WO2014012985A1 - Procédé et dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt - Google Patents

Procédé et dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt Download PDF

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WO2014012985A1
WO2014012985A1 PCT/EP2013/065118 EP2013065118W WO2014012985A1 WO 2014012985 A1 WO2014012985 A1 WO 2014012985A1 EP 2013065118 W EP2013065118 W EP 2013065118W WO 2014012985 A1 WO2014012985 A1 WO 2014012985A1
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WO
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interest
medium
electromagnetic radiation
layer
reflective layer
Prior art date
Application number
PCT/EP2013/065118
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English (en)
Inventor
Frédéric KANOUFI
Jean-Paul Roger
Gilles Tessier
Catherine Combellas
Sorin MUNTEANU
Sarra GAM
Fabien AMIOT
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
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Filing date
Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Definitions

  • the invention relates to a method and a system for measuring a medium of interest by electromagnetic radiation.
  • Biosensors have many fields of application. There are methods and systems for measuring a medium of interest by biosensors. Biosensors are thus used for the quantification of biomolecules. Such biosensors rely on optical reading techniques.
  • Fluorescent biosensor techniques have high measurement sensitivity but require prior labeling of the molecules to be analyzed. This results in a significant additional cost and a considerable preparation time.
  • SP Surface plasmon
  • a first surface of a metal layer is illuminated by an incident light, for example a monochromatic plane wave.
  • SP spreads at the interface between the metal layer and an ambient aqueous medium tested, at the level of the medium of interest, that is to say at a surface layer of a second surface of the metal layer opposite to the first surface.
  • the second surface is functionalized; it can thus present fixed biomolecules forming the medium of interest, the biomolecules can selectively associate in the medium of interest with a molecule of interest whose presence is to be measured in the ambient environment tested.
  • the coupling between the incident light and the SP is associated with a resonance incidence angle of 9SP.
  • ⁇ SP corresponds an abrupt drop and a minimum of the intensity of the beam reflected by the first surface resulting from the incident light.
  • This value 9SP strongly depends on the optical index of the medium of interest, n c , in the vicinity of the second surface, and therefore on the concentration of molecules at the level of the second surface, and therefore the association between the fixed biomolecules and molecules of interest. It is then possible to measure the presence of molecules of interest in the medium of interest, and therefore in the ambient environment tested, without performing preliminary marking.
  • An object of the invention is to provide a method and a device for measuring a medium of interest that does not have these disadvantages.
  • a method for measuring a medium of interest comprising the steps of: disposing the medium of interest between a light source adapted to emit electromagnetic radiation and a substrate comprising a layer having reflective properties,
  • the reflective layer illuminating the substrate by incident electromagnetic radiation from the light source, the reflective layer producing an electromagnetic radiation reflected from the incident electromagnetic radiation, and
  • the emitted electromagnetic radiation is in a spectral band included between 350 nm and 1000 nm
  • the reflective layer has a reflectivity R between 0.2 and 0.7 and a sensitivity c / R / c / (n c xd ) greater than 1 x 10 "3 nm " 1 in the spectral band.
  • the detection step comprises a determination by an abacus of the optical thickness of the medium of interest directly from the monitoring of the intensity of the electromagnetic radiation measured under the conditions of constant illumination and measurement;
  • Constant illumination and measurement for all measurements include relative positioning fixed light source, reflective layer and sensor, and the same electromagnetic radiation emitted by the light source for all measurements,
  • the medium of interest comprises a plurality of probe molecules immobilized on one surface of the reflective layer, the probe molecules being adapted to interact with target molecules, the interaction of the probe molecules with the target molecules changing the optical thickness of the medium of interest in the spectral band,
  • the medium of interest is subjected to a microfluidic flow, and the measuring step is repeated with a frequency greater than 1 Hz,
  • the reflecting layer comprises an opaque sub-layer having a smooth opaque surface facing the medium of interest
  • the opaque layer is a layer of gold, copper or stainless steel, the emitted electromagnetic radiation being included in a spectral band included between 350 nm and 500 nm,
  • the reflective layer further comprises a transparent underlayer, the transparent underlayer being disposed between the medium of interest and the opaque sub-layer,
  • the transparent layer has a thickness of less than 1600 nm
  • the opaque sublayer is a silicon layer and the transparent layer is a layer of silicon oxide or silicon nitride.
  • the invention further relates to a device for measuring a medium of interest, the device comprising: a substrate comprising a layer having reflective properties,
  • the medium of interest being disposed between the light source and the substrate, the light source being adapted to emit electromagnetic radiation and illuminate the substrate by incident electromagnetic radiation from a light source, the reflective layer producing radiation; electromagnetic radiation reflected from incident electromagnetic radiation, and
  • a sensor adapted to measure an intensity of the electromagnetic radiation reflected after passing through the medium of interest
  • calculating means adapted to detect, from measurements taken by the sensor under constant illumination and measurement conditions, a change in the reflective properties of the assembly comprising the medium of interest and the reflecting layer and to determine a modification an optical thickness (n c xd) of the medium of interest corresponding to a modification of a molecular quantity in the medium of interest,
  • the electromagnetic radiation emitted is in a spectral band included between 350 nm and 1000 nm
  • the reflective layer of the substrate has a reflectivity R of between 0.2 and 0.7 and a sensitivity c / R / c / (n c xd) greater than 1 x 10 "3 nm " 1 in the spectral band.
  • FIGS. 1a and 1b show details of devices according to two embodiments of the invention
  • FIG. 2 schematically represents a method according to one embodiment of the invention
  • FIG. 3 is a graph representing the relative variations of reflectivity as a function of the thickness of the medium of interest on a substrate of a device according to the invention
  • FIG. 4 is a graph showing the variations in detection sensitivity on different substrates and in different ambient media as a function of the wavelength of emitted electromagnetic radiation
  • FIG. 5a represents a schematic diagram of an interaction measured in an exemplary embodiment according to the invention
  • FIG. 5b is a graph representing a response of the measurement of an interaction in the exemplary embodiment according to the invention illustrated in FIG. 5a,
  • FIG. 5c is a graph representing a response operation of the measurement of an interaction in the exemplary embodiment according to the invention illustrated in FIGS. 5a and 5b, FIGS. 6b and 6d, respectively, is a graph representing an answer.
  • the measurement of an interaction shown diagrammatically in FIG. 6a, respectively 6c, in another exemplary embodiment according to the invention,
  • FIGS. 7a and 7b illustrate an electrografting on a gold microelectrode for producing a device according to one embodiment of the invention
  • FIGS. 8a to 8e illustrate an immunoassay in a microfluidic cell according to one embodiment of the invention. Description of the invention
  • FIGS. 1a and 1b Examples illustrating embodiments of the device With reference to FIGS. 1a and 1b, there is described a device 10 for measuring a medium of interest 20.
  • the device 10 comprises a light source 1 1.
  • the medium of interest 20 is disposed between the light source 11 and a substrate 12.
  • the substrate 12 comprises a layer 121 having reflective properties.
  • the light source 1 1 is adapted to emit electromagnetic radiation 301 and illuminate the substrate 12 by incident electromagnetic radiation 302 from the light source 11.
  • the light source 11 can vertically illuminate a surface 124 of the reflecting layer 121 facing the medium of interest 20.
  • the light source 11 can thus emit electromagnetic radiation in the form of a digital aperture light beam. given at an average incidence of zero degrees with respect to the surface 124.
  • the light source 11 may be polychromatic, or monochromatic.
  • the light source 11 may comprise a spectral filter filtering a white light, for example a light produced by a halogen lamp.
  • the light source 11 may comprise a light emitting diode.
  • the electromagnetic radiation emitted 301 by the light source is included in a spectral band included between 350 nm and 1000 nm.
  • the light source 11 may comprise a microscope objective 11 or more generally an optical system comprising a combination of lenses.
  • the reflective layer 121 of the substrate 12 has a reflectivity R of between 0.2 and 0.7.
  • the reflective layer 121 further has a sensitivity c / R / d (n c xd) greater than 1 x 10 -3 nm- 1 in the spectral band of emitted electromagnetic radiation 301.
  • the reflective layer 121 may comprise an opaque sub-layer 122 having a smooth opaque surface facing the medium of interest 20.
  • This opaque sub-layer 122 may be metallic.
  • the opaque sub-layer 122 is for example a layer of gold, copper, or stainless steel, the emitted electromagnetic radiation 301 then being included in a spectral band included between 350 nm and 500 nm.
  • the metal sub-layer 122 constitutes the reflective layer 121, the smooth opaque surface being the surface 124 facing the medium of interest 20 and in contact with the medium of interest 20.
  • the reflective layer 121 comprises, in addition to the opaque sub-layer 122, a transparent underlayer 123, the transparent underlayer 123 being disposed between the medium of interest 20 and the underlayer opaque 122.
  • the transparent underlayer 123 has for example a thickness of less than 1600 nm.
  • the opaque sub-layer 122 is a silicon layer and the transparent underlayer 123 is a layer of silicon oxide or silicon nitride. By silicon oxide is meant an element of the form SiO x .
  • the medium of interest 20 comprises for example a plurality of probe molecules 201 immobilized on the surface 124 of the reflective layer 121.
  • the probe molecules are adapted to interact with target molecules 202, the interaction of the probe molecules 201 with the target molecules 202 changing the optical thickness of the medium of interest 20 in the spectral band.
  • interaction is meant a stabilizing interaction between a specific region (or atom) of a molecular entity and another entity molecular. It can be an interaction between a ligand and a receiver in the broad sense. Typical forms of interactions are for example obtained by hydrogen bonding, coordination, ion pair formation, or hydrophobic interaction.
  • the device 13 comprises a light sensor 13.
  • the reflective layer 121 produces a reflected electromagnetic radiation 303 from the incident electromagnetic radiation 302.
  • the sensor 13 is adapted to measure an intensity of the electromagnetic radiation reflected after passing through the medium of interest 30.
  • the objective 1 1 1 of the microscope can for example collect a portion located within the limits of its numerical aperture of the light flux reflected and diffused by the reflective layer 121 and the medium of interest 30.
  • the portion of the flux collected corresponds to a radiation electromagnetic sensor 304 measured by the sensor 13.
  • the sensor 13 may comprise an optical detector placed in the plane conjugate, with respect to the optical system of the lens 1 1 1, a surface of the assembly comprising the reflective layer 121 and the environment of interest 20.
  • the sensor 13 may be a matrix detector comprising a plurality of pixels, such as a CCD or CMOS camera. The sensor 13 can then make it possible to map the electromagnetic radiation captured for each pixel. A clear image of the electromagnetic radiation 304 measured from the surface to be studied can thus be formed at the level of an associated reading system such as a user terminal.
  • a single lens 1 1 1 can be used to transmit the electromagnetic radiation emitted by the light source 11 and the electromagnetic radiation after reflection by the reflective layer 121.
  • the separation of the beams corresponding to each electromagnetic radiation can be obtained by means of a beam splitter.
  • This separator is for example a blade or a cube.
  • the device comprises calculation means 14.
  • the calculation means 14 comprise for example a calculator.
  • the calculation means 14 are adapted to detect a change in reflective properties of the assembly 40 comprising the medium of interest 20 and the reflective layer 121. This change is detected from measurements 703 made by the sensor 13 under constant illumination and measurement conditions.
  • This change in reflective properties characterizes a change in an optical thickness (n c xd) of the medium of interest corresponding to a modification of a molecular quantity in the medium of interest 20.
  • this change in reflective properties can be a variation of reflective properties, and can characterize a variation of an optical thickness of the medium of interest which is representative of a modification, for example of a variation of a molecular quantity in the medium of interest 20.
  • the calculation means 14 may be directly connected to the sensor 13, as shown in FIGS. 1a and 1b, in order to detect the change of reflective properties in real time or directly after a data acquisition by the sensor 13.
  • the calculation means 14 can alternatively be adapted to detect the change of reflective properties from data from the sensor 13 and stored on storage means such as a memory.
  • the calculating means 14 may comprise means for determining 705 by an abacus of the optical thickness of the medium of interest 20 directly from the monitoring of the intensity of the electromagnetic radiation measured under the conditions of constant illumination and measurement.
  • Figure 1a illustrates an exemplary embodiment of the device in open system.
  • the objective 1 1 1 is immersed directly in the solution constituting the ambient medium 50 to be tested, thus making it possible to carry out an immersion measurement.
  • FIG. 1b illustrates an exemplary embodiment of the device in a closed system.
  • the ambient medium to be tested 50 and the substrate 12 are included in a microfluidic cell closed by a cover 501.
  • the lens 1 1 1 may have an optical correction ring to correct the passage of the electromagnetic radiation from the reflective layer 121 through the cover 501.
  • FIG. 2 describes a method for measuring the medium of interest 20.
  • the method comprises a first step 701 of arranging the medium of interest 20 between the light source 1 1 adapted to emit electromagnetic radiation 301 and the substrate 12 comprising the layer 121 having reflective properties, Step 2
  • the method comprises a second step 702 of illuminating the substrate 12 by incident electromagnetic radiation 302 from the light source 11.
  • the incident electromagnetic radiation is derived from the electromagnetic radiation emitted 301 after passing through the medium separating the light source 11 from the surface 124 of the reflective layer of the substrate 12.
  • the emitted electromagnetic radiation 301 is included in a spectral band included between 350 nm and 1000 nm.
  • the illuminated reflective layer 121 then produces a reflected electromagnetic radiation 303 from the incident electromagnetic radiation 302.
  • the reflective layer 121 has a reflectivity R between 0.2 and 0.7 and a sensitivity c / R / c / (n c xd ) greater than 1 x 10 "3 nm " 1 in the spectral band.
  • the method comprises a third step 703 consisting in measuring by the sensor 13 an intensity of the electromagnetic radiation reflected after passing through the medium of interest 20.
  • the electromagnetic radiation measured 304 is derived from the reflected electromagnetic radiation 303 after passing through the medium separating the surface 124 from the reflective layer and the sensor 13.
  • the measurements are made by the sensor 13 under constant illumination and measurement conditions.
  • constant illumination and measurement conditions for the set of measurements 703 is meant a fixed relative positioning of the light source, the reflective layer and the sensor 13, and the same emitted electromagnetic radiation 701 by the light source 11 for all measures 703.
  • the method comprises a fourth step 704 of detecting from measurements taken by the sensor 13 a change in the reflective properties of the assembly 40 comprising the medium of interest 20 and the reflective layer 121.
  • the change in reflective property makes it possible to determine a modification of an optical thickness (n c xd) of the medium of interest corresponding to a modification of a molecular quantity in the medium of interest 20.
  • the fourth detection step 704 may comprise a determination 705 of the optical thickness of the medium of interest 20. This determination is for example carried out by the computer 14 using an abacus stored in a memory, directly from the monitoring the intensity of electromagnetic radiation measured under constant illumination and measurement conditions.
  • the described device is inexpensive and simple to perform. In particular, no prism is necessary. Moreover, such a device and such a method are easily adaptable to different substrates and to different reactions.
  • Such a method allows in-situ and real-time growth monitoring of a medium of interest consisting of a biochemical layer.
  • a thin layer can induce a 15% AR / R reflectivity change over gold, 12% over copper or stainless steel or 25% over silicon.
  • the medium of interest can be subjected to a microfluidic flow.
  • the measurement step 704 can be repeated with a frequency higher than 1 Hz.
  • a measured biochemical reaction typically relates to an interaction between a target molecule 202 present in solution and a probe molecule 201 immobilized on the surface 124 of the reflective layer 121.
  • the biochemical reaction consists, from the optical point of view, in the formation or evolution of a thin layer at the level of the medium of interest 20, with a refractive index different (generally higher) than that of the ambient medium in which propagates the light wave.
  • the target molecule 202 is for example an antibody and the probe molecule 201 an antigen.
  • the reflectance can be calculated from a part of the optical characteristics, typically the optical indices of the ambient environment in which the wave propagates. It is noted for an ambient environment a, its real index n A.
  • the calculation of the reflectance also uses the characteristics of the reflective layer 121 at which the incident electromagnetic radiation 302 is reflected.
  • the reflectance RAS is then defined as the square of the modulus of the reflection coefficient 3 ⁇ 4 of the electromagnetic wave.
  • the reflection coefficient is a complex number which is expressed according to Fresnel relations and is reduced, in normal incidence as proposed in the invention, to:
  • the medium of interest constitutes a thin biochemical layer.
  • a medium of interest 20 of a thickness d has, for example, a refractive index n c ⁇ i, 47. then crossing the medium of interest 20, the overall reflection coefficient 'f is given by an expression comparable realizing multiple reflections on each of the interfaces and the phase delay introduced by the passage through the medium of interest 20 thickness d.
  • the coefficient of reflection between the ambient medium 50 and the medium of interest 20 is noted TAC.
  • the reflection coefficient between the medium of interest 20 and the reflecting layer 121 is noted.
  • the device 10 and the method described thus measure the relative variation of the flux corresponding to the collected reflected radiation 304 [Irefiected (t) - Irefiected (O)] / 1 re fiected (0) equal to the relative variation of the reflectivity AR / R.
  • the sensitivity of the method is related to the optical properties of the reflective layer 121, for example its reflectivity or its optical indices.
  • the monitoring of the intensity of the measured reflected radiation 304 made it possible to follow the evolution of the optical thickness of the medium of interest and thus to measure an interaction between the probe molecules 201 of the medium of interest 20 and the target molecules 202.
  • This effect is obtained in particular and optimally for an emitted radiation 301 included in a spectral band included between 350 nm and 1000 nm, and a reflective layer 121 having a reflectivity R of between 0.2 and 0.7 and a sensitivity c / R / c / (n xd c) greater than 1 x 10 "3 nm" 1 in the spectral band.
  • the measurements by the sensor 13 of the intensity of the electromagnetic radiation reflected after passing through the medium of interest 20 under constant illumination and measurement conditions make it possible to detect a change in the reflective properties of the assembly 40 comprising the medium of interest 20 and the reflecting layer 121 and determining a change in an optical thickness (n c xd) of the medium of interest 20 corresponding to a modification of a molecular quantity in the medium of interest 30.
  • the proposed method requires a reference measurement at which to compare the reflected intensity.
  • the reference measurement can be, as described above, the measurement made in the initial state.
  • the measurement can be performed on a dedicated surface of the same nature as the surface 124 studied but which does not undergo transformation.
  • Promising materials for the reflective layer 121 of the device are silicon and gold, but also copper or stainless steel.
  • Reflective layer comprising silicon
  • Silicon has a complex refractive index, the real part of which is very high (n ⁇ 4 and k ⁇ 0.1 in the entire spectral band between 350 nm and 1000 nm) compared to the index of any biochemical or inorganic layer (its oxide native for example) which allows a monitoring with very high sensitivity ( ⁇ 0.1 nm) of the deposition of thin layers on its surface.
  • FIGS. 3 and 4 show the theoretical evolution of the relative variation of reflectivity during the deposition of organic thin films of increasing thickness on Si.
  • the curve 803 represents the evolution of the variation of reflectivity in the case of a reflective layer.
  • 121 of radiation-irradiated silicon having a wavelength of 490 nm, the ambient medium 50 being water.
  • the curve 804 represents the evolution of the reflectivity variation in the case of a reflective layer 121 of silicon irradiated with radiation having a wavelength of 634 nm, the ambient medium 50 being constituted by water. Note that the reflectivity change is periodic with the thickness d of the medium of interest 20. This is due to the complex exponential term in the expression of the global reflectance R.
  • Figure 3 also allows to assess the sensitivity c / R / a / (n c xd) of the detection device and method described.
  • FIG. 4 shows the theoretical evolution of the sensitivity with respect to the thickness c / R / c / (d), which has a behavior similar to the sensitivity c / R / c / (n c xd) with respect to optical thickness, as a function of the wavelength of the emitted radiation 301.
  • the transparent layer 123 is for example made of silicon oxide and generated by heat treatment.
  • the transparent layer 123 may also be made of silicon nitride.
  • Curve 806 represents the evolution of the sensitivity as a function of the wavelength in the case of a reflective layer composed solely of silicon.
  • Curve 807 represents the evolution of the sensitivity in the case of a reflective layer consisting of an opaque sub-layer 122 of silicon and a transparent underlayer 123 of silicon oxide 40 nm thick.
  • Curve 808 represents the evolution of sensitivity in the case of a reflective layer consisting of an opaque sub-layer 122 of silicon and a transparent underlayer 123 of silicon oxide 120 nm thick.
  • the sensitivity c / R / c / e is retained at low thicknesses, typically less than 100 nm, and damped for large thicknesses.
  • the damping ratio is greater than 0.5 when the optical thickness n c xe ⁇ 1 / (4 x ⁇ ).
  • Sensitive detection therefore imposes an additional criterion on the thickness e of the transparent underlayer which can cover the substrate as a function of the spectral width of the source used.
  • an interference filter placed in front of a halogen lamp makes it possible to produce a source of average wavelength of 500 nm with a spectral width of approximately 20 nm.
  • the LEDs typically have half-widths ranging from 20 to 50 nm over the 350-1000 nm spectral range.
  • the transparent underlayer 123 preferably has a thickness of less than 1600 nm.
  • Reflective layer comprising gold
  • Gold also has remarkable optical properties.
  • a medium of interest 20 comprising a biochemical layer on a reflective layer 121 of gold induces relative reflectivity variations strongly depending on the wavelength of the emitted light radiation 301.
  • Curve 802 represents such a change for emitted radiation 301 at a wavelength of 490 nm.
  • Curve 801 represents such a change for emitted radiation 301 at a wavelength of 634 nm.
  • Reflectivity variations are therefore fourteen times stronger in blue than in red. An optical detection based on the reflectometry in the blue thus makes it possible to characterize the growth of organic layers on a gold surface.
  • the method and the device described make it possible, by image acquisition by a sensor 13, to quantify the evolution of the local distribution of a thin-film medium of interest on the surface 122 of a reflective layer 121.
  • the curve 802 of FIG. 3 shows that for a medium of interest 20 with a thickness of less than 30 nm and a reflective layer of gold illuminated by emitted radiation 301 of 490 nm, the reflectivity decreases with thickness of the medium of interest.
  • a reflectivity variation of 0.38% corresponds to the deposition on the surface of 1 .35 ng / mm 2.
  • Detection of the immobilization of a protein 5 nm thick under the same conditions of the curve 802 results in a decrease in the reflected light intensity of -2%, that is to say by a surface 2% less luminous than before immobilization of the protein.
  • stable is meant that has an intensity variation of less than 0.2% during the reaction.
  • the sensor 13, such as an optical camera, must also under these conditions be able to detect a light intensity variation of less than 0.2%. Examples of applications
  • an immunoassay consists in immobilizing on a reflective layer 121 a molecule of biological interest, for example an antigen 201 on a reflective layer 121 of gold.
  • the detection of the interaction between the immobilized antigen 201 and an associated antibody 202 is obtained by comparing the image obtained by the sensor 13 comprising several pixels, before and after potential interaction with the antibody 202.
  • the real-time detection is simply carried out by monitoring in situ, in aqueous solution, for example a solution of a serum, a luminous intensity of the radiation reflected by the reflective layer 121.
  • the quantitative determination of the amount of immobilized material is directly obtained from the measurement of 1 + AR / R and its correlation presented by an abacus as represented in FIG. 3. This evolution is obtained with a sensor 13 such that a CCD camera, by successive recording of images of the reflected radiation 301.
  • a kinetic analysis can be obtained by tracking 1 + AR (t, i, j) / R in each pixel of the sensor 13.
  • FIG. 5a shows an interaction between ⁇ -lactoglobulin 201 and its associated antibody 202 present in rabbit serum.
  • FIG. 5b represents the evolution 809 of the reflectivity in a zone of 5 ⁇ 5 ⁇ 2 of a reflective layer 121 of gold.
  • the sensitivity and the dynamic range of this immunoassay are obtained preferentially by the slope at the origin of the variation of the reflectivity with the reaction time.
  • the sensitivity corresponds to a dilution of 1/50000 of the patient's serum, a sensitivity comparable to that obtained in SPR, ie approximately 1/30000.
  • the linear dynamic range of our detection ranges from serum dilutions ranging from 1/50000 to more than 1/1000.
  • the device and method described also allow a quantitative analysis of the probe-target biochemical reaction. It is thus possible to measure from the relative change in reflectivity the quantity of target molecules immobilized on the surface.
  • the reflectivity measured at long times over an area of 5 x 5 ⁇ 2 corresponds to the adsorption of 4.5 ng / mm 2 antibody is a surface concentration of 3 ⁇ 10 "14 mol / mm 2
  • the image of the entire surface makes it possible to map the homogeneity of coverage of the surface by the antibody throughout the imaged field, for example 400 x 400 ⁇ 2 with a resolution of 0.4 ⁇ .
  • the measurement 703 of reflectivity is not associated with the creation of an evanescent electromagnetic wave, called surface plasmon, propagating in the vicinity of the surface 124 of the reflective layer 121. While the SPR relies on detecting the disturbances of this evanescent field induced by the reflective layer 121, the detection by the measurement 703 of reflectivity is not limited to thin media of interest of thicknesses less than the length of the reflective layer 121. penetration of the evanescent wave, for example less than 150 nanometers with a decreasing sensitivity when the thickness of the medium of interest increases.
  • Figure 3 shows that the reflectivity measurement does not exhibit this limitation. Oscillations are observed for such media of interest of increasing thickness. It is therefore possible to observe by the process and the device described for more complex biomolecular assemblies than with the SPR comprising for example several biochemical stacks or even to use the method and the device described for following couplings of larger objects such as assemblages or agglutination of nanoparticles or nano objects on a reflective layer 121 of gold.
  • the oscillating variation of the reflectivity signal shows that a quantitative measurement of a thick medium of interest, for example with a thickness greater than 50 nm, requires the monitoring of the real-time evolution of the signal picked up by the sensor 13.
  • FIGS. 6a to 6d show the real-time and in situ monitoring of the Ag-Ac interaction of ⁇ -lactalbumin (Ag) in a solution with its antibody, Ac or anti- ⁇ -lactalbumin, immobilized on gold (FIG. 6b) or the follow-up of the interaction of Ac with anti-IgG (anti-anti- ⁇ -lactalbumin) (FIG. 6d).
  • the measurements are carried out with 0.2 ⁇ / L of ⁇ -lactalbumin or a serum containing anti-IgG diluted 1/1000.
  • the detection limit of ⁇ -lactalbumin is estimated at 0.1 nmol / L and that of anti-IgG at a dilution of less than 1/30000.
  • microfabrication it is easy to deposit microstructures such as gold microdomains, on any type of substrate (glass, polymer, etc.) and to address them electrically individually (gold microelectrode array).
  • the preparation of an immuno-chip high-throughput immunoassay consists in immobilizing a large number of ligand proteins (different antigens, for example) on these microelectrodes.
  • the selective immobilization of an antigen on a given microelectrode is made possible by the use of an electrochemical process: one can selectively and independently activate an electrode, by application of a potential or an electric current, in order to to modify its surface chemistry.
  • electrografting or electrochemical surface functionalization have been described in the literature. There are various routes using the electrochemistry of diazoniums or thiols.
  • a carboxyphenyl group ( " C6H 5 COOH) from carboxyphenyldiazonium ( + N 2 C 6 H 5 COOH) or (2) an antigen from the corresponding diazonium of the antigen which can be prepared by peptide coupling between the antigen and the same carboxyphenyl diazonium (BP Corgier, CA Marquette, LJ Blum J. Am Chem Soc, 2005, 127 (51), 18328-18332.).
  • the route (2) makes it possible to directly and selectively graft an antigen onto any polarized electrode at a potential of less than -0.4 V relative to the saturated calomel electrode.
  • the route (1) likewise introduces the carboxyphenyl group selectively on any polarized electrode.
  • the anchoring of the antigen is then done by peptide coupling, for example by using EDC / NHS type reagents between the surface COOH group and an antigen present in the solution covering the platform.
  • electrochemical pathways also allow the selective immobilization of antigen on an electrode. If the thiol adsorption on a gold surface is not selective, the thiol of gold electrodes can be selectively desorbed by applying a strongly reducing or oxidizing potential to the electrodes which it is desired to thus clean. or renew. Peptide coupling between an antigen and the thiol remaining on the electrochemically unsolicited electrodes allows selective immobilization of the antigen. It is also possible to accelerate the thiol deposition on an electrode by electrochemical induction (by reduction and therefore application of a cathodic potential) and thus make the antigen deposition (after peptide coupling) selective.
  • FIGS. 7a and 7b show the selective electrografting of an organic diazonium layer on a gold microelectrode present in a microfluidic channel. An organic layer only grows on the electrochemically activated microelectrode, which is attested by the reduction of the reflectivity of this single microelectrode during grafting.
  • Figure 7a shows the real-time monitoring of the kinetics of the growth of a thin film of final thickness 10 nm obtained by electrografting of a diazonium salt.
  • Figure 7b shows a reflectivity image showing the deposition of a thin film, 30 nm thick, selectively on the activated gold electrode.
  • This type of device based on a measurement of the variation of reflectivity in real time makes it possible to detect in situ and in real time a biochemical reaction leading to an increase in the thin layer constituting the medium of interest 20 and makes it possible to define a miniaturized immunoassay in closed microfluidic cell according to the steps shown diagrammatically in FIGS. 8a to 8e.
  • the reflectivity imaging makes it possible to simply report on the selectivity of each of the steps: COOH terminal function surface functionation shown in FIG. 8a by a solution of + N 2 -Ar-CO 2 H, selective ligand anchoring represented in FIGS.
  • the proposed device 10 is not constrained by the size of the substrate 12 to be analyzed. Indeed the detection of the presence of a protein of interest is obtained by point-by-point comparison of an image of the substrate before and after, or during the immobilization of this protein on the substrate.
  • the analysis of a large-sized substrate with an area greater than 5 ⁇ 5 cm 2, for example, is possible by reconstruction from images of different regions and constituting a succession of images or photographic and photographic images. displacements of the surface with respect to the objective. This requires previously imaging all or part of the surface of the substrate before immobilization or before the immobilization step that one wishes to study. In this configuration, this prior acquisition is taken as a reference image.
  • each region corresponding to the presence of a protein or interaction on the surface is detected by a local decrease in the reflectivity of the surface.
  • the analysis can be done ex situ to increase the detection sensitivity, but can also take place in situ.
  • the observed field depends on the device used, with a device comprising an optical microscope, it depends on the lens used.
  • the field may be 0.5 x 0.5 mm 2 with an objective x 20, but may also be increased in a configuration using a system comprising lenses and a camera or a camera for example.
  • This configuration is particularly suitable for detection in large protein chips.
  • different ligand proteins are immobilized individually at different positions of a substrate 12 in order, for example, to detect the interaction of each of them with one or more target (s) present in an ambient medium. liquid.
  • the method and the device proposed make it possible to transpose this strategy onto a gold surface 124 with detection in situ and without label.
  • the method and the device described allow first of all to highlight the various steps of the immobilization of the ligands but also to reveal the presence and position of the ligands on the analysis substrate 12.
  • the imaging of the reflectivity of the gold surface after reaction with the serum must show a decrease in reflectivity only in the only region where the ligand has been previously immobilized.
  • This measurement can be done in situ and in real time if one knows beforehand the location of the target on the surface. This is for example the case when one seeks to detect a known target in a complex mixture. It is thus possible to use this type of strategy to define a high-speed immunoassay on a reflective surface.
  • This high-throughput immunoassay can also be miniaturized to operate in a microfluidic channel.
  • a microfluidic channel into which a mixture of serum-forming target molecules is circulated.
  • the method used to assemble a flow cell proposed in WO2006 / 047591, which consists in attaching to the gold surface an adhesive Mylar layer in which a channel has been preformed and in overcoming it, can be used. a hood also in Mylar.
  • the method may further comprise a step of measuring by a second sensor an electrical quantity whose modification, in particular a variation, is representative of a modification of a molecular quantity in the medium of interest, the electrical quantity being representative of electric charge transport properties between the surface 121 and the medium of interest, a physical phenomenon distinct from the measurement of the reflected electromagnetic radiation, the measurement step being performed simultaneously with the measurement step 703 of the intensity of the reflected electromagnetic radiation. It is thus possible to carry out, in parallel and / or with the aid of a common device, electrical measurements making it possible to account for or detect magnetic, electrical or electrochemical phenomena. Electrical measurements corresponding to such phenomena can for example include conductimetry, impedance, potentiometric and / or amperometry measurements, of the same molecular or biomolecular phenomenon observed.
  • the configuration and geometry of a device for measuring a medium of interest as described above is particularly suitable for coupling with other types of measurements.
  • the measurement device described allows a measurement of an electromagnetic field, typically an optical measurement, non-destructive vis-à-vis the medium of interest.
  • the method and the device described thus allow easy implementation of other analysis techniques.
  • the device for measuring a medium of interest proposed above can thus also comprise at least a second sensor adapted to measure a physical quantity representative of electric charge transport properties between the surface 121 and the medium of interest, typically for perform a different type of measurement as described above, for example an electrical measurement.
  • Such electrical measurements can thus be performed by second dedicated sensors.
  • the second sensors can be connected to an electrical measuring device.
  • the electrical measurement device may be an external electrical measurement device, or be included in the device for measuring a medium of interest as described above.
  • Such electrical measurements can be made by means of at least 2 electrodes.
  • a dedicated sensor can form an electrode.
  • One of the electrodes may be formed by one of the aforementioned surfaces, for example the surface 124 of the reflective layer 121.
  • a second electrode can be introduced into the solution or the environment.
  • such a combination of measurements of intensity of electromagnetic radiation on the one hand and electric on the other hand can be implemented by a sensor or a plurality of sensors having an electronic conductivity corresponding to that a metal, for example gold as described above, an alloy of metals, or silicon, in particular doped silicon.
  • a second sensor forming an electrode may be placed in direct contact with the medium of interest or the solution.
  • the measured electrical response corresponds to or makes it possible to detect the presence or absence of a given layer, for example a layer of biological material corresponding to or responsible for a reaction involving a change in the optical thickness of a layer, such as immunoassay or immunoassay.
  • the second electrical sensor forming the electrode 121 may also be buried under a thin dielectric layer, for example an insulating layer, for example a transparent layer such as the transparent underlayer 123, for example a silicon oxide, for example SiO 2, the second electric sensor can thus be arranged without direct contact with the solution and / or the medium of interest.
  • the device can be made in such a way that the optical properties of a measurement zone of the radiation intensity sensor 13, for example a specific surface of the sensor, are compatible with the presence of the dielectric layer to give a sensitivity response.
  • the device for measuring a medium of interest and / or the measurement method described above is made so that the electrical measurement, by the second electrical sensor, electrical charge transport properties between the layer 121, the dielectric layer 123 and the medium of interest have an equally sufficient electrical sensitivity, that is, the sensitivity for detecting the same reaction as measured by the radiation intensity sensor 13.
  • This can be obtained for example by a dielectric layer sufficiently thin to allow an electrical measurement, for example an impedance measurement, that is to say a measurement of high frequency capacitance, sensitive to the layer possibly formed and resulting of the reaction that is to be detected, for example a deposit induced by the immunoassay which alters the capacity of the second sensor.
  • a so-called "contactless" measurement of capacitance can be performed, for example in TouchChip TM fingerprint sensors (TCS).
  • the detection step 704 can then be performed from the electrical measurements made by the second sensor.
  • the calculation means 14 can then be adapted to perform the detection as a function of the measurements described above and the measurements from the second sensor.
  • the optical thickness modification whose method and device aim at determining the presence, results in a variation of a signal: an electromagnetic radiation, in particular an optical signal, with respect to the measurement by the radiation sensor described above, an electrical signal in the context of an electrical measurement, for example resistance, impedance, that is to say resistance and / or capacity, potential or current.
  • the method may thus comprise a step of comparing the various measurements, for example the measurement of electromagnetic radiation and at least one electrical measurement.
  • a comparison step may be obtained by standard logic electronic tests, for example implemented by the calculation means 14.
  • Such a step may comprise a measurement correlation step.
  • a such a comparison step may make it possible to increase the robustness of the detection.
  • calculation means may be adapted to filter the data from the detection step from the data from the second sensor, for example from detection data calculated by the calculation means 14 from data from the second sensor.
  • Such a coupling between the measurement of an electromagnetic radiation described above and the measurement of another phenomenon, for example an electrical measurement, or of the detection data resulting from these measurements, can be implemented by a device such as the device provided, further comprising a second electrical sensor or a plurality of second electrical sensors.
  • the plurality of different types of measurements of the same phenomenon on the same surface makes it possible to significantly increase the reliability of the results of a test thus implemented by the proposed method or device.
  • Such a coupling may for example be implemented as part of a false positive detection step using the results of the various measurements.
  • Such a step may be implemented by the calculation means described, the calculation means outputting a corrected value, for example by removing the false positives detected by the different types of measurements.
  • the modification detected during the detection step can be corrected during a correction step from the data from sensors and / or from different measurements and / or of different type.
  • the microelectrode used to carry out electrografting may allow the realization of an electrochemical measurement in parallel with the steps previously described for the measurement of the medium of interest by electromagnetic radiation.
  • the example of electrografting shown in FIG. 7b is produced by selective connection of the activated electrode. We can then follow the current that passes through each of these electrodes during this electrografting.
  • the inactivated electrode has a current ⁇ 1 pA while the activated electrode has a current> 100 pA.
  • the electrografting results in a measurable reflectivity decrease (-4% in Figure 7a) on the active electrode and in a reflectivity variation lower than the optical sensitivity on the active electrode.
  • the comparison of the two measurements can thus allow a more robust detection of the presence or absence of a deposit on the two electrodes, by means of the method described having the two measuring steps and / or the device described presenting the two sensors.
  • the divergent results between the two types of measurement can for example be considered as false positives or false negatives.

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Abstract

Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt (20), comprenant : disposer (701) le milieu d'intérêt entre une source lumineuse (11) et un substrat (12) comprenant une couche (121) réfléchissante, éclairer (702) le substrat (12) par un rayonnement électromagnétique incident (302) issu de la source lumineuse (11), la couche réfléchissante (121) produisant un rayonnement réfléchi (303) à partir du rayonnement électromagnétique incident (302), mesurer (703) par un capteur (13) une intensité du rayonnement réfléchi, détecter (704) à partir de mesures effectuées dans des conditions d'illumination et de mesure constantes, un changement des propriétés réfléchissantes de l'ensemble (40) comprenant le milieu d'intérêt et la couche réfléchissante (121), le rayonnement électromagnétique émis (301 ) est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1000 nm, et la couche réfléchissante (121) présente une réflectivité entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité supérieure à 1 x 10-3 nm-1 dans la bande.

Description

Procédé et dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt
Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé et un système de mesure d'un milieu d'intérêt par rayonnement électromagnétique.
Etat de l'art
Les biocapteurs présentent de nombreux domaines d'application. Il existe des procédés et des systèmes de mesure d'un milieu d'intérêt par biocapteurs. Les biocapteurs sont ainsi utilisés pour la quantification de biomolécules. De tels biocapteurs reposent sur des techniques de lecture optique.
Les techniques par biocapteurs fluorescents présentent une grande sensibilité de mesure mais nécessitent un marquage préalable des molécules à analyser. Il en résulte un surcoût associé important et un temps de préparation considérable.
II existe également des procédés et des systèmes de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface.
Le plasmon de surface (SP) est un mode d'oscillation d'électrons de conduction d'un métal à l'interface avec un diélectrique. Il se manifeste sous la forme d'une onde qui se propage le long de l'interface, l'onde étant associée à un champ électromagnétique évanescent, c'est-à-dire qu'il confiné à la surface.
Dans une configuration de mesure d'un milieu d'intérêt dite de résonance de plasmon de surface (SPR), une première surface d'une couche métallique est éclairée par une lumière incidente, par exemple une onde plane monochromatique. Un SP se propage à l'interface entre la couche métallique et un milieu aqueux ambiant testé, au niveau du milieu d'intérêt, c'est-à-dire au niveau d'une couche superficielle d'une deuxième surface de la couche métallique opposée à la première surface. La deuxième surface est fonctionnalisée ; elle peut ainsi présenter des biomolécules fixées formant le milieu d'intérêt, les biomolécules pouvant s'associer sélectivement dans le milieu d'intérêt avec une molécule d'intérêt dont on veut mesurer la présence dans le milieu ambiant testé.
Au couplage entre la lumière incidente et le SP est associé un angle d'incidence de résonance 9SP. A cet angle de résonance 9SP correspond une baisse abrupte et un minimum de l'intensité du faisceau réfléchi par la première surface issu de la lumière incidente. Cette valeur 9SP dépend fortement de l'indice optique du milieu d'intérêt, nc, au voisinage de la deuxième surface, et donc de la concentration en molécules au niveau de la deuxième surface, et donc l'association entre les biomolécules fixées et des molécules d'intérêt. Il est alors possible de mesurer la présence de molécules d'intérêt dans le milieu d'intérêt, et donc dans le milieu ambiant testé, sans réaliser de marquage préalable.
Cependant, les systèmes par imagerie SPR sont relativement coûteux et complexe à mettre en œuvre. De plus, la mise en parallèle des mesures implique une forte diminution de la sensibilité du biocapteur, alors qu'une grande qualité de mesure est nécessaire pour ce type d'imagerie. Par ailleurs, la prise de mesure pour ces systèmes est longue ce qui limite les possibilités de suivi en temps réel.
Présentation générale de l'invention
Un but de l'invention est de fournir un procédé et un dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt ne présentant pas ces inconvénients. A cet effet, il est prévu un procédé de mesure d'un milieu d'intérêt, le procédé comprenant des étapes consistant à : - disposer le milieu d'intérêt entre une source lumineuse adaptée pour émettre un rayonnement électromagnétique et un substrat comprenant une couche présentant des propriétés réfléchissantes,
- éclairer le substrat par un rayonnement électromagnétique incident issu de la source lumineuse, la couche réfléchissante produisant un rayonnement électromagnétique réfléchi à partir du rayonnement électromagnétique incident, et
- mesurer par un capteur une intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt,
- détecter à partir de mesures effectuées par le capteur dans des conditions d'illumination et de mesure constantes, un changement des propriétés réfléchissantes de l'ensemble comprenant le milieu d'intérêt et la couche réfléchissante et déterminer une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt,
dans lequel le rayonnement électromagnétique émis est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1000 nm, et la couche réfléchissante présente une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité c/R/c/(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises seules ou en une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- l'étape de détection comprend une détermination par un abaque de l'épaisseur optique du milieu d'intérêt directement à partir du suivi de l'intensité du rayonnement électromagnétique mesurée dans les conditions d'illumination et de mesure constantes, - les conditions d'illumination et de mesure constantes pour l'ensemble des mesures comprennent un positionnement relatif fixe de la source lumineuse, de la couche réfléchissante et du capteur, et un même rayonnement électromagnétique émis par la source lumineuse pour toutes les mesures,
- le milieu d'intérêt comprend une pluralité de molécules sondes immobilisées sur une surface de la couche réfléchissante, les molécules sondes étant adaptées pour interagir avec des molécules cibles, l'interaction des molécules sondes avec les molécules cibles changeant l'épaisseur optique du milieu d'intérêt dans la bande spectrale,
- le milieu d'intérêt est soumis à un écoulement microfluidique, et l'étape de mesure est répétée avec une fréquence supérieure à 1 Hz,
- la couche réfléchissante comprend une sous-couche opaque présentant une surface opaque lisse tournée vers le milieu d'intérêt,
- la couche opaque est une couche d'or, de cuivre ou d'acier inoxydable, le rayonnement électromagnétique émis étant compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 500 nm,
- dans lequel la couche réfléchissante comprend en outre une sous-couche transparente, la sous-couche transparente étant disposée entre le milieu d'intérêt et la sous-couche opaque,
- la couche transparente présente une épaisseur inférieure à 1600 nm,
- la sous-couche opaque est une couche de silicium et la couche transparente est une couche d'oxyde de silicium ou de nitrure de silicium.
L'invention concerne en outre un dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt, le dispositif comprenant : - un substrat comprenant une couche présentant des propriétés réfléchissantes,
- une source lumineuse, le milieu d'intérêt étant disposé entre la source lumineuse et le substrat, la source lumineuse étant adaptée pour émettre un rayonnement électromagnétique et éclairer le substrat par un rayonnement électromagnétique incident issu de source lumineuse, la couche réfléchissante produisant un rayonnement électromagnétique réfléchi à partir du rayonnement électromagnétique incident, et
- un capteur adapté pour mesurer une intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt,
- des moyens de calcul adaptés pour détecter à partir de mesures effectuées par le capteur dans des conditions d'illumination et de mesure constantes, un changement de propriétés réfléchissantes de l'ensemble comprenant le milieu d'intérêt et la couche réfléchissante et déterminer une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt,
dans lequel le rayonnement électromagnétique émis est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1000 nm, et la couche réfléchissante du substrat présente une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité c/R/c/(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale.
Présentation des figures
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront lors de la description ci-après d'un mode de réalisation. Aux dessins annexés : les figures 1 a et 1 b représentent des détails de dispositifs selon deux modes de réalisation de l'invention,
la figure 2 représente schématiquement un procédé selon un mode de réalisation de l'invention,
la figure 3 est un graphe représentant les variations relatives de réflectivité en fonction de l'épaisseur du milieu d'intérêt sur un substrat d'un dispositif selon l'invention,
la figure 4 est un graphe représentant les variations de sensibilité de détection sur différents substrats et dans différents milieux ambiants en fonction de la longueur d'onde d'un rayonnement électromagnétique émis,
la figure 5a représente un schéma de principe d'une interaction mesurée dans un exemple de mode de réalisation selon l'invention,
la figure 5b est un graphe représentant une réponse de la mesure d'une interaction dans l'exemple de mode de réalisation selon l'invention illustré de la figure 5a,
la figure 5c est un graphe représentant une exploitation de réponse de la mesure d'une interaction dans l'exemple de mode de réalisation selon l'invention illustré des figures 5a et 5b, la figures 6b, respectivement 6d, est un graphe représentant une réponse de la mesure d'une interaction représentée schématiquement figure 6a, respectivement 6c, dans un autre exemple de mode de réalisation selon l'invention,
les figures 7a et 7b illustrent un électrogreffage sur une microélectrode d'or pour réaliser un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention,
les figures 8a à 8e illustrent un immunoessai en cellule microfluidique selon un mode de réalisation de l'invention. Description de l'invention
Exemples illustrant des modes de réalisation du dispositif En référence aux figures 1 a et 1 b, il est décrit un dispositif 10 de mesure d'un milieu d'intérêt 20.
Source lumineuse
Le dispositif 10 comprend une source lumineuse 1 1 . Dans une configuration expérimentale, le milieu d'intérêt 20 est disposé entre la source lumineuse 1 1 et un substrat 12. Le substrat 12 comprend une couche 121 présentant des propriétés réfléchissantes.
La source lumineuse 1 1 est adaptée pour émettre un rayonnement électromagnétique 301 et éclairer le substrat 12 par un rayonnement électromagnétique incident 302 issu de la source lumineuse 1 1 . La source lumineuse 1 1 peut par exemple éclairer verticalement une surface 124 de la couche réfléchissante 121 tournée vers le milieu d'intérêt 20. La source lumineuse 1 1 peut ainsi émettre un rayonnement électromagnétique sous la forme d'un faisceau lumineux d'ouverture numérique donnée et sous une incidence moyenne de zéro degré par rapport à la surface 124. La source lumineuse 1 1 peut être polychromatique, ou monochromatique. La source lumineuse 1 1 peut comprendre un filtre spectral filtrant une lumière blanche, par exemple une lumière produite par une lampe halogène. Alternativement, la source lumineuse 1 1 peut comprendre une diode électroluminescente.
Le rayonnement électromagnétique émis 301 par la source lumineuse est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1000 nm.
La source lumineuse 1 1 peut comprendre un objectif 1 1 1 de microscope ou plus généralement un système optique comprenant une association de lentilles.
Substrat La couche réfléchissante 121 du substrat 12 présente une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7. La couche réfléchissante 121 présente en outre une sensitivité c/R/d(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale du rayonnement électromagnétique émis 301 .
La couche réfléchissante 121 peut comprendre une sous-couche opaque 122 présentant une surface opaque lisse tournée vers le milieu d'intérêt 20. Cette sous-couche opaque 122 peut être métallique. La sous- couche opaque 122 est par exemple une couche d'or, de cuivre, ou d'acier inoxydable, le rayonnement électromagnétique émis 301 étant alors compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 500 nm.
Selon un mode de réalisation, la sous-couche métallique 122 constitue la couche réfléchissante 121 , la surface opaque lisse étant la surface 124 tournée vers la milieu d'intérêt 20 et en contact avec le milieu d'intérêt 20.
Selon un autre mode de réalisation, la couche réfléchissante 121 comprend, en sus de la sous-couche opaque 122, une sous-couche transparente 123, la sous-couche transparente 123 étant disposée entre le milieu d'intérêt 20 et la sous-couche opaque 122. La sous-couche transparente 123 présente par exemple une épaisseur inférieure à 1600 nm. La sous-couche opaque 122 est une couche de silicium et la sous- couche transparente 123 est une couche d'oxyde de silicium ou de nitrure de silicium. Par oxyde de silicium on entend un élément de la forme SiOx.
Milieu d'intérêt
Le milieu d'intérêt 20 comprend par exemple une pluralité de molécules sondes 201 immobilisées sur la surface 124 de la couche réfléchissante 121 . Les molécules sondes sont adaptées pour interagir avec des molécules cibles 202, l'interaction des molécules sondes 201 avec les molécules cibles 202 changeant l'épaisseur optique du milieu d'intérêt 20 dans la bande spectrale.
Par interaction on entend une interaction stabilisante entre une région spécifique (ou atome) d'une entité moléculaire et une autre entité moléculaire. Il peut s'agir d'une intéraction entre un ligand et un récepteur au sens large. Des formes typiques d'interactions sont par exemple obtenues par liaison hydrogène, coordination, formation de paires d'ions, ou interaction hydrophobe.
Capteur
Le dispositif 13 comprend un capteur 13 lumineux.
La couche réfléchissante 121 produit un rayonnement électromagnétique réfléchi 303 à partir du rayonnement électromagnétique incident 302. Le capteur 13 est adapté pour mesurer une intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt 30.
L'objectif 1 1 1 du microscope peut par exemple collecter une partie située dans les limites de son ouverture numérique du flux lumineux réfléchi et diffusé par la couche réfléchissante 121 et le milieu d'intérêt 30. La partie du flux collectée correspond à un rayonnement électromagnétique 304 mesuré par le capteur 13. Le capteur 13 peut comprendre un détecteur optique placé dans le plan conjugué, par rapport au système optique de l'objectif 1 1 1 , d'une surface de l'ensemble comprenant la couche réfléchissante 121 et le milieu d'intérêt 20.
Le capteur 13 peut être un détecteur matriciel comprenant une pluralité de pixels, tel qu'une caméra CCD ou CMOS. Le capteur 13 peut alors permettre de réaliser une cartographie d'un rayonnement électromagnétique capté pour chaque pixel. Une image nette du rayonnement électromagnétique 304 mesuré issu de la surface à étudier peut ainsi être formée au niveau d'un système de lecture associé tel qu'un terminal utilisateur.
Un unique objectif 1 1 1 peut être utilisé pour transmettre le rayonnement électromagnétique émis par la source lumineuse 1 1 et le rayonnement électromagnétique après réflexion par la couche réfléchissante 121 . La séparation des faisceaux correspondant à chaque rayonnement électromagnétique peut être obtenue par l'intermédiaire d'un séparateur de faisceaux. Ce séparateur est par exemple une lame ou un cube.
Moyens de calcul
Le dispositif comprend des moyens de calcul 14. Les moyens de calcul 14 comprennent par exemple un calculateur.
Les moyens de calcul 14 sont adaptés pour détecter un changement de propriétés réfléchissantes de l'ensemble 40 comprenant le milieu d'intérêt 20 et la couche réfléchissante 121 . Ce changement est détecté à partir de mesures 703 effectuées par le capteur 13 dans des conditions d'illumination et de mesure constantes. Ce changement de propriétés réfléchissantes caractérise une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt 20 correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt 20. En particulier, ce changement de propriétés réfléchissantes peut être une variation de propriétés réfléchissantes, et peut caractériser une variation d'une épaisseur optique du milieu d'intérêt 20 qui est représentative d'une modification, par exemple d'une variation d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt 20.
Les moyens de calcul 14 peuvent être directement connectés au capteur 13, comme représenté aux figures 1 a et 1 b afin de détecter le changement de propriétés réfléchissantes en temps réel ou directement après une acquisition de données par le capteur 13. Les moyens de calcul 14 peuvent alternativement être adaptés pour détecter le changement de propriétés réfléchissantes à partir de données issues du capteur 13 et stockées sur des moyens de stockage tels qu'une mémoire.
Les moyens de calcul 14 peuvent comprendre des moyens de détermination 705 par un abaque de l'épaisseur optique du milieu d'intérêt 20 directement à partir du suivi de l'intensité du rayonnement électromagnétique mesuré dans les conditions d'illumination et de mesure constantes. Exemple illustrant un mode de réalisation du dispositif en système ouvert
La figure 1 a illustre un exemple de mode de réalisation du dispositif en système ouvert. L'objectif 1 1 1 est plongé directement dans la solution constituant le milieu ambiant 50 à tester, permettant ainsi de réaliser une mesure en immersion.
Exemple illustrant un mode de réalisation du dispositif en système fermé
La figure 1 b illustre un exemple de mode de réalisation du dispositif en système fermé. Le milieu ambiant à tester 50 et le substrat 12 sont inclus dans une cellule microfluidique fermée par un capot 501 . L'objectif 1 1 1 peut présenter une bague de correction optique pour corriger le passage du rayonnement électromagnétique issu de la couche réfléchissante 121 à travers le capot 501 .
Exemples illustrant des modes de réalisation du procédé
La figure 2 décrit un procédé de mesure du milieu d'intérêt 20.
Première étape
Le procédé comprend une première étape 701 consistant à disposer le milieu d'intérêt 20 entre la source lumineuse 1 1 adaptée pour émettre un rayonnement électromagnétique 301 et le substrat 12 comprenant la couche 121 présentant des propriétés réfléchissantes, Deuxième étape
Le procédé comprend une deuxième étape 702 consistant à éclairer le substrat 12 par un rayonnement électromagnétique incident 302 issu de la source lumineuse 1 1 . Le rayonnement électromagnétique incident est issu du rayonnement électromagnétique émis 301 après traversée du milieu séparant la source lumineuse 1 1 de la surface 124 de la couche réfléchissante du substrat 12. Le rayonnement électromagnétique émis 301 est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1000 nm.
La couche réfléchissante 121 éclairée produit alors un rayonnement électromagnétique réfléchi 303 à partir du rayonnement électromagnétique incident 302. La couche réfléchissante 121 présente une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité c/R/c/(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale.
Troisième étape
Le procédé comprend une troisième étape 703 consistant à mesurer par le capteur 13 une intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt 20. Le rayonnement électromagnétique mesuré 304 est issu du rayonnement électromagnétique réfléchi 303 après traversée du milieu séparant la surface 124 de la couche réfléchissante et le capteur 13.
Les mesures sont effectuées par le capteur 13 dans des conditions d'illumination et de mesure constantes. Par conditions d'illumination et de mesure constantes pour l'ensemble des mesures 703, on entend un positionnement relatif fixe de la source lumineuse, de la couche réfléchissante et du capteur 13, et un même rayonnement électromagnétique émis 701 par la source lumineuse 1 1 pour toutes les mesures 703.
Quatrième étape
Le procédé comprend une quatrième étape 704 consistant à détecter à partir de mesures effectuées par le capteur 13, un changement des propriétés réfléchissantes de l'ensemble 40 comprenant le milieu d'intérêt 20 et la couche réfléchissante 121 . Le changement de propriété réfléchissante permet de déterminer une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt 20 correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt 20. La quatrième étape de détection 704 peut comprendre une détermination 705 de l'épaisseur optique du milieu d'intérêt 20. Cette détermination est par exemple réalisée par le calculateur 14 à l'aide d'un abaque stocké dans une mémoire, directement à partir du suivi de l'intensité du rayonnement électromagnétique mesuré dans les conditions d'illumination et de mesure constantes.
Par rapport à la SPR, le dispositif décrit est peu coûteux et simple à réaliser. En particulier, aucun prisme n'est nécessaire. Par ailleurs un tel dispositif et une telle méthode sont aisément adaptables à différents substrats et à différentes réactions.
Une telle méthode permet un suivi in-situ et en temps réel de croissance d'un milieu d'intérêt 20 constitué d'une couche biochimique. En particulier, en milieu aqueux et sous illumination à 490 nm, une couche mince peut induire un changement de réflectivité AR/R 15% sur or, 12% sur cuivre ou acier inoxydable ou 25% sur silicium.
En particulier, le milieu d'intérêt 20 peut être soumis à un écoulement microfluidique. Un tel suivi est possible car contrairement à la SPR, l'étape de mesure 704 peut être répétée avec une fréquence supérieure à 1 Hz.
Principe du dispositif et du procédé
Détecter un changement de réflectivité par mesure de l'intensité du rayonnement
Une réaction biochimique mesurée concerne typiquement une interaction entre une molécule cible 202 présente en solution et une molécule sonde 201 immobilisée sur la surface 124 de la couche réfléchissante 121 . La réaction biochimique consiste, du point de vue optique, en la formation ou l'évolution d'une couche mince au niveau du milieu d'intérêt 20, d'indice de réfraction différent (généralement supérieur) de celui du milieu ambiant dans lequel se propage l'onde lumineuse. La molécule cible 202 est par exemple un anticorps et la molécule sonde 201 un antigène.
Ceci se traduit donc par un changement de l'indice de réfraction au voisinage de la surface 124 de la couche réfléchissante, au niveau du milieu d'intérêt 20. La traversée du milieu d'intérêt 20 par le faisceau lumineux 301 issu de la source lumineuse 1 1 modifie les caractéristiques du faisceau lumineux réfléchi 303, notamment son intensité lumineuse.
Par réflectance on entend le rapport de l'intensité du faisceau réfléchi 303, fiected, par celle du faisceau indicent 302, Incident- La réfléctance est notée R = Irefiected linddent-
Pour une incidence et une polarisation données du rayonnement magnétique 301 émis, la réflectance peut être calculée à partir d'une part des caractéristiques optiques, typiquement les indices optiques du milieu ambiant dans laquelle l'onde se propage. On note pour un milieu ambiant a, son indice réel nA. Le calcul de la réflectance fait appel d'autre part aux caractéristiques de la couche réfléchissante 121 au niveau de laquelle le rayonnement électromagnétique incident 302 est réfléchi. On note pour une couche réfléchissante 121 correspondant à un milieu s, un indice de réfraction complexe hs = ns + /' ks, dont ns est la partie réelle de l'indice de réfraction complexe et ks, la partie imaginaire de l'indice de réfraction complexe, est son coefficient d'extinction.
La réflectance RAS est alors définie comme le carré du module du coefficient de réflexion ¾ de l'onde électromagnétique. Le coefficient de réflexion est un nombre complexe qui s'exprime selon les relations de Fresnel et se réduit, en incidence normale comme proposé dans l'invention, à :
Figure imgf000016_0001
Dans le cas d'une interaction biochimique, le milieu d'intérêt 20 constitue une couche biochimique mince. Un milieu d'intérêt 20 d'une épaisseur d présente par exemple un indice de réfraction n c^i,47 . Lors de la traversée du milieu d'intérêt 20, le coefficient de réflexion global 'f est donné par une expression comparable rendant compte des réflexions multiples sur chacune des interfaces et du retard de phase introduit par la traversée du milieu d'intérêt 20 d'épaisseur d. On note TAC le coefficient de réflexion entre le milieu ambiant 50 et le milieu d'intérêt 20. On note ?cs le coefficient de réflexion entre le milieu d'intérêt 20 et la couche réfléchissante 121 . On obtient alors pour la réflectance globale:
Figure imgf000017_0001
Lorsque le flux du rayonnement incident 302 est constant, le capteur 13 et le calculateur associé 14 permettent de mesurer l'évolution du flux du rayonnement réfléchi collecté 304 à l'instant t par rapport à une mesure de référence, par exemple l'intensité du flux mesuré à l'instant initial : Ireflected(t) / Ireflected(O) = 1 + AR/R.
Le dispositif 10 et le procédé décrits mesurent ainsi la variation relative du flux correspondant au rayonnement réfléchi collecté 304 [Irefiected(t) - Irefiected(O)] / lrefiected(0) égale à la variation relative de la réflectivité AR/R.
La sensibilité du procédé est liée aux propriétés optiques de la couche réfléchissante 121 , par exemple sa réflectivité ou ses indices optiques.
Déterminer une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt
Il a été remarqué que, dans le cadre des procédés et des dispositifs décrits, le suivi de l'intensité du rayonnement réfléchi mesuré 304 permettait de suivre l'évolution de l'épaisseur optique du milieu d'intérêt et de mesurer ainsi une interaction entre les molécules sonde 201 du milieu d'intérêt 20 et des molécules cibles 202.
Cet effet est obtenu en particulier et de façon optimale pour un rayonnement émis 301 compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1000 nm, et une couche réfléchissante 121 présentant une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité c/R/c/(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale.
Ainsi, les mesures par le capteur 13 de l'intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt 20 dans des conditions d'illumination et de mesure constantes, permettent de détecter un changement des propriétés réfléchissantes de l'ensemble 40 comprenant le milieu d'intérêt 20 et la couche réfléchissante 121 et de déterminer une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt 20 correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt 30.
Choix d'une mesure de référence
Comme décrit ci-avant, la méthode proposée nécessite de disposer d'une mesure de référence à laquelle comparer l'intensité réfléchie. La mesure de référence peut être, comme décrit ci-avant, la mesure réalisée à l'état initial. Alternativement la mesure peut être réalisée sur une surface dédiée de même nature que la surface 124 étudiée mais qui ne subit pas de transformation.
Modes de réalisations de la couche réfléchissante
Des matériaux prometteurs pour la couche réfléchissante 121 du dispositif sont le silicium et l'or, mais également le cuivre ou l'acier inoxydable.
Couche réfléchissante comprenant du silicium
Le silicium présente un indice de réfraction complexe dont la partie réelle est très élevée (n~ 4 et k<0.1 dans toute la bande spectrale comprise entre 350 nm et 1000 nm) comparativement à l'indice de toute couche biochimique ou inorganique (son oxyde natif par exemple) ce qui permet un suivi avec une très grande sensibilité (<0.1 nm) du dépôt de couches minces à sa surface. Les figures 3 et 4 montrent l'évolution théorique de la variation relative de réflectivité lors du dépôt de couches minces organiques d'épaisseur croissante sur Si. La courbe 803 représente l'évolution de la variation de réflectivité dans le cas d'une couche réfléchissante 121 de silicium éclairée par un rayonnement ayant une longueur d'onde de 490 nm, le milieu ambiant 50 étant constitué d'eau. La courbe 804 représente l'évolution de la variation de réflectivité dans le cas d'une couche réfléchissante 121 de silicium éclairée par un rayonnement ayant une longueur d'onde de 634 nm, le milieu ambiant 50 étant constitué d'eau. On remarque que le changement de réflectivité est périodique avec l'épaisseur d du milieu d'intérêt 20. Ceci est dû au terme exponentiel complexe dans l'expression de la réflectance globale R.
La figure 3 permet également d'apprécier la sensibilité c/R/c/(nc x d) du dispositif de détection et du procédé décrits.
La figure 4 montre l'évolution théorique de la sensibilité par rapport à l'épaisseur c/R/c/(d), qui a un comportement similaire à la sensibilité c/R/c/(nc x d) par rapport à l'épaisseur optique, en fonction de la longueur d'onde du rayonnement émis 301 . Dans le cas du silicium, le dépôt d'une sous-couche transparente 123 permet de modifier R de manière à contrôler la sensibilité, c/R/c/(nc x d). La couche transparente 123 est par exemple réalisée en oxyde de silicium et générée par traitement thermique. La couche transparente 123 peut également être réalisée en nitrure de silicium.
Couche transparente
La courbe 806 représente l'évolution de la sensibilité en fonction de la longueur d'onde dans le cas d'une couche réfléchissante constituée uniquement de silicium. La courbe 807 représente l'évolution de la sensibilité dans le cas d'une couche réfléchissante constituée d'une sous- couche opaque 122 de silicium et d'une sous-couche transparente 123 d'oxyde de silicium de 40 nm d'épaisseur. La courbe 808 représente l'évolution de la sensibilité dans le cas d'une couche réfléchissante constituée d'une sous-couche opaque 122 de silicium et d'une sous- couche transparente 123 d'oxyde de silicium de 120 nm d'épaisseur. Ainsi la comparaison de ces courbes montre que la présence d'une sous- couche transparente 123 mince d'oxyde de silicium, d'au moins 10 nm, sur la sous-couche opaque 122 de silicium permet d'optimiser la sensibilité de la détection. Mais on peut aussi utiliser des couches plus épaisses d'oxydes afin de former des substrats présentant une variation de sensibilité dans la gamme spectrale. Pour une sous-couche transparente 123 d'oxyde de silicium de 120 nm d'épaisseur, on remarque que la sensibilité est maximale dans le bleu.
Par ailleurs, la source lumineuse 1 1 est caractérisée par une longueur d'onde moyenne λ et une largeur spectrale Δλ ou Δσ, avec σ=1 /λ. A partir de l'expression de la réfléctance en fonction de la longueur d'onde λ, on voit que, pour une source monochromatique, les conditions sur R et c/R/c/e, sensibilité par rapport à l'épaisseur e de la sous-couche transparente 123 et du milieu d'intérêt 20, peuvent imposer des conditions sur la longueur d'onde λ de travail à sélectionner en fonction de la surface de substrat choisie.
Dans le cas d'une couche transparente d'indice optique de partie réelle n et de partie imaginaire k=0, R et donc la sensibilité, c/R/c/e, sont des fonctions périodiques de l'épaisseur e, de période A/2nc.
Pour une source de largeur spectrale Δλ, la sensibilité c/R/c/e est conservée aux faibles épaisseurs, typiquement inférieures à 100 nm, et amortie pour les grandes épaisseurs. Le facteur d'amortissement est supérieur à 0.5 lorsque l'épaisseur optique nc x e < 1 /(4 x Δσ).
Une détection sensible impose donc un critère supplémentaire sur l'épaisseur e de la sous-couche transparente qui peut recouvrir le substrat en fonction de la largeur spectrale de la source utilisée.
Typiquement, un filtre interférentiel placé devant une lampe halogène permet de réaliser une source de longueur d'onde moyenne 500 nm avec une largeur spectrale d'environ 20 nm. De même, les LEDs puissantes ont typiquement des largeurs à mi-hauteur allant de 20 à 50 nm sur le domaine spectral 350 - 1000 nm.
Si Δσ = 1000cm"1 , c'est à dire Δλ=25 nm à λ = 500 nm, ou Δλ = 100 nm à λ = 1000nm, le critère supplémentaire sur l'épaisseur d' de l'ensemble (d'=d+e, avec e épaisseur de la sous-couche et d épaisseur du milieu d'intérêt) se traduit par : nc x d'≤ 1 /(4 x Δσ) = 2.5 μιτι, soit d' < 1 .6 μιτι pour nc = 1 .5.
Si Δσ = 2000 cm"1 , c'est-à-dire Δλ = 50 nm à λ = 500 nm, ou Δλ = 200 nm à lambda = 1000 nm, le critère supplémentaire sur l'épaisseur d' de l'ensemble se traduit par : nc x d' < 1 /(4 x Δσ) = 1 .25 μιτι, soit d' < 0.8 μιτι pour nc = 1 .5.
Ainsi, la sous-couche transparente 123 présente préférentiellement une épaisseur inférieure à 1600 nm.
Couche réfléchissante comprenant de l'or
L'or présente également des propriétés optiques remarquables.
Contrairement au silicium, le dépôt d'un milieu d'intérêt 20 comprenant une couche biochimique sur une couche réfléchissante 121 d'or induit des variations relatives de réflectivité dépendant fortement de la longueur d'onde du rayonnement lumineux émis 301 .
La figure 3 présente l'évolution de la variation relative de réflectivité d'une couche réfléchissante 121 d'or, dans le cas d'un milieu d'intérêt 20 constitué d'un couche mince homogène et isotrope présentant un indice de réfraction nc=1 ,47, le milieu ambiant étant un milieu aqueux d'indice nA=1 ,33. La courbe 802 représente une telle évolution pour un rayonnement émis 301 à une longueur d'onde de 490 nm. La courbe 801 représente une telle évolution pour un rayonnement émis 301 à une longueur d'onde de 634 nm. Les variations de réflectivité sont donc quatorze fois plus fortes dans le bleu que dans le rouge. Une détection optique basée sur la réflectométrie dans le bleu permet ainsi de caractériser la croissance de couches organiques sur une surface d'or. La courbe 805 de la figure 4 représente l'évolution de la sensibilité en fonction de la longueur d'onde dans le cas d'une couche réfléchissante constituée uniquement d'or. Une sensibilité optimale ainsi peut être obtenue dans le cas d'une couche réfléchissante 121 en or, lorsque le rayonnement émis 301 est compris entre 350 nm et 500 nm.
La méthode et le dispositif décrits permettent, par une acquisition d'images par un capteur 13, de quantifier l'évolution de la distribution locale d'un milieu d'intérêt 20 formant couche mince sur la surface 122 d'une couche réfléchissante 121 .
Par exemple, la courbe 802 de la figure 3 montre que pour un milieu d'intérêt 20 d'une épaisseur inférieure à 30nm et d'une couche réfléchissante d'or éclairée par un rayonnement émis 301 de 490 nm, la réflectivité décroît avec l'épaisseur du milieu d'intérêt. Typiquement, en milieu aqueux un milieu d'intérêt 20 mince d'indice nc=1 .47 induit une variation de réflectivité de 0.38% par nm. Pour un milieu d'intérêt 20 de densité 1 .35 g/cm3, valeur typique pour les films minces organiques ou les biomolécules, une variation de réflectivité de 0.38% correspond au dépôt sur la surface de 1 .35ng/mm2.
La détection de l'immobilisation d'une protéine de 5 nm d'épaisseur dans les mêmes conditions de la courbe 802 se traduit par une diminution de l'intensité lumineuse réfléchie de -2%, c'est-à-dire par une surface 2% moins lumineuse qu'avant l'immobilisation de la protéine.
L'analyse d'une réaction biochimique sur un substrat 12 nécessite l'utilisation d'une source lumineuse 1 1 stable. Par stable, on entend qui présente une variation d'intensité inférieure à 0.2% pendant la réaction. Le capteur 13, tel qu'une caméra optique, doit également dans ces conditions pouvoir détecter une variation d'intensité lumineuse inférieure à 0,2%. Exemples d'applications
Immunoessais
L'élaboration d'un immunoessai consiste à immobiliser sur une couche réfléchissante 121 d'une molécule d'intérêt biologique, par exemple un antigène 201 sur une couche réfléchissante 121 d'or. La détection de l'interaction entre l'antigène 201 immobilisé et un anticorps 202 associé est obtenue par comparaison de l'image obtenue par le capteur 13 comprenant plusieurs pixels, avant et après interaction potentielle avec l'anticorps 202.
La détermination quantitative 704 de la variation relative de réflectance est alors obtenue par comparaison entre une intensité mesurée sur la première image, lo(ij) en chaque pixel de coordonnées (i,j) avec une intensité mesurée sur le même pixel sur l'image obtenue au temps t, lt(i,j) et 1 +AR(t,i,j)/R = lt(i,j)/lo(i,j). La détection en temps réel est simplement réalisée par le suivi in situ, en solution aqueuse, par exemple une solution d'un sérum, d'une intensité lumineuse du rayonnement réfléchi 303 par la couche réfléchissante 121 . La détermination quantitative de la quantité de matière immobilisée est directement obtenue à partir de la mesure de 1 +AR/R et de sa corrélation présentée par un abaque telle que représentée en figure 3. Cette évolution est obtenue, avec un capteur 13 tel qu'une caméra CCD, par enregistrement successif d'images du rayonnement réfléchi 301 . Une analyse cinétique peut être obtenue par le suivi de 1 +AR(t,i,j)/R en chaque pixel du capteur 13.
Exemple d'une interaction antigène-anticorps Ag-Ac
La figure 5a représente une interaction entre la β-lactoglobuline 201 et son anticorps associé 202 présent dans un sérum de lapin. La figure 5b représente l'évolution 809 de la réflectivité en une zone de 5x5 μιτι2 d'une couche réfléchissante 121 d'or. La figure 5c représente la variation de réflectivité à t=0 en fonction du facteur de dilution du sérum. Ainsi la figure 5c représente la gamme dynamique de l'immunoessai obtenue par la pente (en s"1) aux temps courts ; l'origine à t=40s correspond à l'injection de la cible.
La sensibilité et la gamme dynamique de cet immunoessai sont obtenus préférentiellement par la pente à l'origine de la variation de la réflectivité avec le temps de réaction. Dans le cas de la β-lactoglobuline et pour une surface d'or de 4 μηη2, la sensibilité correspond à une dilution de 1 /50000 du sérum du patient, une sensibilité comparable à celle obtenue en SPR, soit environ 1 /30000. La gamme dynamique linéaire de notre détection s'étend de dilutions de sérum allant de 1 /50000 à plus de 1 /1000.
Le dispositif et le procédé décrits permettent également une analyse quantitative de la réaction biochimique sonde-cible. Il est ainsi possible de mesurer à partir du changement relatif de réflectivité la quantité de molécules cibles immobilisées sur la surface. Par exemple sur la figure 5b, la réflectivité mesurée aux temps longs sur une région de 5 x 5 μιτι2 correspond à l'adsorption de 4.5 ng/mm2 d'anticorps soit une concentration surfacique de 3 x 10"14 mol/mm2. L'image de toute la surface permet de cartographier l'homogénéité de couverture de la surface par l'anticorps dans tout le champ imagé, par exemple 400 x 400 μιτι2 avec une résolution de 0.4 μιτι.
Il est également possible de déterminer à partir du suivi in situ et en temps réel de l'interaction antigène-anticorps la cinétique et la thermodynamique de ce processus de reconnaissance. La cinétique détectée sur la figure 5b comme une décroissance de réflectivité peut être analysée, comme cela est fait dans de nombreux biocapteurs par exemple en SPR, par un processus d'adsorption/désorption du premier ordre. Les variations de réflectivité expérimentale sont comparées à une évolution exponentielle de type Langmuir représentée par la courbe 810 sur la figure 5b.
On extrait de la comparaison expérience/modèle la vitesse apparente du couplage anticorps-antigène. De nombreux modèles sont connus de l'homme du métier pour rendre compte notamment du transport de matière souvent limitant. Dans la version la plus simplifiée du modèle cinétique, la constante apparente est décrite par kapp = kaCo + kd où ka est la constante cinétique du phénomène d'association exprimée en M"1s"1 , kd est la constante de dissociation du complexe immun en s"1 et Co correspond à la concentration de l'espèce cible présente en solution, à savoir l'anticorps sur la figure 5a. On obtient ka et kd et donc la constante thermodynamique d'association du complexe immun KA=ka/kd par observation de processus d'adsorption/désorption à plusieurs concentrations de cible en solution. Dans l'exemple présenté sur les figures 5a à 5c, on estime à partir des cinétiques de reconnaissance pour des dilutions de sérum allant de 1 /1000 à 1 /10000 kd = 8 x 10"4 s"1 , la pente de la variation de kapp avec le facteur de dilution est de 8.2/C* M"1s"1 où C* est la concentration de l'anticorps cible dans le sérum. La constante thermodynamique de la réaction de couplage est obtenue par KA=ka/kd, ici KA = 104/C* M"1.
Interaction anticorps/anti-anticorps (IgG/Anti-lgG) - détection de sandwiches immunologiques complets
Contrairement à la SPR, la mesure 703 de réflectivité n'est pas associée à la création d'une onde électromagnétique évanescente, dite plasmon de surface, se propageant au voisinage de la surface 124 de la couche réfléchissante 121 . Alors que la SPR repose sur la détection des perturbations de ce champ évanescent induit par la couche réfléchissante 121 , la détection par la mesure 703 de réflectivité n'est pas limitée à des milieu d'intérêt 20 minces d'épaisseurs inférieures à la longueur de pénétration de l'onde évanescente, par exemple inférieures à 150 nanomètres avec une sensibilité diminuant quand l'épaisseur du milieu d'intérêt 20 augmente.
La figure 3 montre que la mesure de réflectivité ne présente pas cette limitation. On observe des oscillations pour de tels milieux d'intérêts 20 d'épaisseurs croissantes. Il est donc possible d'observer par le procédé et le dispositif décrits pour des assemblages biomoléculaires plus complexes qu'avec la SPR comprenant par exemple plusieurs empilements biochimiques ou même d'utiliser le procédé et le dispositif décrits pour suivre des couplages d'objets plus gros tels des assemblages ou agglutination de nanoparticules ou nano-objets sur une couche réfléchissante 121 d'or. La variation oscillante du signal de réflectivité montre qu'une mesure quantitative de milieu d'intérêt épais, par exemple d'épaisseur supérieure à 50 nm, requiert le suivi de l'évolution en temps réel du signal capté par le capteur 13.
On met en évidence la présence d'un anticorps 201 immobilisé sur une surface 124 d'une couche réfléchissante par interaction avec son antigène associé 202 présent en solution (Figures 6a et 6b) mais également par l'interaction ultérieure de l'anticorps immobilisé 201 avec son anti-lgG associé (Figures 6c et 6d). Un tel exemple est illustré sur les figures 6a à 6d qui présentent le suivi en temps réel et in situ de l'interaction Ag-Ac de Γα-lactalbumine (Ag) en une solution avec son anticorps, Ac ou anti-a-lactalbumine, immobilisé sur or (figure 6b) ou le suivi de l'interaction de Ac avec l'anti-lgG (anti-anti-a-lactalbumine) (Figure 6d). Les mesures sont effectuées avec 0,2 μηηοΙ/L d'a-lactalbumine ou un sérum contenant l'anti-lgG dilué à 1 /1000. La limite de détection de l'a- lactalbumine est estimée à 0,1 nmol/L et celle de l'anti-lgG à une dilution inférieure à 1 /30000.
Cet exemple montre que le procédé et le dispositif décrits permettent, sans perte de sensibilité, de détecter des sandwiches immunologiques complets (séquence Ag/Ac/anti-Ac), plus délicats à mettre en évidence par SPR. Le procédé et le dispositif décrits permettent également de détecter des assemblages avec des objets plus volumineux utilisant par exemple des nanoparticules.
Enfin tous ces assemblages peuvent être dissociés par mise en contact avec une solution de glycine ou de force ionique élevée. Cette dissociation rapide peut également être suivie par imagerie in situ et en temps réel de l'augmentation de réflectivité de la surface 124 de la couche réfléchissante 121 . Les exemples présentés ici sont illustrés sur une surface 124 d'or plane obtenue par dépôt d'une couche réfléchissante 121 d'or de 100 nm sur un wafer de silicium. Ils peuvent aisément s'adapter au suivi de réactions biochimiques similaires sur une surface de silicium (un wafer de silicium avec un oxyde ou un nitrure associé) ou sur des surfaces de cuivre ou d'acier inoxydable par exemple recouvertes d'une couche mince transparente les protégeant de la corrosion.
Formats Immunoessai en format miniaturisé
Par microfabrication il est aisé de déposer des microstructures telles des microdomaines d'or, sur tout type de substrat (verre, polymère,...) et de les adresser électriquement individuellement (réseau de microélectrodes d'or). La préparation d'un immunoessai à haut débit de type puce immunologique, consiste à immobiliser un grand nombre de protéines ligands (différents antigènes par exemple) sur ces microélectrodes. L'immobilisation sélective d'un antigène sur une microélectrode donnée est rendu possible par l'utilisation d'un processus électrochimique: on peut activer sélectivement et indépendamment une électrode, par application d'un potentiel ou d'un courant électrique, afin d'en modifier sa chimie de surface. Plusieurs procédés d'électrogreffage ou de fonctionnalisation de surface électrochimique ont été décrits dans la littérature. On peut citer différentes voies utilisant l'électrochimie des diazoniums ou des thiols.
L'électrochimie des diazoniums permet de greffer sur une électrode:
(1 ) un groupement carboxyphényl ("C6H5COOH) à partir de carboxyphenyldiazonium (+N2C6H5COOH) ou (2) un antigène à partir du diazonium correspondant de l'antigène qui peut être préparé par couplage peptidique entre l'antigène et le même carboxyphényldiazonium (B. P. Corgier, C. A. Marquette, L. J. Blum J. Am. Chem. Soc, 2005, 127 (51 ), 18328-18332.). La voie (2) permet de greffer directement et sélectivement un antigène sur toute électrode polarisée à un potentiel inférieur à -0.4 V par rapport à l'électrode au calomel saturée. La voie (1 ) introduit de même le groupement carboxyphényl sélectivement sur toute électrode polarisée. L'ancrage de l'antigène se fait ensuite par couplage peptidique, par exemple par utilisation de réactifs de type EDC/NHS entre le groupement COOH de surface et un antigène présent dans la solution recouvrant la plateforme.
Dans le cas de l'utilisation de thiols, des voies électrochimiques permettent également l'immobilisation sélective d'antigène sur une électrode. Si l'adsorption de thiol sur une surface 124 d'or n'est pas sélective, on peut désorber sélectivement le thiol d'électrodes d'or par application d'un potentiel fortement réducteur ou oxydant aux électrodes que l'on désire ainsi nettoyer ou renouveler. Un couplage peptidique entre un antigène et le thiol restant sur les électrodes non sollicitées électrochimiquement permet une immobilisation sélective de l'antigène. On peut également accélérer le dépôt de thiol sur une électrode par induction électrochimique (par réduction et donc application d'un potentiel cathodique) et ainsi rendre le dépôt d'antigène (après couplage peptidique) sélectif.
Toutes ces étapes peuvent, être suivies en temps réel et in situ par imagerie des variations relatives de la réflectivité des surfaces activées. Par exemple les figures 7a et 7b présentent l'électrogreffage sélectif d'une couche organique de diazonium sur une microélectrode d'or présente dans un canal microfluidique. Une couche organique croît seulement sur la microélectrode activée électrochimiquement, ce qui est attesté par la diminution de la réflectivité de cette seule microélectrode au cours du greffage.
La figure 7a représente le suivi temps réel de la cinétique de la croissance d'un film mince d'épaisseur finale 10 nm obtenu par électrogreffage d'un sel de diazonium. La figure 7b représente une image de réflectivité montrant le dépôt d'un film mince, de 30 nm d'épaisseur, sélectivement sur l'électrode d'or activée.
Ce type de dispositif reposant sur une mesure de la variation de réflectivité en temps réel permet de détecter in situ et en temps réel une réaction biochimique conduisant à un accroissement de la couche mince constituant le milieu d'intérêt 20 et permet de définir un immunoessai miniaturisé en cellule microfluidique fermée selon les étapes schématisées sur les figure 8a à 8e. L'imagerie de la réflectivité permet de rendre compte simplement de la sélectivité de chacune des étapes : fonctionnalisation de surface par fonction terminale COOH représentée figure 8a par une solution de +N2-Ar-CO2H, ancrage sélectif de ligand représentées figures 8b par ajout d'une solution d'EDC/NHS et 8c par ajout de ligand, détection sélective de la cible sur l'électrode fonctionnalisée avec l'antigène correspondant, mais aussi et en même temps détection de la spécificité de la réaction par mesure sur l'électrode fonctionnalisée avec un autre antigène représentées figures 8d et 8e.
Cette approche est développable en système microfluidique fermé ou ouvert comme indiqué ci-avant. Elle n'est pas non plus limitée aux plateformes simples décrites ici constituées de réseaux de microélectrodes implantées dans le fond d'un canal mirofluidique. Elle est également adaptable à des plateformes constituées de microleviers (« microcantilevers » en terminologie anglo-saxonne) adressés individuellement. Dans ce cas, on peut utiliser, dans une formulation dérivée de celle proposée dans Optics Lett. 201 1 (Amiot et al.), un éclairage à 2 longueurs d'onde pour découpler les contributions optiques liées à la déformation du levier et à la réaction biochimique en identifiant les contributions dépendantes et indépendantes de la longueur d'onde. Un éclairage bicolore est obtenu aisément et à moindre coût par utilisation de LED. L'activation sélective de différents leviers est également rendue possible par activation électrochimique et par les méthodes d'électrogreffage proposées précédemment.
L'utilisation de ces plateformes activables électrochimiquement permet aussi de multiplier le nombre de détection (optique et électrochimique, voire mécanique dans le cas de microleviers). Cette redondance de mesures d'interactions permet d'augmenter la fiabilité des immunoessais proposés.
Immunoessais grands formats
Le dispositif 10 proposé n'est pas contraint par la dimension du substrat 12 à analyser. En effet la détection de la présence d'une protéine d'intérêt est obtenue par comparaison point-par-point d'une image du substrat avant et après, ou au cours de l'immobilisation de cette protéine sur le substrat. L'analyse d'un substrat de grande dimension, de surface supérieure à 5 x 5 cm2 par exemple, est possible par reconstruction à partir d'images de différentes régions et constituant une succession d'images ou de prises de vues photographiques et de déplacements de la surface par rapport à l'objectif. Ceci requiert d'imager au préalable tout ou partie de la surface du substrat avant immobilisation ou avant l'étape d'immobilisation que l'on souhaite étudier. Dans cette configuration, cette acquisition préalable est prise comme image de référence. Par exemple on peut prendre comme région de référence, dans chaque image élémentaire, les parties de l'image qui présentent les valeurs d'intensité les plus grandes. Les images du substrat obtenues après immobilisation seront comparées à celles de références et permettront de rendre compte de l'étape d'immobilisation. Ainsi, chaque région correspondant à la présence d'une protéine ou d'une interaction sur la surface est détectée par une diminution locale de la réflectivité de la surface. L'analyse peut se faire ex situ afin d'augmenter la sensibilité de détection, mais peut également avoir lieu in situ. Le champ observé dépend du dispositif utilisé, avec un dispositif comprenant un microscope optique, il dépend de l'objectif utilisé. Par exemple le champ peut être de 0,5 x 0,5 mm2 avec un objectif x 20, mais peut également être augmenté dans une configuration utilisant un système comprenant des lentilles et une caméra ou un appareil photographique par exemple.
Cette configuration est particulièrement adaptée à la détection dans des puces à protéines de grandes dimensions. Dans ces puces, différentes protéines ligands sont immobilisées individuellement en différentes positions d'un substrat 12 afin, par exemple, de détecter l'interaction de chacune d'elles avec une ou plusieurs cible(s) présente(s) dans un milieu ambiant 50 liquide.
Ce type d'analyse existe en immunologie, la réponse immunologique de chacune des protéines ligands vis-à-vis de cibles présentes par exemple dans un sérum étant obtenue par mise en contact d'un support 2D de ligands avec un sérum puis par révélation par marquage secondaire des anticorps cibles ayant interagi avec les ligands (eux-mêmes marqués par des terminaisons fluorescences ou radioactives).
Le procédé et le dispositif proposés permettent de transposer cette stratégie sur une surface 124 d'or avec une détection in situ et sans label. Le procédé et le dispositif décrits permettent tout d'abord de mettre en évidence les différentes étapes de l'immobilisation des ligands mais également de révéler la présence et la position des ligands sur le substrat 12 d'analyse.
Il est également possible de suivre, par le dispositif et le procédé décrits, in situ et en temps réel l'interaction cible-ligand. Si on fait réagir la surface de la puce à protéine avec un sérum contenant une seule cible par exemple les anticorps de la β-lactoglobuline, d'un seul des ligands immobilisés sur la surface, par exemple la β-lactoglobuline, l'imagerie de la réflectivité de la surface d'or après réaction avec le sérum doit présenter une diminution de réflectivité uniquement dans la seule région où le ligand a été préalablement immobilisé. Cette mesure peut se faire in situ et en temps réel si l'on connaît au préalable l'emplacement de la cible sur la surface. Ceci est par exemple le cas lorsque l'on cherche à dépister une cible connue dans un mélange complexe. Il est ainsi possible d'utiliser ce type de stratégie pour définir un immunoessai à haut débit sur surface réfléchissante.
Cet immunoessai haut-débit peut être également miniaturisé pour fonctionner en canal microfluidique. On assemble sur la surface d'or où ont été immobilisées les ligands un canal microfluidique dans lequel on fait circuler un mélange de molécules cibles formant un sérum. On peut utiliser par exemple la méthode utilisée pour assembler une cellule à flux proposée dans le brevet WO2006/047591 , qui consiste à attacher à la surface d'or une couche de Mylar adhésive dans laquelle un canal a été préformé et à la surmonter d'un capot également en Mylar.
Couplage de mesures de types différents Les étapes décrites et proposées peuvent être couplées à d'autres mesures physicochimiques dont les étapes peuvent être inclues au procédé proposé.
Le procédé peut ainsi comprendre en outre une étape consistant à mesurer par un deuxième capteur une grandeur électrique dont une modification, en particulier une variation, est représentative d' une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt, la grandeur électrique étant représentative de propriétés de transport de charges électriques entre la surface 121 et le milieu d'intérêt, phénomène physique distinct de la mesure du rayonnement électromagnétique réfléchi, l'étape de mesure étant réalisée simultanément à l'étape de mesure 703 de l'intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi. Il est ainsi possible de réaliser, en parallèle et/ou à l'aide d'un dispositif commun, des mesures électriques permettant de rendre compte de ou de détecter des phénomènes magnétiques, électriques ou électrochimiques. Des mesures électriques correspondant à de tels phénomènes peuvent par exemple comprendre des mesures de conductimétrie, d'impédance, de potentiométrie et/ou d'ampérométrie, du même phénomène moléculaire ou biomoléculaire observé.
La configuration et la géométrie d'un dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt tel que décrit ci-avant est particulièrement adapté à un couplage avec d'autres types de mesures. En effet, le dispositif de mesure décrit permet une mesure d'un champ électromagnétique, typiquement une mesure optique, non destructrice vis-à-vis du milieu d'intérêt. Le procédé et le dispositif décrits permettent ainsi une implémentation aisée d'autres techniques d'analyses.
Le dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt proposé précédemment peut ainsi comprendre en outre au moins un deuxième capteur adapté pour mesurer une grandeur physique représentative de propriétés de transport de charges électriques entre la surface 121 et le milieu d'intérêt, typiquement pour réaliser une mesure de type différent telle que décrite ci- dessus, par exemple une mesure électrique.
De telles mesures électriques peuvent ainsi être réalisées par des deuxièmes capteurs dédiés. Les deuxièmes capteurs peuvent être connectés à un dispositif de mesure électrique. Le dispositif de mesure électrique peut être un dispositif de mesure électrique externe, ou être inclus au dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt tel que décrit précédemment. De telles mesures électriques peuvent être réalisées au moyen d'au moins 2 électrodes. Un capteur dédié peut former une électrode. L'une des électrodes peut être formée par l'une des surfaces indiquées précédemment, par exemple la surface 124 de la couche réfléchissante 121 . Une deuxième électrode peut être introduite dans la solution ou le milieu ambiant. Selon un exemple de mode de réalisation, une telle combinaison de mesures d'intensité de rayonnement électromagnétique d'une part et électrique d'autre part, peut être mise en œuvre par un capteur ou une pluralité de capteurs présentant une conductivité électronique correspondant à celle d'un métal, par exemple de l'or comme décrit précédemment, d'un alliage de métaux, ou encore de silicium, en particulier de silicium dopé. Un tel deuxième capteur formant une électrode peut être placé en contact direct avec le milieu d'intérêt ou la solution. La réponse électrique mesurée correspond à ou permet de détecter la présence ou l'absence d'une couche donnée, par exemple une couche de matériel biologique correspondant à ou responsable d'une réaction impliquant une modification d'épaisseur optique d'une couche, telle qu'une réaction d'immunodosage ou d'immunoessai donnée. En effet une telle réaction peut altérer la propriété électrique et/ou la pluralité de propriétés électriques, telles que la conductivité, l'impédance, un potentiel, et/ou un courant, mesurée par l'électrode et/ou une pluralité d'électrodes. Le deuxième capteur électrique formant l'électrode 121 peut également être enfoui sous une couche mince diélectrique, par exemple une couche isolante, par exemple transparente telle que la sous-couche transparente 123, par exemple un oxyde de silicium, par exemple du S1O2, le deuxième capteur électrique pouvant ainsi être disposé sans contact direct avec la solution et/ou le milieu d'intérêt. Le dispositif peut être réalisé de telle sorte que les propriétés optiques d'une zone de mesure du capteur 13 d'intensité de rayonnement, par exemple une surface spécifique du capteur s'accommodent de la présence de la couche diélectrique pour donner une réponse de sensibilité optique suffisante, par exemple comme décrite par la courbe 807 sur la Figure 3. Il convient alors que le dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt et/ou le procédé de mesure décrit précédemment est réalisé de telle sorte que la mesure électrique, par le deuxième capteur électrique, des propriétés de transport de charges électriques entre la couche 121 , la couche diélectrique 123 et le milieu d'intérêt présentent une sensibilité électrique également suffisante, c'est- à-dire la sensibilité permettant la détection de la même réaction que mesurée par le capteur 13 d'intensité de rayonnement. Ceci peut être obtenu par exemple par une couche diélectrique suffisamment mince pour permettre une mesure électrique, par exemple une mesure d'impédance, c'est-à-dire une mesure de capacité à haute fréquence, sensible à la couche éventuellement en formation et résultant de la réaction que l'on cherche à détecter, par exemple un dépôt induit par l'immunoessai qui altère la capacité du deuxième capteur. On peut ainsi par exemple réaliser une mesure, dite « sans-contact », de capacité comme par exemple dans les capteurs capacitifs de type TouchChip™ fingerprint Sensors (TCS).
L'étape de détection 704 peut alors être réalisée à partir des mesures électriques effectuées par le deuxième capteur.
Les moyens de calcul 14 peuvent alors être adaptés pour réaliser la détection en fonction des mesures décrites précédemment et des mesures issues du deuxième capteur.
Quel que soit le mode de détection, la modification d'épaisseur optique dont le procédé et le dispositif visent à déterminer la présence, se traduit par une variation d'un signal : un rayonnement électromagnétique, en particulier un signal optique, en ce qui concerne la mesure par le capteur de rayonnement décrit précédemment, un signal électrique dans le cadre d'une mesure électrique, par exemple de résistance, d'impédance, c'est-à-dire de résistance et/ou de capacité, de potentiel ou de courant.
Le procédé peut ainsi comprendre une étape comparaison des différentes mesures, par exemple de la mesure de rayonnement électromagnétique et d'au moins une mesure électrique. Une telle étape de comparaison pourra être obtenue par des tests électroniques logiques standards, par exemple mis en œuvre par les moyens de calcul 14. Une telle étape peut comprendre une étape de corrélation des mesures. Une telle étape de comparaison peut permettre d'augmenter la robustesse de la détection.
En complément ou en alternative, les moyens de calcul peuvent être adaptés pour filtrer les données issues de l'étape de détection à partir des données issues du deuxième capteur, par exemple à partir de données de détection calculées par les moyens de calcul 14 à partir de données issues du deuxième capteur.
Un tel couplage entre la mesure d'un rayonnement électromagnétique décrite précédemment et la mesure d'un autre phénomène, par exemple une mesure électrique, ou des données de détection issues de ces mesures, peut être mis en œuvre par un dispositif tel que le dispositif proposé, comprenant en outre un deuxième capteur électrique ou une pluralité de deuxièmes capteurs électriques.
La pluralité de types de mesures différents du même phénomène sur la même surface par exemple par une pluralité de capteurs, permet d'augmenter de manière significative la fiabilité des résultats d'un test ainsi mis en œuvre par le procédé ou le dispositif proposé.
Un tel couplage peut par exemple être mis en œuvre dans le cadre d'une étape de détection de faux positifs utilisant les résultats des différentes mesures. Une telle étape peut être mise en œuvre par les moyens de calcul décrits, les moyens de calcul fournissant en sortie une valeur corrigée, par exemple en supprimant les faux positifs détectés par les différents types de mesures.
Ainsi la modification détectée lors de l'étape de détection peut être corrigée lors d'une étape de correction à partir des données issues de capteurs et/ou de mesures distinctes et/ou de type différent.
Par exemple, en référence à la figure 7b, la microélectrode utilisée pour réaliser un électrogreffage peut permettre la réalisation d'une mesure électrochimique en parallèle des étapes décrites précédemment pour la mesure du milieu d'intérêt par un rayonnement électromagnétique. L'exemple d'électrogreffage présenté sur la figure 7b est produit par connexion sélective de l'électrode activée. On peut alors suivre le courant qui traverse chacune de ces électrodes pendant cet électrogreffage. L'électrode inactivée présente un courant <1 pA tandis que l'électrode activée présente un courant >100 pA.
L'électrogreffage se traduit par une diminution de réflectivité mesurable (-4% sur Figure 7a) sur l'électrode active et par une variation de réflectivité inférieure à la sensibilité optique sur l'électrode active.
La comparaison des deux mesures peut ainsi permettre une détection plus robuste de la présence ou de l'absence d'un dépôt sur les deux électrodes, à l'aide du procédé décrit présentant les deux étapes de mesure et/ou du dispositif décrit présentant les deux capteurs. Les résultats divergents entre les deux types de mesure peuvent par exemple être considérés comme de faux positifs ou faux négatifs.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt (20), le procédé comprenant des étapes consistant à :
- disposer (701 ) le milieu d'intérêt (20) entre une source lumineuse (1 1 ) adaptée pour émettre un rayonnement électromagnétique (301 ) et un substrat (12) comprenant une couche (121 ) présentant des propriétés réfléchissantes,
- éclairer (702) le substrat (12) par un rayonnement électromagnétique incident (302) issu de la source lumineuse
(1 1 ), la couche réfléchissante (121 ) produisant un rayonnement électromagnétique réfléchi (303) à partir du rayonnement électromagnétique incident (302), et
- mesurer (703) par un capteur (13) une intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt
(20),
- détecter (704) à partir de mesures effectuées par le capteur (13) dans des conditions d'illumination et de mesure constantes, un changement des propriétés réfléchissantes de l'ensemble (40) comprenant le milieu d'intérêt (20) et la couche réfléchissante
(121 ) et déterminer une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt (20) correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt (30), dans lequel le rayonnement électromagnétique émis (301 ) est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1 000 nm, et la couche réfléchissante (121 ) présente une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité c/R/c/(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l'étape de détection (704) comprend une détermination (705) par un abaque de l'épaisseur optique du milieu d'intérêt (20) directement à partir du suivi de l'intensité du rayonnement électromagnétique mesuré dans les conditions d'illumination et de mesure constantes.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel les conditions d'illumination et de mesure constantes pour l'ensemble des mesures (703) comprennent un positionnement relatif fixe de la source lumineuse, de la couche réfléchissante et du capteur (13), et un même rayonnement électromagnétique émis (701 ) par la source lumineuse (1 1 ) pour toutes les mesures (703).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le milieu d'intérêt (20) comprend une pluralité de molécules sondes
(201 ) immobilisées sur une surface de la couche réfléchissante (121 ), les molécules sondes étant adaptées pour interagir avec des molécules cibles
(202) , l'interaction des molécules sondes (201 ) avec les molécules cibles (202) changeant l'épaisseur optique du milieu d'intérêt (20) dans la bande spectrale.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le milieu d'intérêt (20) est soumis à un écoulement microfluidique, et l'étape de mesure (704) est répétée avec une fréquence supérieure à 1 Hz.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la couche réfléchissante (121 ) comprend une sous-couche opaque (122) présentant une surface opaque lisse tournée vers le milieu d'intérêt (20).
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la sous-couche opaque (122) est une couche d'or, de cuivre ou d'acier inoxydable, le rayonnement électromagnétique émis (301 ) étant compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 500 nm.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, dans lequel la couche réfléchissante (121 ) comprend en outre une sous-couche transparente (123), la sous-couche transparente (123) étant disposée entre le milieu d'intérêt (20) et la sous-couche opaque (122).
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la sous-couche transparente (123) présente une épaisseur inférieure à 1600 nm.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, dans lequel la sous-couche opaque (122) est une couche de silicium et la sous- couche transparente (123) est une couche d'oxyde de silicium ou de nitrure de silicium.
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant en outre une étape consistant à mesurer par un deuxième capteur une grandeur électrique dont une variation est représentative d'une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt, la grandeur électrique étant représentative de propriétés de transport de charges électriques entre la surface 121 et le milieu d'intérêt, l'étape de mesure étant réalisée simultanément à l'étape de mesure (703) de l'intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi.
12. Procédé selon la revendication 1 1 , dans lequel l'étape de détection (704) est réalisée en outre à partir des mesures effectuées par le deuxième capteur.
13. Dispositif de mesure d'un milieu d'intérêt (20), le dispositif (10) comprenant :
- un substrat (12) comprenant une couche (121 ) présentant des propriétés réfléchissantes, - une source lumineuse (1 1 ), le milieu d'intérêt (20) étant disposé entre la source lumineuse (1 1 ) et le substrat (12), la source lumineuse (1 1 ) étant adaptée pour émettre un rayonnement électromagnétique (301 ) et éclairer le substrat (12) par un rayonnement électromagnétique incident (302) issu de la source lumineuse (1 1 ), la couche réfléchissante (121 ) produisant un rayonnement électromagnétique réfléchi (303) à partir du rayonnement électromagnétique incident (302), et
- un capteur (13) adapté pour mesurer une intensité du rayonnement électromagnétique réfléchi après traversée du milieu d'intérêt (30),
- des moyens de calcul (14) adaptés pour détecter à partir de mesures (703) effectuées par le capteur (13) dans des conditions d'illumination et de mesure constantes, un changement de propriétés réfléchissantes de l'ensemble (40) comprenant le milieu d'intérêt (20) et la couche réfléchissante (121 ) caractérisant une modification d'une épaisseur optique (nc x d) du milieu d'intérêt (20) correspondant à une modification d'une quantité moléculaire dans le milieu d'intérêt (20), dans lequel le rayonnement électromagnétique émis (301 ) est compris dans une bande spectrale incluse entre 350 nm et 1 000 nm, et la couche réfléchissante (121 ) du substrat (12) présente une réflectivité R comprise entre 0,2 et 0,7 et une sensitivité c/R/c/(nc x d) supérieure à 1 x 10"3 nm"1 dans la bande spectrale.
14. Dispositif selon la revendication 13, comprenant en outre un deuxième capteur adapté pour mesurer une grandeur électrique représentative de propriétés de transport de charges électriques entre la surface 121 et le milieu d'intérêt.
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