Raman emitido por los fragmentos polimórficos pueden ser enviados a través de un sistema de telecomunicación, una línea telefónica analógica, una línea telefónica digital, un teléfono celular y/o un equipo unido a una red de datos entre otros.
Una vez detectado y autenticado el objeto marcado se procede a la identificación del o de los fragmentos polimórficos de STRs o SNPs tipificando los mismos preferentemente por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Para ello es absolutamente necesario en una primera instancia conocer el nombre de los mismos para poder utilizar los reactivos y condiciones de amplificación adecuadas para realizar el análisis correspondiente.
Es por ello importante mencionar que a cada fragmento usado para marcar el objeto, los inventores lo relacionaron a un número de código existente en los bancos de genes, la combinación de los fragmentos polimórficos STRs o SNPs usados crea un único código, equivalente a un numero de PIN, que se corresponde con el sitio exacto, dentro de los miles de sitios polimórficos del genoma del o los seres vivientes.
Y es el poseedor de dicho código el dueño mismo del objeto marcado.
En caso de haber algún tipo de controversia se puede revelar a cuál de todos los fragmentos corresponde cada uno de los números de PIN y cualquier laboratorio de biología molecular del mundo podrá corroborar la existencia del mismo, en forma independiente de quien haya sido el proveedor del o los fragmentos mencionados.
De esta manera, en caso de controversia, se garantiza el derecho de todas las partes ya que es posible reproducir la prueba concerniente a la identidad del objeto marcado en forma independiente, en cualquier lugar del mundo y todas las veces que resulte necesario.
Una vez conocido el nombre del fragmento polimórfico utilizado, la tipificación se realiza por el método de Reacción en Cadena de la polimerasa aunque también podrá llevarse a cabo mediante procedimientos y técnicas que resultan habituales en el arte previo tal como el empleo de geles como propugna J. M. Robertson (1994); electroforesis capilar según Me. Cord (1993); detección por hibridización múltiple o capilaridad múltiple propuesta por Y. Wang (1995), mediante el uso de microchips como establece Woolley (1996); por espectrometría de masa según Becker (1997); etc. A su vez, podrán detectarse los polimorfismos de una sola base por medio de un análisis conformacional de cadena única como demuestran Orita y otros (1989); oligonucleótido alelo específico como indican Landeegren y otros (1988); múltiple extensión de primer según Syvanen y otros (1990) o bien por cualquiera de otras tecnologías entre las que pueden mencionarse las de chips, espectrometría de masa, etc.
Adicionalmente, los inventores conocen que los SNPs son responsables de los caracteres fenotípicos de los seres vivos, por lo que se incluye en la presente invención un procedimiento con los mismos doce pasos mencionados, en donde los únicos marcadores genéticos polimórfico utilizado son los SNPs y específicamente aquellos que son responsables de caracteres fenotípicos que sirven para individualizar al ser vivo o a algún producto derivado de los mismos por Ej. Se puede marcar un vino con los SNPs que le dan color, olor o gusto, o bien en un pasaporte se puede colocar una gota con todos los fragmentos de SNPs responsables de los caracteres fenotípicos de una persona, como color de ojos, pelos, color de piel etc. Creando, luego ser detectada por SERS Raman y digitalizada una "foto genética" que es posible de cotejar con la persona que posee el pasaporte. Por Ejemplo variantes en el SNP SLC24A4, están asociadas con el color de ojos y pelos, una variante cercana a KITLG esta asociada al color de pelo, dos variantes de TYR están asociadas al color de ojos y pecas, una variante en 6p 25,3 está asociado con pecas, el color de ojos azules fue encontrado en tres SNPs variantes del OCA2 así como los distintos tonos del color piel están relacionados con la región 5' proximal del control regulatorio del OCA2. Distintos autores están investigando y encontrando cada vez mas cantidad de genes relacionados a los caracteres fenotípicos entre los que podemos citar a Sulen, P, Gudbjartsson en "Genetic determinants of hair, eye and skin pigmentation in Europeans" Nat. Gen 2007 Dec:39(12): 1415, y Duffy DL en "A three SNP haplotype in intron 1 of OCA2 explains most human eye color variation" entre otros; tal y como se ha representado en Figura 12 y 13 A y 13 B. Con el marcador divulgado en la presente documentación pueden marcarse e identificarse con absoluta certeza innumerables objetos tales como pinturas, esculturas, insumos del deporte, obras de arte, artesanías, videocasetes, grabadores, televisores y cualquier objeto del hogar, también computadoras, impresoras, software, elementos de oficina y equipamientos de negocios. Asimismo se podrán identificar perfumes, ropas, carteras, portafolios, cajas de diferentes productos, blister de medicamentos, medicamentos, partes de automóviles, aeroplanos, bicicletas, certificados de acciones, billetes de avión, entradas de reclamo de equipaje, controles, instrumentos negociables, papeles comerciales, documentos legales, testamentos, escrituras de propiedad, contratos, fideicomisos, arrendamientos, cesiones, servidumbres, documentos postales, sellos, bonos, tarjetas de identificación, certificados de nacimiento, licencias de conducir, facturas de envío, etiquetas, formularios médicos, historias clínicas, prescripciones, obras de arte originales, valiosos sellos, documentos bancarios, tarjetas de crédito, autorizaciones de tarjetas de crédito, facturas, notas, permisos, autorizaciones, solicitudes, y declaraciones de impuestos, billetes, papel moneda, cheques, documentos notariales, cédulas de identificación, licencias de conducir, pasaportes, visas, tarjetas de crédito, de teléfonos y objetos similares tales como títulos académicos, inventarios, billetes de lotería y otros juegos de azar, etc.
El presente invento proporciona diversas complejidades destinadas a evitar la falsificación de los objetos marcados. Las mismas presentan los siguientes niveles de seguridad:
Primer Nivel: Consiste en la determinación de la estructura química del polímero. Para que un falsificador analice la composición del o de los fragmentos polimórficos utilizados para marcar el objeto, debe en una primera instancia, conocer la estructura del polímero usado para microencapsular dichos fragmentos a fin de lograr la apertura del mismo sin alterar el ADN en su interior. Segundo Nivel: Consiste en la identificación del fragmento polimórfico. En caso que el falsificador pase el primer nivel, para identificar el o los fragmentos polimórficos utilizados para marcar el objeto debe usar la técnica de mayor sensibilidad de detección que es la de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para lo cual debe conocer el nombre del o de los fragmentos polimórficos STRs o SNPs a los fines de identificar su secuencia y, en consecuencia los pares de primers necesarios así como las condiciones de reacción adecuadas para lograr la amplificación de los mismos.
Si bien podría pensarse que se podría utilizar el método de la clonación del o de los fragmentos polimórficos, ello no resulta posible lograrlo debido a que, por una parte, dichos fragmentos polimórficos han sido modificados y, por otra parte, las concentraciones que se utilizan en el presente desarrollo lo impiden.
Tercer Nivel: Consiste en la tipificación del o de los fragmentos polimórficos, ya que suponiendo que el falsificador ha conseguido evadir los niveles anteriores deberá conocer también las variantes alélicas de cada uno de los fragmentos polimórficos para reproducir con exactitud aquellas usados para marcar el objeto.
Cuarto Nivel: Consiste en trabajar con una concentración de los marcadores que se condice con el límite inferior de los fragmentos polimórficos de STR o SNP utilizados para imposibilitar el uso de la técnica de clonado molecular.
Quinto Nivel: Consiste en la modificación de la estructura tridimensional de la molécula de ADN utilizando una o una combinación de conformaciones tridimensionales de dicha molécula, dificultando al falsificador revertir el proceso si no tiene conocimiento de la modificación producida en la estructura. Sexto Nivel: Consiste en el enmascaramiento de los marcadores con distintos fragmentos de ADN de forma que el falsificador debe conocer cual o cuales de los fragmentos identificados por él se han usado para marcar el objeto. Con esa intención, a la combinación de fragmentos polimórficos utilizada para crear ese código único se agregan otros fragmentos de ADN distintos de los elegidos. Séptimo Nivel: La utilización del espectro Raman de fragmentos polimórficos modificados determina que el falsificador debe conocer cual o cuales son los picos de longitudes de onda correspondientes a los fragmentos polimórficos cuya estructura tridimensional de la molécula de ADN han sido modificados. Octavo Nivel: Consiste en el enmascaramiento de los espectros Raman de los marcadores con distintos espectros de sustancias Raman activas y determina que aun cuando el falsificador obtenga por metodología SERS Raman un espectro de emisión deberá distinguir cuales son los picos correspondientes a los fragmentos de ADN polimórficos usados para generar ese código único o PIN y los correspondientes a las sustancias químicas Raman activas que se agregan para enmascarar los correspondientes a los restantes fragmentos de ADN.
Noveno Nivel: Consiste en la codificación de la base de datos para que, superados los niveles anteriores, el falsificador deba decodificarlos para interpretarlos y aplicar los espectros de respuestas. Décimo Nivel: Consiste en la variación de la concentración relativa de cada fragmento polimórfico, de forma que la autenticación se realiza mediante la comparación entre los valores superior e inferior de la intensidad de los picos obtenidos en el espectro emitido por los ADN polimórficos con los valores límite que previamente se almacenaron en una base de datos de espectros de respuesta. Como los valores correspondientes a la intensidad en un espectro Raman están directamente relacionados con la concentración de cada fragmento polimórfico de STRs o SNPs usados para marcar, el falsificador debería detectar cuál es la concentración relativa de cada fragmento polimórfico utilizado en los marcadores.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN Se completa dicha descripción con diversos ejemplos que han sido llevados a la práctica que permiten contar con un todo con fines ejemplificativos que persiguen una función puramente demostrativa pero en ningún caso limitativa de la invención.
De esta forma se ha reseñado una de las posibles secuencias de etapas que llevan a concretar el invento y la manera en que el mismo funciona, y se complementa la documentación con la síntesis de la invención contenida en las cláusulas reivindicatorías que se agregan a continuación.
Ejemplo 1. Utilización de ADN ínter-especies como Taq anti-falsificación
Se forma una molécula de ADN que no existe en la naturaleza. Para lograrlo se amplifica 6 pg. de ADN extraído del gen del maíz ZmZ1 P5, el gen Humano D13S317 y el gen canino ZUBECA6,Se determinan la vanantes alélicas de cada uno de ellos usando un secuenciador ABI PRIS 310 de Applied Biosystem. Al producto final de PCR se lo mezcla con una solución final de 0,25 M de átomos de Plata según la técnica descripta por Lee. Posteriormente se micro encapsuló en poliestíreno se disuelven en cantidad suficiente de agua, a los fines de aplicar en el objeto que se desea marcar. Se realiza la detección de SERS Raman utilizando un Inspector Raman de DeltaNu con un láser de 120 mW a 785 nm, una resolución de 8 cm"1 y un rango de espectro de 200-2000cm"1. Y para autenticar se compararon los datos con el programa NuSpec data acquisition and library software. En caso de litigio judicial cualquier laboratorio especializado del mundo podrá identificar el perfil genético utilizado como tag. Para ello se deben disolver las microesferas con un solvente orgánico adecuado y una vez revelado el pin formado con los códigos de acceso a los gen bank de cada especie, Ej ZmZIP5ZUBECA6D13S3 7 se podrán utilizar los reactivos adecuados (primers) para que por medio de la PCR se puedan amplificar nuevamente las variantes alélicas utilizadas (Véase figura 10).
Ejemplo N° 2. Utilización de ADN personal como Taq anti-falsificación.
Se forma una molécula de ADN personal. En caso de litigio judicial se revela el pin formado con los códigos de acceso a los bancos de genes de cada STR/SNP, sumado a la variante alélica de cada uno de los fragmentos utilizados para que cualquier laboratorio especializado del mundo pueda recrear el perfil genético de los fragmentos polimórficos utilizados como Tags sin depender del fabricante de los mismos, como por ejemplo pin: X0629288X14720101 1 M8652545.
Ejemplo N° 3. Utilización de SNP Fenotípicos para autenticar pasaportes.
Uso de SNPs responsables de los caracteres fenotípicos de una persona, como color de ojos, pelos, color de piel etc. Creando, luego ser detectada por SERS Raman y digitalizada una "foto genética" que es posible de cotejar con la persona que posee el pasaporte. Posteriormente se extraen 0,5 ugr de ADN de la saliva de una persona y se amplifican los seis genes SNPs que a continuación se detallan en la figura 13 A. El posible escenario hipotético para la determinación de color de ojos azules y marrones según las variantes genotípicas de estos seis SNPs, tal como se muestra en la figura 13 B.
Ejemplo N° 4. Micro esferas con ADN polimórfico como tag anti-falsificación de billetes Su utilización para dicho fin, se representa en la Figura 14.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para obtener un marcador de objetos a identificar, que comprende al menos un primer paso de selección de un ser viviente y extracción del ADN a utilizar y un octavo paso de determinación y corrección del grado de fluidez y concentración de la solución; CARACTERIZADO porque también comprende;
• un segundo paso de incluir el ADN obtenido en una solución compuesta por entre 9 y 10,2 mM de Tris-HCI; entre 0,95 y 0, 1 1 de EDTA; SDS al 20% (peso/ volumen) y entre 9,8 y 10,3 mg/ml de Proteinasa K, procediendo a la purificación en medio de Fenol/Cloroformo en una proporción de 10:9 (volumen/volumen);
• un tercer paso de amplificar los fragmentos polimórficos cortos en tándem (STRs) o polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), presentes en la muestra de ADN;
• un cuarto paso de determinación de las variantes alélicas del o de los fragmentos polimórficos elegidos;
• un quinto paso de modificación de la estructura tridimensional del o de los fragmentos polimórficos STRs - SNPs y su adsorción a nanopartículas en al menos un metal;
• un sexto paso de concentración y de microencapsulado de los fragmentos polimórficos; y
• un séptimo paso de solubilización de las microesferas de ADN o el ADN microencapsulado para la detección por espectroscopia Raman.
2. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque en el quinto paso, dicho metal es seleccionado entre; oro, plata, platino o cobre.
3. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque en el quinto paso la estructura tridimensional del ADN se modifica siguiendo un método seleccionado entre:
I. -el adicionado individual o en forma de coloides de las nanopartículas metálicas con el ADN adsorbido; cuyo adicionado en forma de coloides produce agregados del tipo de los dimeros, trímeros, tetrámeros, con las moléculas de ADN; a cuyas nanopartículas metálicas se agrega al menos un grupo de unión seleccionado entre un polímero, un silano o un alcano y sus derivados y cuyo polímero se selecciona entre fenilacetileno, politetrafluoretileno, polipropileno, poliacrilamida y similares,
II. -el adicionado de complejos ADN - dendrímeros del tipo PAMAM o similar para formar una estructura tridimensional característica con un espectro Raman único,
III. -por la unión covalente de los fragmentos polímórficos con ADN sintético del tipo PNAs (peptide nucleic acid),
IV. -por la unión de fragmentos polimórficos STRs - SNPs con aptámeros obtenidos con el proceso SELEX,
V. -por torsión de la doble hélice del ADN mediante el intercalado de moléculas de agentes intercalantes entre las bases y a lo largo de dicha doble hélice; cuyos agentes intercalantes se seleccionan entre el Bromuro de Etidio, ad amicyn, 9- aminoacridine (9AA) y proflavine (PF) (3,6-díaminoacridine),
VI. -por precipitación o agregación de una proteína a los surcos mayores y menores del ADN utilizando una droga seleccionada entre Spermina, Spermidina, Putrescina, Hoechst 33258, Netropsin, Pentamidine, o similares, VII. -por formación de agregados que reaccionan con el fosfato y, o con bases nitrogenadas, desestabilizando la doble hélice por ruptura de los puentes de hidrógeno axial a partir de complejos DNA- metal divalentes como Sr+2, Ba+2, Mg+2, Ca+2, Mn+2, Co+2, Ni+2 y Cd+2.
4. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 3, CARACTERIZADO porque en el punto VI del quinto paso la interacción de estas drogas con los surcos mayores y menores del ADN está directamente relacionada con la cantidad de A-T, por lo tanto de la secuencia de cada fracción de STR o SNP se puede obtener un espectro característico del fragmento polimórfico usado para marcar el objeto.
5. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque en el quinto paso las nanoparticulas metálicas con el ADN adsorbido incorporadas como marcador, aumentan la señal de SERS Raman entre 106 y 1014 veces.
6. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 3, CARACTERIZADO porque en el quinto paso el grupo de unión se selecciona entre moléculas de silanos y aléanos o sus derivados unidos a moléculas de ADN formando agregados característicos conformadores de una red molecular con una señal espectrográfica Raman única.
7. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque en el sexto paso se procede al concentrado por ultracentrifugación y al microencapsulado de los fragmentos polimórficos mediante la técnica de inversión de fase; cuyo ADN polimórfico a ser microencapsulado se disuelve en un solvente, para luego y en el mismo solvente, pasar a disolver un polímero agregado con una concentración de entre 0,25% y 10% peso/volumen; cuyo polímero utilizado se selecciona entre los biodegradables y los no biodegradables.
8. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 7, CARACTERIZADO porque en el sexto paso, el solvente es un solvente orgánico seleccionado entre cloroformo y cloruro de metileno, y el no solvente se selecciona entre el etanol y el hexano.
9. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 7, CARACTERIZADO porque en el sexto paso el polímero biodegradable se selecciona entre ácido láctico, ácido glicólico, un polianhídrido, un poliuretano, poliácido butírico, poliácido valerino, y similares.
10. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 7, CARACTERIZADO porque en el sexto paso el polímero no biodegradable se selecciona entre acetato de viniletileno, poliácido acrílico, poliamidas y copolímeros, así como sus mezclas.
11. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 7, CARACTERIZADO porque en el sexto paso los polímeros se seleccionan entre al menos uno del grupo que comprende dextrán, celulosa, colágeno, albúmina, caseína, o los similares.
12. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número CARACTERIZADO porque en el sexto paso la relación solvente/no solvente es entre 1/40 y 4/200.
13. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque en el sexto paso se procede al concentrado por ultracentrifugación con microconcentradores del tipo Centricon 100.
14. Marcador obtenido con el procedimiento de la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque las concentraciones de fragmentos polimórficos de ADN utilizadas son variables a partir de 0,9 nM.
15. Marcador según la reivindicación número 14, CARACTERIZADO porque a cada fragmento polimórfico de ADN utilizado se le asigna un número de código existente en los bancos de genes de forma que la combinación de los fragmentos polimórficos STRs - SNPs utilizados en el marcador crea un número único, que se corresponde con los sitios exactos dentro de los sitios polimórficos del genoma del o los seres vivos cuyo ADN se haya utilizado.
16. Marcador según la reivindicación número 14, CARACTERIZADO porque se enmascara el o los fragmentos polimórficos de ADN seleccionados incorporando fragmentos de ADN distintos a los elegidos para conformar el número único.
17. Marcador según la reivindicación número 14, CARACTERIZADO porque se enmascara el espectro Raman del o los fragmentos polimórficos de ADN incorporados al marcador adicionando una mezcla de sustancias orgánicas Raman activas sin influencia en el espectro emitido por dichos fragmentos polimórficos.
18. Método de detección del marcador obtenido con el procedimiento de la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque el mismo comprende la detección de los fragmentos polimórficos de ADN incluidos en dicho marcador detectándose los nucleótidos con un método seleccionado entre los siguientes pero sin limitación a ellos: Normal Raman scattering; Resonance Raman scattering; surface enhanced Raman scattering; surface enhanced resonance Raman scattering; coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS); stimulated Raman scattering; inverse Raman spectroscopy; stimulated gain Raman spectroscopy; hyper-Raman scattering; molecular optical láser examiner (MOLE) or Raman microprobe or Raman microscopy or confocal Raman microspectrometry; three-dimensional or scanning Raman; Raman saturation spectroscopy; time resolved resonance Raman; Raman decoupling spectroscopy or UV-Raman microscopy.
19. Método para autenticar instantáneamente los objetos marcados con el marcador obtenido con el procedimiento de la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque comprende una primera etapa de suprimir la fluorescencia característica del ADN y una segunda etapa de comparación de los valores superior e inferior de la intensidad de los picos obtenidos en el espectro emitido por los fragmentos polimórficos de ADN con valores de referencia límite previamente resguardados para dar una respuesta de autenticación instantánea por coincidencia positiva o negativa.
20. Método para autentificar instantáneamente los objetos marcados, según la reivindicación número 19, CARACTERIZADO porque en la primera etapa de supresión de la fluorescencia, comprende un paso de determinación de un valor medio de intensidad en los datos del espectro obtenido dentro de una sección en torno a cada punto de la marca de dicho espectro de respuesta y un paso de restar dicho valor medio de cada uno de los puntos que produjo el ADN utilizado como marcador.
21. Método para autentificar instantáneamente los objetos marcados, según la reivindicación número 19, CARACTERIZADO porque la segunda etapa comprende un paso de comparación de los datos de los picos Raman obtenidos con los datos de los picos Raman almacenados en una base de datos y un paso de comparación de los números de onda e intensidad de cada pico, con los datos espectrográficos almacenados en una base de datos.
22. Método para autentificar instantáneamente los objetos marcados, según la reivindicación número 19, CARACTERIZADO porque los datos almacenados en una base de datos corresponden al espectro de cada uno de los fragmentos polimórficos STRs - SNPs utilizados para marcar el objeto a autenticar.
23. Método para autentificar instantáneamente los objetos marcados, según la reivindicación número 19, CARACTERIZADO porque los valores detectados del espectro Raman emitido por los fragmentos polimórficos de ADN se envían a través de alguno de los siguientes sistemas de telecomunicación: una línea telefónica analógica; una línea telefónica digital; un teléfono celular; un equipo unido a una red de datos o sistema equivalente.
24. Método para verificar los objetos marcados con el marcador obtenido con el procedimiento de la reivindicación número 1 , CARACTERIZADO porque una vez detectado y autenticado el objeto marcado se procede a la identificación del o los fragmentos polimórficos de STRs - SNPs tipificándolos por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
25. Método para verificar los objetos marcados con el marcador, según la reivindicación número 24, CARACTERIZADO porque comprende un paso de establecer el nombre de los fragmentos polimórficos STRs - SNPs y un paso de adecuación de los reactivos y obtención de las condiciones de amplificación adecuadas.
26. Método para verificar los objetos marcados con el marcador, según la reivindicación número 24, CARACTERIZADO porque el número asignado a un único fragmento polimórfico e incluido en una base de datos puede ser determinado por el análisis de dicho fragmento polimórfico realizado por técnicas de biología molecular y comparación del resultado de dicho análisis con los datos obrantes en dicha base de datos.
27. Método para verificar los objetos marcados con el marcador, según la reivindicación número 24, CARACTERIZADO porque la tipificación del o los fragmentos polimórficos de STRs - SNPs se realiza con procedimientos y técnicas que resultan habituales en el arte previo tales y como el empleo de geles; la electroforesis capilar; la detección por hibridización múltiple o capilaridad múltiple; mediante el uso de microchips y por espectrometría de masa entre otras.
28. Método para verificar los objetos marcados con el marcador, según la reivindicación número 24, CARACTERIZADO porque la detección de los polimorfismos de una sola base se realiza por un análisis conformacional de cadena única; o por oligonucleótido alelo específico; por múltiple extensión de primer o bien por cualquiera de otras tecnologías entre las que pueden mencionarse las de chips y espectrometría de masa.
29. Método para incorporar un marcador a un objeto a identificar, donde dicho marcador se obtiene con el procedimiento de la reivindicación número 1 y cuyo método comprende un paso de incorporar dicho marcador a un fluido y un paso de incluir el fluido conteniendo dicho marcador a un aplicador, CARACTERIZADO porque el marcador contenido en la solución está presente en una concentración de entre 6 y 10 pg por mm2 de superficie.
30. Método para incorporar un marcador a un objeto a identificar, según la reivindicación número 29, CARACTERIZADO porque las microesferas con el o los fragmentos polimórficos de ADN se solubilizan en distintas variedades de tinta, tales y como tintas flexográficas, tintas litográficas, tintas serigráficas, tintas de huecograbado, tintas reactivas moneda, tintas borrables, tintas reactivas de bolígrafo, tintas de reacción al calor, tintas visibles al infrarrojo, tintas variables óptimamente, tintas penetrantes, tintas fotocromáticas, tintas reactivas a disolventes químicos y al agua.
31. Método para incorporar un marcador a un objeto a identificar, según la reivindicación número 29, CARACTERIZADO porque el marcador se incorpora a un aplicador seleccionado entre una lapicera de pluma, una microfibra, un bolígrafo, un atomizador, un instrumento de dibujo, un pincel, un sello, una impresora electrofotográfica del tipo chorro de tinta, una máquina de litografía offset o de letterpress, de huecograbado, de xerografía, de serigrafía, un sistema de impresión textil o similar, un filtro.
32. Método para incorporar un marcador a un objeto a identificar, según la reivindicación número 29, CARACTERIZADO porque entre la solución conteniendo el marcador y el objeto a marcar se emplea un medio intermediario que embebido en dicha solución se selecciona entre nitrocelulosa, papel, madera, cartón, material plástico, nylon cargado, tela, sustancias orgánicas en forma de gotitas o gel, inorgánicas.
33. Método para incorporar un marcador a un objeto a identificar, según la reivindicación número 29, CARACTERIZADO porque la solución conteniendo el marcador se incorpora en pinturas, esculturas, insumos del deporte, obras de arte, artesanías, videocasetes, grabadores, televisores y cualquier objeto del hogar, también computadoras, impresoras, software, elementos de oficina y equipamientos de negocios, perfumes, ropas, carteras, portafolios, cajas de diferentes productos, blister de medicamentos, medicamentos, partes de automóviles, aeroplanos, bicicletas, certificados de acciones, billetes de avión, entradas de reclamo de equipaje, controles, instrumentos negociables, papeles comerciales, documentos legales, testamentos, escrituras de propiedad, contratos, fideicomisos, arrendamientos, cesiones, servidumbres, documentos postales, sellos, bonos, tarjetas de identificación, certificados de nacimiento, licencias de conducir, facturas de envío, etiquetas, formularios médicos, historias clínicas, prescripciones, obras de arte originales, valiosos sellos, documentos bancarios, tarjetas de crédito, autorizaciones de tarjetas de crédito, facturas, notas, permisos, autorizaciones, solicitudes, y declaraciones de impuestos, billetes, papel moneda, cheques, documentos notariales, cédulas de identificación, licencias de conducir, pasaportes, visas, tarjetas de crédito, de teléfonos y objetos similares tales como títulos académicos, inventarios, billetes de lotería y juegos de azar.
34. Procedimiento de conformidad con la reivindicación número 1 ,
CARACTERIZADO porque comprende los siguientes niveles de seguridad: un primer nivel que consiste en la determinación de la estructura química del polímero usado para microencapsular el o los fragmentos polimórficos; un segundo nivel que consiste en la identificación del o los fragmentos polimórficos modificados que se utilizan; un tercer nivel que consiste en la tipificación del o los fragmentos polimórficos determinando las variantes alélicas de cada uno de ellos; un cuarto nivel que consiste en trabajar con una concentración de los marcadores que se condice con el límite inferior de los fragmentos polimórficos de STR o SNP utilizados; un quinto nivel que consiste en la modificación de la estructura tridimensional de la molécula de ADN utilizando una o una combinación de conformaciones tridimensionales de dicha molécula; un sexto nivel que consiste en el enmascaramiento de los marcadores con el agregado de distintos fragmentos de ADN; un séptimo nivel que consiste en utilizar el espectro Raman de los fragmentos polimórficos modificados; un octavo nivel que consiste en el enmascaramiento de los espectros Raman de los marcadores con distintos espectros de sustancias Raman activas; un noveno nivel que consiste en la codificación de la base de datos; y un décimo nivel que consiste en variar la concentración relativa de cada fragmento polimórfico.
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